專(zhuān)利名稱(chēng)：包含分離自半枝蓮活性級(jí)分的組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，明確言之，涉及用于預(yù)防及疾病治療的抗-血管生成藥物的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管生成作用是自既存的血管往外生長(zhǎng)生成新的血管結(jié)構(gòu)的過(guò)程。在此過(guò)程中，因?yàn)橹蝺?nèi)皮細(xì)胞的基膜被蛋白水解酶分解，因而內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)脫離基膜，而后這些細(xì)胞會(huì)遷移出原來(lái)的血管、進(jìn)行分裂，并形成新分化的血管結(jié)構(gòu)(Risau(1997)Nature 386671-674；Wilting等人)，(1995)Cell.Mol.Biol.Res.41(4)219-232)。已發(fā)現(xiàn)有數(shù)種不同生物因子具有控制血管形成的功能(Bussosino等人，(1997)Trends inBiochem Sci 22(7)251-256；Folkman及D’Amore，(1996)Cell871153-1155)，這些包括具有多種功能的蛋白質(zhì)；諸如生因子、細(xì)胞表面受體、蛋白酶、蛋白酶抑制劑，及胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(Achen及Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79255-265；Devalaraja和Richmond，(1999)Trends in Pharmacol.Sci.20(4)151-156；Hanahan，(1997)Science27748-50；Maisonpierre等人，(1997)Science27755-60；Suri等人，(1996)Cell 871171-1180；Sato等人，(1995)Nature37670-74；Mignatii及Rifkin，(1996)EnzymeProtein49117-137；Pintucci等人，(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)517-524；Vernon及Sage，(1995)Am.J.Pathol.147(4)873-883；Brooks等，(1994)Science 264569-571；Koch等人，(1995)Nature376517-519)。血管形成作用的復(fù)雜性及控制其進(jìn)程的因子的多樣性提供控制體內(nèi)血管形成作用的治療方法的可用思維。
正常情況下，血管形成作用以周密受控制的方式發(fā)生于胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)，及特別情況下(例如傷口愈合及女性生殖循環(huán))(Wilting及Christ，(1996)Naturwissenschaften83153-164；Goodger及Rogers，(1995)Microcirculation2329-343；Augustin等人，(1995)Am.J.Pathol.147(2)339-351)。血管形成作用過(guò)程中某些重要的步驟有1)生長(zhǎng)因子(即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，VEGF)信號(hào)作用；2)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及VEGF受體相互作用；3)內(nèi)細(xì)胞遷移至生長(zhǎng)因子信號(hào)作用位置；及4)內(nèi)皮細(xì)胞管狀物的生成。病理性血管形成作用在一些人類(lèi)疾病上扮演重要的角色，包括腫瘤生長(zhǎng)及移轉(zhuǎn)性癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，及其他炎癥疾病，諸如牛皮癬(Folkman，(1995)Nature Med.1(1)27-31；Polverini，(1995)Rheumatology 38(2)103-112；Healy等人，(1998)Hum.Reprod.Update4(5)736-396)。在這些例子中，疾病的惡化由持續(xù)失控的血管形成作用所驅(qū)動(dòng)，例如，在類(lèi)風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎中，新毛細(xì)血管侵入關(guān)節(jié)，并破壞軟骨。在糖尿病性視網(wǎng)膜病中，視網(wǎng)膜中的毛細(xì)血管侵入玻璃體，出血并導(dǎo)致失明。重要的是，腫瘤生長(zhǎng)及移轉(zhuǎn)作用依賴(lài)血管形成作用，大部分原發(fā)性固體腫瘤經(jīng)歷一段長(zhǎng)時(shí)間無(wú)血管狀態(tài)，期間的生長(zhǎng)局限于直徑約為1-2毫米范圍。在此大小之內(nèi)，腫瘤細(xì)胞可經(jīng)由被動(dòng)擴(kuò)散作用獲取所需的氧及營(yíng)養(yǎng)，而這些微觀腫瘤質(zhì)體終會(huì)啟動(dòng)血管形成作用，并募集周邊的血管，開(kāi)始突生出毛細(xì)血管，在腫瘤質(zhì)體內(nèi)形成血管，為腫瘤持續(xù)擴(kuò)展及惡性腫瘤向遠(yuǎn)端位置轉(zhuǎn)移提供可能。雖然在探索病理性血管形成作用發(fā)生時(shí)的生物事件已有明顯的進(jìn)展，然而目前并無(wú)有效的醫(yī)藥化合物可用以控制體內(nèi)的血管形成作用，因此，能有效控制血管形成作用的治療法有可能減輕大量人類(lèi)疾病的狀況。
