專利名稱：滑膜細(xì)胞蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)的新蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸以及所述蛋白質(zhì)或多核苷酸的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及一種有望用作RA特異性診斷標(biāo)記的新蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明還涉及一種新基因，該基因可為開(kāi)發(fā)用于治療RA的藥物提供新的方法。
背景技術(shù)：
RA是全身性的慢性炎癥，其中關(guān)節(jié)滑膜組織處可見(jiàn)異常增生?；ぜ?xì)胞是成纖維樣細(xì)胞，它形成關(guān)節(jié)滑膜的1至6層上皮樣層，據(jù)認(rèn)為它可為滑液提供蛋白聚糖和透明質(zhì)酸。在RA患者的關(guān)節(jié)中，可觀察到滑膜組織增生，以及多層結(jié)構(gòu)所致的癥狀和由此導(dǎo)致的滑膜細(xì)胞浸潤(rùn)至其它組織。另外，RA患者的血清含有針對(duì)其自身IgG的Fc結(jié)構(gòu)域的自身抗體。因此，人們認(rèn)為RA是自身免疫病，但仍未闡明其病因。
長(zhǎng)期以來(lái)，人們將上述識(shí)別自身IgG的自身抗體的存在用作RA的特征性診斷指標(biāo)。最近，已可以買到含有經(jīng)修飾的人IgG作為主要成分的自身抗體檢測(cè)試劑盒。該自身抗體也被稱為RA因子?；跈z測(cè)RA因子以診斷RA在診斷疾病的特異性方面存在問(wèn)題，另一問(wèn)題是由于尚未闡明產(chǎn)生抗體所依賴的系統(tǒng)，因此仍不清楚RA因子與病因的關(guān)系。
當(dāng)從體內(nèi)的多個(gè)免疫反應(yīng)和伴隨著骨損壞的關(guān)節(jié)滑膜增生疾病這兩個(gè)方面檢查RA的病理學(xué)時(shí)，進(jìn)行了與所述免疫反應(yīng)有關(guān)的多項(xiàng)研究，其分子機(jī)理即將被闡明。然而，盡管與關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞有關(guān)的研究是RA研究的主要方面，但目前仍沒(méi)有闡明其細(xì)胞生物學(xué)特征。闡明RA與其它慢性和難治疾病之開(kāi)始和進(jìn)展背后所隱藏的分子機(jī)理是診斷、預(yù)防和治愈疾病所必需的。另外，在社會(huì)老齡化未顯示出停止跡象的現(xiàn)行形勢(shì)下，從社會(huì)學(xué)的觀點(diǎn)上看，闡明老化疾病RA的病理學(xué)也是一個(gè)重要問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的蛋白質(zhì)和編碼該蛋白質(zhì)的新基因，所述蛋白質(zhì)可為診斷和治療RA提供新的方法。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)和編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸與RA的成因密切相關(guān)，并能為診斷提供有用的信息，還可在開(kāi)發(fā)治療技術(shù)時(shí)導(dǎo)致新藥的產(chǎn)生。另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供表達(dá)了編碼所述蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及缺損所述基因的敲除動(dòng)物。這些動(dòng)物可用于分析本發(fā)明基因的功能，還可在開(kāi)發(fā)RA治療方法和治療藥物中用作模型動(dòng)物。
本發(fā)明人使用得自RA患者的、經(jīng)培養(yǎng)的人滑膜細(xì)胞作為免疫原獲得抗-人滑膜細(xì)胞抗體，并使用該抗體對(duì)RA患者滑膜細(xì)胞的cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，從而成功地分離出在RA患者的滑膜組織中表達(dá)的新基因。表達(dá)該基因的組織是滑膜細(xì)胞，因此將該基因編碼的蛋白質(zhì)稱為滑膜蛋白(Synoviolin)。
本發(fā)明人已證實(shí)抗-人滑膜細(xì)胞抗體與上述培養(yǎng)滑膜細(xì)胞的約80-kDa、140-kDa和220-kDa分子量組分的反應(yīng)性被上述滑膜蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物吸收。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些帶和上述滑膜蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)出與RA患者血液中存在的抗體的反應(yīng)性。另外，發(fā)明人還證實(shí)抗-人滑膜細(xì)胞抗體表現(xiàn)出與RA患者滑膜組織的強(qiáng)反應(yīng)性。
此外，本發(fā)明人使用生物化學(xué)連鎖實(shí)驗(yàn)闡明了滑膜蛋白配體(SL)的存在，所述配體是滑膜蛋白的天然配體。SL是由本發(fā)明人首次分離到的身為滑膜蛋白配體的蛋白質(zhì)。然而，當(dāng)發(fā)明人嘗試以編碼SL的DNA的核苷酸序列為基礎(chǔ)進(jìn)行檢索時(shí)，發(fā)現(xiàn)被稱為S1-5的已知基因的5’末端結(jié)構(gòu)域和3’末端結(jié)構(gòu)域包括共同的核苷酸序列。本發(fā)明人分離的SL和S1-5在DNA部分序列以及基因大小、表達(dá)產(chǎn)物的分子量等方面幾乎相同，因此，它們很有可能是相同的蛋白質(zhì)。S1-5[也被稱為“FBNL”(原纖蛋白-樣)或“EFEMP1”(含EGF的原纖蛋白-樣胞外基質(zhì)蛋白1)]作為人二倍體成纖維細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的基因被分離得到(Lecka-Czernik，B等，Molecular and Cellular Biology，15，120-128，1995)。在結(jié)構(gòu)上，它具有能促進(jìn)DNA合成的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)-樣結(jié)構(gòu)域。已發(fā)現(xiàn)S1-5的結(jié)構(gòu)和核酸合成促進(jìn)活性(細(xì)胞增殖活性)。另外，最近的報(bào)道表明S1-5的突變與Malattia Leventinese(ML)和Doyne蜂窩狀視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良(DHRD)有關(guān)(Stone，E.M等，Nature Genetics 22，199-202，1999)，但不知其與RA的關(guān)系。另外，不用說(shuō)，與滑膜蛋白的親和性是本發(fā)明人獲得的全新認(rèn)識(shí)。
