專利名稱：含有類維生素a增效劑的穩(wěn)定的皮膚調(diào)節(jié)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含特定化合物的穩(wěn)定的皮膚調(diào)節(jié)組合物，該化合物可以增強(qiáng)類維生素A的效果。
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)廣泛地應(yīng)用天然和人造維生素A衍生物作為修復(fù)或者再生皮膚的試劑來治療各種皮膚病。視黃酸已經(jīng)被應(yīng)用于治療各種皮膚病癥，例如痤瘡、皺紋、牛皮癬、老年斑和變色。參見Vahlquist，A.等的J.Invest.Dermatol.，Vol.94，Holland D.B.和Cunliffe，W.J.(1990)，第496-498頁；Ellis，C.N.等，＂Pharmacology ofRetinolsin Skin，＂Basel，Karger，Vol.3，(1989)，第249-252頁；Lowe，N.J.等，＂Pharmacology of Retinols in Skin，＂Vol.3(1989)，第240-248頁；和PCT專利申請WO93/19743。
人們普遍相信視黃醇或者視黃醇的短鏈酯的用途比視黃酸優(yōu)異。視黃醇是在人體自然存在的內(nèi)源化合物，對于正常上皮細(xì)胞分化是必不可少的。視黃醇的短鏈酯在體內(nèi)水解會生成視黃醇。人們認(rèn)為使用視黃醇和視黃酯比視黃酸更安全。然而，視黃醇和視黃酯比視黃酸更不穩(wěn)定。參見Idson，＂Vitamins and the Skin，＂Cosmetics &Toiletties，Vol.108，1993年12月，第79-94頁，AlluredPublishing Corp.(1993)；Hoffman-La Roche公司的數(shù)據(jù)表＂Vitamin A--The′Normalizer，″′Roche Vitamins & Fine Chemicals；Hoffman-La Roche公司的產(chǎn)品數(shù)據(jù)＂Vitamin A Alcohol Blend.＂。特別是當(dāng)存在水時它們迅速降解。
現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開了一些能穩(wěn)定一定類型的類維生素A配方的方法。例如，授予Nogueira(以后稱為＂Nogueira＂)等的美國專利6,113,928公開了含有13-反視黃醛的穩(wěn)定的非醇美容組合物，其為水包油型乳液，其中脂肪相組分具有不大于約5的過氧化值，其中脂肪相包括10-15％重量比的癸酸/辛酸甘油酯和0.02-0.5％重量比的抗氧化劑BHT，還公開了制備組合物的方法。
授予Habif等(以下稱為＂Habif＂)的美國專利5,744,148公開了在油相中含類維生素A的水包油乳液。在該發(fā)明的乳液中，類維生素A是穩(wěn)定的，盡管存在大約50％到大約98％的水相，方法是采用特定的油相形成含溶解的不穩(wěn)定類維生素A的油珠，并且通過選擇固體組分的組合來形成用于油珠的特定晶體大小的阻擋層。然而，晶體篩選和阻擋層的形成難以實(shí)現(xiàn)。
授予Wilmott等(以下稱為＂Wilmott＂)的美國專利4,826,828公開了利用揮發(fā)性的硅氧烷和乙醇來制備含視黃醇的組合物。在使用之前將制備液進(jìn)行稀釋，形成水/油乳液。然而該配方儲存后不令人滿意，并且水/油乳液不適合于局部施用。
在上文論述的現(xiàn)有技術(shù)中沒有公開通過控制乳液特征，在水包油型乳液中穩(wěn)定類維生素A，同時又加強(qiáng)類維生素A活性，具有雙重作用的有效方法。
因此，一直需要一種皮膚護(hù)理組合物，它既能夠改善視黃醇的穩(wěn)定性又能夠增加視黃醇的作用效果。
本發(fā)明涉及一種水包油型皮膚調(diào)節(jié)乳液組合物，包括(a)大約0.001到大約10重量％的增效劑化合物；(b)大約0.001到大約10重量％的類維生素A；和(c)美容可接受的載體，其中水包油乳液中油相各成分的過氧化值小于或等于大約12。
除在實(shí)施例和對比實(shí)施例中之外，或者另外明確指明，說明書中所有表示物質(zhì)含量或比例、或反應(yīng)條件、物質(zhì)的物理性能和/或用途的數(shù)值應(yīng)理解為用“約”來修飾。除非另作說明，水包油型乳液的所有量都按重量計算。
在這里使用的術(shù)語＂皮膚＂包括面部、頸、胸、背部、手臂、手、腿和頭皮的皮膚。
除非另作說明，水包油型乳液的所有量都按重量計算。
本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)某些化合物抑制ARAT/LRAT、視黃醛還原酶、CRABPII和視黃酸氧化(后者由細(xì)胞色素P450體系催化)，而某些其它化合物增強(qiáng)視黃醇脫氫酶。相信類維生素A按照表1所述的機(jī)理在皮膚中通過酶作用而轉(zhuǎn)化為視黃酸。
視黃醇在表皮中的代謝酶作用
ARAT/LRAT＝?；o酶A(CoA)視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶/卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶CRABPII＝細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白II這些化合物在本文中總體命名為“增效劑”并且編號為組B1-B5，如上述表1中所示。單獨(dú)或者彼此之間組合使用的增效劑通過增加用于轉(zhuǎn)化為視黃酸的視黃醇的量并抑制視黃酸的降解而加強(qiáng)了類維生素A的作用。增效劑與類維生素A(例如視黃醇、視黃基酯、視黃醛、視黃酸)聯(lián)合作用，后者原生存在于皮膚中。但是優(yōu)選的組合物在其中包括類維生素A與增效劑共同存在以使性能最優(yōu)化。
本發(fā)明部分包括一種皮膚調(diào)節(jié)組合物，按組合物重量計，它含有大約0.0001％到大約50％，優(yōu)選0.001％到10％，最優(yōu)選0.001％到5％的至少一種增效劑化合物，其中在體外轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗中，當(dāng)化合物或者化合物組合的混合濃度為10mM時，抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶達(dá)到50％以上。本發(fā)明的組合物也包括在水包油乳液中的類維生素A和美容可接受的載體，其中油相的過氧化值(POV)小于12。
本發(fā)明組合物中包括的增效劑選自(a)雙增效劑，其中兩者都選自相同的B2；B3；B4；(b)增效劑的二元組合，選自B1/B2、B1/B3、B1/B4、B1/B5、B2/B3、B2/B4、B2/B5、B3/B4、B3/B5、B4/B5；(c)增效劑的三元組合，選自B1/B2/B3、B1/B2/B4、B1/B2/B5、B1/B3/B4、B1/B3/B5、B1/B4/B5、B2/B3/B4、B2/B3/B5、B2/B4/B5、B3/B4/B5；
(d)增效劑的四元組合，選自1B1/B2/B3/B4、B1/B2/B3/B5、B1/B2/B4/B5、B1/B3/B4/B5、B2/B3/B4/B5和(e)五組增效劑的組合B1/B2/B3/B4/B5。
優(yōu)選的組合物包括至少一種來自不同組的增效劑(即上述組(b)-(e))。
包括在本發(fā)明中作為增效劑的化合物首先基于下列原則選擇這些化合物以表A中所列的某種濃度經(jīng)過下文2.1-2.7部分所述的特定酶的體外Microsomal試驗的能力。化合物(單獨(dú)或與另一種增效劑組合)隨后進(jìn)行下述的體外轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗，單獨(dú)或組合濃度為10mM。如果這種組合抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶到超過50％，那么它就適用于本發(fā)明。如果單獨(dú)測試一種增效劑，并經(jīng)過轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗，那么它可以與另一種經(jīng)過轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗的增效劑或增效劑組合進(jìn)行組合。
本發(fā)明優(yōu)選的組合物含有至少一種單獨(dú)濃度為10mM時抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶到超過50％的增效劑或增效劑的組合。
如本文所使用的術(shù)語“護(hù)理”是指預(yù)防和治療干燥皮膚、痤瘡、光損傷皮膚、皺紋、老年斑、老化皮膚、提高角質(zhì)層彈性、優(yōu)化皮膚色澤、控制皮脂分泌并通常提高皮膚的質(zhì)量。該組合物可以用來改進(jìn)皮膚脫屑和表皮分化。
增效劑是一種經(jīng)過下文2.1-2.7部分所述的體外Microsomal試驗的化合物。本發(fā)明的化合物以表A中所列的濃度抑制或增強(qiáng)一種酶到至少表A中所列的一般％表A增效劑測試濃度和％抑制/提高ARAT/LRAT試驗(鑒定B1增效劑)

