專(zhuān)利名稱(chēng)：擾亂膜結(jié)合性化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的化合物、藥物組合物和采用它們的新穎的治療與診斷方法。
參考文獻(xiàn)列表下列參考文獻(xiàn)被視為有助于理解本發(fā)明的背景Bevers，E.M.，等，Biochim.Biophys.Acta，1439317-330，1999；Bombeli，T.，等，Blood，892429-2442，1997；Bratton，D.L.，等，J.Biol.Chem.，27226159-26165，1997；Bursch，W.，等，Trends Pharmacol. Sci.，13245-251，1992；Kockx M.M.，等，Cardiovasc.Res.，45736-746，2000；Mallat，Z.，等，Circulation，96424-428，1997；Martin，S.，等，J.Exp。Med.，1821545-1556，1995；Pugsley，W.，等，Stroke，251393-1399，1994；Sims，P.J.，等，Thromb.Haemost.，86266-275，2001；Stary，H.C.，等，Circulation，921355-1374，1995；Van den Eijnde，S.M.，等，Cell Death Diff.，4311-316，1997.
下文在對(duì)上述參考文獻(xiàn)進(jìn)行引用時(shí)將在括號(hào)內(nèi)指出第一作者和出版年份。
背景技術(shù)：
完整真核生物細(xì)胞的生物膜是以高度組織化的結(jié)構(gòu)為特征的。這種高水平的組織化尤其由下列因素決定構(gòu)成膜的特定脂質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；組成膜的各種脂質(zhì)之間的比例；磷脂在膜的外部與內(nèi)部小葉之間的分布；和膜的蛋白質(zhì)組分。
維持高水平的膜組織化是正常細(xì)胞生理學(xué)的基礎(chǔ)，正常膜組織化的實(shí)質(zhì)性擾亂和改變(PNOM)發(fā)生在大量生理學(xué)和病理學(xué)條件中，表現(xiàn)為多種疾病(Martin，S.等，1995)。這類(lèi)改變和擾亂可能在形態(tài)水平上(在經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞中所觀(guān)察到的膜起泡)和分子水平上都是明顯的。伴有細(xì)胞活化、細(xì)胞疾病或細(xì)胞死亡的擾亂的范圍尚未得到充分闡明。它們尤其包括膜磷脂的混雜和再分布，同時(shí)氨基磷脂向細(xì)胞表面運(yùn)動(dòng)，主要為磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)，它們?cè)谡Ｇ闆r下幾乎完全被限制在膜雙分子層的內(nèi)部小葉，還有鞘磷脂和磷脂酰膽堿從膜的外部小葉向內(nèi)部小葉運(yùn)動(dòng)(Sims，P.J.等，2001)。這種再分布在本文中被稱(chēng)為細(xì)胞膜脂質(zhì)不對(duì)稱(chēng)性(CMLA)的喪失。這些改變?cè)谑辜?xì)胞表面成為若干凝血因子配合物(例如tenase和凝血酶原酶配合物)裝配的催化平臺(tái)中扮演不可缺少的角色(Bevers，E.M.等，1999)。因而，血小板在活化后經(jīng)歷PNOM，這些改變?cè)谡Ｑ耗讨幸约霸诖罅空系K中的異常、過(guò)度凝血的引發(fā)和/或傳播中構(gòu)成重要的因素。這些障礙尤其包括動(dòng)脈或靜脈血栓形成或血栓栓塞(例如腦中風(fēng)、心肌梗塞、深靜脈血栓形成(DVT)、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓性血小板減少性紫癜等)；不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑、鐮刀細(xì)胞疾病；β-地中海貧血；抗磷脂抗體綜合征；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；與膜微粒脫落有關(guān)的障礙，例如與心肺旁路有關(guān)的神經(jīng)功能障礙。
細(xì)胞程序死亡是發(fā)生細(xì)胞膜改變/擾亂的另一種主要情形(Bratton，D.L.，等，1997)。細(xì)胞程序死亡是細(xì)胞自我破壞或“自殺”的內(nèi)在程序，這是每種真核生物細(xì)胞所固有的。響應(yīng)于激發(fā)性刺激，細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜起泡、染色質(zhì)凝縮與碎裂、最后細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合性粒子簇(細(xì)胞程序死亡體)等事件的高度特征性級(jí)聯(lián)，然后被巨噬細(xì)胞吞噬(Bursch，W.，等，1992)。PNOM是細(xì)胞程序死亡的普遍現(xiàn)象，它發(fā)生在細(xì)胞程序死亡級(jí)聯(lián)的早期，很可能在細(xì)胞進(jìn)入死亡過(guò)程之時(shí)，還已顯示是吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞程序性死亡的識(shí)別和除去中的重要因素(Vanden Eijnde，S.M.，等，1997)。
最近發(fā)現(xiàn)在PNOM與細(xì)胞程序死亡性細(xì)胞的有力促凝血活性之間存在密切關(guān)系(Bombeli，T.，等，1997)。細(xì)胞程序死亡性?xún)?nèi)皮細(xì)胞中的PNOM(例如在動(dòng)脈粥樣硬化斑中(Mallat，Z.，等，1997))很可能在血栓形成性血管障礙的發(fā)病機(jī)理中扮演重要角色。PNOM還是炎性細(xì)胞(即淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)的特征，受各種激發(fā)物的活化。
與PNOM膜選擇性結(jié)合的化合物因此充當(dāng)重要的工具，用于檢測(cè)和定向經(jīng)歷活化、損傷或死亡過(guò)程、尤其是細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞。在臨床意義上，與所述膜結(jié)合可以用于(1)診斷(例如診斷疾病進(jìn)程、監(jiān)測(cè)疾病的過(guò)程與進(jìn)展、監(jiān)測(cè)各種治療方法對(duì)疾病過(guò)程的效果)；(2)治療(例如定向于PNOM細(xì)胞的藥物，和/或與PNOM有關(guān)的障礙的調(diào)節(jié))；和(3)廓清(選擇性結(jié)合和除去體液中的PNOM要素)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)這樣的化合物，它能夠與經(jīng)歷正常膜組織化擾亂(PNOM)的細(xì)胞選擇性結(jié)合，而與維持正常膜組織化的細(xì)胞結(jié)合的程度則低得多。
用于本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)PNOM涉及具有至少一種下列特征的細(xì)胞(i)膜磷脂的混雜，伴有磷脂在細(xì)胞膜內(nèi)部與外部小葉之間分布的正常不對(duì)稱(chēng)性下降；(ii)氨基磷脂暴露在外部細(xì)胞表面上(主要是磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺的暴露)；(iii)膜成分包裝的減低；(iV)脂質(zhì)在每種膜小葉內(nèi)的正常分布減低，例如單側(cè)區(qū)域的形成，分別是特定脂質(zhì)膜成分的富集或貧乏，例如磷脂酰絲氨酸或膽固醇。
術(shù)語(yǔ)“擾亂膜結(jié)合性化合物”(PMBC)涉及這樣一種化合物，它與以PNOM為特征的膜選擇性結(jié)合，而與正常膜結(jié)合的程度則較低。
PMBC在本發(fā)明中用于制備與擾亂膜選擇性結(jié)合的藥物。PMBC類(lèi)化合物被指定為“NST700”。PMBC類(lèi)包括新化合物和已知化合物。
因而，按照一個(gè)方面，本發(fā)明提供擾亂膜結(jié)合性化合物(PMBC)在藥物制備中的用途，該藥物用于與經(jīng)歷其正常膜組織化擾亂的細(xì)胞選擇性結(jié)合，所述PMBC具有式Ce，其中e選自1、2和3，C是具有式(I)的基團(tuán)
或式(I)結(jié)構(gòu)的藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中所述C基團(tuán)可以各自是相同或不同的；Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基或這類(lèi)基團(tuán)的組合構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5-10個(gè)原子組成；X代表CH、CH2、N、NH、O或S；n、m、r和p各自獨(dú)立地是0或1；其中n+r＝1；m+p＝1；R1可以各自是相同或不同的，獨(dú)立地選自由A和L-A組成的組，其中L可以各自是相同或不同的，獨(dú)立地選自由D、U、U-D、D-U、D-U-O、O-U-D、D-U-NH、NH-U-D、D-U-D和U-D-U組成的組；U代表氫或者選自可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基、C3-C6亞環(huán)烷基、亞環(huán)烯基、芳基、亞雜環(huán)烷基、亞雜環(huán)烯基、雜芳基和所述基團(tuán)的任意組合；D選自由O、S、SO、SO2、SO2NH、NHSO2、NH、PO、PO2、POOH、PO(NH)2、NHPOOH、CO、C(O)O、NHCO、CONH、SO2NHCHCOOH、SO2NHCO或當(dāng)D是二價(jià)原子團(tuán)時(shí)上述列表的對(duì)應(yīng)含義組成的組；A可以各自是相同或不同的，當(dāng)e是1時(shí)，A是在pH約7下帶電的部分；或者當(dāng)e是2或3時(shí)，A獨(dú)立地選自極性不帶電部分和在pH約7下帶電的部分，所述帶電部分是帶正電的、帶負(fù)電的或兩性離子形式；R2是WR3b，其中W缺無(wú)或者選自由仲或叔胺、氧、硫、碳和D組成的組，其中D是如上所定義的；
R3代表氫或C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C8支鏈烷基、C3-C8支鏈烯基；R3部分可以是相同或不同的；b是1、2或3；當(dāng)e是2或3時(shí)，C基團(tuán)是彼此直接或者通過(guò)L部分連接的，其中L是如上所定義的。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，e是2。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述式IPMBC的Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5或6個(gè)原子組成；U代表可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基和所述基團(tuán)的任意組合；和R2由WR3b組成，其中W缺無(wú)或者選自由仲或叔胺、氧和硫組成的組，R3和b是如上所定義的。
優(yōu)選地，b是2，R3獨(dú)立地選自下列組合(a)甲基，(b)丁基，(c)己基，(d)丁基與甲基，(e)己基與甲基的組合。
在式(I)的PMBC中，每個(gè)R1和R2可選地可以包含Y，所述Y是連接基團(tuán)，與任意下列連接1、固體載體；2、成像標(biāo)志，例如熒光、X-射線(xiàn)、CT掃描、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層照相術(shù)(PET)或放射性同位素掃描的檢測(cè)劑；3、另一種藥物，醫(yī)學(xué)上可用于預(yù)防或治療特定疾病，經(jīng)由與PMBC連接定向于病患細(xì)胞或組織。優(yōu)選地，該藥物可以是細(xì)胞程序死亡抑制劑(例如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、抗氧化劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑)或細(xì)胞毒劑，例如細(xì)胞程序死亡激活劑(例如抗癌藥)；作為替代選擇，該藥物優(yōu)選地是抗凝血?jiǎng)?、抗血栓形成劑或血管溶解劑。在這類(lèi)情況下，所述藥物優(yōu)選地選自抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、或凝血因子抑制劑，例如凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑；進(jìn)而作為替代選擇，該藥物優(yōu)選地是抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)藥。