傳統(tǒng)上，通過(guò)篩選具所需醫(yī)藥特性的合成性化學(xué)化合物，而后在體內(nèi)試驗(yàn)其毒性及有效性，以開(kāi)發(fā)出醫(yī)藥化合物。利用此法所篩選的化合物常于體內(nèi)具有毒性副作用，且此方法尚未成功發(fā)展出可進(jìn)行疾病治療的有效的血管形成作用的抑制劑。近來(lái)，已應(yīng)用分子生物技術(shù)發(fā)展血管形成作用的抑制劑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭锌煽刂蒲苄纬傻难苄纬勺饔玫牡鞍滓种苿?，諸如血管抑制蛋白(angiostatin)(O’Reilly等人，(1994)Cell 79(2)315-328)及內(nèi)皮抑制蛋白(endostatin)(O’Reilly等從，(1997)Cell 88(2)277-285)。但是，生產(chǎn)此種蛋白質(zhì)相當(dāng)昂貴，難以制劑，且不易傳送給受體。目前，蛋白質(zhì)血管形成作用的抑制劑尚未開(kāi)發(fā)成疾病患者的醫(yī)療藥物，因此需要能安全施用于患者，且有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理性生長(zhǎng)的治療性化合物。本發(fā)明提供的組合物及方法即是用于此目的，并可提供相關(guān)的優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明提供自半枝蓮提取藥學(xué)活性級(jí)分(又稱(chēng)“提取物”，“化合物”或“藥物”)的方法。一方面，該方法自半枝蓮熱(至少約60℃，更優(yōu)選約100℃)茶中萃取可溶于有機(jī)溶劑的級(jí)分，其光學(xué)吸收值介于約200nm至約400nm。獲得此級(jí)分的一個(gè)方法是將有效量的半枝蓮浸泡在有效量的熱水中。制成液態(tài)萃取物，過(guò)濾液態(tài)萃取物后獲得濾液，而后以有效量有機(jī)溶劑萃取，氮?dú)夥障氯コ軇?，并將沉淀物重懸于水中。濃縮懸浮液，利用層析法分離藥學(xué)活性級(jí)分。本發(fā)明亦提供利用這些方法所獲得的藥學(xué)活性級(jí)分，例如ESBa，ESBb及ASB03。
本發(fā)明提供通過(guò)向細(xì)胞傳送生長(zhǎng)抑制含量的本發(fā)明的級(jí)分，以抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。通過(guò)向組織中傳送抗血管形成作用含量的級(jí)分，對(duì)抑制組織中血管形成作用有用。本發(fā)明亦提供治療各種疾病，包括癌癥的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1至圖5描述本發(fā)明的實(shí)例方法。雖未總是申明，然而應(yīng)了解，所述藥劑僅為實(shí)例，其亦可為本領(lǐng)域中所熟知的等同物。下列為實(shí)例，而其等同物也在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)。
圖1描述可作為食品及健康補(bǔ)充物，名為ESBa及ESBb的活性級(jí)分的分離步驟。從植物的初始萃取作用至經(jīng)第一次冷凍干燥的后的過(guò)程中，所得的第一個(gè)粗萃取物為ESBa，此萃取物含有抗-血管生成的特性。繼續(xù)該方法，可獲得第二個(gè)粗萃取物，ESBb。第一冷凍干燥后，先以95％乙醇清洗，而后以無(wú)水甲醇萃取，此方法可進(jìn)一步分離出ESBa中發(fā)現(xiàn)的活性級(jí)分。將此乙醇清洗/甲醇萃取作用后的萃取物溶解于水中，而后冷凍干燥，產(chǎn)生更為濃縮且純化的半枝蓮活性萃取物，命名為ESBb，將此更為濃縮且純化的萃取物溶解于水中，而后吸附至C-18微型柱。用水清洗后，以25％甲醇洗脫自C-18微型柱上解吸出所吸附的活性成分。自HPLC C-18疏水柱，利用0至100％甲醇梯度的洗脫液中獲得純化的ASB03。每一純化步驟后利用CPAE分析法分析所有的級(jí)分、沉淀物，及上清液，確?？?血管生成級(jí)分并未消失，或遺漏。
圖2描述半枝蓮甲醇萃取物自C-18疏水層析柱的HPLC洗脫。
圖3描述另一種自半枝蓮中萃取及純化ASB03的步驟。
圖4是描述利用G-25柱分析ASB03抗-血管生成活性的圖形結(jié)果。
圖5(A、B及C圖)描述自半枝蓮HPLC C-18層析法萃取物所得的ASB03活性級(jí)分的UV光譜分析。
本發(fā)明的實(shí)施方式此整篇公開(kāi)內(nèi)容中各種發(fā)表文獻(xiàn)、專(zhuān)利及公開(kāi)的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)明確引用作用參考。這些發(fā)表文獻(xiàn)、專(zhuān)利及公開(kāi)的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)在此全部并入本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)參考，以便更完全詳述本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)狀態(tài)。
除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用本領(lǐng)域技藝范圍內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)，有文獻(xiàn)詳細(xì)說(shuō)明此等技術(shù)。
定義本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中所用的某些名詞具有下列的定義。
除非在上下文中有明確指出，否則本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求書(shū)中所指單數(shù)形成“一”也包括其復(fù)數(shù)含義，例如，“一種細(xì)胞”包括細(xì)胞的復(fù)數(shù)，包括其混合物。
本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中所用“包括”意指該組合物及方法中包含所列舉的元素，但不排除包含其他元素。當(dāng)以“基本由…組成”定義組合物及方法時(shí)，意為排除其他任何對(duì)該組合具有基本重要性的元素。因此，基本由在此所定義的元素組成的組合物不排除有分離及純化時(shí)帶入的少量污染物，及醫(yī)藥學(xué)上可接愛(ài)的載體，諸如磷酸緩沖鹽溶液，防腐劑，及類(lèi)似物?！坝伞M成”指對(duì)施用本發(fā)明組合物排除其他成分的大于痕量的元素，及實(shí)質(zhì)的方法步驟。這些變化名詞限定的實(shí)施方案屬本發(fā)明范圍內(nèi)。
所有的數(shù)值名稱(chēng)，例如pH、溫度、時(shí)間、濃度及分子量，包括范圍，系以0.1數(shù)值增(+)或減(-)。應(yīng)了解雖無(wú)法總是精確列舉，但在數(shù)值前應(yīng)加上“約”字。也應(yīng)了解，雖無(wú)法總是精確列舉，但本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)所述的試劑只是實(shí)例，而其等同物為本域中所熟知。