視黃醇脫氫酶試驗(鑒定B2增效劑)

視黃醛還原酶試驗(鑒定B3增效劑)

CRABPII拮抗劑試驗(鑒定B4增效劑)

視黃酸氧化試驗(鑒定B5增效劑)

用于測定化合物是否適用于包括在本發(fā)明組合物中的體外Microsomal試驗如下1.原料全反式視黃醇，全反式視黃酸，棕櫚?；o酶A，二月桂?；字Ｄ憠A，NAD和NADPH，購于Sigma化學(xué)品公司。用于Microsomal試驗的類維生素A儲存液在HPLC級乙腈中制備。所有用于HPLC分析的類維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲存液在乙醇中制備，儲存在-70℃液氮中，并且在不儲存時于黃色光下保持在冰上。其他化學(xué)品和抑制劑購于美容材料供應(yīng)商或化學(xué)品公司，如Aldrich或國際香精和香料公司。
2.方法2.1RPE微粒體的分離(修改自J.C.Saari和D.L.Bredberg，＂CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification inRetinal Pigment Epithelium＂，J.Bill Chem. 263，8084-8090(1988))。
50個移走視網(wǎng)膜和眼房水的冷凍對切牛視杯從美國W.L.Lawson公司，Lincoln，NE獲得。眼睛過夜解凍并且用鑷子剝除彩色的虹膜。每只視杯用2×0.5mL冷緩沖液洗滌(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)，方法是用美術(shù)刷或橡膠刮棒刮刷暗色細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液加入到虹膜，并且懸浮液用Teflon攪拌子在燒杯中攪拌幾分鐘。通過粗濾器過濾懸浮液(Spectra/Por，925μm孔徑的聚乙烯篩網(wǎng))以除去大顆粒，并且所得暗色懸浮液用Glas-Col(帶有一個馬達(dá)驅(qū)動的Teflon均質(zhì)器)均質(zhì)化。細(xì)胞勻漿在20,000g離心30分鐘(Sorvaal模式RC-5B離心機(jī)，帶有SS34馬達(dá)，在2.5×10cm管中，14,000RPM)。所得上清液進(jìn)一步在150,000g離心60分鐘(Beckman L80超速離心機(jī)，帶有SW50.1馬達(dá)，在13×51mm管中，40,000RPM)。所得丸粒采用加熱體系分散在約5mL 0.1M PO4/5mM DTT，pH7緩沖液中(Ultrasonics公司，W185D超聲波細(xì)胞破碎機(jī))，所得微粒體分散液分裝在小管中并儲存在-70℃。微粒體的蛋白質(zhì)濃度采用BioRad染色結(jié)合試驗測定，BSA用作標(biāo)準(zhǔn)物。
2.2鼠肝微粒體的分離(修改自R. Martini&M.Murray，＂Participation of P450 3A Enzymes in Rat HepaticMicrosomal Renitoic Acid 4-Hydroxylatiod′，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993))。
大約6克冷凍的鼠肝臟(來自Harlan Sprague Dawley鼠，Accurate Chemical and Scien tific公司)在3倍體積的0.1Mtris/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M蔗糖，pH7.4緩沖液中采用BrinkmannPolytron均質(zhì)化。所得組織懸浮液在上述馬達(dá)驅(qū)動的Teflon均質(zhì)器中進(jìn)一步均質(zhì)化。所得勻漿連續(xù)離心在10,000g 30分鐘、在20,000g30分鐘、在30,000g 15分鐘，所得上清液在105,000g高速離心80分鐘。丸粒如上所述超聲波離解在約5mL 0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mMMgCl2，pH7.4緩沖液中，并且分裝儲存在-70℃。蛋白質(zhì)濃度如上所述進(jìn)行測定。
2.3 ARAT和LRAT活性的測試(鑒定B1)下述程序是描述于J.C.Saari & D.L.Bredberg，＂ARAT&LRATActivities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes＂，Methods Enzymol.190，156-163(1990)中的方法的改進(jìn)。制備以下緩沖液并儲存在4℃0.1M PO4/5mM二硫蘇糖醇，pH7.0(PO4/DTT)中。在試驗時加入2mg BSA/mL緩沖液以得到PO4/DTT/BSA工作緩沖液。1mM視黃醇底物在乙腈中制備并儲存于-20℃氮?dú)庀碌淖厣恐?。制?mM棕櫚?；o酶A在工作緩沖液中的溶液(分裝儲存)和4mM二月桂?；字Ｄ憠A在乙醇中的溶液并儲存于-20℃。抑制劑制備成10mM在水、乙醇、乙腈或DMSO中的儲存溶液。采用含有50μg/mL丁基化羥基甲苯(BHT)的純乙醇制備滅活溶液，并且含有50μg/mL BHT的己烷溶液用作提取液。
向2打蘭玻璃小瓶中依次加入下述物質(zhì)PO4/DTT/BSA緩沖液以使總體積為500μL，5μL?；w(4mM棕櫚?；o酶A和/或二月桂酰基磷脂酰膽堿)，5μL抑制劑或溶劑空白液(10mM儲存液或進(jìn)一步稀釋)，然后是大約15μg RPE微粒體蛋白(大約15μL約1mg/mL微粒體蛋白分裝液)。在37℃孵育5分鐘以使反應(yīng)溫度平衡并隨后加入5μL 1mM視黃醇。將小瓶蓋上蓋子，旋渦振動5秒，在37℃孵育30-90分鐘。加入0.5mL乙醇/BHT使反應(yīng)猝滅。加入3mL己烷/BHT以抽提類維生素A，數(shù)次旋渦振動小管若干秒并且在低速離心小管5分鐘以快速將層分離。將上面的己烷層轉(zhuǎn)移在清潔的小瓶中，并用如上所述的另外3mL己烷/BHT再次抽提水性層。合并己烷層并通過在37℃于氮?dú)饬髦杏眉訜岬匿X塊干燥來蒸發(fā)己烷。在-20℃儲存干燥后的殘余物直到HPLC分析。如下所述通過整合HPLC信號分別定量視黃基棕櫚酸酯和視黃基月桂酸酯以測定ARAT和LRAT活性。
注意孵育溶液含有40μM?；w、100μM或更少的抑制劑、10μM視黃醇、大約30μg/mL微粒體蛋白和約0.1M PO4，pH7/5mM DTT/2mg/mLBSA。加入視黃醇之后的所有步驟都在暗室或棕色光下進(jìn)行。
2.4視黃醇脫氫酶活性的測試(鑒定B2)制備下列儲存溶液50mM KH2PO4，pH7.4緩沖液，無菌過濾。
10mM全反式視黃醇(Sigma R7632)，于DMSO中。
200mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽(NADP)(Sigma N0505)，于無菌水中。
40mM測試化合物，于適當(dāng)溶劑中(水、緩沖液、乙醇、氯仿或DMSO)。
鼠肝微粒體的1∶10稀釋液，于50mM KH2PO4，pH7.4緩沖液(4μg/μl)。
向帶有螺旋蓋的2打蘭玻璃小瓶中依次加入下列物質(zhì)緩沖液以使最終體積為400μl25μl稀釋的微粒體(最終＝100μg)，煮沸的微粒體作為對照物，普通的微粒體作為測試樣品。
4μl 200mM NADP(最終＝2mM)1μl 40mM測試化合物(最終＝100μM)8μl 10mM視黃醇(最終＝200μM)將小瓶在37℃振動水浴中孵育45分鐘。向每個小瓶中加入500μl冰冷卻的乙醇以使反應(yīng)猝滅。用冰冷卻的己烷抽提類維生素A兩次(每次抽提2.7ml)。在第一次抽提期間將視黃基乙酸酯(5μl 900μM儲存液)加入到每個小管中作為在每個樣品中監(jiān)測抽提效果的方法。旋渦振動樣品10秒，然后在1000rpm、5℃于Beckman GS-6R離心機(jī)中輕柔離心5分鐘。在每次抽提后，將含有類維生素A的己烷上層從水性層中轉(zhuǎn)移到清潔的2打蘭小瓶中。在輕柔的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)掉己烷。在-20℃儲存干燥后的殘余物直到HPLC分析。
2.5視黃醛還原酶活性的測試(鑒定B3)如上所述使用下列替代物質(zhì)制備所有的儲存溶液10mM全反式視黃醛(Sigma R2500)，DMSO中。替代視黃醇。
200mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四鈉鹽，還原形式(NADPH)(Sigma N7505)，無菌水中。替代NADP。
向帶有螺旋蓋的2打蘭玻璃小瓶中依次加入下列物質(zhì)緩沖液以使最終體積為400μl25μl稀釋的微粒體(最終＝100μg)，煮沸的微粒體作為對照物，普通的微粒體作為測試樣品。
4μl 200mM NADPH(最終＝2mM)1μl 40mM測試化合物(最終＝100μM)
3μl 10mM視黃醛(最終＝75μM)接下來進(jìn)行與上述相同的孵育和抽提操作。