此外，本發(fā)明人通過(guò)導(dǎo)入滑膜蛋白基因制備出轉(zhuǎn)基因小鼠，并且制備出缺損滑膜蛋白基因的敲除小鼠，并觀察了它們的表型。當(dāng)在小鼠體內(nèi)過(guò)量表達(dá)滑膜蛋白分子時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜增生以及骨和軟骨的損壞，因此表現(xiàn)出與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎極其相似的癥狀。另一方面，當(dāng)將滑膜蛋白基因完全(純合地)缺損時(shí)，可在小鼠的胎兒期發(fā)現(xiàn)不完整的肢芽和骨骼形成。這些表型暗示滑膜蛋白不僅對(duì)滑膜組織起作用，對(duì)軟骨和骨組織的產(chǎn)生、分化、再生和代謝也有作用。另外，在滑膜蛋白過(guò)表達(dá)小鼠的關(guān)節(jié)病損害中，滑膜、軟骨和骨組織中的代謝和再生被積極誘導(dǎo)。這些結(jié)果清楚地表明滑膜蛋白分子對(duì)RA和其它形式的關(guān)節(jié)病起作用。另外，已證實(shí)滑膜蛋白過(guò)表達(dá)小鼠可用作關(guān)節(jié)病模型動(dòng)物。
根據(jù)這一新認(rèn)識(shí)，本發(fā)明人闡明了滑膜蛋白及其基因、其抗體或配體在醫(yī)學(xué)治療或診斷中的用途，從而完成本發(fā)明。另外，本發(fā)明人通過(guò)導(dǎo)入滑膜蛋白基因制備出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并闡明該動(dòng)物作為RA疾病模型的用途。另外，本發(fā)明人通過(guò)用lacZ基因取代滑膜蛋白基因制備出嵌入(knock-in)動(dòng)物?；さ鞍谆蚯贸蚻acZ基因嵌入的動(dòng)物使分析缺乏滑膜蛋白基因的后果成為可能，并且也能允許通過(guò)檢測(cè)由滑膜蛋白基因內(nèi)源性啟動(dòng)子表達(dá)的LacZ(為β-半乳糖苷酶活性)，容易地檢測(cè)出滑膜蛋白基因啟動(dòng)子的活性。使用該嵌入動(dòng)物，能夠?qū)φ{(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的化合物進(jìn)行篩選。據(jù)認(rèn)為通過(guò)抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)中的滑膜蛋白基因過(guò)量表達(dá)，應(yīng)該也可以預(yù)防滑膜增生和緩解疾病。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的基因與RA疾病的主要病因，即滑膜組織增生密切相關(guān)，為RA的診斷提供了極其重要的信息。另外，從對(duì)滑膜組織增生(RA的病因)所起的作用上看，可以認(rèn)為本發(fā)明的基因、其表達(dá)產(chǎn)物、抗此表達(dá)產(chǎn)物的自身抗體，以及該表達(dá)產(chǎn)物的配體是解釋RA的病理學(xué)所必不可少的物質(zhì)。特別是，在RA患者的血液中發(fā)現(xiàn)了能識(shí)別滑膜蛋白的自身抗體，該發(fā)現(xiàn)為RA的診斷提供了全新的方法。另外，這些物質(zhì)在開(kāi)發(fā)RA治療方法時(shí)也可導(dǎo)致嶄新的方法。
另外，被鑒定為滑膜蛋白配體的S1-5的突變與ML和DHRD有關(guān)，因此滑膜蛋白也可能對(duì)這些疾病起作用。因此，可以使用滑膜蛋白診斷這些疾病，而能調(diào)節(jié)滑膜蛋白配體與滑膜蛋白結(jié)合的化合物或能用作滑膜蛋白配體的化合物可成為這些疾病的候選藥物。
另外，在發(fā)育過(guò)程中，滑膜蛋白在未分化的間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。因此，可將滑膜蛋白用作細(xì)胞標(biāo)記，用于在細(xì)胞分選儀等中分離未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。如此分離的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞可用于體外組織再生。如果能夠在體外重構(gòu)關(guān)節(jié)，那么這將對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和遭受關(guān)節(jié)損害的很多患者的再生醫(yī)療很有用處。
即，本發(fā)明涉及下述滑膜蛋白蛋白質(zhì)、其抗體、編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸、其用途、滑膜蛋白配體及其用途，以及滑膜蛋白基因的表達(dá)被修飾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其用途。
下述(a)至(e)任意一項(xiàng)記載的多核苷酸(a)編碼由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，(c)編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列，但其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加的蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)的功能等同于由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(d)在嚴(yán)緊條件下能與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸，所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)功能等同于由SEQ IDNO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，和(e)含有與SEQ ID NO1所示核苷酸序列具有至少70％或更高同一性的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)功能等同于由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
編碼由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的部分肽的多核苷酸。
由根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)或肽。