術(shù)語(yǔ)“分離”系指將化合物從自然狀態(tài)下正常與其關(guān)連的組成物、細(xì)胞及其他成分分開(kāi)。
“受體”或“宿主”指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選動(dòng)物或哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人類(lèi)患者。哺乳動(dòng)物包括但不局限于鼠、猿類(lèi)、人類(lèi)患者、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、比賽動(dòng)物，及寵物。
相互變化用詞，及使用其單數(shù)或復(fù)數(shù)的“癌癥”、“惡性腫瘤”及“腫瘤”指已經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其對(duì)宿主有機(jī)體造成病理性傷害。利用良好建立的技術(shù)，特別是組織學(xué)檢查，可輕易的區(qū)分原發(fā)性癌細(xì)胞(換言之，獲自靠近惡性轉(zhuǎn)化位點(diǎn)的細(xì)胞)與非-癌癥細(xì)胞。本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)所用癌癥定義包括的不僅有原發(fā)性癌細(xì)胞，亦包括衍生自癌癥細(xì)胞祖先的任何細(xì)胞。其包括轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞及體外培養(yǎng)細(xì)胞，及衍生自癌細(xì)胞的細(xì)胞株。當(dāng)稱(chēng)某類(lèi)癌癥正常稱(chēng)為固體腫瘤時(shí)，“臨床可檢測(cè)的”腫瘤是根據(jù)腫瘤質(zhì)量可測(cè)得的腫瘤；例如，利用諸如CAT掃描步驟、磁性共振影像(MRI)、X-光、超聲波或觸診所測(cè)。只以生化或免疫學(xué)所發(fā)現(xiàn)的不足以符合此定義。
本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)所指“抑制”為終止、延滯或減緩內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖或細(xì)胞分裂，或血管在組織中的生成。監(jiān)控抑制作用的方法包括，但不局限于內(nèi)皮細(xì)胞增殖分析、利用測(cè)定血液含量及定量測(cè)定血管結(jié)構(gòu)密度以測(cè)定血管床的體積。當(dāng)培養(yǎng)物為細(xì)胞混合物時(shí)，利用定量測(cè)定能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記(諸如血管形成因子、蛋白分解酶及內(nèi)皮細(xì)胞特異性細(xì)胞吸附分子)的細(xì)胞，以監(jiān)控新血管形成。
“組合物”指活性藥劑及其他化合物或組合物、惰性物(例如可檢測(cè)劑或標(biāo)記)或活性劑諸如佐劑的組合。
“藥學(xué)組合物”指包括活性藥劑與惰性或活性載體的組合，以使該組合物適于體內(nèi)，體外或離體診斷或治療用途。
本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中所用“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何標(biāo)準(zhǔn)藥用載體，諸如磷酸緩沖鹽溶液、水及乳化液，諸如油/水或水/油乳化液，及各式類(lèi)型的潤(rùn)濕劑。組合物亦可包括穩(wěn)定劑及防腐劑。載體、穩(wěn)定劑及佐劑的實(shí)例，可參考Martin，REMINGTON’S PHARM.SCI.15版(Mack出版公司.，Easton(1975))。
“有效量”指足以產(chǎn)生有益或所需結(jié)果的量，此量與預(yù)防有效量可相同或不相同，所謂預(yù)防有效量指預(yù)防疾病或疾病癥狀發(fā)生所必須的量。以一次或多次施用、應(yīng)用或劑量可施用有效量。
申請(qǐng)者已經(jīng)確定自半枝蓮萃取藥學(xué)活性級(jí)分的步驟。在一方面，該步驟自半枝蓮熱茶(約100℃)萃取出級(jí)分，其可溶于有機(jī)溶劑，其中該級(jí)分具有光學(xué)吸收值介于約200nm至500nm，而更優(yōu)選介于約200nm至約400nm。獲得此級(jí)分的一種方法是將有效量的半枝蓮浸泡在有效量的熱水中，制備液態(tài)萃取物，爾后過(guò)濾萃取物得濾液，此級(jí)分命名為ESBa，并含有抗-血管形成特性(參考圖1及2)。將其濃縮，可作為食品或健康補(bǔ)充品(參考圖1)。
而后用有效量的有機(jī)溶劑萃取。示于圖1中，濃縮物先以乙醇(95％)清洗，而后以無(wú)水甲醇萃取，濃縮成ESBb，其亦具有抗-血管形成特性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，以有機(jī)溶劑萃取名為ESBa的級(jí)分(參考圖1)。氮?dú)夥障?，去除溶劑，并將沉淀物重懸于水中，濃縮懸浮液，并利用層析分離藥學(xué)活性級(jí)分。
本發(fā)明者亦發(fā)現(xiàn)萃取物ESBa、ESBb及活性成分ASB03可抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，且具有抗-血管生成特性。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供通過(guò)向細(xì)胞中傳送生長(zhǎng)抑制量的級(jí)分以抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明亦提供通過(guò)向組織中傳送抗-血管生成量的本發(fā)明級(jí)分，以抑制組織中血管生成作用的方法。
本發(fā)明可應(yīng)用于體外或體內(nèi)。當(dāng)應(yīng)用于體外試驗(yàn)時(shí)，將內(nèi)皮細(xì)胞或血管化組織培養(yǎng)于本領(lǐng)域中所熟知的條件下，如后述例示。細(xì)胞和/或組織可源自已建立的細(xì)胞株或培養(yǎng)自患者活檢樣品。而后將該級(jí)分直接加入培養(yǎng)基中，或以藥物組合物中的成分傳送。