2.6測試CRABPII拮抗劑(鑒定B4)2.6.1合成CRABPIIa.表達(dá)體系在pET29a-c(+)質(zhì)粒(Novagen)上克隆CRABPII基因?？寺〉幕虮粡?qiáng)噬菌體T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號控制。T7聚合酶源由宿主細(xì)胞大腸桿菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供。后者在1acUV5控制下含有T7聚合酶的染色體拷貝，由存在的IPTG誘導(dǎo)。質(zhì)粒按照制造商說明手冊(Novagen)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BLR(DE3)pLysS細(xì)胞。
b.誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物在含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2xYT中稀釋到1∶100。細(xì)胞在37℃振蕩生長，直到600nm處的OD值達(dá)到0.6-0.8。然后加入IPTG，終濃度為1mM。培養(yǎng)物再孵育2小時。在室溫下5000g離心10分鐘收集細(xì)胞。丸粒儲存在-20℃。
2.6.2純化按照Norris和Li，1997所述的方法進(jìn)行純化。
a.裂解冷凍的丸粒在室溫解凍并重新懸浮于1-2倍丸粒體積的新鮮制備裂解緩沖液中(50mM Tris/HCl，pH8，10％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.05％(w/v)疊氮化鈉，0.5mM DTT，10mM MnCl2，2.5mM苯甲基磺酰氟，2.5mM苯甲脒，6μg/mL DNA酶)。溶解產(chǎn)物在室溫孵育30分鐘。進(jìn)一步用超聲波進(jìn)行裂解(在10,000psi下六次30秒，期間在冰上放置五次30秒)。裂解產(chǎn)物的不溶部分在4℃于15000rpm離心1小時除去，上清液儲存在-20℃。
b.在Sephacryl S300上的凝膠過濾來自步驟a.的上清液在室溫下裝入2.5×100cm sephacryl S-300(Pharmacia)柱中。洗脫緩沖液是20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％疊氮化鈉(緩沖液A)。流動速率是2mL/min。收集的2mL級份用280nm處的紫外吸光度來檢測。用SDS-page測定級份代表的峰，以檢測CRABPII的存在。
c.陰離子交換色譜
2mL含有CRABPII的凝膠過濾級份裝入季銨陰離子交換柱FPLC(快速蛋白質(zhì)液相色譜)，型號monoQ(Pharmacia)。使用梯度緩沖液室溫下在20分鐘內(nèi)洗脫CRABPII，從100％緩沖液A到30％緩沖液B(100％緩沖液B＝緩沖液A+250mM NaCl)。每分鐘收集1mL級份。再次用SDSpage檢測CRABPII的存在。CRABPII儲存在4℃，之后用帶有小瓶平臺附件的Micromodulyo 1.5K冷凍干燥(Edwards High VacuumInternational)。粉末狀樣品儲存在室溫，直到它們用于結(jié)合試驗。
d.檢測CRABPII的存在CRABPII的表達(dá)和純化采用變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)在7-15％聚丙烯酰胺凝膠(Biorad)上分析。10μl樣品與10μl 2X緩沖液(100mM Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并通過加熱失活(80℃，2分鐘)。將樣品加載到凝膠上，浸泡在1X Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)中，在室溫下施加恒定電流(25mA)1小時。考馬斯藍(lán)染色后，根據(jù)用Benchmark預(yù)染蛋白質(zhì)梯度帶(GibcoBRL)測定的分子量來鑒定蛋白質(zhì)。
采用蛋白印跡來證實(shí)CRABPII的存在。在SDS-PAGE中分離的蛋白質(zhì)使用Biorad暗盒轉(zhuǎn)移到Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜(Millipore)上。轉(zhuǎn)移在1X Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)+10％甲醇中進(jìn)行。施加電流(60mA)3小時以使蛋白質(zhì)遷移到膜中。此后，室溫下將膜用5％干乳在1X TBS中封閉1小時，并在相同的緩沖液中于4℃用CRABPII的一抗標(biāo)記(鼠抗克隆5-CRA-B3的1/1000稀釋液)過夜。接下來，膜用PBS(3×5分鐘)洗滌，然后與二抗，結(jié)合過氧化物酶的抗鼠抗體(ECLTM，Amersham)的1∶2000稀釋液在室溫孵育1小時。
膜用1xPBS(3×5分鐘)洗滌，根據(jù)制造商的使用指南采用ECL檢測試劑盒(Amersham)檢測蛋白質(zhì)。純化后的CRABPII濃度使用BSA試劑盒(Pierce)測定。
2.6.3放射活性結(jié)合試驗220pmol CRABPII在20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中與15pmol放射活性全反式視黃酸(NEN)(總體積為70μL)孵育。為了進(jìn)行競爭性試驗，過量的另一種配體(6670∶1、670∶1或70∶1)加入到混合物中。反應(yīng)在室溫下于暗處進(jìn)行1小時。為了將未結(jié)合的全反式視黃酸與結(jié)合的全反式視黃酸分離，使用6kD短切微型色譜柱(Biorad)。使用Microplex多道移液器根據(jù)制造商的使用指南(Pharmacia)將儲存緩沖液棄去。將樣品裝入柱中，在30分鐘內(nèi)利用重力進(jìn)行分離。結(jié)合CRABPII的視黃酸(RA)出現(xiàn)在濾液中，而游離的RA殘留在柱中。濾液的放射活性采用閃爍計數(shù)器來測定。
2.7NADPH依賴型視黃酸氧化的試驗(鑒定B5)下述程序是描述于R.Martini&M.Murray，＂Participation ofP450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-Hydroxylation＂，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)中的方法的改進(jìn)。制備下列試驗緩沖液并且儲存在4℃0.1MPO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。試驗時，在緩沖液中制備60mMNADPH溶液。如上所述制備抑制劑儲存液、酸化乙醇/BHT猝滅溶液和己烷/BHT。1mM視黃酸工作溶液通過用乙醇稀釋15mM儲存液(在DMSO中)來制備。
向2打蘭小瓶中依次加入下列物質(zhì)試驗緩沖液以使最終體積為500μl，20μl 60mM NADPH，5μl抑制劑或溶劑空白液，然后是大約2mg鼠肝臟微粒體蛋白。在37℃孵育5分鐘，隨后加入5μl 1mM視黃酸工作溶液。在37℃連續(xù)孵育60分鐘(不蓋蓋子，因為氧化過程需要氧分子加入到NADPH中)。如上所述用酸化乙醇/BHT猝滅，并用己烷/BHT抽提。如下所述通過整合HPLC信號來定量并快速洗脫極性視黃酸代謝物(假定是4-氧代視黃酸)。
注意加入視黃酸之后的所有步驟都在暗室或棕色光下進(jìn)行。最終孵育溶液含有2.4mM NADPH、100μM或更少的抑制劑、10μM視黃酸、大約4mg/mL鼠肝臟微粒體蛋白和大約0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mMMgCl2。
單獨(dú)的類維生素A的HPLC分析用HPLC定量的類維生素A樣品通過將每個小瓶中的殘余物用100μl甲醇溶解來制備。溶液轉(zhuǎn)移到1mL加蓋小瓶內(nèi)的150μl玻璃圓錐管中，緊密蓋緊，并且置于Waters 715自動取樣器內(nèi)。立即注射60μl等份樣品并且分析類維生素A含量。
色譜儀由Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光電二極管陣列檢測器和Waters 474掃描熒光檢測器組成。兩種HPLC方案用于類維生素A分析。對于ARAT和LRAT試驗，視黃醇和視黃醇酯的分離用Waters 3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters SentryNovaPak C18保護(hù)柱，采用調(diào)節(jié)到流速為1mL/min的80∶20(v/v)甲醇/THF作為流動相進(jìn)行10分鐘。監(jiān)測洗脫液在325nm的吸光度和在325ex/480em的熒光。較短的Waters 3.9×150mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保護(hù)柱用于分離視黃醇和視黃酸氧化試驗中的酸和醇，采用描述于A.B.Barua，＂Analysis ofWater-Soluble CompoundsGlucoronides＂，Methods Enzymol.189，136-145(1990)中的梯度體系的改進(jìn)方法。該體系包括從含有10mM乙酸銨的68∶32(v/v)甲醇/水到4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷的20分鐘線性梯度，隨后是在流速為1mL/min保持5分鐘。柱洗脫液在300nm-400nm監(jiān)測。