優(yōu)選地，當(dāng)e是整數(shù)2或3時(shí)，PMBC的C基團(tuán)是彼此直接或者通過(guò)L部分連接的，其中L是如上所定義的。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC包含具有下式(II)的C基團(tuán) 包括式(II)結(jié)構(gòu)的藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p都具有與上述定義相同的含義。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，式(I)的PMBC包含這樣的C基團(tuán)，其中所述C基團(tuán)由萘基組成(也就是說(shuō)Z是苯基環(huán))，該萘基的一個(gè)環(huán)與選自結(jié)構(gòu)-SO2-(NH)-(CH2)v-A、-SO2-O-(CH2)v-A的單元連接，其中v代表整數(shù)1-5；該萘基的第二個(gè)環(huán)與單烷基或二烷基氨基連接；A是由氨基和/或酸性基團(tuán)構(gòu)成的帶電基團(tuán)，酸性基團(tuán)例如羧酸、磷酸、磷酸鹽、磺酸或硫酸。
優(yōu)選地，R3選自下列組合(a)兩個(gè)甲基，(b)兩個(gè)丁基，(c)兩個(gè)己基，(d)丁基與甲基的組合，(e)己基與甲基的組合。
按照另一種優(yōu)選的實(shí)施方式，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(III)的C基團(tuán)
包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中A是由氨基和/或羧酸基團(tuán)構(gòu)成的帶電基團(tuán)，至少一個(gè)R3是C2-C6烷基，L是-SO2-(NH)-(CH2)v(v代表整數(shù)1-5)。
更具體地，PMBC具有下式(IV)，被指定為NST701 有些PMBC是新化合物，代表本發(fā)明的第二方面。這些新化合物具有結(jié)構(gòu)Ce，其中C是如上所定義的，e是2(也就是說(shuō)新化合物是二聚物)或1；其中在e＝1的情況下，PMBC包含除-(CH2)5-以外的L基團(tuán)。
下列PMBC不是新化合物N2，N6-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-J-賴(lài)氨酸、N，N’-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-胱氨酸、N，O-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-酪氨酸和N，N”-雙[[2-(5-(二甲氨基)萘-1-磺?；?氨基乙基]氨基甲?；谆鵠二亞乙基三胺-N，N’，N-三乙酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的新化合物具有下式(V) 其中G1、G2、G3和G4可以是相同或不同的，獨(dú)立地選自氫、COOH、C(O)NH2、NH2和-N+(CH3)3；M選自缺無(wú)、NHC(O)、C(O)NH、NH、O、S、S-S、CH2、(CH2)2、NH-(CH)2NH、N(CH2)kCOOH和N+(CH3)(CH2)kCOOH；Q1、Q2、Q3和Q4可以是相同或不同的，獨(dú)立地選自缺無(wú)或(CH2)k；k是整數(shù)1-6；R3代表氫或C1-C6烷基。
優(yōu)選地，R3是甲基、丁基或己基。
在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(VI)，被指定為NST740
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(VII) 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R3具有與上述定義相同的含義，y是整數(shù)2-6，z是整數(shù)1-6，T選自缺無(wú)、氫和甲基。
優(yōu)選地，R3選自甲基、丁基或己基，y是2或3，z是1、2或3。
在另一種特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(VIII)，被指定為NST750 在另一種特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的新化合物具有下式(IX) 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R3可以是相同或不同的，具有上述相同含義。
優(yōu)選地，新化合物具有式(IX)結(jié)構(gòu)，其中R3是甲基，被指定為NST751。
在特定的實(shí)施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(X)，被指定為DDL 在另一種特定的實(shí)施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(XI)，被指定為
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，用在本發(fā)明中的PMBC具有下式(XII) 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R3選自甲基、丁基和己基。
與經(jīng)歷正常組織化擾亂的細(xì)胞膜(PNOM)選擇性結(jié)合而基本上不與維持其正常組織化的膜結(jié)合或者結(jié)合程度低得多的PMBC可以用在本發(fā)明的三種不同方法中。
按照第一種方法，以下稱(chēng)為“檢測(cè)方法”，選擇性結(jié)合可以用于檢測(cè)細(xì)胞或細(xì)胞派生粒子，它們含有擾亂的膜(PM)。這可以用于診斷其中細(xì)胞經(jīng)歷PNOM的疾病，下文將有解釋。
按照第二種方法，以下稱(chēng)為“治療方法”，與PM選擇性結(jié)合的性質(zhì)可以用于使用PMBC作為定向部分治療疾病、定向治療用藥物于其中發(fā)生PNOM的體內(nèi)器官和組織，例如細(xì)胞死亡、血栓形成或炎癥的區(qū)域。
按照被稱(chēng)為“廓清方法”的本發(fā)明第三種方法，本發(fā)明化合物與PM的選擇性結(jié)合用于從具有PM的細(xì)胞或包含這類(lèi)膜的更大結(jié)構(gòu)(例如在血液中循環(huán)的栓子)中廓清體液。
按照檢測(cè)方法，本發(fā)明涉及組合物，包含如上所定義的PMBC作為有效成分，用于體外、來(lái)自體內(nèi)或體內(nèi)檢測(cè)生物細(xì)胞樣本中的擾亂膜。根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)方法的PMBC能夠與存在于測(cè)定樣本中的PM選擇性結(jié)合。然后，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意手段鑒別所述結(jié)合。PMBC可以具有其自身的可檢測(cè)性質(zhì)，例如熒光發(fā)射，這些可檢測(cè)性質(zhì)例如可以通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞測(cè)定設(shè)備加以檢測(cè)。
術(shù)語(yǔ)“以PM為特征的疾病”涉及這樣一種疾病，其表現(xiàn)之一是正常膜組織化的擾亂。這并不意味著這種擾亂必然是疾病的原因或唯一后果，而是它的表現(xiàn)之一。
按照優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施方式，PMBC可以包含可檢測(cè)標(biāo)記或者經(jīng)由Y部分與之結(jié)合，例如熒光發(fā)射部分、放射性標(biāo)記、能夠經(jīng)歷酶反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)顏色的標(biāo)記、用于X-射線(xiàn)、MRI、放射性同位素成像或PET掃描的標(biāo)記，以生成PMBC-標(biāo)記加合物。這類(lèi)加合物使可檢測(cè)標(biāo)記能夠通過(guò)本發(fā)明化合物與PM以選擇性方式結(jié)合。然后，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方式檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記，根據(jù)所用的特定標(biāo)記，例如熒光、放射性發(fā)射、顯色、MRI、X-射線(xiàn)等。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”涉及共價(jià)或非共價(jià)(例如靜電)結(jié)合，連接PMBC與可檢測(cè)標(biāo)記。作為替代選擇，由于其結(jié)構(gòu)的化學(xué)屬性，PMBC可以具有其自身的可檢測(cè)性質(zhì)，使其能夠被任意上述技術(shù)檢測(cè)。
優(yōu)選地，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自金屬離子用于放射性同位素掃描的Tc-99m和In-111，用于MRI的Gd。有利地，Y包含金屬螯合基團(tuán)，所述金屬是可檢測(cè)標(biāo)記，其中所述螯合基團(tuán)選自任意下列結(jié)構(gòu)
其中該螯合基團(tuán)經(jīng)由其氨基之一與化合物連接。
進(jìn)而有利地，Y連接基團(tuán)包含L單元，連接螯合基團(tuán)與PMBC的羧基、胺或磺酰胺部分；所述L單元是如上所定義的。上述加合物能夠用于檢測(cè)和診斷多種以PM的形成為特征的生理學(xué)條件(包括正常條件)、病理學(xué)條件、疾病或障礙。
以PM為特征的條件的實(shí)例如下以過(guò)度細(xì)胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾病，例如變性障礙、神經(jīng)變性障礙(例如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病)、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細(xì)胞丟失；腫瘤、尤其是高度惡性/侵襲性腫瘤，除了過(guò)度組織增生以外，也經(jīng)常是以增強(qiáng)的細(xì)胞程序死亡為特征的。
表現(xiàn)為過(guò)度凝血的疾病，其中PNOM發(fā)生在血小板活化期間和/或其他細(xì)胞要素(例如內(nèi)皮細(xì)胞)的活化或損傷期間。這些疾病尤其包括動(dòng)脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞(例如心肌梗塞、腦中風(fēng)、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP))、鐮刀細(xì)胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
炎癥和/或與免疫介導(dǎo)的病因?qū)W或發(fā)病機(jī)理有關(guān)的疾病，例如自體免疫障礙，例如抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；結(jié)締組織障礙，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病；甲狀腺炎；皮膚病學(xué)障礙，例如天皰瘡或結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學(xué)障礙；自體免疫性神經(jīng)病學(xué)障礙，例如重癥肌無(wú)力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙，例如潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎。
動(dòng)脈粥樣硬化斑、尤其是不穩(wěn)定的、易損的和有破裂傾向的斑，也是以PM結(jié)構(gòu)為特征的，包含細(xì)胞程序死亡的巨噬細(xì)胞、細(xì)胞程序死亡的平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞程序死亡的內(nèi)皮細(xì)胞、活化的血小板和活化的炎性細(xì)胞。
經(jīng)由檢測(cè)有關(guān)的PNOM來(lái)檢測(cè)這些病理學(xué)條件、障礙或疾病可以是單獨(dú)的目標(biāo)，僅僅用于診斷特定個(gè)體中疾病條件的存在。