不是每種治療均對(duì)每個(gè)個(gè)體有效，因此，利用體外分析評(píng)估對(duì)各患者效果是有利的。本方法提供這些方法，以測(cè)定組合物或治療法是否可治療與病理性?xún)?nèi)皮細(xì)胞增生或血管生成作用有關(guān)的特異性疾病。例如，自患者分離出組織活檢切片，并處以本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)定義的有效量的藥用組合物或治療法，置于對(duì)細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)有效的條件下。利用常規(guī)步驟，例如本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中所述的CPAE分析法，測(cè)定病理性細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，其顯示本發(fā)明組合物和/或治療法可有效治療患者。
本發(fā)明亦提供通過(guò)對(duì)患者施用治療有效量或生長(zhǎng)抑制量的本發(fā)明級(jí)分，或其藥學(xué)可接受衍生物，鹽或前藥，以治療患者中與病理性新血管生成作用有關(guān)的疾病的方法。本文所用“治療”一詞指減緩病理性新血管生成作用相關(guān)的病征，及減少新血管生成作用。此種疾病包括但不局限于關(guān)節(jié)疾病、基于新血管的皮膚疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、再狹窄癥、毛細(xì)血管擴(kuò)張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、傷口肉芽作用(granularization)、血管纖維瘤、歐斯勒-偉柏綜合癥、心肌血管生成作用、及硬皮癥。關(guān)節(jié)炎疾病實(shí)例選自牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎。對(duì)于治療癌癥及固體腫瘤而言，“治療”包括抑制血管的生長(zhǎng)，使得腫瘤和/或癌細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，腫瘤及生成物減少，并可能消失不見(jiàn)。治療關(guān)節(jié)疾病將導(dǎo)致減少軟骨特別是關(guān)節(jié)中血管的形成，使得這些區(qū)域移動(dòng)性及彈性增加。對(duì)治療牛皮癬而言，該用藥可減少皮膚性癥狀，諸如疙瘩、鱗片化及皮膚表面下的可見(jiàn)血管。對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病而言，施用本發(fā)明的級(jí)分可減少視網(wǎng)膜多余血管的形成，產(chǎn)生非障礙性視覺(jué)。治療卡波西氏肉瘤時(shí)，施用本發(fā)明級(jí)分可抑制血管的生長(zhǎng)和/或血管的進(jìn)一步形成，因此可抑制所產(chǎn)生的損傷和/或腫瘤。
當(dāng)對(duì)受體施用該組分時(shí)，諸如對(duì)小鼠、大鼠或人類(lèi)患者，該級(jí)分可加至藥學(xué)可接受的載體中，并以全身性、經(jīng)口、經(jīng)皮或局部投藥方式施與受體。治療量可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，并可根據(jù)欲治療的疾病、欲治療的患者，及治療方法所用活性級(jí)分形式的毒性而調(diào)整。各種形式的活性級(jí)分可以經(jīng)口、靜脈內(nèi)、經(jīng)腹膜內(nèi)或經(jīng)皮方式傳送，當(dāng)對(duì)動(dòng)物施用時(shí)，該方法可用于進(jìn)一步確認(rèn)活性級(jí)分的有效性。
當(dāng)以動(dòng)物模式為實(shí)例時(shí)，裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各組以皮下方法接種約105至約109本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)所定義的病理細(xì)胞，當(dāng)移植物建立后，施用該級(jí)分，例如，在移植物周邊以皮下方式注射。利用游標(biāo)測(cè)徑器測(cè)定移植物在2個(gè)維度上尺寸的減少，每周測(cè)定兩次。
得自Jackson Labs(Maine)MRL/Ipr小鼠(MRL/MPJ-FasIpr)用以測(cè)定或監(jiān)控對(duì)關(guān)節(jié)疾病的效果。有效治療效果包括減少動(dòng)物關(guān)節(jié)處及后腿處的腫脹程度，及減少軟骨退化程度(利用X-光監(jiān)控)。
體內(nèi)投藥在療程中可以單一劑量、復(fù)劑量、持續(xù)或間斷投藥實(shí)現(xiàn)。決定最有效方式及投藥劑量的方法為本領(lǐng)域所熟知，且可根據(jù)治療所用的組合物、治療目的、欲治療的靶細(xì)胞及欲治療的受體而調(diào)整。根據(jù)治療師所選定的劑量水平及形式進(jìn)行單一劑量或復(fù)劑量投藥。本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)描述施用活性級(jí)分的適當(dāng)劑量劑型及投藥方法。
根據(jù)慣用步驟投藥法，諸如藥物組合物中的活性成分，本發(fā)明組合物及藥物制劑可用于制備治療人類(lèi)及其他動(dòng)物的藥物。
該級(jí)分或化合物可以經(jīng)口、鼻內(nèi)、腸胃外或通過(guò)吸入療法投藥，且可為片劑、錠劑、顆粒、膠囊、藥丸、安瓶、栓劑或氣溶膠形式。其投藥形式亦可為活性成分的水或非水稀釋液的懸浮液、溶液及乳化液、糖漿、顆?；蚍勰３吮景l(fā)明活性級(jí)分外，藥物組合物亦可含有其他醫(yī)藥活性藥劑。
通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩?，包括?jīng)口、直腸、鼻腔、局部(包括經(jīng)皮、氣溶膠、口腔及舌下)、陰道、腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)及經(jīng)皮)及肺部，可施用活性級(jí)分，以達(dá)到治療目的。需知優(yōu)選途徑根據(jù)病征及患者的年紀(jì)，及欲治療的疾病而有所不同。
需知活性級(jí)分的適當(dāng)劑量視疾病類(lèi)型及嚴(yán)重性及時(shí)期而定，且患者與患者之間有所不同。最佳劑量涉及本發(fā)明療法的療效水平相對(duì)任何風(fēng)險(xiǎn)及負(fù)面效果的平衡。
理想的是，施用提取物(“藥物”)或包含它的組合物時(shí)，該活性化合物在疾病處可達(dá)到最高濃度。例如，可通過(guò)靜脈注射藥物，可選溶于鹽水中，或以口服投藥例如施用片劑、膠囊或含有活性成分的糖漿，而達(dá)到此目的。利用持續(xù)性輸液，可維持所需血藥濃度，以便為疾病組織提供活性成分的有效量。本發(fā)明亦考慮使用有效性組合來(lái)提供治療組合物，其所需的每種成分藥劑的總劑量低于單獨(dú)使用每種治療化合物或藥劑的所需劑量，因此，可以降低副作用。