根據(jù)清楚地分辨每個試驗中相關(guān)視黃酸、醇、醛和/或酯的能力和分離的相對快速來選擇這些方案。用HPLC鑒定各種類維生素A是根據(jù)未知峰的駐留時間與購買的已知類維生素A標(biāo)準(zhǔn)物之間的確切匹配，未知峰的UV光譜分析(300-400nm)與購買的已知類維生素A之間進(jìn)行比較。
在轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗中適用于進(jìn)一步檢測的增效劑包括但不限于列于下表B1-B5的增效劑。
ARAT/LRAT抑制劑(B1)分類 化合物％ 總體 ％ ％ ％％總體抑制 TG(IC50) 抑制 抑制抑制 抑制TG ARAT (10μm) ARAT (100μm) LRAT (10μm) LRAT (100μm)(-ROH/RE)類胡蘿卜素 藏紅花酸 3.75E-05 15％ 34％0 15％脂肪酸酰胺& 乙?；拾贝? 6.78E-06 19％+/-12 62％+/-11 10％+/-10 50％+/-18其他表面活性劑脂肪酸酰胺& C13β-羥基酸/酰胺 17％ 28％ 25％其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 蓖麻油MEA 3.25E-05其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 椰油酰氨基丙基甜菜堿 25％其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 椰油羥乙基咪唑啉 2.84E-07 68％ 68％其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 椰油酰胺-MEA(或椰油酰基單 11％ 13％ 34％其他表面活性劑 乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 甘油基-PCA-油酸酯41％+/-6 58％+/-2其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 己酰胺 20％其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 己?；拾贝? 9.99E-05 28％+/-4 37％+/-9其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 羥乙基-2-羥基-C12酰胺 3.29E-05 35％ 35％其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 羥乙基-2-羥基-C16酰胺25％ 30％其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 月桂酰基肌氨酸 20％其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 利多卡因 12％ 0其他表面活性劑脂肪酸酰胺& 亞油酰胺-DEA(或亞油?；? 59％ 12％+/-13 43％+/-311％+/-9 51％+/-15其他表面活性劑 二乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 亞油酰胺-MEA(或亞油?；鶈?1.61E-05 14％ 35％20％+/-8 35％其他表面活性劑 乙醇酰胺)脂肪酸酰胺& 亞油酰氨基丙基二甲基胺 69％+/-18 75％+/-4其他表面活性劑分類化合物總體 ％ ％ ％ ％％TG(IC50) 抑制 抑制抑制 抑制總體抑制ARAT(10μm)ARAT(100μm)LRAT(10μm)LRAT(100μm)(-ROH/RE)脂肪酸酰胺 &Melin酰胺 64％+/-15 43％+/221其他表面活性劑脂肪酸酰胺 &肉豆蔻酰基肌氨酸41％+/-14 11％+/-11其他表面活性劑脂肪酸酰胺 &油?；鸩藟A 2.80E-05 47％其他表面活性劑脂肪酸酰胺 &棕櫚酰胺-MEA 6％23％ 12％ 33％其他表面活性劑脂肪酸酰胺 &硬脂基羥基酰胺 10％10％其他表面活性劑脂肪酸酰胺 &Utrecht-1 21％ 43％ 54％ 51％ 48％+/-6其他表面活性劑脂肪酸酰胺 &Utrecht-23.47E-0642％ 83％+/-9 51％ 92％+/-3其他表面活性劑類黃酮 柑桔黃素33％14％香料烯丙基α-紫羅蘭酮16％+/-14 22％+/-2317％+/-10 36％/-7香料α-大馬酮3.35E-0467％+/-27 83％+/-1287％+/-6 98％+/-1香料α-紫羅蘭酮 9.27E-04 45％+/-27 49％+/-30香料α-甲基紫羅蘭酮 67％77％香料α-萜品醇 26％25％香料β-大馬酮45％ 84％ 52％ 92％香料婆羅醇 70％75％香料大馬烯酮 23％ 70％ 29％ 79％香料δ-大馬酮58％ 87％ 64％ 95％香料二氫α-紫羅蘭酮 13％18％香料藏紅花酸乙酯51％49％香料小茴香醇12％4％香料γ-甲基紫羅蘭酮 21％38％香料異丁基紫羅蘭酮 8％ 45％香料異環(huán)香葉醇 18％16％
分類化合物總體 ％ ％ ％ ％％TG(IC50) 抑制抑制抑制 抑制總體抑制ARAT(10μm) ARAT(100μm)LRAT(10μm) LRAT(100μm)(-ROH/RE)香料異大馬 80％ 92％香料Lyral 1.27E-04 76％ 71％香料檀香 23％ 12％香料檀香醇 15％ 43％香料Timberol 34％ 33％香料Tonalid50％ 33％香料Traseolide 41％ 21％雜項椰油基三甲基氯化銨 27％雜項Urosolic Acid 1.46E-06 21％ 28％非環(huán)香料檸檬醛 20％非環(huán)香料香茅醇 30％ 0非環(huán)香料金合歡醇 9.35E-05 23％+/-18 53％+/-18 10％+/-7 53％+/-19非環(huán)香料香葉醇7.83E-03 13％ 32％非環(huán)香料香葉基香葉醇38％+/-12 81％+/-6 16％+/- 9 77％+/-13非環(huán)香料里吶醇 28％ 0非環(huán)香料壬二烯醇 20％非環(huán)香料Pseudoionone 12％ 37％磷脂二辛基磷脂酰乙醇胺 23％ 50％+/-2 0 17％+/-17脲 二甲基咪唑烷酮 22％脲 咪唑烷基脲 35％
視黃醇脫氫酶活化劑(B2)％視黃醇脫分類 化合物 氫酶的增加磷脂 磷脂酰膽堿 21％增加磷脂 鞘磷脂 26％增加視黃醛還原酶抑制劑(B3)總％視黃醛還原分類 化合物 TG(IC50)酶的抑制醛香草醛 9.70E-036％脂肪酸花生酸 20％脂肪酸花生酸 49％脂肪酸亞油酸 1.63E-0462％+/-2脂肪酸亞麻酸 1.34E-0454％+/-16脂肪酸肉豆蔻酸 1.72E-0526％雜項 胺苯丫啶 6.26E-0622％+/-8雜項 氫琥珀酸甘草次酸 3.61E-0726％+/-2雜項 Glycyrretinic8.64E-0638％＝/-1Acid磷脂 磷脂酰乙醇胺 37％CRABPII拮抗劑(B4)總CRABPII抑制％分類 化合物 TG(IC50)脂肪酸反油酸 6.50E-05＞50％脂肪酸十六烷二酸 1.30E-04＞50％脂肪酸12-羥基硬脂酸2.91E-05＞50％脂肪酸異硬脂酸 6.88E-05＞50％脂肪酸亞麻油 ＞50％
視黃酸氧化抑制劑(B5)分類化合物總體 ％視黃酸抑制％視黃酸抑制TG(IC50) (10μM) (100μM)咪唑聯(lián)苯芐唑89％100％咪唑氯咪巴唑 4.47E-06 80％92％咪唑克霉唑 76％85％咪唑益康唑 88％100％咪唑酮康唑 1.85E-07 84％84％咪唑咪康唑 2.78E-07 74％86％脂肪酸酰胺& 月桂基羥乙基咪唑啉 4.67E-07其他表面活性劑油基羥乙基咪唑啉 3.02E-05 54％80％脂肪酸酰胺&
其他表面活性劑柑桔黃素 6.29E-05 40％74％類黃酮香豆素 香豆素喹啉(7H-苯并咪唑[2，1-a]苯并[二]-異喹啉-7-酮 8.59E-07喹啉羥基喹啉 3.64E-04喹啉甲吡酮(2-甲基-1，2-二-3-吡啶基-1-丙烷) 47％
增效劑或其組合以10mM的濃度在下述轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗中抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶到至少50％。
轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗

轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗和角質(zhì)化細(xì)胞分化在表皮的最終分化過程中，15nm厚的蛋白質(zhì)層，稱之為角質(zhì)外殼(CE)形成于細(xì)胞外周的內(nèi)表面。CE由許多不同的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)已經(jīng)通過形成Nε-(Y-谷氨?；?賴氨酸異二肽鍵交聯(lián)在一起，由至少兩種在表皮中表達(dá)的不同轉(zhuǎn)谷酰胺酶催化。轉(zhuǎn)谷酰胺酶I在表皮的分化層中表達(dá)豐富，特別是顆粒層，而在未分化基礎(chǔ)表皮中較少。因此轉(zhuǎn)谷酰胺酶I是一種有用的表皮角質(zhì)化細(xì)胞分化標(biāo)記物，高轉(zhuǎn)谷酰胺酶I水平表明更加分化的狀態(tài)。在下面的例子中，采用轉(zhuǎn)谷酰胺酶I抗體的ELISA轉(zhuǎn)谷酰胺酶I試驗用于評價培養(yǎng)的角質(zhì)化細(xì)胞的分化狀態(tài)。
角質(zhì)化細(xì)胞(如上所述培養(yǎng))以4,000-5,000細(xì)胞/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板的200μl培養(yǎng)基中。孵育2-3天后，或者到細(xì)胞長滿約50％后，將培養(yǎng)基換作含有測試化合物的培養(yǎng)基(每個樣品重復(fù)五次)。細(xì)胞接著培養(yǎng)96小時，此后吸出培養(yǎng)基并且將培養(yǎng)板儲存在-70℃。培養(yǎng)板從冷柜中取出，細(xì)胞用200μl 1x PBS洗滌兩次。細(xì)胞在室溫用TBS/5％BSA(洗滌緩沖液，牛血清白蛋白)孵育1小時。接著加入轉(zhuǎn)谷酰胺酶一抗50μl單克隆抗轉(zhuǎn)谷酰胺酶I Ab B.C.在洗滌緩沖液中稀釋到1∶2000。一抗在37℃孵育2小時并隨后用洗滌緩沖液清洗6次。細(xì)胞隨后在37℃用50μl二抗(Fab片段，結(jié)合過氧化物酶的抗鼠IgG，來自Amersham)在洗滌緩沖液中稀釋到1∶4,000孵育2小時，然后用洗滌緩沖液清洗3次。用洗滌緩沖液清洗之后，細(xì)胞用PBS洗滌3次。為了進(jìn)行比色分析，細(xì)胞用100μl底物溶液(4mg鄰亞苯基二胺和3.3μl 30％H2O2在10ml 0.1M檸檬酸鹽緩沖液中，pH5.0)在室溫下于暗處嚴(yán)格孵育5分鐘(鋁箔下)。通過加入50μl 4N H2SO4使反應(yīng)終止。在UV分光光度計中讀出96孔培養(yǎng)板中樣品在492nm處的吸光度。在五組平行測定中，四組采用兩種抗體進(jìn)行處理，第五組用作轉(zhuǎn)谷酰胺酶背景對照。測定轉(zhuǎn)谷酰胺酶水平并且表示為％對照。
測定轉(zhuǎn)谷酰胺酶水平并在上述表B1-B5中分別表示為(i)％(增效劑+視黃醇抑制/對照抑制)-％(ROH抑制/對照抑制)，測量增效劑+視黃醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)谷酰胺酶抑制與單獨(dú)視黃醇相比的增加效應(yīng)，或(ii)當(dāng)檢測多個增效劑濃度的抑制效果時的IC50值-假定增效劑的濃度與恒定視黃醇濃度10-7M組合來抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶超過50％。
在本發(fā)明中IC50值用作基準(zhǔn)。
在轉(zhuǎn)谷酰胺酶試驗中測試的最佳增效劑組B1化合物