根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽，它具有至少一個(gè)選自下述(1)至(3)的活性(1)與在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血液中發(fā)現(xiàn)的抗體結(jié)合，(2)與滑膜蛋白配體S1-5結(jié)合，和(3)促使滑膜增生。
插入根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的載體。
攜有根據(jù)[1]的多核苷酸或根據(jù)[5]的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
制備根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括下述步驟培養(yǎng)根據(jù)[6]的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞或培養(yǎng)上清中回收表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽。
與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的抗體。
用于分析能識(shí)別根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽的抗體的免疫分析試劑，所述試劑含有根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽。
根據(jù)[9]的免疫分析試劑，其中該試劑被用于診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或判斷治療效果。
用于分析根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的免疫分析試劑，所述試劑含有能與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)的抗體。
根據(jù)[11]的免疫分析試劑，其中該試劑被用于診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或判斷治療效果。
根據(jù)[12]的免疫分析試劑，其中待分析的根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)存在于滑膜細(xì)胞中。
測(cè)定生物樣品中的抗體的方法，其中所述抗體與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)和/或其部分肽結(jié)合，所述方法包括下述步驟(1)使生物樣品與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)和/或其部分肽接觸，和(2)檢測(cè)與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)和/或其部分肽結(jié)合的抗體。
測(cè)定生物樣品中的根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)和/或其部分肽的方法，所述方法包括下述步驟(1)使生物樣品與根據(jù)[8]的抗體接觸，和(2)檢測(cè)根據(jù)[8]的抗體，其中所述抗體與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)和/或其部分肽結(jié)合。
含有至少15個(gè)核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。
測(cè)定生物樣品中的根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟(1)使生物樣品與根據(jù)[16]的多核苷酸接觸，和(2)檢測(cè)根據(jù)[16]的多核苷酸，其中所述多核苷酸與根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸雜交。
測(cè)定根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的試劑盒，所述試劑盒含有根據(jù)[16]的多核苷酸。
檢測(cè)或分離表達(dá)根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的細(xì)胞的方法，所述方法以所述蛋白質(zhì)或編碼所述蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)為指標(biāo)。
根據(jù)[19]的方法，其中所述細(xì)胞是類風(fēng)濕的滑膜細(xì)胞。
根據(jù)[19]的方法，其中所述細(xì)胞是未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。
檢測(cè)或分離表達(dá)根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的細(xì)胞的試劑，所述試劑含有根據(jù)[8]的抗體。
檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記是選自根據(jù)[1]的多核苷酸、根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)、根據(jù)[3]的肽、與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體和與根據(jù)[3]的肽結(jié)合的抗體中的至少一種，所述方法包括下述步驟i)檢測(cè)受試者生物樣品中存在的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎標(biāo)記，和ii)將步驟i)的檢測(cè)結(jié)果與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相聯(lián)系。
根據(jù)[23]的方法，其中生物樣品是受試者的血液，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記是與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體和/或與根據(jù)[3]的肽結(jié)合的抗體。
根據(jù)[23]的方法，其中生物樣品是受試者的滑膜組織或滑膜細(xì)胞，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記是根據(jù)[1]的多核苷酸和/或根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)。
檢測(cè)受試化合物與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合活性的方法，所述方法包括下述步驟a)使受試化合物與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽接觸，和b)觀察受試化合物與所述蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合。