雖然活性級(jí)分或化合物可以單獨(dú)施用，但優(yōu)選施用至少含有一種上述所定義的活性成分與一種或多種藥學(xué)可接受載體的藥物制劑，并可選包含其他治療藥劑。所謂每種載體必須“可接受”是指其與制劑中的其他成分相容，且對(duì)患者無(wú)害。
制劑包括適合經(jīng)口、直腸、鼻腔、局部(包括經(jīng)皮、口腔及舌下)、陰道、腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)及皮內(nèi))及肺部施用的制劑。制劑可以方便地以單位劑量形式存在，且可以醫(yī)藥領(lǐng)域中所熟知的方法制備。此種方法包括將活性成分與構(gòu)成一種或多種附屬成分的載體結(jié)合的步驟。一般而言，制劑以將活性成分與液態(tài)載體或微細(xì)固態(tài)載體或兩者均質(zhì)并密切結(jié)合而制備，而后若需要可定型產(chǎn)品。
適合經(jīng)口投藥的本發(fā)明制劑可為個(gè)別單位形式，諸如膠囊、藥丸或片劑，其各含有事先確定含量的活性成分；可為粉末或顆粒；可為水或非水液體的溶液或懸浮液；或?yàn)樗鸵簯B(tài)乳化液或油包水液態(tài)乳化液?；钚猿煞忠嗫蔀榇笏幫?、糖膏劑或貼片形式。
可利用壓縮作用或定模作用，可選一種或多種附屬成分制成片劑。在適當(dāng)?shù)膲嚎s機(jī)器中，壓縮自由流動(dòng)形式的活性成分(諸如粉末或顆粒)，可選混有粘合劑(例如聚烯吡酮、明膠、羥基丙基甲基纖維素)、濕潤(rùn)劑、惰性稀釋劑、防腐劑、分散劑(例如淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)聚烯吡酮、交聯(lián)的羧基甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合，制成壓縮片劑。在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中，定?；煊卸栊砸簯B(tài)稀釋劑的粉末化合物后，可制成定模片劑，片劑可選被包衣或蝕刻及配制成能在使用時(shí)緩慢釋放或控制釋放活性成分，例如，各種比例的羥基丙基甲基纖維素可提供所需釋放速度。片劑可選涂覆腸衣，以便在腸道而非胃部釋放。
適合口腔局部投藥的制劑包括在經(jīng)調(diào)味的基材(通常為蔗糖及阿拉伯膠或西黃蓍膠)中含有活性成分的糖錠；在惰性基材，諸如明膠及甘油，或蔗糖及阿拉伯膠中含有活性成分的軟錠片；及在適當(dāng)液態(tài)載體中含有活性成分的漱口水。
根據(jù)本發(fā)明適合局部投藥的藥物組合物可調(diào)配成軟膏、乳膏、懸浮液、乳液、粉末、溶液、貼片、凝膠、噴劑、氣溶膠或油狀物?；蛘撸苿┛砂ㄐ〔紬l或繃帶類(lèi)藥品，諸如浸漬活性成分及可選一種或多種賦型劑或稀釋劑的繃帶或吸附性貼片。
對(duì)眼睛或其他外部組織(例如口腔及皮膚)的疾病而言，制劑優(yōu)選以含有活性成分的局部用軟膏或乳膏施用。當(dāng)調(diào)配成軟膏時(shí)，藥物可與石蠟物質(zhì)或易與水混合的軟膏基材調(diào)配?；蛘?，藥物成分可用水包油乳膏基材調(diào)配于乳膏中。
若有需要，乳膏基材的水相可包括，例如，至少約3％重量/重量的多羥基醇，即，具有兩個(gè)或多個(gè)羥基的醇類(lèi)，諸如，丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油及聚乙二醇及其混合物。局部制劑可包括能增強(qiáng)活性級(jí)分經(jīng)由皮膚或其他作用部位吸收或穿透的化合物，此種透皮促進(jìn)劑實(shí)例包括二甲基砜及相關(guān)的類(lèi)似物。
本發(fā)明乳化液的油相包括任何已知方式的已知成分。雖然此相可只包括乳化劑(或稱(chēng)為乳化藥劑)，其可包括至少一種具有脂或油或同時(shí)這兩者的乳化劑。優(yōu)選，親水性乳化劑與作為穩(wěn)定劑的親脂性乳化劑一起，優(yōu)選同時(shí)包括油及脂。同時(shí)，含或不含穩(wěn)定劑的乳化劑組合成所謂的乳化蠟，而該蠟與油和/或脂組合成所謂的乳化軟膏基材，其形成乳膏制劑的油狀分散相。
適合用于本發(fā)明制劑的乳化劑及乳化液穩(wěn)定劑包括Tween60、Span80、十六醇十八醇混合物、十四醇、單硬脂酸甘油酯及月桂硫酸鈉。
選擇適合用于制劑的油或脂根據(jù)能夠達(dá)成的所需化妝品的特性而定，因?yàn)榛钚曰衔镌诖蟛糠挚赡苡糜谒幬锶榛苿┑挠椭腥芙舛认喈?dāng)?shù)?，因此，乳液?yōu)選為非-油膩性，非-染劑且可清洗掉的具適當(dāng)稠度的產(chǎn)物，以避免自管狀容器或其他容器中滲漏出來(lái)?？墒褂弥辨溁蛑ф湥瑔卧蚨榛?，諸如二-異己二酸酯，硬脂酸異十六酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，十四酸異丙酯，油酸癸酯，棕櫚酸異丙酯，硬脂酸丁酯，棕櫚酸乙基己酯，或已知為Crodamol CAP的支鏈酯的混合物，后三者是優(yōu)選酯類(lèi)。這些可根據(jù)所需特性單獨(dú)使用或組合使用?；蛘撸梢允褂酶呷埸c(diǎn)脂，諸如白軟蠟和/或液態(tài)蠟或其他礦物油。
適合眼睛局部用藥的制劑包括滴眼水，其中活性成分溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)妮d體中，特別是活性成分的水溶液溶劑。用于直腸用藥的制劑可為含有適當(dāng)基質(zhì)的栓劑，例如包括可可油或水楊酸。
適合陰道用藥的制劑可為子宮套、棉塞、乳液、凝膠、貼片、泡沫或噴霧制劑，除活性成分外，尚可包括本領(lǐng)域中所熟知的適當(dāng)載體。
載體為固體的適合鼻腔用藥的制劑，包括具有顆粒大小范圍例如約20至約500微米的粗顆粒，其以鼻吸入的方式投藥，即將含有粉末的容器靠近鼻子后，快速的吸入鼻腔通道。載體為液態(tài)的適合的鼻腔用藥的制劑，例如，鼻腔噴霧，滴鼻藥水，或以噴鼻器施用的氣溶膠，包括活性成分的水溶液或油脂溶液。
適合腸胃外投藥的制劑包括等張無(wú)菌注射用的水或非水溶液，其可包含有抗-氧化劑，緩沖液，抑菌劑及使制劑與欲治療受體的血液等張的溶質(zhì)；及包括設(shè)計(jì)為將化合物向血液成分或一或多種器官靶向的懸浮劑及增稠劑，與脂質(zhì)體或其他微顆粒系統(tǒng)的水性或非水性無(wú)菌懸浮液。制劑可置于單位劑量或多劑量密封容器，例如，安瓶及小瓶，可以冷凍干燥(粉末冷凍干燥)條件保存，在使用的前，只需加入無(wú)菌液態(tài)載體，例如注射用水即可。即時(shí)注射用溶液及懸浮液可從先前所述無(wú)菌粉末，顆粒及片劑種類(lèi)制得。