B2化合物

B3化合物

B4化合物

B5化合物

類維生素A在本發(fā)明產(chǎn)品中，所選擇化合物的存在實(shí)質(zhì)上改善了類維生素A的性能。
本發(fā)明的組合物包含占組合物重量約0.001％到約10％的類維生素A。
類維生素A選自視黃基酯、視黃醇、視黃醛和視黃酸，優(yōu)選視黃醇或視黃基酯。術(shù)語“視黃醇”包括視黃醇的下列異構(gòu)體全反式視黃醇，13-順式-視黃醇，11-順式-視黃醇，9-順式-視黃醇，3，4-二脫氫-視黃醇，3，4-二脫氫-13-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-11-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-9-順式-視黃醇。優(yōu)選的異構(gòu)體是全反式視黃醇，13-順式-視黃醇，3，4-二脫氫-視黃醇，9-順式-視黃醇。最優(yōu)選的是全反式視黃醇，這是因為它廣泛的商業(yè)來源。
視黃基酯是視黃醇的一種酯。術(shù)語“視黃醇”已經(jīng)如上所定義。適用于本發(fā)明的視黃基酯是視黃醇的C1-C30酯，優(yōu)選C2-C20酯，并且最優(yōu)選C2、C3和C16酯，因為它們更容易得到。視黃基酯的例子包括但不限于視黃基棕櫚酸酯、視黃基甲酸酯、視黃基乙酸酯、視黃基丙酸酯、視黃基丁酸酯、視黃基戊酸酯、視黃基異戊酸酯、視黃基己酸酯、視黃基庚酸酯、視黃基辛酸酯、視黃基壬酸酯、視黃基癸酸酯、視黃基十一酸酯、視黃基月桂酸酯、視黃基十三酸酯、視黃基肉豆蔻酸酯、視黃基十五酸酯、視黃基十七酸酯、視黃基硬脂酸酯、視黃基異硬脂酸酯、視黃基十九酸酯、視黃基花生四烯酸酯、視黃基山崳酸酯、視黃基亞油酸酯、視黃基油酸酯。
用于本發(fā)明的優(yōu)選酯選自視黃基棕櫚酸酯、視黃基乙酸酯和視黃基丙酸酯，因為這些酯最容易得到且因此而最便宜。還優(yōu)選視黃基亞油酸酯和視黃基油酸酯，這是因為它們的效果好。
在本發(fā)明的組合物中視黃醇或視黃基酯的用量為約0.001％-約10％，優(yōu)選用量為約0.01％-約1％，最優(yōu)選用量為約0.01％-約0.5％。
過氧化值如上文所述，類維生素A在水包油乳液中不穩(wěn)定。類維生素A的化學(xué)穩(wěn)定定義為，經(jīng)規(guī)定的貯存期和特定溫度后，以原始化學(xué)形式存在的類維生素A的濃度。因此本發(fā)明提供了雙重作用，在皮膚內(nèi)部增強(qiáng)類維生素A的轉(zhuǎn)化，同時通過除去過氧化值大于12并優(yōu)選大于6的任何初始原料化合物，增加了類維生素A的穩(wěn)定性。
用AOCS通用的方法Cd8-53來測量過氧化值(POV)，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其它方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在目前的例子中，試驗在不同過氧化值的油中視黃醇的穩(wěn)定性，從而檢測油的過氧化值對視黃醇和增效劑組成的組合物的影響。用下列方程式1計算過氧化值過氧化值(毫克當(dāng)量過氧化物/1000g樣品)＝(S-B)×1000/樣品質(zhì)量，g其中B＝空白滴定劑的體積，mlS＝樣品滴定劑的體積，mlN＝硫代硫酸鈉溶液的正常標(biāo)準(zhǔn)方法1.稱量5g樣品，放入具有玻璃塞子的250ml燒瓶中，并加入30ml乙酸∶氯仿為3∶2的溶液。旋轉(zhuǎn)以溶解樣品。加入0.5ml的飽和碘化鉀溶液。
2.將溶液偶然搖動放置正好1分鐘。然后立即增添30ml的蒸餾水。
3.用0.1N硫代硫酸鈉滴定，緩慢加入并勻速攪動。繼續(xù)滴定直到碘黃色幾乎消失。再加入0.5ml 10％ SDS，然后加入大約0.5ml的淀粉指示劑溶液。勻速攪動繼續(xù)滴定，特別是接近終點(diǎn)時，從溶劑層釋放出所有的碘。逐滴加入硫代硫酸鹽溶液直到藍(lán)色剛好消失。
4.每日進(jìn)行試劑的空白試驗。空白滴定不準(zhǔn)超過0.1ml的0.1N硫代硫酸鈉溶液。
實(shí)施例1