篩選對(duì)根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽具有結(jié)合活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)[26]的方法檢測(cè)受試化合物與根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合活性，和b)選擇所述結(jié)合活性高于對(duì)照的受試化合物。
檢測(cè)阻斷根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)與其配體結(jié)合的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在受試化合物的存在下使根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽與其配體接觸，和b)檢測(cè)與所述蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的配體和/或受試化合物。
根據(jù)[28]的方法，其中配體是滑膜蛋白配體S1-5。
篩選對(duì)根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合具有阻斷活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)[28]的方法檢測(cè)受試化合物阻斷根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合的活性，和b)選擇所述阻斷活性高于對(duì)照的受試化合物。
檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)經(jīng)由根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在存在或不存在所述蛋白質(zhì)的配體時(shí)，使受試化合物與所述蛋白質(zhì)接觸，和b)檢測(cè)經(jīng)由所述蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
篩選具有調(diào)節(jié)經(jīng)由根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)[31]的方法檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)經(jīng)由所述蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性，和b)選擇所述調(diào)節(jié)活性高于對(duì)照的受試化合物。
檢測(cè)調(diào)節(jié)根據(jù)[1]的多核苷酸表達(dá)的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在受試化合物的存在下培養(yǎng)表達(dá)根據(jù)[1]的多核苷酸的細(xì)胞，和b)測(cè)定所述多核苷酸的表達(dá)水平。
篩選能調(diào)節(jié)根據(jù)[1]的多核苷酸表達(dá)的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)[33]的方法檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)根據(jù)[1]的多核苷酸表達(dá)的活性，和b)選擇所述活性與對(duì)照相比有所不同的受試化合物。
滑膜蛋白刺激劑，所述刺激劑含有通過(guò)根據(jù)[27]的篩選方法獲得的化合物作為活性成分。
滑膜蛋白和滑膜蛋白配體之間的結(jié)合阻斷劑，所述阻斷劑含有通過(guò)根據(jù)[30]的篩選方法獲得的化合物作為活性成分。
滑膜增生阻斷劑，所述阻斷劑含有通過(guò)根據(jù)[30]或[32]的篩選方法獲得的化合物作為活性成分。
藥物組合物，其含有選自根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸，根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽和根據(jù)[5]的載體的任一組分作為活性成分。
轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的表達(dá)被修飾，或所述修飾是可誘導(dǎo)的。
根據(jù)[39]的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸是經(jīng)外源導(dǎo)入的。
根據(jù)[40]的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中所述脊椎動(dòng)物是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物。
轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中根據(jù)[1]或[2]的內(nèi)源性多核苷酸的表達(dá)被抑制。
根據(jù)[42]的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中嵌入了其它基因。
得自根據(jù)[40]或[42]的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物的細(xì)胞。
檢測(cè)調(diào)節(jié)根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)使受試化合物與表達(dá)系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)在根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子的控制之下能表達(dá)報(bào)道基因，和b)測(cè)定報(bào)道基因的表達(dá)水平。
根據(jù)[45]的方法，其中所述表達(dá)系統(tǒng)是根據(jù)[43]的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物或得自所述脊椎動(dòng)物的細(xì)胞。
篩選能調(diào)節(jié)根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)[45]的方法測(cè)定受試化合物調(diào)節(jié)根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性的活性，和b)選擇所述活性與對(duì)照相比有所不同的受試化合物。