優(yōu)選的單位劑量制劑包括藥劑成分的每日劑量或單位，每日次劑量(subdose)(如本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)前述)，或其適當(dāng)?shù)募?jí)分。其亦可包括額外的活性藥劑，例如，抗-腫瘤，抗-癌，抗-血管生成藥劑或免疫促進(jìn)劑。
需知除了前所特別說(shuō)明的成分外，本發(fā)明制劑可包括有關(guān)劑型領(lǐng)域常規(guī)的其他藥劑，例如，適合口服的制劑包括甜味劑，粘稠劑及調(diào)味劑。
相同的提取物(“藥劑”)或組合物亦可用于獸用型制劑中，其可如本領(lǐng)域中常規(guī)方法制備。
本發(fā)明另外提供篩選用以抑制新血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的治療藥劑的方法，篩選方法包括(a)將藥劑與適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織樣品接觸；(b)將另一適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織與含有效量的本發(fā)明提取物或含該提取物的藥學(xué)可接受的組合物接觸；及(c)比較步驟(a)樣品與步驟(b)樣品的生長(zhǎng)，當(dāng)其中步驟(a)的生長(zhǎng)抑制情況與步驟(b)樣品相同或相似程度時(shí)，表示(a)的藥劑為抑制新血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的治療藥劑。
如本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)所使用，適當(dāng)樣品意指任何含有內(nèi)皮細(xì)胞的樣品。方法如本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)所述，可體外或體內(nèi)實(shí)施。
本發(fā)明亦提供治療受體病理性新血管生成作用相關(guān)疾病的試劑盒。該試劑盒包括治療量的提取物及使用說(shuō)明書(shū)。該試劑盒用以治療選自關(guān)節(jié)炎疾病、基于新血管的皮膚病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、再狹窄癥、毛細(xì)血管擴(kuò)張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、傷口肉芽作用、血管纖維瘤、歐斯勒-偉板綜合癥、心肌血管生成作用、硬皮癥、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及風(fēng)關(guān)節(jié)炎。
下列的實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明，并非限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1分離及純化活性級(jí)分本發(fā)明提供數(shù)個(gè)自含有半枝蓮的組合物中制備生成活性級(jí)分的實(shí)施方案。一方面(如圖1所示)，該方法包括萃取溶于有機(jī)溶劑的級(jí)分，獲得具有光吸收值介于約200nm至約500nm的活性級(jí)分，優(yōu)選介于約200nm及約400nm。在另一方面，該級(jí)分的光吸收值介于260nm及330nm。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法需自10克干燥半枝蓮及約300毫升熱雙蒸水(至少約60℃，更優(yōu)選至少約100℃)的組合中萃取。其浸泡約5分鐘至30分鐘，而后以具有適當(dāng)孔徑約22至25微米的濾膜過(guò)濾，適合的濾膜可高溫滅菌，可無(wú)菌化，且對(duì)多數(shù)化學(xué)溶劑具有抗性。一種適當(dāng)?shù)臑V膜為市售的iracloth。此萃取物(ESBa，參考圖1)具有抗-血管生成特性，其可為食品或健康補(bǔ)充物，或進(jìn)一步加工成食品或健康補(bǔ)充物。
而后以有機(jī)溶劑，諸如乙醇或甲醇，或其他相似的有機(jī)溶劑至少萃取該“茶”三次，而后以甲醇萃取2至5次，優(yōu)選約4次。該萃取物(ESBb，參考圖1)亦具有抗-血管生成活性，其可為食品或健康補(bǔ)充物，或進(jìn)一部加工成食品或健康補(bǔ)充物。
ESBb可進(jìn)一步濃縮，例如，溶解于水中，并冷凍干燥。利用柱層析法自冷凍干燥物中獲得具有光學(xué)吸收值約200至約500nm，或優(yōu)選介于約200至約400nm，及更優(yōu)選介于約300nm至約400nm的活性級(jí)分ASB03(見(jiàn)圖1)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，獲得活性級(jí)分的步驟有a)將有效量的半枝蓮浸泡于熱的雙蒸水中至少5分鐘。
b)而后將液體離心(2000rpm)約10分鐘，以Watman濾紙過(guò)濾，丟棄沉淀物。
c)粗萃取液進(jìn)行冷凍干燥過(guò)夜，獲得ESBa。
d)用95％乙醇清洗，并離心，用有效量有機(jī)溶劑萃取沉淀物，獲得較純化的萃取物。
e)以氮?dú)庹舭l(fā)有機(jī)溶劑(例如甲醇)。
f)干燥物用至少約12至約18毫升水混合，并隔夜冷凍干燥，獲得ESBb。
g)其可重懸于藥學(xué)可接受載體，諸如雙蒸水中。
h)溶液過(guò)柱層析分離，此柱之一為AC-18，25％甲醇溶液用以洗脫所吸附的活性級(jí)分。
i)以氮?dú)鈿饬髡舭l(fā)甲醇。
j)萃取物重懸于水中，并冷凍干燥。
k)利用柱層析法，諸如0至100％梯度的HPLC分級(jí)，以獲得ADB03。
實(shí)施例2圖3所示為另一種分離名為ASB03活性級(jí)分的步驟。在此實(shí)施方案中，以上述實(shí)施例1步驟制備的粗萃取物，再用G-25-300(25×40公分)柱分離。圖4所示為自G-25管柱分離的不同級(jí)分的抗-血管生成活性。柱分離以流速為2毫升/分鐘過(guò)柱得各級(jí)分，以CPAE分析法(后述)測(cè)定級(jí)分22至30的生物活性。