實(shí)施例2加了增效劑的視黃醇穩(wěn)定性/POV(半衰期為根據(jù)2-3個星期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的預(yù)測值)

實(shí)施例3

實(shí)施例4

實(shí)施例5

實(shí)施例6

*為單個過氧化值的平均值美容可接受的載體本發(fā)明的組合物還包含一種美容可接受的載體以用作組合物中的活性組分的稀釋劑、分散劑、或載體，從而當(dāng)組合物施用于皮膚上時有利于它們的分布。
非水或除水之外的載體可以包括液體或固體潤膚劑、溶劑、保濕劑、增稠劑和粉末。一種特別優(yōu)選的非水性載體是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發(fā)明的硅氧烷可以是25℃時的粘度范圍是約10-10,000,000厘沲的任意硅氧烷。特別優(yōu)選的是低和高粘度硅氧烷的混合物。這些硅氧烷可以購于通用公司，商品名為Vicasil、SE和SF，以及購于Dow Corning公司，商品名為200和550系列。本發(fā)明組合物中硅氧烷的用量范圍可以是組合物重量的5-95％，優(yōu)選25-90％。
任選的皮膚增益材料和美容助劑可以存在一種油或油性材料，同時還有一種乳化劑以提供水包油乳液或油包水乳液，很大程度上取決于所使用的乳化劑的平均親水親油平衡(HLB)。
各種類型的活性成分可以存在于本發(fā)明的美容組合物中，并且如下所描述?；钚猿煞侄x為除潤膚劑和只改進(jìn)組合物物理性能的其他成分之外的皮膚或頭發(fā)增益劑。盡管不限于此范疇，但通常的例子包括防曬劑、皮膚增白劑、鞣劑。
防曬劑包括那些通常用來阻擋紫外線的材料。舉例的化合物有PABA的衍生物、肉桂酸酯和水楊酸酯。例如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基苯甲酮。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基苯甲酮分別可以商品名Parsol MCX和Benzophenone-3購買。
乳液中防曬劑的實(shí)際用量可以根據(jù)所需的防止日光中紫外線輻射的程度而變化。
另一種優(yōu)選的任選成分選自基本脂肪酸(EFA)，即那些對于所有細(xì)胞的質(zhì)膜形成都是必須的脂肪酸。在角質(zhì)細(xì)胞中，EFA缺失會使細(xì)胞過度增殖。提供EFA可以矯正過度增殖。EFA還增強(qiáng)表皮的脂質(zhì)生物合成并且為表皮的阻透層形成提供脂質(zhì)?；局舅醿?yōu)選選自亞油酸、γ-亞麻酸、均-γ-亞麻酸、columbinic acid、二十-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、γ-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十碳六烯酸及其混合物。
潤膚劑通常結(jié)合到本發(fā)明的美容組合物中。這些潤膚劑的用量范圍可以是組合物總重量的約0.5％-約50％，優(yōu)選約5％-30％?？梢詺w類于這些通用化學(xué)品范疇內(nèi)的潤膚劑是酯、脂肪酸和醇、多元醇和烴。
酯可以是一元或二元酯。脂肪酸二酯的可接受例子包括己二酸二丁酯、己二酸二乙酯、癸二酸二乙酯、癸二酸二異丙酯和琥珀酸二辛酯?？山邮艿闹ф溨舅狨グㄈ舛罐⑺?-乙基-己基酯、硬脂酸異丙酯和棕櫚酸異硬脂基酯?？山邮艿娜狨グㄈ齺営退崛惐ズ蜋幟仕崛鹿鸹??？山邮艿闹辨溨舅狨グㄗ貦八嵩鹿鸹?、乳酸肉豆蔻基酯、oleyl eurcate和油酸硬脂基酯。優(yōu)選的酯包括椰油辛酸/癸酸酯(椰油辛酸酯和椰油癸酸酯的混合物)，丙二醇肉豆蔻基醚乙酸酯，己二酸二異丙酯和辛酸十六烷基酯。
合適的脂肪醇和酸包括那些含有10-20個碳原子的化合物。特別優(yōu)選的是這些化合物，如十六烷基、肉豆蔻基、棕櫚基或硬脂基醇和酸。
可以用作潤膚劑的多元醇有線形或支鏈烷基多羥基化合物。例如優(yōu)選丙二醇、山梨糖醇和甘油。還可以使用聚合多元醇如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇還特別優(yōu)選作為滲透增強(qiáng)劑。
可以用作潤膚劑的烴是那些具有12-30個碳原子的烴鏈的化合物。具體例子包括礦物油、凡士林油、角鯊烯和異石蠟烴。
在本發(fā)明的美容組合物中使用的另一種功能成分是增稠劑。增稠劑的通常用量為組合物重量的0.1-20％，優(yōu)選約0.5％-10％。增稠劑的例子有交聯(lián)的聚丙烯酸酯，商品名為Carbopol，購自B.F.Goodrich公司?？梢允褂脴淠z如黃原膠、角叉菜膠、明膠、刺梧桐樹膠、果膠和洋槐豆膠。在某些情況下可以使用硅氧烷或潤膚劑來實(shí)現(xiàn)增稠作用。例如粘度大于10厘沲的硅氧烷膠和如具有雙官能度的硬脂酸甘油酯的酯。
粉末可以加入到本發(fā)明美容組合物中。這些粉末包括白堊、滑石、漂白土、高嶺土、淀粉、蒙脫石、化學(xué)改性鋁硅酸鎂、有機(jī)改性蒙脫粘土、水合鋁硅酸鹽、煅燒二氧化硅、琥珀酸辛基鋁淀粉及其混合物。
其他少量輔助成分還可以加入到本發(fā)明美容組合物中。這些成分可以包括著色劑、遮光劑和香料。這些物質(zhì)的用量范圍可以是組合物重量的0.001％-20％。
組合物的用途本發(fā)明美容組合物主要作為局部施用于人皮膚上的產(chǎn)品，特別是作為調(diào)節(jié)和潤滑皮膚、防止或減少出現(xiàn)皺紋或老化皮膚的制劑。
在使用時，少量的組合物，例如1-5ml，從合適的容器或施涂器中施用到皮膚的暴露區(qū)域，并且如果必要，隨后用手或手指或合適的裝置噴灑和/或涂抹到皮膚上。
產(chǎn)品形式和包裝本發(fā)明的局部皮膚處理組合物可以配制成洗液、流體乳膏、乳膏或凝膠。可以將組合物包裝在適當(dāng)?shù)娜萜髦衼磉m合它的粘度和滿足消費(fèi)者的需求。例如，可以裝在瓶子或者滾球敷涂器中的洗液或者流體乳膏，或者膠囊劑、或者推進(jìn)劑驅(qū)動的噴霧裝置或者裝有能手指操作的小泵的容器。當(dāng)組合物為膏狀物時，可以簡單地保存在不變形的瓶子或者印模容器，例如管子或者帶蓋的罐子中。
本發(fā)明也提供了容納這里定義的美容可接受組合物的密閉容器。
下面的實(shí)施例說明了視黃醇和增效劑的協(xié)同組合。
實(shí)施例7為了確定B1-B5活性化合物與視黃醇的組合是否協(xié)同抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶的表達(dá)，必須要確定在視黃醇存在下單獨(dú)測試時活性化合物的劑量響應(yīng)曲線(包括IC50值)。該數(shù)據(jù)用于確定每種活性化合物適當(dāng)?shù)拇?最大抑制濃度，使得可以鑒定在視黃醇存在下活性化合物的混合物的協(xié)同效應(yīng)。為了證實(shí)兩種化合物的協(xié)同作用，有必要選擇最大IC20的測試濃度，換句話說就是單獨(dú)促進(jìn)視黃醇抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶的表達(dá)為20％的化合物濃度。這兩種化合物應(yīng)該具有疊加抑制40％。采用這種方式來確定濃度使得有40-100％的進(jìn)一步轉(zhuǎn)谷酰胺酶抑制，以測定兩種待測化合物的協(xié)同作用。更優(yōu)選的濃度標(biāo)準(zhǔn)可以是選擇單獨(dú)表現(xiàn)出不促進(jìn)視黃醇對轉(zhuǎn)谷酰胺酶抑制的化合物的濃度。但是在此研究中我們選擇甚至更優(yōu)選的標(biāo)準(zhǔn)。我們選擇的化合物濃度比最低的有效轉(zhuǎn)谷酰胺酶抑制濃度低10倍和100倍。采用這樣很低的濃度來鑒定協(xié)同結(jié)合作用將意味著鑒定最有效的協(xié)同結(jié)合作用。
下表中的數(shù)據(jù)代表比最小抑制化合物濃度低2個數(shù)量級的化合物濃度。這些是用于B1/B5結(jié)合作用研究的濃度。
表2