用于調(diào)節(jié)根據(jù)[1]的多核苷酸表達(dá)的藥物組合物，所述藥物組合物含有通過(guò)根據(jù)[34]或[47]的篩選方法得到的化合物作為活性成分。
此外，本發(fā)明涉及刺激滑膜蛋白的方法，所述方法包括施用通過(guò)根據(jù)[27]的篩選方法得到的化合物的步驟。或者，本發(fā)明涉及阻斷滑膜蛋白與滑膜蛋白配體結(jié)合的方法，所述方法包括施用通過(guò)根據(jù)[30]的篩選方法得到的化合物的步驟。另外，本發(fā)明涉及阻斷滑膜增生的方法，所述方法包括施用通過(guò)根據(jù)[30]或[32]的篩選方法得到的化合物的步驟。另外，本發(fā)明涉及促進(jìn)滑膜增生的方法，所述方法包括施用選自根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸，根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽和根據(jù)[5]的載體的任一組分的步驟。另外，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)根據(jù)[1]的多核苷酸表達(dá)的方法，所述方法包括施用通過(guò)根據(jù)[34]或[47]的篩選方法得到的化合物的步驟。
另外，本發(fā)明涉及通過(guò)根據(jù)[27]的篩選方法得到的化合物用于制備滑膜蛋白刺激劑的用途?；蛘撸景l(fā)明涉及通過(guò)根據(jù)[30]的篩選方法得到的化合物用于制備阻斷滑膜蛋白和滑膜蛋白配體之間的結(jié)合的結(jié)合阻斷劑的用途。另外，本發(fā)明涉及通過(guò)根據(jù)[30]或[32]的篩選方法得到的化合物用于制備滑膜增生阻斷劑的用途。另外，本發(fā)明涉及選自根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸，根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)或肽和根據(jù)[5]的載體的任一組分用于制備滑膜增生促進(jìn)劑的用途。另外，本發(fā)明涉及通過(guò)根據(jù)[34]或[47]的篩選方法得到的化合物用于制備調(diào)節(jié)根據(jù)[1]的多核苷酸表達(dá)的藥物組合物的用途。
本發(fā)明提供了編碼滑膜蛋白的多核苷酸，其含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA或RNA。另外，它也可包括經(jīng)修飾的核苷酸?？赏ㄟ^(guò)已知方法(Nucleic Acid Res.167583-7600，1988)，從RA患者的滑膜細(xì)胞中克隆編碼本發(fā)明的滑膜蛋白的多核苷酸。具體地說(shuō)，基于提取自滑膜細(xì)胞的mRNA獲得cDNA文庫(kù)，所述細(xì)胞得自出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的組織，其中從RA患者體內(nèi)回收該組織以作為滑膜組織或經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞(Nucleic Acid Res.167583，1988)?？梢允褂没赟EQID NO1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)的探針，通過(guò)篩選與探針雜交的克隆從所述文庫(kù)中分離滑膜蛋白基因。
本發(fā)明還包括編碼功能等同于上述滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的多核苷酸。在本發(fā)明中，編碼功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的多核苷酸被稱為功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸。首先，功能等同的蛋白質(zhì)被定義為在免疫學(xué)上等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)。即，在本發(fā)明中，功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)可以是滑膜蛋白的結(jié)構(gòu)域，只要它能與RA患者血清中存在的、特異性識(shí)別滑膜蛋白的抗體反應(yīng)即可?；蛘?，它也可以是含有該免疫活性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)使用RA患者的血清系列和正常人的血清來(lái)篩選滑膜蛋白的片段，可以容易地選擇其突變體。
基于免疫學(xué)特征以及與SL(S1-5)結(jié)合的特征來(lái)定義功能等同于本發(fā)明的滑膜蛋白的蛋白質(zhì)。即，本發(fā)明包括對(duì)SL(S1-5)有親和性的滑膜蛋白片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)使用SL(S1-5)來(lái)篩選候選蛋白質(zhì)可以容易地選擇其突變體。例如，如實(shí)施例所示，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的SL(S1-5)為了與滑膜蛋白結(jié)合，需要對(duì)應(yīng)于滑膜蛋白cDNA第1233-1592位的120個(gè)氨基酸殘基。因此，由構(gòu)成該結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或包括該氨基酸序列的蛋白質(zhì)組成了功能等同于本發(fā)明的滑膜蛋白的蛋白質(zhì)?？捎米鱏L的蛋白質(zhì)可以是由登錄號(hào)AAA65590(核苷酸登錄號(hào)U03877)，I38449，NP_061489(核苷酸登錄號(hào)NM_018894)，NP_004096(核苷酸登錄號(hào)NM_004105)或Q12805鑒定的S1-5蛋白，或是具有與人滑膜蛋白蛋白(SEQID NO2)結(jié)合的活性的類似蛋白質(zhì)(Lecka-Czemik，B等，Mol.Cell.Biol.15.120-128，1995；Heon，E等，Arch.Ophthalmol.114，193-198，1996；Ikegawa，S等，Genomics 35，590-592，1996；Katsanis，N等，Hum.Genet.106，66-72，2000；Giltay，R等，Matrix Biol.18，469-480，1999；Stone，E.M等，Nat.Genet.22，199-202，1999)。