所述檢測(cè)還可以對(duì)已知患有疾病的個(gè)人進(jìn)行，目的是評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重性和監(jiān)測(cè)對(duì)各種治療藥征的響應(yīng)。這類(lèi)監(jiān)測(cè)的實(shí)例是評(píng)價(jià)對(duì)抗癌療法的響應(yīng)。由于大多數(shù)抗腫瘤治療——化療法或放療法通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡發(fā)揮作用，療法誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞程序死亡的PMBC檢測(cè)基本上可以縮短抗癌治療給藥時(shí)間與適當(dāng)評(píng)價(jià)其功效時(shí)間之間的遲滯期。
而且，所述檢測(cè)可以用于監(jiān)測(cè)抗癌治療的副作用。大部分這類(lèi)副作用是由于事與愿違的治療對(duì)正常而敏感的細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，例如胃腸上皮或骨髓造血系統(tǒng)的細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞程序死亡的PMBC檢測(cè)可以允許早期檢測(cè)這種事與愿違的組織損傷，更好地優(yōu)化治療方案。
另外，所述檢測(cè)可以致力于鑒定腫瘤內(nèi)部細(xì)胞程序死亡的負(fù)載，鑒定腫瘤的發(fā)展水平，和測(cè)定轉(zhuǎn)移。
同樣，本發(fā)明化合物或組合物可用于監(jiān)控器官移植后的移植存活，因?yàn)榭捎蒔MBC潛在檢測(cè)的細(xì)胞程序死亡在移植排異期間的細(xì)胞損失中起主要作用。
另外，所述檢測(cè)可以致力于監(jiān)測(cè)對(duì)細(xì)胞保護(hù)性治療的響應(yīng)，從而通過(guò)使細(xì)胞死亡成為評(píng)價(jià)量度，有助于篩選和開(kāi)發(fā)能夠抑制各種疾病(例如上文引用的那些)中的細(xì)胞丟失的藥物。
所述檢測(cè)還可以用于檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑，因?yàn)檫@類(lèi)斑的去穩(wěn)定化賦予它們易損的、有破裂的傾向、血栓形成和栓塞化，是以若干要素的參與為特征的，它們共同具有擾亂的膜(i)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞不穩(wěn)定的斑是以細(xì)胞程序死亡的巨噬細(xì)胞、細(xì)胞程序死亡的平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞程序死亡的內(nèi)皮細(xì)胞為特征的；(ii)活化的血小板；(iii)活化的炎性細(xì)胞。脂質(zhì)內(nèi)核、包含脂質(zhì)的細(xì)胞外蓄積，也是動(dòng)脈粥樣硬化斑經(jīng)歷去穩(wěn)定化的證明之一(Kockx M.M.，等，2000；Stary，H.C.，等，1995)。PMBC和本發(fā)明化合物由于它們的疏水性芳族組分，還可以用于鑒別這類(lèi)易損的動(dòng)脈粥樣硬化斑的脂質(zhì)內(nèi)核。
檢測(cè)還可以在組織培養(yǎng)和動(dòng)物模型的細(xì)胞程序死亡研究中用于基礎(chǔ)研究目的，還可以幫助確定細(xì)胞程序死亡在各種組織的正常發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的角色，例如在胚胎發(fā)生期間的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，以及在正常老化等情形期間。
按照這種方法，本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測(cè)生物細(xì)胞中PM的方法，該方法包含(i)使細(xì)胞樣本與PMBC在使所述PMBC能夠與生物膜結(jié)合的條件下接觸；(ii)檢測(cè)化合物與所述細(xì)胞的結(jié)合；顯著量所結(jié)合的化合物的存在說(shuō)明在所述細(xì)胞中存在PM。
本發(fā)明的方法可以用于診斷以PNOM的存在為特征的疾病，例如任意一種上述疾病。
本發(fā)明的方法還可以用于監(jiān)測(cè)各種治療藥征對(duì)所述疾病或醫(yī)學(xué)條件的效果，或者作為替代選擇用于如上所解釋的基礎(chǔ)科學(xué)研究目的。
按照本發(fā)明的第二種方法“治療方法”，本發(fā)明涉及藥物組合物，包含活性成分，可選地和藥學(xué)上可接受的載體；所述活性成分包含由(i)藥學(xué)活性藥物和(ii)PMBC構(gòu)成的PMBC-綴合物。所述藥物組合物發(fā)揮定向藥物于經(jīng)歷PNOM的細(xì)胞的作用，因此能夠用于治療如上所定義的以PM的存在為特征的疾病。
術(shù)語(yǔ)“PMBC-綴合物”用于表示這樣一種綴合物，包含與PMBC的互補(bǔ)單元締合的藥物，其中所述綴合物能夠充當(dāng)PMBC。所述締合作用可以通過(guò)共價(jià)結(jié)合、非共價(jià)結(jié)合(例如靜電力)或載體粒子(例如脂質(zhì)體)的形成，其中包含在其表面具有PMBC的藥物，定向該配合物于PM。
PMBC-綴合物的目的是使藥物僅選擇性指向表現(xiàn)PNOM或表現(xiàn)顯著量PNOM的細(xì)胞、組織或器官。一旦藥物到達(dá)靶，它應(yīng)當(dāng)能夠發(fā)揮其生理活性，無(wú)論仍然作為PMBC的一部分處于配合物中、從互補(bǔ)性PMBC單元分離(例如通過(guò)裂解、破壞、天然酶的活性)、在其膜上具有PMBC的含藥脂質(zhì)體的吞噬作用、還是通過(guò)任意其他已知的機(jī)理。
在選擇藥物時(shí)應(yīng)當(dāng)根據(jù)組合物適用的特定疾病。
關(guān)于表現(xiàn)為異常與過(guò)度凝血的引發(fā)或傳播的疾病(例如動(dòng)脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞、鐮刀細(xì)胞疾病、β-地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、系統(tǒng)紅斑狼瘡)的治療或預(yù)防，藥物應(yīng)當(dāng)是這樣一種化合物，已知它抑制血塊的形成或者溶解已經(jīng)產(chǎn)生的血塊，例如抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIB/IIIA拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、或凝血因子抑制劑，例如凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑。
若疾病表現(xiàn)為不適當(dāng)?shù)暮瓦^(guò)度的細(xì)胞程序死亡，例如變性障礙、神經(jīng)變性障礙(例如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病)、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間的移植細(xì)胞丟失，則藥物應(yīng)當(dāng)能夠抑制細(xì)胞程序死亡。這類(lèi)藥物尤其可以是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑或抗氧化劑。
若疾病是炎癥和/或與免疫介導(dǎo)的病因?qū)W或發(fā)病機(jī)理有關(guān)的疾病，例如自體免疫障礙，例如抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；結(jié)締組織障礙，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮??；甲狀腺炎；皮膚病學(xué)障礙，例如天皰瘡或結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學(xué)障礙；自體免疫性神經(jīng)病學(xué)障礙，例如重癥肌無(wú)力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙，例如潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎，則藥物應(yīng)當(dāng)是抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)藥。
關(guān)于不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑(以血栓形成、炎癥或細(xì)胞程序死亡為特征)的治療或預(yù)防，藥物可以選自上述各組。
本發(fā)明的綴合物可以包含抗癌藥，目的是增強(qiáng)抗癌方案的功效?？拱┓桨傅脑鰪?qiáng)作用是這樣實(shí)現(xiàn)的(1)定向所述綴合物于以異常過(guò)度細(xì)胞程序死亡負(fù)荷為特征的腫瘤組織(后者經(jīng)常與腫瘤侵襲水平有關(guān))；或(2)使用兩波細(xì)胞程序死亡第一波使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)治療劑或放射治療劑，致力于引發(fā)腫瘤內(nèi)的細(xì)胞程序死亡過(guò)程；繼之以第二波細(xì)胞程序死亡，其中給以PMBC-藥物綴合物形式的抗癌藥，它被定向于由第一波產(chǎn)生的細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞。因而，實(shí)現(xiàn)抗癌藥在腫瘤塊內(nèi)的局部濃度增加，所以增強(qiáng)局部腫瘤殺死過(guò)程。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)任意已知途徑給藥，尤其是口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、舌下、眼內(nèi)、鼻內(nèi)或局部給藥。在選擇載體時(shí)應(yīng)當(dāng)根據(jù)所需的給藥方式，包括任意已知組分，例如溶劑；乳化劑、賦形劑、滑石；矯味劑；著色劑等。如果需要的話(huà)，藥物組合物還可以包含其他藥學(xué)活性化合物，它們用于治療疾病、消除副作用或增加活性組分的活性。
本發(fā)明還涉及包含藥物的PMBC、即PMBC-綴合物在藥劑制備中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的用途優(yōu)選地用于制備這樣一種藥劑，它治療和檢測(cè)以PM的存在為特征的疾病和/或其中PM扮演病因?qū)W或致病角色的疾病。這類(lèi)疾病的實(shí)例參見(jiàn)上文。
按照這個(gè)方面，本發(fā)明更進(jìn)一步涉及改善表現(xiàn)為PM的疾病治療的方法，包含對(duì)需要這樣一種治療的個(gè)體給以有效量的PMBC-綴合物，所述綴合物包含對(duì)所述疾病有治療活性的藥物。綴合物允許選擇性定向藥物于承受PNOM的組織，從而增加其局部濃度，潛在地增強(qiáng)其對(duì)靶部位的治療效果。這類(lèi)醫(yī)學(xué)障礙是如上所定義的。
術(shù)語(yǔ)“有效量”涉及能夠在可測(cè)量的程度上減少至少一種疾病不利表現(xiàn)的量，在選擇時(shí)應(yīng)當(dāng)根據(jù)所用的藥物、給藥方式、患者的年齡與體重、疾病嚴(yán)重性等。
第三種方法稱(chēng)為“廓清方法”，利用PMBC與PM特異性結(jié)合的性質(zhì)廓清細(xì)胞、粒子、微?；蛉我夂蠵M的結(jié)構(gòu)的體液。優(yōu)選地，體液是血液或血液產(chǎn)物。
很多需要體外循環(huán)的外科或內(nèi)科干預(yù)與血液要素暴露于外源性人工環(huán)境有關(guān)。這經(jīng)常引起血液細(xì)胞的活化與損傷、全身炎癥和血栓栓塞現(xiàn)象，潛在地具有嚴(yán)重的臨床后果，例如神經(jīng)功能障礙。因此需要檢測(cè)和除去所述被損傷的、被活化的或細(xì)胞程序死亡的血液細(xì)胞。
因而，本發(fā)明涉及固定在固體載體上的PMBC。所述固定化可以是直接附著，通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，或者是通過(guò)間隔基團(tuán)附著。被固定的PMBC打算廓清體液中的PM細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)。