實(shí)施例3內(nèi)皮細(xì)胞分析法(“CPAE”)根據(jù)Connally等人，(1986)Anal.Biochem.152136-4經(jīng)修飾(Liang及Wong(1999)ANGIOGENESISFROM THE MOLECULAR TOINTEGRATIVE PHARMACOLOGY Maradoudakis出版，KluwerAcademic/Plenum出版商，紐約)后的步驟進(jìn)行分析。牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)接種在24孔培養(yǎng)盤(pán)中，密度為10000細(xì)胞/槽孔。在37℃下，5％CO2條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)約60小時(shí)，每個(gè)樣品孔中加入樣品劑量(約50微升至約100微升)，再培養(yǎng)30分鐘，培養(yǎng)后，以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的存在，及利用ECC分析法。兩種分析法用以檢測(cè)每個(gè)孔中是否含內(nèi)皮細(xì)胞，不含樣品的對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)正常。
實(shí)施例4CAM分析絨毛膜(CAM)分析(Nguyen，M.，等人，(1994)Microvas.Res.4731-40)用以測(cè)定活性級(jí)分、萃取物或化合物在體內(nèi)模型中的效果。獲自King Valley農(nóng)場(chǎng)(Kingsburg，CA)的受精雞蛋培養(yǎng)在37℃潮濕室中，每日將雞蛋轉(zhuǎn)180度一次，第四日時(shí)，以下述的方法在蛋殼上切一小窗口；首先，以95％乙醇控試雞蛋，并在雞蛋鈍端開(kāi)一小洞，破壞鈍端處的氣室，利用鋼鋸(25齒/寸)自蛋殼取下1平方公分大小“窗口”時(shí)，絨毛膜會(huì)脫離蛋殼。以無(wú)菌Howard’s Ringer溶液洗掉任何多余的蛋殼碎片，后以玻璃紙膠帶將雞蛋窗口封住，置回培養(yǎng)箱中。4-7天后，開(kāi)啟窗口，放置無(wú)菌蓋玻片為參考點(diǎn)。測(cè)試時(shí)，用無(wú)菌針在CAM的血管間開(kāi)一小孔，將小量樣品置入小孔中，再次封住，以乳糖為對(duì)照。每日觀察有否任何抑制CAM血管發(fā)育的作用，觀察四日。
實(shí)施例5MMP分析P.C.Brooks，等人，(1996)在“基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2通過(guò)與整合蛋白ανβ3相互作用定位至侵害細(xì)胞表面‘Cell85683-93中揭示基質(zhì)金屬蛋白酶及αν/β整合蛋白相互作用的體外分析法。實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)MMP-2/ανβ3整合蛋白復(fù)合物的作用確定該樣品作用機(jī)制是否與血管生成途徑的任何破壞有關(guān)。這涉及試驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)樣品是否可抑制MMP-2與ανβ3整合蛋白的相互作用。開(kāi)始時(shí)，以抗MMP-2抗體的ELISA進(jìn)行，并測(cè)定這些抗體對(duì)樣品的結(jié)合。另外研究是否會(huì)有陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生。已知為MMP-2天然抑制物的TIMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑)用為對(duì)照組。
實(shí)施例6內(nèi)皮細(xì)胞管狀物/中心管形成分析在冰冷的96孔微量盤(pán)的每個(gè)孔中置入馬萃膠(Matrigel)(10毫克/毫升濃度，60微升；Collaborative Lab#35423)，將微量盤(pán)置于室溫下15分鐘，而后在37℃培養(yǎng)30分鐘，讓馬萃膠進(jìn)行聚合化，同時(shí)，以EGM-2(Clonetic#CC3162)制備HUVEC，濃度為2×105細(xì)胞/毫升，以相同的培養(yǎng)基制備2X所需濃度的測(cè)試化合物(5個(gè)濃度水平)，細(xì)胞(500微升)與2X級(jí)分或化合物(500微升)混合，將2份此懸浮液的200微升置于聚合的馬萃膠上。培養(yǎng)24小時(shí)后，以Bioquant Image Analysis系統(tǒng)拍下每個(gè)濃度樣品情況，每個(gè)濃度拍三張。測(cè)定所形成小管/管狀物長(zhǎng)度及交接點(diǎn)數(shù)目，與未處理對(duì)照組比較后，評(píng)估藥劑效果(IC50)。以TNP-470(NSC642492)及紫杉醇(paclitaxel)(NSC125973)為參考化合物。
實(shí)施例7內(nèi)皮細(xì)胞遷移分析利用48-孔Boyden盒子及8微米孔徑大小動(dòng)物膠原蛋白涂覆(10微克/毫升老鼠尾膠原蛋白；Collaborative Laboratories聚碳酸濾膜(Osmonics公司)評(píng)估遷移。底層盒子孔只注入27-29微升DMEM培養(yǎng)基(基礎(chǔ)線)，或含有化學(xué)吸引物(bFGF，VEGF或經(jīng)Swiss 3T3細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基)的培養(yǎng)基。上層盒子加入在DMEM+1％BSA中制備且含/不含級(jí)分或化合物的45微升HUVEC細(xì)胞懸浮液(1×106細(xì)胞/毫升)，在37℃下培養(yǎng)5小時(shí)后，以PBS潤(rùn)濕濾膜，固定，并在Diff-Quick溶液中染色。將移動(dòng)細(xì)胞面朝下方式將濾膜置于玻璃片上，且以Kimwipe去除上面的細(xì)胞，該試驗(yàn)進(jìn)行4-6個(gè)重復(fù)，每個(gè)孔計(jì)算五個(gè)視野，從刺激的對(duì)照和級(jí)分或化合物處理的數(shù)值減去陰性未刺激對(duì)照組數(shù)值，所得數(shù)據(jù)以平均遷移的細(xì)胞±S.D作圖，從所得圖形數(shù)據(jù)計(jì)算出IC50。TNP-470(NSC642492)及紫杉醇(NSC125973)用為參考化合物。