另外，功能等同于人滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的例子包括具有促進(jìn)滑膜增生之活性的蛋白質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入人滑膜蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出腳趾腫脹，并伴隨有顯著頻率的關(guān)節(jié)炎。從組織學(xué)上看，在其腳趾關(guān)節(jié)中觀察到伴隨有滑膜增生的骨損壞和異常骨生成。也可以基于促進(jìn)滑膜增生的活性來(lái)定義功能等同于人滑膜蛋白蛋白的蛋白質(zhì)。通過(guò)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或者通過(guò)將基因局部導(dǎo)入關(guān)節(jié)中，或者通過(guò)在體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)即可證實(shí)對(duì)滑膜增生的促進(jìn)作用。下文將描述使用本發(fā)明的多核苷酸獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
功能等同于人滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的例子包括具有對(duì)正常骨形成和四肢發(fā)育有貢獻(xiàn)的活性的蛋白質(zhì)。在發(fā)育過(guò)程中，頂骨、四肢、耳等形成骨和軟骨的區(qū)域大量表達(dá)滑膜蛋白，在四肢形成期，在尖端外胚層嵴(AER)以及軟骨和骨的原基中觀察到強(qiáng)表達(dá)。通過(guò)擊靶敲除了內(nèi)源性滑膜蛋白基因的敲除小鼠胚胎從頂骨區(qū)至臀部的長(zhǎng)度短，并且呈現(xiàn)出提前形成頭顱和四肢的趨勢(shì)。純合子表現(xiàn)出肢芽、上下頜骨和耳的形態(tài)異常，很有可能導(dǎo)致胎鼠死亡?；さ鞍谆蚣兒系那贸∈笤谔浩诒憩F(xiàn)出肢芽形成的異常；未發(fā)現(xiàn)軟骨和骨的形成；在肢芽和產(chǎn)生軟骨和骨的區(qū)域發(fā)現(xiàn)了滑膜蛋白的表達(dá)，由此闡明滑膜蛋白分子對(duì)骨骼形成和四肢發(fā)育有貢獻(xiàn)。
在使用基于外植塊方法的培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行分析時(shí)，僅在據(jù)認(rèn)為是軟骨、骨和四肢原基的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了滑膜蛋白敲除(lacZ基因嵌入)小鼠胚胎的肢芽細(xì)胞中的LacZ表達(dá)。另外，經(jīng)堿性磷酸酶染色，Kossa染色或其它方法證實(shí)在得自純合敲除小鼠的細(xì)胞中，形成骨和軟骨的能力被延遲。據(jù)認(rèn)為，通過(guò)產(chǎn)生敲除動(dòng)物，或通過(guò)分析體外培養(yǎng)的骨和軟骨細(xì)胞的標(biāo)記基因表達(dá)以及分析骨形成能力，即可闡明對(duì)正常骨形成和四肢發(fā)育的貢獻(xiàn)。另外，通過(guò)施用由本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，或通過(guò)編碼所述蛋白質(zhì)的DNA或RNA的表達(dá)可恢復(fù)失去的功能這一事實(shí)，可在所述多核苷酸的表達(dá)受到抑制的敲除動(dòng)物或經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞中證實(shí)某種蛋白質(zhì)具有對(duì)正常骨形成和四肢發(fā)育有貢獻(xiàn)的活性的事實(shí)。
另外，也可以基于滑膜蛋白的生物化學(xué)活性來(lái)定義功能等同于本發(fā)明的滑膜蛋白的蛋白質(zhì)。例如，可將滑膜蛋白的生物化學(xué)活性定義為酪氨酸激酶或遍在蛋白連接酶活性。通過(guò)在滑膜蛋白中發(fā)現(xiàn)的多個(gè)基元和實(shí)施例的結(jié)果可以證實(shí)這些生物化學(xué)活性。即，本發(fā)明包括保留了滑膜蛋白所具有的生物化學(xué)活性中的至少一個(gè)活性的滑膜蛋白片段。下文將具體描述證實(shí)滑膜蛋白的生物化學(xué)活性的方法和維持各個(gè)生物化學(xué)活性的結(jié)構(gòu)域。
這些功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)可與其它蛋白質(zhì)形成融合蛋白。例如，所述功能等同的蛋白質(zhì)也包括可添加FLAG標(biāo)記、HA標(biāo)記、組氨酸標(biāo)記等附加氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)保留了上述功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的至少一個(gè)特性。甚至在添加的蛋白質(zhì)具有不同于滑膜蛋白的活性的情況下，所述融合蛋白也包括在本發(fā)明的功能等同的蛋白質(zhì)中，只要該融合蛋白保留了滑膜蛋白的至少一個(gè)功能即可。
本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知方法(Jikken Igaku Bessatsu*Idenshi K*gakuHandobukku[Experi-mental Medicine，Supplement-Genetic EngineeringHandbook]，pp.246-251，Yodosha Co.，Ltd.，1991)也可分離由在上述本發(fā)明的多核苷酸中含有突變的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸。例如，如果使用SEQ IDNO1(或其片段)所示的核苷酸序列作為探針，對(duì)含有類似基因的文庫(kù)進(jìn)行篩選，即可克隆出具有高水平同源性的核苷酸序列的DNA?？梢允褂媚硞€(gè)在SEQ ID NO1的核苷酸序列中包括隨機(jī)突變的文庫(kù)，得自非人動(dòng)物的滑膜組織的cDNA文庫(kù)等作為上述文庫(kù)。
在給定核苷酸序列中隨機(jī)添加突變的已知方法的例子包括通過(guò)用亞硝酸處理DNA來(lái)取代堿基對(duì)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，797258-7260，1982)。使用該方法可通過(guò)用亞硝酸處理導(dǎo)入突變的區(qū)段而在特定的區(qū)段隨機(jī)導(dǎo)入堿基對(duì)取代。也可以使用帶缺口的雙鏈體等方法(Methods in Enzymol.，154350-367，1987)作為在任意位置導(dǎo)入目的突變的技術(shù)。將克隆有待突變基因的環(huán)狀雙鏈載體制備成單鏈，并與在靶位置具有突變的合成寡核苷酸雜交。使得自經(jīng)限制性酶切割的線形化載體的互補(bǔ)單鏈DNA與上述環(huán)狀單鏈載體退火。用DNA聚合酶補(bǔ)平上述合成的核苷酸和互補(bǔ)單鏈DNA之間的缺口，進(jìn)行連接以形成完整的雙鏈環(huán)狀載體。