術(shù)語(yǔ)“PM細(xì)胞”涉及膜經(jīng)歷PNOM的細(xì)胞。通常關(guān)于血液或血液產(chǎn)物，這包括活化的、細(xì)胞程序死亡的或損傷的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血小板派生微粒、組織巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“含有PM的結(jié)構(gòu)”涉及細(xì)胞和/或非細(xì)胞組分的聚集體，它含有具有PNOM的膜。該術(shù)語(yǔ)通常涉及微栓子，它們是促凝血的粒子和促凝血的細(xì)胞。所述微栓子包含活化的血小板、血小板派生微粒、血小板-纖維蛋白凝塊、損傷的細(xì)胞、衰老的細(xì)胞、細(xì)胞程序死亡的內(nèi)皮與血液細(xì)胞、細(xì)胞程序死亡的尸體和細(xì)胞碎屑。這些要素是以PM為特征的，所述微栓子可以沉積在遠(yuǎn)端小血管中，使它們閉塞和/或引發(fā)局部血栓形成，從而導(dǎo)致局部缺血。事實(shí)上，這些微栓子在各種器官——特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)——毛細(xì)血管中的廣泛沉積目前被視為在心臟手術(shù)期間心肺旁路后器官損傷與功能障礙發(fā)病機(jī)理中的主要因素(Pugsley，W.，等，1994)。
術(shù)語(yǔ)“固體載體”在本發(fā)明的上下文中涉及固體基質(zhì)、不溶性基質(zhì)和不溶性載體。根據(jù)本發(fā)明的固體載體可以形成各種結(jié)構(gòu)，例如微粒、微濾器或微毛細(xì)管的堆積體，可以由各種材料組成，例如氧化鋁、硅藻土、C鹽、碳酸鈣、硫酸鈣、離子交換樹(shù)脂、硅膠、木炭、安伯來(lái)特、dowex、Eupergit和乙磺酰氧基纖維素。
按照優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式，固體載體具有大量與PMBC結(jié)合的珠粒。優(yōu)選地，這些珠粒是涂有樹(shù)脂的珠粒。作為替代選擇，這些珠?？梢允谴判灾榱！?br> 若固體載體包括大量纖維或微毛細(xì)管，體液流過(guò)其中和/或其間，則其內(nèi)部和/或外部表面被PMBC覆蓋。
固定在固體載體上的化合物構(gòu)成過(guò)濾裝置的一部分。因而按照廓清方法，本發(fā)明進(jìn)一步涉及過(guò)濾裝置，包含容器、流體入口和流體出口，容器含有固定在所述固體載體上的PMBC。體液、例如血液或血液產(chǎn)物通過(guò)所述入口進(jìn)入容器，與容器中所含有的固定化PMBC接觸和粘附。因而，體液被廓清了，除去具有擾亂膜的循環(huán)細(xì)胞，例如損傷或死亡的細(xì)胞，或者除去更大的結(jié)構(gòu)，例如具有擾亂膜的栓子。所以，從所述出口流出的流體減少了所述含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的含量或者基本上沒(méi)有它們。
過(guò)濾裝置可以構(gòu)成體外循環(huán)儀器的可替換的、永久的或添加的部分。因而，本發(fā)明還涉及包含所述過(guò)濾裝置的體外循環(huán)儀器，其中循環(huán)通過(guò)該儀器的血液也穿過(guò)該裝置。
這類(lèi)儀器的實(shí)例是心肺旁路儀；血液透析儀；血漿除去儀和輸血儀，例如本領(lǐng)域現(xiàn)有的輸血袋。
廓清方面還提供從生物流體、優(yōu)選體液中除去含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的方法。該方法包含使體液與固定在固體載體上的PMBC接觸，接觸的條件和時(shí)間足以使含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)與PMBC結(jié)合，由此從體液中除去至少一部分所述含有PM的細(xì)胞或粒子。
體液(例如血液或血液派生產(chǎn)物)與固定化PMBC的接觸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法進(jìn)行，以從流體中除去粒子，具體方法為使體液流經(jīng)本發(fā)明的過(guò)濾裝置，由此廓清血液，除去至少一部分其中存在的微栓子。
本發(fā)明的方法可以用于通過(guò)從血液中除去潛在有害的含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)(主要是微栓子)，改善牽涉體外循環(huán)的操作的臨床結(jié)果，例如需要心肺旁路的手術(shù)，由此減少操作期間的血栓栓塞事件的危險(xiǎn)。在實(shí)踐中，過(guò)濾裝置可以置于體外循環(huán)機(jī)與患者之間，從而從血液中濾出PM細(xì)胞或聚集物。作為替代選擇，可以將血液暫時(shí)轉(zhuǎn)移到包含過(guò)濾裝置的系統(tǒng)中，進(jìn)行PM要素的過(guò)濾，然后將純化后的血液返回到全身循環(huán)中。該方法還可以用于從經(jīng)歷血液透析的患者或經(jīng)歷血漿除去的患者的循環(huán)中廓清含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)。
該方法還可以用于在輸血前處理所貯存的血液，以便最小化其中存在的含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的量，從而最小化與輸血有關(guān)的各種并發(fā)癥。關(guān)于所貯存的血液的處理，可以采用所述過(guò)濾方法作為血庫(kù)血液加工的一部分，或者用在向患者輸血期間，在這種情況下所述濾器可以置于輸血袋與患者之間。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明為了理解本發(fā)明和了解如何在實(shí)踐中實(shí)施，現(xiàn)在將描述優(yōu)選的實(shí)施方式，其中評(píng)價(jià)了本發(fā)明化合物與由于細(xì)胞程序死亡或活化作用而經(jīng)歷PNOM的細(xì)胞結(jié)合的檢測(cè)。通過(guò)熒光顯微鏡檢查或流式細(xì)胞測(cè)定(FACS)分析，監(jiān)測(cè)化合物內(nèi)在熒光的強(qiáng)度，測(cè)量結(jié)合作用?，F(xiàn)在將借助非限制性實(shí)施例描述所述優(yōu)選的實(shí)施方式，并參照附圖，其中

圖1DDL與活化紅細(xì)胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細(xì)胞測(cè)定分析；圖2熒光顯微鏡檢查，顯示DDC與細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的選擇性結(jié)合；圖3DDC與活化紅細(xì)胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細(xì)胞測(cè)定分析；圖4DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合；流式細(xì)胞測(cè)定分析；圖5用DDC體內(nèi)檢測(cè)肝細(xì)胞程序死亡；圖6用DDC體內(nèi)檢測(cè)腫瘤內(nèi)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞，與TUNEL來(lái)自體內(nèi)測(cè)定法對(duì)比；圖7用NST750體內(nèi)檢測(cè)化療法誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞程序死亡。
附圖的詳細(xì)解釋圖1DDL與活化紅細(xì)胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細(xì)胞測(cè)定分析在Ca2+的存在下，將RBC用N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)和鈣離子載體A23187處理進(jìn)行活化(Kuypers A.等，1996，Blood，87，1179-1187)。向活化組或?qū)φ战M(未處理的RBC)加入DDL(最終濃度1μM)。然后使用Beckton-Dickinson細(xì)胞分類(lèi)器和CellQuest軟件，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)定(FACS)分析。激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm。完整的RBC不表現(xiàn)顯著的DDL結(jié)合(藍(lán)線(xiàn)，類(lèi)似于基礎(chǔ)的背景熒光(黑線(xiàn)))，而活化的RBC表現(xiàn)顯著的DDC結(jié)合，反映在峰顯著漂移到更高的熒光值(紅線(xiàn))。X軸代表530nm下的熒光，Y軸代表所統(tǒng)計(jì)的RBC數(shù)。
圖2熒光顯微鏡檢查，顯示DDC與細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的選擇性結(jié)合暴露于500μM多巴胺達(dá)18小時(shí)，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡，然后用DDC(100μM)培育。未處理的細(xì)胞充當(dāng)對(duì)照。利用IX70熒光顯微鏡(Olympus)進(jìn)行細(xì)胞肉眼檢查，測(cè)量DDC化合物的固有熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm)。在對(duì)照培養(yǎng)物(a)中，完整的細(xì)胞保持未被染色。相形之下，在細(xì)胞程序死亡的培養(yǎng)物(b)中，大多數(shù)細(xì)胞特異性結(jié)合DDC。對(duì)照培養(yǎng)物內(nèi)小部分細(xì)胞結(jié)合了DDC，這代表天然存在的細(xì)胞死亡過(guò)程，是細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)所常見(jiàn)的(放大率X400)。
圖3DDC與活化紅細(xì)胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細(xì)胞測(cè)定分析向?qū)φ张c活化的RBC加入DDC(最終濃度500μM)，使用Becton-Dickinson細(xì)胞分類(lèi)器和CellQuest軟件，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm。在加入DDC(藍(lán)線(xiàn))后，完整的RBC(黑線(xiàn))不表現(xiàn)顯著的向更高熒光值漂移，而活化的RBC是以顯著更高的DDC結(jié)合為特征的，反映在峰漂移到更高的熒光值(紅線(xiàn))。X軸代表530nm下的熒光，Y軸代表RBC數(shù)。
圖4DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合；流式細(xì)胞測(cè)定分析暴露于膠原和凝血酶，使血小板活化。(a)顯示DDC與活化血小板選擇性結(jié)合的FACS斑點(diǎn)分析Y軸顯示530nm下的熒光強(qiáng)度，說(shuō)明DDC結(jié)合，X軸顯示前角光散射，這與細(xì)胞直徑有關(guān)。對(duì)照血小板如左欄所示，表現(xiàn)低水平的熒光，說(shuō)明缺少顯著的DDC結(jié)合。相形之下，用膠原和凝血酶活化的血小板(如右欄所示)表現(xiàn)明顯增加的熒光值，說(shuō)明大部分血小板被DDC標(biāo)記。每欄頂部矩形中的數(shù)字表示顯示熒光值增加的總體內(nèi)血小板的百分率。(b)顯示結(jié)果的FACS直方圖X軸顯示530nm下的熒光強(qiáng)度，Y軸顯示事件的次數(shù)；黑線(xiàn)代表未用DDC處理的對(duì)照血小板的熒光，紅線(xiàn)代表DDC染色的活化血小板。一旦活化，對(duì)照血小板的峰顯示向更高熒光值強(qiáng)烈漂移，反映了DDC與這些細(xì)胞的明顯的選擇性結(jié)合。
圖5用DDC體內(nèi)檢測(cè)肝細(xì)胞程序死亡按照Ogasawara等的模型，通過(guò)抗Fas抗體的靜脈內(nèi)給藥誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞程序死亡(Nature，364806-809，1993)。然后向抗Fas抗體處理的和對(duì)照未處理的動(dòng)物注射DDC(70mg/kg)。兩小時(shí)后，處死動(dòng)物，取出肝臟，冷凍。然后制備低溫切片，用于病理組織學(xué)分析，這是利用熒光顯微鏡檢查法進(jìn)行的(放大率X600)。(a)對(duì)照肝臟，(b)用抗Fas抗體處理的肝臟。箭頭指向經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡的肝細(xì)胞。