為了檢測B1和B5活性化合物與視黃醇結(jié)合來協(xié)同抑制轉(zhuǎn)谷酰胺酶表達(dá)，測試了下表給出濃度的所選擇化合物組合。得到下面的數(shù)據(jù)
表3

B1/B5組合的效果分為兩類特別有效的組合(上表用斜體字印刷的，即前14個組合或行)和無效的組合(非斜體字的，即下面6個組合或行)。意外的是某些B1/B5組合表現(xiàn)出比其他組合更好。那些無效的組合是(i)脂肪酸酰胺+唑；(ii)羥基脂肪酸酰胺+唑和(iii)柑桔黃素/槲皮酮+唑。含有B1增效劑結(jié)合B5增效劑的有效組合選自下列類脂肪族羥乙基咪唑啉表面活性劑、環(huán)脂肪族不飽和化合物、多環(huán)三萜、n-取代的脂肪酸酰胺。
盡管在此已經(jīng)具體地描述了本發(fā)明，并且參考了某些優(yōu)選的實(shí)施方案，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解可以作出各種變化、改進(jìn)和替換方案，并且在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。應(yīng)該理解所有這些實(shí)施方案和變化都在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且概括在如下的權(quán)利要求書中，本發(fā)明僅僅由下述權(quán)利要求來限制，這些權(quán)利要求應(yīng)該解釋為合理的尺度。在本申請全文中引述了各種出版物。這些出版物以其全部內(nèi)容包括于此作為參考。
權(quán)利要求
1.一種水包油型皮膚調(diào)節(jié)乳液組合物，包括(a)大約0.001到大約10重量％的至少一種增效劑化合物；(b)大約0.001到大約10重量％的類維生素A；和(c)美容可接受的載體；其中水包油乳液中油相各成分的過氧化值小于或等于12。
2.權(quán)利要求1的水包油型皮膚調(diào)節(jié)乳液組合物，其中乳液油相的過氧化值小于或等于6。
3.權(quán)利要求1或2的水包油型皮膚調(diào)節(jié)乳液組合物，其中組合物包括至少兩種增效劑化合物。
4.一種減少或者預(yù)防油質(zhì)皮膚病癥的美容皮膚護(hù)理方法，該方法包括將權(quán)利要求1到3的任一組合物施用到皮膚上。
5.一種刺激皮膚中成纖維細(xì)胞的膠原蛋白合成的美容皮膚護(hù)理方法，該方法包括將權(quán)利要求1到3的任一組合物施用到皮膚上。
6.一種治療皮膚老化、光致老化、干燥、有細(xì)紋或皺紋的美容皮膚護(hù)理方法，該方法包括將權(quán)利要求1到3的任一組合物施用到皮膚上。
7.一種減少或者預(yù)防油質(zhì)皮膚病癥并且治療皮膚老化、光致老化、干燥、有細(xì)紋或皺紋的美容皮膚護(hù)理方法，該方法包括將權(quán)利要求1到3的任一組合物施用到皮膚上。
8.權(quán)利要求1到3任一組合物在制備用于刺激皮膚中成纖維細(xì)胞的膠原蛋白合成的藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1到3任一組合物在制備用于調(diào)節(jié)皮膚的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1到3的任一水包油型皮膚調(diào)節(jié)乳液組合物，用于調(diào)節(jié)皮膚。
11.權(quán)利要求1到3的任一水包油型皮膚調(diào)節(jié)乳液組合物，用于刺激皮膚中成纖維細(xì)胞的膠原蛋白合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)皮膚的水包油型乳液組合物包括類維生素A、至少一種增效化合物和可接受的美容載體，其中水包油乳液中油相各成分的過氧化值小于或等于12。
文檔編號A61K8/00GK1553794SQ01821438
公開日2004年12月8日 申請日期2001年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者P·錢達(dá), 周艷, 格蘭格爾 S·P·, I·R·斯科特, 格蘭格爾 , P 錢達(dá), 斯科特 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司