據(jù)認(rèn)為經(jīng)修飾的氨基酸的數(shù)目一般為50個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選為30個(gè)氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選為5個(gè)氨基酸或更少(例如1個(gè)氨基酸)。
據(jù)認(rèn)為，當(dāng)氨基酸被人工取代時(shí)，如果它們被具有類似特性的氨基酸所取代，更容易維持初始蛋白質(zhì)的活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括在上述氨基酸取代中添加保守取代，且功能等同于人滑膜蛋白蛋白(SEQ ID NO2)的蛋白質(zhì)。據(jù)認(rèn)為，當(dāng)在對(duì)蛋白質(zhì)的活性至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)域等中取代氨基酸時(shí)，保守取代十分重要。氨基酸的保守取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
保守取代的氨基酸組的例子包括堿性氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，不帶電的極性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非極性氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)，β-分支的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)，芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和組氨酸)等。
另外，據(jù)認(rèn)為非-保守取代可增加蛋白質(zhì)的活性(例如包括組成活性蛋白質(zhì)等)或降低所述活性(例如包括顯性失活蛋白質(zhì)等)。
具有根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，且功能等同于由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)也包括天然蛋白質(zhì)。從干擾素基因等中發(fā)現(xiàn)，真核生物的基因一般具有多態(tài)性。因所述多態(tài)性引起的核苷酸序列的改變可包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加的情況。本發(fā)明還包括天然存在的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是具有根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，且功能等同于由SEQID NO2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
實(shí)際上，本發(fā)明人已從多個(gè)個(gè)體中克隆出本發(fā)明的基因，并通過(guò)測(cè)定其核苷酸序列，證實(shí)了缺失了一個(gè)氨基酸的克隆。本發(fā)明包括在上述氨基酸序列中包括突變的蛋白質(zhì)和含有編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多核苷酸。由本發(fā)明人證實(shí)的缺失一個(gè)氨基酸的克隆的核苷酸序列示于SEQ IDNO6，由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO7。SEQ ID NO6的核苷酸序列缺乏對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1第1293-1295位的gca。結(jié)果，根據(jù)SEQ ID NO7的氨基酸序列缺乏SEQ ID NO2第412位的丙氨酸。
或者，在某些情況下，即使因多態(tài)性而使核苷酸序列有變化，但氨基酸序列可能不變。核苷酸序列中的這種突變被稱為沉默突變。本發(fā)明還包括含有具有沉默突變的核苷酸序列的基因。本文中提及的多態(tài)性指的是一組個(gè)體中的某個(gè)基因具有不同的核苷酸序列。多態(tài)性與發(fā)現(xiàn)不同基因的比率無(wú)關(guān)。
另外，獲得功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的方法可包括例如利用雜交的方法等。即，在該方法中，將編碼SEQ ID NO1所示的本發(fā)明滑膜蛋白的多核苷酸或其片段用作探針，分離出能與其雜交的多核苷酸。如果在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交，則可選擇出具有高同源性的多核苷酸作為核苷酸序列，因此，在分離出的蛋白質(zhì)中含有功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的可能性變得更大。具有高同源性的核苷酸序列被定義為例如70％或更高的相同性，或優(yōu)選為90％或更高的相同性。
嚴(yán)緊條件的例子包括例如以下條件在6×SSC，40％甲酰胺和25℃雜交，并在1×SSC和55℃洗滌。而嚴(yán)緊度受諸如鹽濃度、甲酰胺濃度或溫度之類的條件的影響，顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)置這些條件，從而獲得所需的嚴(yán)緊度。
通過(guò)使用雜交，可以在例如非人動(dòng)物中分離出編碼滑膜蛋白同系物的多核苷酸。由可得自小鼠、大鼠、兔、豬、山羊或其它非人動(dòng)物的多核苷酸編碼的滑膜蛋白同系物組成了本發(fā)明的功能等同的蛋白質(zhì)。
對(duì)本發(fā)明的多核苷酸的來(lái)源沒(méi)有限制。即，它可得自cDNA，基因組DNA或合成。另外，它可包括基于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而具有任意核苷酸序列的多核苷酸，只要它能編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)即可。