圖6用DDC體內(nèi)檢測(cè)腫瘤內(nèi)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞，與TUNEL來(lái)自體內(nèi)測(cè)定法對(duì)比向c57 black小鼠皮下注射D122(小細(xì)胞肺癌)細(xì)胞。腫瘤發(fā)育至2-3mm后，靜脈內(nèi)給以DDC(70mg/kg)。兩小時(shí)后，切下腫瘤，冷凍。然后制備低溫切片，利用熒光顯微鏡檢查法(放大率X600)進(jìn)行病理組織學(xué)分析。肉眼觀(guān)察到單一細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞是藍(lán)綠色熒光的細(xì)胞——圖6A。為了證明DDC與細(xì)胞結(jié)合與細(xì)胞程序死亡過(guò)程之間的聯(lián)系，也制備了低溫切片，用于來(lái)自體內(nèi)的細(xì)胞程序死亡評(píng)價(jià)，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口端標(biāo)記(TUNEL)染色，這是一種被普遍接受的用于檢測(cè)特征性細(xì)胞程序死亡DNA裂解的方法。觀(guān)察到DDC與腫瘤內(nèi)經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞特異性結(jié)合，與TUNEL染色對(duì)比——圖6B。
圖7用NST750體內(nèi)檢測(cè)化療法誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞程序死亡將Balb/c小鼠用紫杉醇(300mg/kg)與環(huán)磷酰胺(27mg/kg)的單一劑量組合處理。24小時(shí)后，向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射13mg/ml NST750。兩小時(shí)后處死動(dòng)物，對(duì)小腸組織進(jìn)行熒光病理組織學(xué)分析。通過(guò)NST750檢測(cè)，在化療法治療的小鼠小腸腺管中觀(guān)察到單一細(xì)胞程序死亡的上皮細(xì)胞(A)，但是在沒(méi)有化療法的小鼠組織中則不然(B)。
實(shí)施例實(shí)施例1DDL與活化紅細(xì)胞(RBC)的選擇性結(jié)合DDL與活化/損傷RBC的選擇性結(jié)合是這樣證明的，在Ca2+的存在下，用N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)與鈣離子載體A23187聯(lián)合處理，活化新鮮的RBC(Kuypers A.等，1996，Blood，871179-1187)。通過(guò)檢測(cè)膜結(jié)合后其固有的熒光強(qiáng)度，測(cè)量DDL的結(jié)合(激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm)。
將新鮮包裝的紅細(xì)胞用緩沖液A(143mM NaCl，2mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM NaH2PO4，Ph＝7.4)稀釋至最初體積的0.1，在上述緩沖液中洗滌4次。然后將細(xì)胞再懸浮在緩沖液B(55mM NaCl，90mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM hepes，Ph＝7.4)中。使用如上制備的細(xì)胞作為完整紅細(xì)胞對(duì)照。關(guān)于活化，將細(xì)胞用2mM CaCl2、5μM鈣離子載體A23187與5mM NEM的組合處理。在37℃下培育15-60分鐘。然后將細(xì)胞用含有0.1％BSA的緩沖液B洗滌兩次，最后再懸浮在含有2mMCaCl2的緩沖液B中。加入DDL，最終濃度為1μM，通過(guò)FACS分析進(jìn)行所結(jié)合的DDL評(píng)價(jià)。
如圖1所示，對(duì)照RBC不顯著結(jié)合DDL。相形之下，活化RBC表現(xiàn)明顯的DDL結(jié)合，實(shí)際上大多數(shù)細(xì)胞漂移至更高的熒光值(圖1)。
DDL因此表現(xiàn)與承受PNOM的RBC的選擇性結(jié)合，在本例中PNOM是通過(guò)細(xì)胞活化誘導(dǎo)的。
實(shí)施例2DDC與細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的選擇性結(jié)合使HeLa S3細(xì)胞(ATCC CCL-2.2)生長(zhǎng)在Dulbecco氏改性Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，培養(yǎng)基補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、12.5單位/ml制霉菌素或10％胎牛血清(FCS)。將細(xì)胞按5×106細(xì)胞/平板的密度接種在10cm3培養(yǎng)平板上，體積10ml，在誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡之前培育24小時(shí)。
細(xì)胞程序死亡是這樣誘導(dǎo)的，在低血清含量培養(yǎng)基(2％FCS)的存在下，用多巴胺(500μM)處理18小時(shí)，多巴胺是確證無(wú)疑的細(xì)胞程序死亡引發(fā)物(Lou J.等，J.Biol.Chem.1998，2733756-3764)。未處理的細(xì)胞充當(dāng)對(duì)照，供養(yǎng)在沒(méi)有多巴胺的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。處理后，用細(xì)胞刮器收獲細(xì)胞，穿過(guò)帶有18G針頭的注射器分離為單一的細(xì)胞，按106細(xì)胞/ml的密度再懸浮在pH＝7.4的PBS緩沖液中。
使培養(yǎng)物如上所述生長(zhǎng)，用HBS(HEPES緩沖鹽水10mMHEPES，150mM NaCl，pH＝7.4)洗滌兩次。通過(guò)檢測(cè)膜結(jié)合后化合物的固有熒光強(qiáng)度，測(cè)量DDC的結(jié)合(激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm)。關(guān)于所述結(jié)合的測(cè)量，將細(xì)胞用TBS(Tris緩沖鹽水10mMTris，pH 7.4，150mM NaCl)洗滌兩次。將DDC懸浮在pH＝7.4的0.1MNaPPi中，濃度1mM，然后將細(xì)胞用最終濃度100μM的DDC培育2-10分鐘，總體積為50μL。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡檢查。利用Olympus熒光顯微鏡(IX70型，激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm)進(jìn)行觀(guān)察。
在用細(xì)胞程序死亡引發(fā)物處理的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)中檢測(cè)到單一細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的強(qiáng)烈熒光(圖2B)。在細(xì)胞程序死亡培養(yǎng)物內(nèi)被DDC染色的這部分細(xì)胞是很多的。相形之下，未處理的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)物表現(xiàn)非常低的染色細(xì)胞部分，反映了培養(yǎng)物內(nèi)天然存在的細(xì)胞死亡過(guò)程(圖2A)。DDC通過(guò)其與PNOM膜的選擇性結(jié)合，因此表現(xiàn)與培養(yǎng)物中經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的選擇性結(jié)合。
實(shí)施例3DDC與活化紅細(xì)胞(RBC)的選擇性結(jié)合；流式細(xì)胞測(cè)定分析研究或證明了DDC與活化或損傷紅細(xì)胞(RBC)和對(duì)照健康RBC的選擇性結(jié)合。在Ca2+的存在下，用N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)和鈣離子載體聯(lián)合處理，誘導(dǎo)完整RBC的活化(Kuypers A.等，1996，Blood，87，1179-1187)。
得到新鮮的RBC，用緩沖液A(143mM NaCl，2mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM NaH2PO4，Ph＝7.4)稀釋至最初體積的0.1，在上述緩沖液中洗滌4次。然后將細(xì)胞再懸浮在緩沖液B(55mM NaCl，90mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM Hepes，pH＝7.4)中。然后使用這些細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞。關(guān)于活化，將細(xì)胞在37℃下用2mM CaCl2、5μM鈣離子載體A23187與5mM NEM的組合處理15-60分鐘。然后將細(xì)胞用含有0.1％牛血清白蛋白的緩沖液B洗滌兩次，最后再懸浮在含有2mMCaCl2的緩沖液B中。關(guān)于DDC與細(xì)胞結(jié)合的檢查，將DDC溶于0.1MNaPPi，pH＝7.4，儲(chǔ)備濃度為1mM。在50μM的最終濃度下進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，通過(guò)流式細(xì)胞測(cè)定法評(píng)價(jià)結(jié)合的水平。
如圖3所示，完整的紅細(xì)胞基本上不被DDC染色。不過(guò)，作為RBC活化的結(jié)果，全體細(xì)胞群經(jīng)歷向更高熒光水平的實(shí)質(zhì)性漂移，反映了DDC結(jié)合。因此，DDC表現(xiàn)與活化/損傷RBC的選擇性結(jié)合。
實(shí)施例4DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合利用流式細(xì)胞測(cè)定(FACS)分析測(cè)定DDC與活化血小板的選擇性結(jié)合。
從健康志愿者獲取富含血小板的血漿。將109新鮮血小板離心(5分鐘，380Xg)，洗滌，再懸浮在臺(tái)羅德氏緩沖液(137mM NaCl，2.8mMKCl，1mM MgCl2，12mM NaHCO3，0.4mM Na2HPO4，5.5mM D-葡萄糖，10mM Hepes pH 7.4，0.35％BSA)中。將純化后的血小板保存在冰上，充當(dāng)對(duì)照。
關(guān)于活化，在2mM CaCl2的存在下，將200μl洗滌后的血小板用0.05單位/ml凝血酶與5μg/ml膠原的混合物在37℃下培育5分鐘，最終體積為1ml。培育后，將血小板離心(2分鐘，104rpm)，再懸浮在1ml臺(tái)羅德氏緩沖液中。
將活化的和對(duì)照未處理的血小板用10μM DDC在室溫下培育5分鐘。然后使用Beckton-Dickinson細(xì)胞分類(lèi)器和CellQuest軟件，對(duì)血小板進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)定(FACS)分析。在360nm下激發(fā)，在530nm下測(cè)量發(fā)射。圖4A顯示活化后結(jié)合DDC的血小板部分。僅有小部分對(duì)照血小板表現(xiàn)DDC的結(jié)合(占總體的3.6％)，而血小板活化導(dǎo)致血小板總體的81％獲得明顯的DDC結(jié)合，反映為清楚地漂移至更高熒光強(qiáng)度。如圖4B的FACS直方圖所示，活化作用與全體血小板主要向更高熒光強(qiáng)度漂移有關(guān)。DDC通過(guò)其對(duì)PNOM的檢測(cè)，因此能夠充當(dāng)有效的藥物，標(biāo)志和區(qū)分活化的和未活化的血小板。
實(shí)施例5體內(nèi)DDC與細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的選擇性結(jié)合體內(nèi)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的選擇性檢測(cè)具有大量診斷性和治療性臨床應(yīng)用。為了證明DDC在完成這項(xiàng)任務(wù)中的潛力，采用由抗Fas抗體靜脈內(nèi)給藥誘導(dǎo)的體內(nèi)肝細(xì)胞程序死亡的成熟模型(OgasawaraJ.，等，Nature364806-809，1993)。用抗Fas單克隆激動(dòng)性抗體處理小鼠，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡，引起動(dòng)物在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。研究包括DDC向抗Fas抗體注射的小鼠以及對(duì)照未處理動(dòng)物的靜脈內(nèi)給藥。然后進(jìn)行熒光病理組織學(xué)研究，以評(píng)價(jià)DDC結(jié)合的水平。