為使本發(fā)明更為清楚，雖然前述發(fā)明已通過(guò)說(shuō)明及實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但顯然可以實(shí)施某些變化及修飾。例如，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然本發(fā)明方法可與一種或多種已知抗-腫瘤、抗-血管生成性或免疫增進(jìn)治療法及組合物聯(lián)合，例如鯊魚(yú)軟骨，酷胺酸神經(jīng)鞘胺醇或神經(jīng)鞘胺醇。因此，說(shuō)明及實(shí)施例不應(yīng)理解為限制所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.自半枝鏈的組合物制備為名ASB03的生物活性級(jí)分的方法，其包括提取可溶于有機(jī)溶劑的級(jí)分，其中該級(jí)分具有光吸收值介于約200nm至約500nm。
2.權(quán)利要求1的方法，其包括步驟a)將有效量的半枝鏈浸泡于有效量的熱水中，獲得液態(tài)提取物；b)過(guò)濾該提取物，獲得名為ESBa的濾液；c)以有效量的有機(jī)溶劑萃取該濾液，獲得ESBb；d)濃縮該萃取液；及e)分離具有光吸收值介于約200nm至約450nm的級(jí)分，分離出ASB03。
3.權(quán)利要求1的方法，其包括步驟a)以乙醇萃取半枝鏈液態(tài)提取物至少兩次，獲得上清液；b)以甲醇至少萃取三次，獲得濃縮的上清液；c)以氮?dú)庹舭l(fā)甲醇；d)將該萃取物重懸于約12至約18毫升水中，并干燥；e)重懸于藥學(xué)可接受載體，獲得溶液；f)將溶液過(guò)C-18微型柱；g)以至少約35毫升水清洗該柱；h)以至少約15毫升的25％甲醇清洗該柱；i)以氮?dú)庹舭l(fā)甲醇；j)將該萃取物重懸于液態(tài)載體中；及k)利用C-18疏水HPLC層析，獲得具有光吸收值約200nm至約500nm的名為ASB03的生物活性級(jí)分。
4.由權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法所獲得的生物活性提取物。
5.包括權(quán)利要求4的提取物及藥學(xué)可接受載體的組合物。
6.包括權(quán)利要求4的提取物及抗-血管生成或免疫刺激藥劑的組合物。
7.抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括向細(xì)胞傳送生長(zhǎng)抑制量的權(quán)利要求4的提取物。
8.抑制組織血管化的方法，其包括向組織傳送抗-血管化量的權(quán)利要求4的提取物。
9.治療受體的病理性新血管生成相關(guān)疾病的方法，其包括對(duì)受體施用治療有效量的權(quán)利要求4的提取物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中疾病選自癌癥，關(guān)節(jié)炎疾病、基于新血管的皮膚病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、毛細(xì)血管擴(kuò)張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、傷口肉芽作用、血管纖維瘤、歐斯勒-偉板綜合癥、心肌血管生成和硬皮癥。
11.權(quán)利要求7或8的方法，其中疾病是選自牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎病。
12.權(quán)利要求7或8的方法，其中傳送方式選自經(jīng)口，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)和經(jīng)皮方式。
13.權(quán)利要求8的方法，其中受體是動(dòng)物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中動(dòng)物選自寵物，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物或人類(lèi)患者。
15.篩選抑制新血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的治療藥劑的方法，其包括步驟a)將藥劑與適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織樣品接觸；b)將另一份適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織與治療有效量的權(quán)利要求4的提取物接觸；及c)比較步驟(a)樣品的生長(zhǎng)與步驟(b)樣品的生長(zhǎng)，其中任何生長(zhǎng)抑制情況與步驟(b)樣品相同或相似程度的步驟(a)藥劑，為抑制新血管生成或內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的治療藥劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中接觸為體內(nèi)或體外接觸。
17.權(quán)利要求7，8或9任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括施用或傳送有效量的抗血管生成藥劑或療法。
18.權(quán)利要求7，8或9任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括施用或傳送抗腫瘤藥劑或療法。
19.治療病理性新血管生成相關(guān)疾病的試劑盒，其包括治療有效量的權(quán)利要求4的提取物和使用說(shuō)明。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中疾病選自癌癥，關(guān)節(jié)炎疾病、基于新血管的皮膚病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、再狹窄癥、毛細(xì)血管擴(kuò)張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、傷口肉芽作用、血管纖維瘤、歐斯勒-偉板綜合癥、心肌血管生成和硬皮癥。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中疾病是選自牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎病。
全文摘要
本發(fā)明涉及自半枝蓮分離出的生物活性級(jí)分的制備方法；也涉及含該活性級(jí)分的組合物及其在治療有關(guān)病理性新血管生成狀況中的用途。
文檔編號(hào)A61K36/539GK1486190SQ01822063
公開(kāi)日2004年3月31日 申請(qǐng)日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月12日
發(fā)明者汪建平 申請(qǐng)人:維克沃姆有限公司