向五周齡雄性BALB/c小鼠靜脈內(nèi)注射10μg/動(dòng)物的純化倉(cāng)鼠抗Fas單克隆抗體(Jo2，PharMingen，San Diego，CA)。然后向小鼠靜脈內(nèi)注射70mg/kg DDC。注射是在抗體處理后30分鐘進(jìn)行的。向?qū)φ談?dòng)物僅注射DDC，沒(méi)有抗體給藥。在抗體給藥后三小時(shí)處死全部動(dòng)物，然后取出器官。將肝臟橫向切片，穿過(guò)每葉中部，立即浸入液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃下達(dá)24小時(shí)。然后將器官轉(zhuǎn)移至OCT溶液中，制備低溫切片(5μm)。對(duì)這些切片進(jìn)行熒光顯微鏡檢查。將平行切片用蘇木精/曙紅(H&E)染色，同時(shí)評(píng)價(jià)表現(xiàn)DDC結(jié)合的細(xì)胞的特征性細(xì)胞程序死亡形態(tài)學(xué)。
用DDC注射的對(duì)照動(dòng)物肝切片不表現(xiàn)顯著的熒光，也就是說(shuō)觀(guān)察到?jīng)]有顯著的DDC結(jié)合(圖5A)。相形之下，在用抗Fas抗體處理的動(dòng)物肝臟中觀(guān)察到明顯的、DDC與大量細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的特異性結(jié)合(圖5B，箭頭標(biāo)示若干細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞)。與H&E染色比較，確認(rèn)了表現(xiàn)DDC結(jié)合的細(xì)胞的確具有特征性細(xì)胞程序死亡形態(tài)學(xué)。
這些實(shí)驗(yàn)因此證明DDC在全身給藥后體內(nèi)檢測(cè)和選擇性結(jié)合細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的潛力。
實(shí)施例6用DDC體內(nèi)檢測(cè)腫瘤內(nèi)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞原發(fā)性腫瘤的特征之一是存在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡，同時(shí)存在瘤性細(xì)胞的增殖?，F(xiàn)已清楚，原發(fā)性腫瘤內(nèi)增殖與細(xì)胞程序死亡之間的凈平衡是重要的預(yù)后因素和轉(zhuǎn)移瘤的預(yù)示(Naresh，K.Y.，等，Cancer，91578-594，2001)。非常普遍的細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞與更加惡性的腫瘤和更差的預(yù)后有關(guān)。因此，用以體內(nèi)評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)細(xì)胞程序死亡負(fù)荷的非侵入性診斷與預(yù)測(cè)工具在臨床腫瘤學(xué)中具有潛在的重要的應(yīng)用。
DDC因此用于檢測(cè)腫瘤內(nèi)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞。通過(guò)皮下注射0.5×106細(xì)胞/動(dòng)物的D122腫瘤細(xì)胞，在12周齡c57 black小鼠中誘發(fā)Lewis肺癌(3LL)的原發(fā)性腫瘤。如Eisenbach L，等供養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系(Int.J.Cancer，34.567-573，1984)。注射后兩周，當(dāng)觀(guān)察到2-3mm的腫瘤時(shí)，向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射70mg/kg DDC。兩小時(shí)后取出腫瘤，迅速冷凍在液氮中。然后制備低溫切片，利用熒光顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)分析(放大率X600)。
圖6A證明了DDC在全身給藥后體內(nèi)檢測(cè)腫瘤內(nèi)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞的能力。這類(lèi)檢測(cè)允許計(jì)算腫瘤的細(xì)胞程序死亡指數(shù)(AI)。為了證明利用DDC實(shí)現(xiàn)的這種指數(shù)的確反映腫瘤內(nèi)的細(xì)胞程序死亡負(fù)荷，使用TUNEL進(jìn)行平行染色，這是一種被充分接受的用于檢測(cè)特征性細(xì)胞程序死亡核小體間DNA裂解的方法(圖6B)。利用這兩種檢測(cè)方法，可以在腫瘤內(nèi)觀(guān)察到相似數(shù)量的細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞。DDC因此能夠體內(nèi)檢測(cè)腫瘤內(nèi)的細(xì)胞程序死亡負(fù)荷。它在全身靜脈內(nèi)給藥后體內(nèi)測(cè)量腫瘤AI的靈敏性類(lèi)似于TUNEL操作對(duì)來(lái)自體內(nèi)的組織切片的直接鑒定。
實(shí)施例7NST750檢測(cè)化療法誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞程序死亡在對(duì)癌癥患者施用化療法期間經(jīng)常觀(guān)察到胃腸損傷。具體而言，小腸腺管表現(xiàn)上皮細(xì)胞程序死亡，是對(duì)化療法和輻射的早期反應(yīng)(Keefe，D.M.K.，等，Gut，47632-637，2000)。因此評(píng)價(jià)了NST750化合物體內(nèi)檢測(cè)用單一劑量化療法處理的健康小鼠小腸細(xì)胞程序死亡過(guò)程的能力。
向12周齡Balb/c小鼠或瑞士小鼠靜脈內(nèi)給以紫杉醇(300mg/kg)與環(huán)磷酰胺(27mg/kg)的單一劑量組合。不接受化療法的動(dòng)物充當(dāng)對(duì)照。24小時(shí)后，向全部動(dòng)物靜脈內(nèi)注射13mg/kg的NST750。兩小時(shí)后處死動(dòng)物，將小腸冷凍，制備低溫切片，用于熒光顯微鏡檢查。
在化療法處理的小鼠小腸腺管中檢測(cè)到強(qiáng)烈結(jié)合NST750的大量細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞(圖7A)。相形之下，在對(duì)照未處理的動(dòng)物中觀(guān)察到?jīng)]有顯著的NST750染色(圖7B)。NST750因此表現(xiàn)對(duì)化療法誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞程序死亡的選擇性結(jié)合和檢測(cè)。這為這種化療副作用的早期與靈敏監(jiān)測(cè)提供了工具(單一劑量抗癌治療后僅24小時(shí))。NST750的這種活性因此可以在抗癌治療的優(yōu)化中具有重要的臨床應(yīng)用。
實(shí)施例8NST750的合成按照下列流程合成NST750 在二異丙基乙胺(DIPEA)的存在下，使L-天冬酰胺與芐酯基(Z)氯反應(yīng)，收率63％。將Z-保護(hù)的天冬酰胺2(50g)在500mL二甲基甲酰胺(DMF)/100mL水混合物中冷卻至0℃，一次性用85g雙-三氟乙酰氧基碘苯處理。在0℃下攪拌10分鐘后，歷時(shí)15分鐘向反應(yīng)滴加31mL吡啶。將溶液在RT下攪拌過(guò)夜。在45℃真空中濃縮反應(yīng)，將所得油溶于500mL水與200mL乙醇的混合物。用吡啶調(diào)節(jié)溶液的pH至5.0，通過(guò)真空過(guò)濾收集所得大量沉淀。將固體用200mL二氯甲烷洗滌，在40℃真空中干燥，得到3(31g)，收率70％。將Z-保護(hù)的衍生物3(31g)轉(zhuǎn)化為中間體4，收率80％。類(lèi)似地，在二氮雜二環(huán)十一碳烯(BDU)的存在下應(yīng)用碘代甲烷，幾乎定量地得到甲基酯5。通過(guò)氫化作用除去Z-保護(hù)基團(tuán)后得到2-氨基-4-Boc氨基甲基丁酸酯(6)。
在氮下，向預(yù)形成的甲醇與乙酰氯的溶液加入異絲氨酸11?；亓?小時(shí)后，判斷反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物濃縮至干，將所得油溶于甲醇/二噁烷混合物，用DIPEA處理，然后加入丁氧羰基(Boc)-酸酐。通常的操作后，粗反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)快速柱色譜純化，使用30％EtOAc/庚烷作為洗脫劑，得到13，收率95％。然后使用Dess Martin試劑氧化化合物13，得到2-酮基-4-Boc氨基甲基丁酸酯7a，收率60％。
在1.3-1.5當(dāng)量胺6、乙酸和硫酸鎂的存在下，在40℃下進(jìn)行酮基酯7a的還原性偶聯(lián)。隨后氫化(披鈀碳，50psi，12小時(shí))，得到8，為非對(duì)映體的混合物(收率53％)。
化合物8(0.25g)是非對(duì)映體的混合物，在RT下使用2N NaOH的二噁烷溶液水解甲基酯達(dá)2小時(shí)。將反應(yīng)混合物進(jìn)一步濃縮至干，得到0.4g白色固體。將對(duì)應(yīng)的固體懸浮在6mL二噁烷中，用5mL 2MHCl/乙醚溶液處理。然后濃縮反應(yīng)，將殘余物溶于水/二噁烷，用DIPEA調(diào)節(jié)pH至9.2。將所得溶液用丹磺酰氯(2eq.)溶液處理，同時(shí)保持反應(yīng)的pH在9.2左右。完成后，將反應(yīng)用水(10mL)稀釋?zhuān)靡颐严礈?。棄去醚層，含水層用乙酸乙酯回收，?M HCl酸化至pH 4.0。將有機(jī)層用鹽水洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥。濃縮至干后，分離到160mg亮黃色固體。使固體從甲醇/乙醚混合物中結(jié)晶，得到100mg黃色固體亞氨基-雙2-(3-丹磺酰氨基)-丙酸(NST750)。1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ8.58(bm，2H)，8.4-8.2(b，4H)，7.6(b，4H)，7.25(b，2H)3.5-3.0(b，4H)，2.9(s，12H)，1.4(m，2H).MS(ESI)658.2(M+H).
實(shí)施例9NST740的合成按照下列流程合成NST740 使用雙-三氟乙酰氧基碘苯，將芐酯基(cbz)-D-天冬酰胺1轉(zhuǎn)化為2-cbz保護(hù)的2，3-二氨基丙酸2，收率非常良好。使2(7.2g)在乙酰氯與甲醇的溶液中回流，得到定量收率的甲基酯鹽酸鹽。將該鹽進(jìn)一步懸浮在無(wú)水二氯甲烷中，用2.5當(dāng)量三乙胺處理。一旦得到澄清溶液，將所得溶液用丹磺酰氯溶液處理。在RT下攪拌過(guò)夜后，反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物用100mL二氯甲烷(DCM)稀釋?zhuān)B續(xù)用含水飽和碳酸氫鈉(2×100mL)、水(100mL)和鹽水洗滌。將所得有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，濃縮至干。所得油經(jīng)過(guò)硅膠色譜純化(10％EtOAc/CHCl3)，得到3，收率72％。將一部分該原料(3.5g)在四氫呋喃(THF)/MeOH混合物中水解，普通的操作后得到3.4g的4，為亮黃色固體。同時(shí)，將5.6g的3除去氨基甲酸芐基酯，得到氨基酯5，收率良好。將4(0.5g)用1當(dāng)量二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)處理5小時(shí)，導(dǎo)致完全轉(zhuǎn)化為所需的NHS酯，收率83％。將該酯進(jìn)一步溶于無(wú)水THF，用等摩爾量5處理。6小時(shí)后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋?zhuān)蔑柡蚇H4Cl洗滌，除去NHS副產(chǎn)物。有機(jī)層進(jìn)一步經(jīng)硫酸鎂干燥，濃縮至干，得到0.8g二肽6，收率77％，HPLC分析純度＞95％。隨后在氫氧化鈉的二噁烷溶液中水解甲基酯，以通常的方式(H2/Pd)除去芐酯基保護(hù)基團(tuán)，得到2-(3-丹磺酰氨基-2-氨基丙酰氨基)-3-丹磺酰氨基丙酸(NST740)。1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ8.53(dd，2H，J＝8.5，8.6 Hz)，8.34(d，J＝8.67 Hz，1H)，8.24(dd，J＝8.6，7.3 Hz，2H)，8.12(d，7.32 Hz，1H)，7.5(m，4H)，7.26(d，J＝7.56 Hz，1H)，7.19(d，J＝6.98 Hz，1H)，4.18(t，J＝4.34 Hz，1H)，3.65(t，J＝3.45 Hz，1H)，3.2(m，4H)，2.85(s，12H).MS(ESI)657.16(M+H).
實(shí)施例10NST751的合成按照下列流程合成NST751 在甲苯中回流4-環(huán)己烯-1，2-二羧酸酐1(30g)與催化量的硫酸以及10當(dāng)量異丙醇。在回流下攪拌6小時(shí)后，分離到30g二異丙基-4-環(huán)己烯-1，2-琥珀酸酯2。將化合物2(7g)用四氧化鋨、再用乙酸鉛進(jìn)行氧化性裂解。普通的操作之后，得到7g二異丙基雙-1，2-(2-乙醛)間琥珀酸酯3，直接用于下一步。將化合物3(6.8g)溶于乙醇，用1當(dāng)量硼氫化鈉處理。在0℃下攪拌1小時(shí)后，反應(yīng)完全(Rf30.4，Rf40.1∶40％EtOAc/庚烷)，小心地加入1M HCl猝滅反應(yīng)。在真空中除去有機(jī)層，含水層用乙酸乙酯萃取。經(jīng)硫酸鎂干燥和在真空中濃縮后，得到二異丙基雙-1，2-(2-乙醇)間琥珀酸酯4(6.8g)，收率90％。1H NMR 1.3 ppm(14H，異丙基酯)，3.6ppm(4H，羥甲基)將二醇4(6.8g)溶于無(wú)水二氯甲烷，用3當(dāng)量三乙胺處理，然后在0℃下緩慢加入2當(dāng)量甲磺酰氯達(dá)兩小時(shí)。加入飽和氯化銨溶液猝滅反應(yīng)混合物，收集有機(jī)層，用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾。濃縮濾液至干，然后硅膠色譜純化，得到二異丙基雙-1，2-(2-甲磺?；一?間琥珀酸酯5(4g)，收率55％。
在40℃下，將雙甲磺酸酯5用疊氮化鈉的二甲基甲酰胺(DMF)溶液處理3小時(shí)。通常的操作之后，分離到二異丙基雙-1，2-(2-疊氮乙基)間琥珀酸酯6，收率93％。將化合物6(2.1g)溶于乙醇/水(3∶1)混合物，在30℃下用氫氧化鈉(2eq)處理過(guò)夜。將反應(yīng)用水稀釋?zhuān)谡婵罩谐ゴ罅恳掖?，含水層用乙醚洗滌。將含水層用乙酸乙?100mL)回收，用3M HCl酸化至pH 2.5。在真空中濃縮后，得到1.5g二元酸。將所得疊氮基酸溶于乙醇/2M NaOH(10∶1)混合物，在50psi氫下經(jīng)過(guò)披鈀碳?xì)浠瘍尚r(shí)。完全轉(zhuǎn)化為二胺，反應(yīng)混合物經(jīng)C鹽過(guò)濾，濃縮濾液至干，得到1.5g粘性固體，隨后與丹磺酰氯反應(yīng)，得到雙-1，2-(丹磺?；?3-氨基乙基)間琥珀酸(NST751)。1H NMR(300 MHz，CD3OD)，δ8.50(d，J＝8.6 Hz，2H)，8.35(d，J＝8.8 Hz，2H)，8.15(t，J＝4.5 Hz，2H)，7.51(m，4H)，7.19(d，J＝8.3 Hz，2H)，2.87(s，12H)，2.75(m，4H)，2.3(m，1H)，2.2(m，1H)，1.5(m，2H)，1.29(m，2H).MS(ESI)671.0(M+H).
權(quán)利要求
1.擾亂膜結(jié)合性化合物(PMBC)在藥物制備中的用途，該藥物用于與經(jīng)歷其正常膜組織化擾亂的細(xì)胞選擇性結(jié)合，所述PMBC具有式Ce，其中e選自1、2和3，C是具有式(I)的基團(tuán) 包括式(I)結(jié)構(gòu)的藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中所述C基團(tuán)可以各自是相同或不同的；Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基或這類(lèi)基團(tuán)的組合構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5-10個(gè)原子組成；X代表CH、CH2、N、NH、O或S；n、m、r和p各自獨(dú)立地是0或1；其中n+r＝1；m+p＝1；R1可以各自是相同或不同的，獨(dú)立地選自由A和L-A組成的組，其中L可以各自是相同或不同的，獨(dú)立地選自由D、U、U-D、D-U、D-U-O、O-U-D、D-U-NH、NH-U-D、D-U-D和U-D-U組成的組；U代表氫或者選自可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基、C3-C6亞環(huán)烷基、亞環(huán)烯基、芳基、亞雜環(huán)烷基、亞雜環(huán)烯基、雜芳基和所述基團(tuán)的任意組合；D選自由O、S、SO、SO2、SO2NH、NHSO2、NH、PO、PO2、POOH、PO(NH)2、NHPOOH、CO、C(O)O、NHCO、CONH、SO2NHCHCOOH、SO2NHCO或當(dāng)D是二價(jià)原子團(tuán)時(shí)上述列表的對(duì)應(yīng)含義組成的組；A可以各自是相同或不同的，當(dāng)e是1時(shí)，A是在pH約7下帶電的部分；或者當(dāng)e是2或3時(shí)，A獨(dú)立地選自極性不帶電部分和在pH約7下帶電的部分，所述帶電部分是帶正電的、帶負(fù)電的或兩性離子形式；R2是WR3b，其中W缺無(wú)或者選自由仲或叔胺、氧、硫、碳和D組成的組，其中D是如上所定義的；R3代表氫或C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C8支鏈烷基、C3-C8支鏈烯基；R3部分可以是相同或不同的；b是1、2或3；當(dāng)e是2或3時(shí)，C基團(tuán)是彼此直接或者通過(guò)L部分連接的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述Ce結(jié)構(gòu)的PMBC中的e是2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中在所述PMBC中，Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5或6個(gè)原子組成；U代表可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基和所述基團(tuán)的任意組合；R2由WR3b組成，其中W缺無(wú)或者選自由仲或叔胺、氧和硫組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的用途，其中在所述PMBC中，b是2，R3獨(dú)立地選自下列組合(a)甲基，(b)丁基，(c)已基，(d)丁基與甲基，(e)己基與甲基的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的、如權(quán)利要求1或2所定義的Ce結(jié)構(gòu)PMBC的用途，其中C具有式(II) 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的、如權(quán)利要求3所定義的Ce結(jié)構(gòu)PMBC的用途，其中C具有式(II)，包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的、如權(quán)利要求4所定義的Ce結(jié)構(gòu)PMBC的用途，其中C具有式(II)，包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
8.Ce結(jié)構(gòu)的化合物，其中C是如權(quán)利要求1所定義的，e是1，其條件是L不是-(CH2)5-。
9.Ce結(jié)構(gòu)的化合物，其中C是如權(quán)利要求1所定義的，e是2，C基團(tuán)是彼此直接或者通過(guò)L部分連接的，其中L具有與權(quán)利要求1定義相同的含義，下列化合物除外N2，N6-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-賴(lài)氨酸；N，N’-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-胱氨酸；N，O-雙[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺?；鵠-L-酪氨酸；和N，N”-雙[[2-(5-(二甲氨基)萘-1-磺?；?氨基乙基]氨基甲酰基甲基]二亞乙基三胺-N，N’，N-三乙酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的化合物，其中Z代表由環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基構(gòu)成的環(huán)系，所述環(huán)系由5或6個(gè)原子組成；U代表可選被取代的C1-C6亞烷基、C2-C6亞烯基、C3-C6支鏈亞烷基、C3-C6支鏈亞烯基和所述基團(tuán)的任意組合；R2由WR3b組成，其中W缺無(wú)或者選自由仲或叔胺、氧和硫組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任意一項(xiàng)的化合物，其中b是2，R3獨(dú)立地選自下列組合(a)甲基，(b)丁基，(c)己基，(d)丁基與甲基，(e)己基與甲基的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的Ce結(jié)構(gòu)化合物，其中e是1，C具有式(II) 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p具有與權(quán)利要求1定義相同的含義，其條件是L不是-(CH2)5-。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的Ce結(jié)構(gòu)化合物，其中e是2，C具有式(II) 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中C具有式(II)，包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中C具有式(II)，包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15任意一項(xiàng)的化合物，其中C具有式(II)，其中萘基的一個(gè)環(huán)與選自結(jié)構(gòu)-SO2-(NH)-(CH2)v-A和-SO2-O-(CH2)v-A的單元連接，其中v代表整數(shù)1；該萘基的第二個(gè)環(huán)與單烷基或二烷基氨基連接；A是由氨基和/或酸性基團(tuán)構(gòu)成的帶電基團(tuán)，其中酸性基團(tuán)選自羧酸、磷酸、磷酸鹽、磺酸和硫酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求8或9的Ce結(jié)構(gòu)化合物，其中C具有下式(III) 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中A是由氨基和/或羧酸基團(tuán)構(gòu)成的帶電基團(tuán)，至少一個(gè)R3是C1-C6烷基，L是-SO2-(NH)-(CH2)v單元，其中v代表整數(shù)1-5。
18.根據(jù)權(quán)利要求8的式(IV)化合物 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)的用途，其中在所述PMBC中，當(dāng)e＞1時(shí)，C基團(tuán)是彼此直接或者通過(guò)L部分連接的，其中L具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
20.根據(jù)權(quán)利要求9-17任意一項(xiàng)的化合物，其中當(dāng)e＞1時(shí)，C基團(tuán)是彼此直接或者通過(guò)L部分連接的，其中L具有與權(quán)利要求1定義相同的含義。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的、下列通式(V)PMBC的用途 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中G1、G2、G3和G4可以是相同或不同的，獨(dú)立地選自氫、COOH、C(O)NH2、NH2和-N+(CH3)3；M選自缺無(wú)、C(O)NH、NH、O、S、S-S、CH2、(CH2)2、NH-(CH2)2NH、N(CH2)kCOOH和N+(CH3)(CH2)kCOOH；Q1、Q2、Q3和Q4可以是相同或不同的，獨(dú)立地選自缺無(wú)或(CH2)k；k是整數(shù)1-6；R3代表氫或C1-C6烷基。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的式(V)化合物，其中M、G1、G2、G3、G4、Q1、Q2、Q3、Q4、k和R3是如權(quán)利要求21所定義的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(VI)化合物 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(VII)化合物 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R3具有與權(quán)利要求1定義相同的含義，y代表整數(shù)2-6，z代表整數(shù)1-6，T選自缺無(wú)、氫和甲基。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的化合物，其中R3選自甲基、丁基和己基，y是2或3，z是1、2或3。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(VIII)化合物 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的下式(IX)化合物 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R3代表氫或甲基。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的式(X)PMBC的用途 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求21的式(XI)PMBC的用途 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求19的式(XII)PMBC的用途 包括其藥學(xué)上可接受的鹽和水合物，其中R3獨(dú)立地選自甲基、丁基和己基。
31.如權(quán)利要求1所定義的PMBC或根據(jù)權(quán)利要求8或9的化合物的用途，它們是直接或者通過(guò)連接基團(tuán)Y與選自固體載體、成像標(biāo)志和藥物的成員連接的。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，包含連接所述PMBC或化合物與固體載體，用于制造藥物，該藥物用于廓清具有擾亂膜的循環(huán)細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的體液。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，包含連接所述PMBC或化合物與成像標(biāo)志，用于制造藥物，該藥物用于檢測(cè)生物細(xì)胞中的擾亂膜。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中該標(biāo)志用于熒光、X-射線(xiàn)、CT掃描、MRI、放射性同位素掃描或PET掃描的檢測(cè)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中該標(biāo)志選自金屬離子用于放射性同位素掃描的Tc-99m和In-111，用于MRI的Gd。
36.根據(jù)權(quán)利要求31、33-35任意一項(xiàng)的用途，其中Y連接基團(tuán)包含金屬螯合基團(tuán)，用于螯合可檢測(cè)的標(biāo)記；所述螯合基團(tuán)選自任意下列結(jié)構(gòu) 其中所述螯合基團(tuán)經(jīng)由其氨基之一與化合物連接。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其中所述Y連接基團(tuán)包含如權(quán)利要求1所定義的L單元。
38.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，包含連接所述PMBC或化合物與藥物，用于制造藥物，該藥物用于治療以細(xì)胞、組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)擾亂膜的存在為特征的疾病。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的用途，其中該藥物選自細(xì)胞程序死亡抑制劑、細(xì)胞毒劑、抗血小板劑、抗凝劑、纖維蛋白溶解劑、抗炎藥和免疫調(diào)節(jié)藥。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的用途，其中該藥物選自天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、抗癌劑、抗凝劑、抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑(tPA)或凝血因子抑制劑，例如凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑。
41.檢測(cè)生物細(xì)胞中擾亂膜(PM)的方法，該方法包含(i)使細(xì)胞與如權(quán)利要求1所定義的式(I)PMBC接觸；(ii)檢測(cè)與所述細(xì)胞結(jié)合的PMBC的存在；顯著量所結(jié)合的化合物的存在說(shuō)明在細(xì)胞中存在PM。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測(cè)經(jīng)歷死亡過(guò)程的細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，用于檢測(cè)經(jīng)歷細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測(cè)促凝血粒子，選自活化的血小板、血小板派生的微粒和細(xì)胞程序死亡的尸體。
45.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測(cè)活化的炎性細(xì)胞，選自活化的白細(xì)胞和活化的組織巨噬細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測(cè)疾病，選自以過(guò)度細(xì)胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾病；變性障礙、神經(jīng)變性障礙、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細(xì)胞丟失；表現(xiàn)為過(guò)度凝血的疾??；動(dòng)脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞、心肌梗塞、腦中風(fēng)、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、鐮刀細(xì)胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；炎癥和/或與免疫介導(dǎo)的病因?qū)W或發(fā)病機(jī)理有關(guān)的疾??；自體免疫障礙、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織障礙，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病；甲狀腺炎；皮膚病學(xué)障礙、天皰瘡、結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學(xué)障礙；自體免疫性神經(jīng)病學(xué)障礙、重癥肌無(wú)力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙、潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎。
47.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，用于檢測(cè)不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑。
49.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于檢測(cè)腫瘤內(nèi)的細(xì)胞程序死亡、監(jiān)測(cè)腫瘤的侵襲或者檢測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移。
50.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)抗癌治療的響應(yīng)，選自化療法和放療法。
51.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測(cè)抗癌治療的副作用，它們是由于誘導(dǎo)事與愿違的正常細(xì)胞程序死亡而引起的。
52.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測(cè)移植器官在移植術(shù)后的存活。
53.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，用于監(jiān)測(cè)以過(guò)度細(xì)胞程序死亡為特征的疾病中對(duì)細(xì)胞保護(hù)療法的響應(yīng)。
54.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求8或9的化合物作為活性成分，和藥學(xué)上可接受的載體。
55.用于檢測(cè)生物細(xì)胞中擾亂膜的藥物組合物，該組合物包含如權(quán)利要求1所定義的PMBC作為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的藥物組合物，其中該活性成分一種標(biāo)志結(jié)合，該標(biāo)志用于熒光、X-射線(xiàn)、CT掃描、MRI、放射性同位素掃描或PET掃描的檢測(cè)。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的藥物組合物，其中該標(biāo)志選自金屬離子用于放射性同位素掃描的Tc-99m和In-111，用于MRI的Gd。
58.用于治療疾病的藥物組合物，該疾病是以細(xì)胞、組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)中擾亂膜的存在為特征的，該組合物包含藥學(xué)上可接受的載體和有效量的活性成分，所述活性成分包含由如權(quán)利要求1所定義的PMBC和醫(yī)用藥物構(gòu)成的藥物-綴合物。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述藥物選自天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑、Bcl-2系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、細(xì)胞毒劑、抗凝劑、抗血小板劑、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑、組織纖溶酶原激活劑、抗炎藥或免疫調(diào)節(jié)藥。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的藥物組合物，其中該藥物是凝血因子抑制劑。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的藥物組合物，其中該藥物是凝血酶抑制劑或Xa因子抑制劑。
62.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，用于檢測(cè)、預(yù)防或治療疾病，選自以過(guò)度細(xì)胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾病；變性障礙、神經(jīng)變性障礙、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細(xì)胞丟失；表現(xiàn)為過(guò)度凝血的疾??；動(dòng)脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞、心肌梗塞、腦中風(fēng)、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、鐮刀細(xì)胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；炎癥和/或與免疫介導(dǎo)的病因?qū)W或發(fā)病機(jī)理有關(guān)的疾?。蛔泽w免疫障礙、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織障礙，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病；甲狀腺炎；皮膚病學(xué)障礙、天皰瘡、結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學(xué)障礙；自體免疫性神經(jīng)病學(xué)障礙、重癥肌無(wú)力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙、潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎；動(dòng)脈粥樣硬化斑；不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑。
63.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述PMBC或化合物被固定在涂有樹(shù)脂的珠粒上。
64.用于廓清體液中的具有擾亂膜的循環(huán)細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過(guò)濾裝置，包含被固定的權(quán)利要求32的PMBC或化合物、流體入口和流體出口。
65.用于廓清血液中的具有擾亂膜的循環(huán)細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的體外循環(huán)儀器，包含權(quán)利要求64的過(guò)濾裝置。
66.從體液中除去含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)的方法，該方法包含使體液與固定在固體載體上的、如權(quán)利要求1所定義的PMBC或如權(quán)利要求8或9所定義的化合物接觸，接觸的條件和時(shí)間足以使含有PM的細(xì)胞或含有PM的結(jié)構(gòu)與被固定的化合物結(jié)合，由此從體液中除去至少一部分所述含有PM的細(xì)胞或粒子。
67.治療或預(yù)防疾病的方法，該疾病選自以過(guò)度細(xì)胞程序死亡的發(fā)生為特征的疾??；變性障礙、神經(jīng)變性障礙、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、AIDS、脊髓發(fā)育不良綜合征、缺血或毒性發(fā)作、移植排斥期間移植細(xì)胞丟失；表現(xiàn)為過(guò)度凝血的疾?。粍?dòng)脈或靜脈血栓形成、血栓栓塞、心肌梗塞、腦中風(fēng)、深靜脈血栓、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(TTP)、鐮刀細(xì)胞疾病、地中海貧血、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；炎癥和/或與免疫介導(dǎo)的病因?qū)W或發(fā)病機(jī)理有關(guān)的疾?。蛔泽w免疫障礙、抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織障礙，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮??；甲狀腺炎；皮膚病學(xué)障礙、天皰瘡、結(jié)節(jié)性紅斑；自體免疫性血液病學(xué)障礙；自體免疫性神經(jīng)病學(xué)障礙、重癥肌無(wú)力；多發(fā)性硬化；炎性腸障礙、潰瘍性結(jié)腸炎；結(jié)節(jié)性脈管炎；動(dòng)脈粥樣硬化斑；不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑；所述方法包含對(duì)需要這樣一種治療的受治療者給以治療有效量的如權(quán)利要求1所定義的PMBC，所述PMBC包含藥物或者與藥物結(jié)合，以構(gòu)成根據(jù)權(quán)利要求38的藥物綴合物，從而定向醫(yī)用藥物于患有疾病的細(xì)胞或組織。
68.治療癌癥的方法，包含對(duì)需要這樣一種治療的受治療者給以治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求38的PMBC-藥物綴合物，其中與PMBC結(jié)合或者包含在PMBC內(nèi)的藥物是細(xì)胞毒劑。
69.治療癌癥的方法，該方法包含(i)對(duì)需要這樣一種治療的受治療者給以化療法和/或放療法，所述療法致力于增強(qiáng)腫瘤內(nèi)的內(nèi)在細(xì)胞程序死亡負(fù)荷，隨后(ii)對(duì)所述受治療者給以治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求38的PMBC-藥物綴合物，其中與PMBC結(jié)合或者包含在PMBC內(nèi)的藥物是細(xì)胞毒劑。
70.如權(quán)利要求8-18、20和22-27任意一項(xiàng)所定義的化合物在藥劑制備中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供化合物的用途，這些化合物與經(jīng)歷其正常膜組織化擾亂與改變的細(xì)胞選擇性結(jié)合，而與具有正常組織化膜的細(xì)胞結(jié)合的程度則低得多。這些化合物被稱(chēng)為擾亂膜結(jié)合性化合物(PMBC)。PMBC類(lèi)化合物包括新化合物和已知化合物。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1484526SQ01821435
公開(kāi)日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月6日
發(fā)明者I·齊夫, A·舍范, S·埃伯納, , I 齊夫 申請(qǐng)人:Nst神經(jīng)存活技術(shù)有限公司