通過(guò)在人滑膜蛋白(SEQ ID NO2)中導(dǎo)入突變而獲得的蛋白質(zhì)，和由使用上述雜交技術(shù)等分離出的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)一般在氨基酸序列水平上與人滑膜蛋白(SEQ ID NO2)具有高同源性。高同源性指的是序列具有30％或更高的相同性，優(yōu)選為50％或更高的相同性，或更優(yōu)選為80％或更高(例如95％或更高)的相同性。使用國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)可以測(cè)定核苷酸和氨基酸序列的同一性[例如日本的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)中，可以使用FASTA，BLAST，PSI-BLAST，SSEARCH等同源性檢索[例如日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)網(wǎng)站的同源性檢索(Search and Analysis)網(wǎng)頁(yè)http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]和國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，可進(jìn)行使用BLAST的檢索(例如NCBI主頁(yè)網(wǎng)站的BLAST網(wǎng)頁(yè)http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；Altschul，S.F等，J.Mol.Biol.，1990，215(3)403-10；Altschul，S.F.&Gish，W.，Meth.Enzymol.，1996，266460-480；Altschul，S.F等，Nucleic Acids Res.，1997，253389-3402)]。
例如，可在高級(jí)BLAST 2.1中，通過(guò)使用blastp作為程序，將Expect值設(shè)置為10，將所有Filter設(shè)置為OFF，使用BLOSUM62作為Matrix，將Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索以對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算。然后即可獲得同一性的值(％)(Karlin，S和S.F.Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-68；Karlin，S和S.F.Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-7)。
本發(fā)明提供了這些多核苷酸除生產(chǎn)蛋白質(zhì)外的應(yīng)用。即，本發(fā)明包括針對(duì)編碼由本發(fā)明提供的滑膜蛋白的多核苷酸或其部分的反義多核苷酸。反義多核苷酸優(yōu)選具有的鏈長(zhǎng)度約為15-20個(gè)核苷酸，以有效阻斷基因轉(zhuǎn)錄。如果滑膜蛋白支持滑膜細(xì)胞異常增生，那么，滑膜蛋白反義多核苷酸在治療RA中具有主要作用。從控制基因表達(dá)的角度出發(fā)，不僅可以設(shè)計(jì)反義多核苷酸，也可以設(shè)計(jì)核酶。即，可以設(shè)計(jì)能識(shí)別和切割由SEQ ID NO1所示DNA的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的RNA的核酶。
本發(fā)明還涉及鏈長(zhǎng)至少為15個(gè)核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。這些多核苷酸是鏈長(zhǎng)優(yōu)選為20或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為25或更多個(gè)核苷酸，或甚至更優(yōu)選為30或更多個(gè)核苷酸，且與本發(fā)明的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)的多核苷酸?！盎パa(bǔ)鏈”表示對(duì)應(yīng)于由堿基對(duì)A∶T(或?qū)NA而言為U)和G∶C組成的雙鏈核酸中的一條鏈的另一條鏈。另外，“互補(bǔ)”的定義并不僅限于在至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在完全互補(bǔ)的序列，還包括在核苷酸序列水平上同源性至少為70％，優(yōu)選為至少80％，更優(yōu)選為90％，甚至更優(yōu)選為95％或更高的核苷酸序列。測(cè)定同源性所用的算法可以是本文中提及的一種算法。所述多核苷酸包括例如與上述本發(fā)明的多核苷酸雜交，且鏈長(zhǎng)至少為15個(gè)核苷酸的多核苷酸。
優(yōu)選雜交特異于本發(fā)明的多核苷酸。在本文中，術(shù)語(yǔ)“特異于”指的是在嚴(yán)緊雜交條件下，不會(huì)與編碼其它蛋白質(zhì)的多核苷酸發(fā)生顯著的交叉雜交。
這些多核苷酸可用作探針和引物，用于檢測(cè)和擴(kuò)增滑膜蛋白基因。優(yōu)選本發(fā)明的探針和引物的鏈長(zhǎng)至少約為15聚體，并且具有能與SEQ IDNO1的核苷酸序列中的、特異于滑膜蛋白的序列雜交的多核苷酸序列，使得在給定嚴(yán)緊度下能夠發(fā)生特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)給定的核苷酸序列，能夠容易地設(shè)計(jì)出有用的核苷酸序列以用作探針或引物。使用基于本發(fā)明提供的滑膜蛋白基因-特異性的探針或引物，可以對(duì)滑膜細(xì)胞樣品進(jìn)行原位雜交和PCR。由于RA患者的滑膜組織中強(qiáng)表達(dá)滑膜蛋白，人們認(rèn)為掌握細(xì)胞中的表達(dá)狀況可以為了解RA關(guān)節(jié)炎的癥狀提供重要的信息。
本發(fā)明的新蛋白質(zhì)滑膜蛋白可得自RA患者的滑膜組織。由于可在體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，因此可從該培養(yǎng)物中回收滑膜蛋白。具體地說(shuō)，可經(jīng)滑膜切除術(shù)以手術(shù)的方式從RA患者體內(nèi)取出滑膜組織等，并從中分離出滑膜細(xì)胞。通過(guò)培養(yǎng)分離的細(xì)胞，可以象回收粘著細(xì)胞一樣來(lái)回收滑膜細(xì)胞(J.Clin.Invest.92186-193，1993)。通過(guò)已知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)的組合，從回收的細(xì)胞中提取和純化滑膜蛋白。
本發(fā)明不僅包括提取自滑膜細(xì)胞的人滑膜蛋白，還包括功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)。即，可以人工或天然產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括突變的蛋白質(zhì)，該突變蛋白具有人滑膜蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO2)，但其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，其功能等同于人滑膜蛋白。對(duì)這些蛋白質(zhì)中的氨基酸突變的數(shù)目或位置沒(méi)有限制，只要能保持滑膜蛋白的功能即可。
通過(guò)使用蛋白酶消化即可獲得滑膜蛋白的片段。另外，通過(guò)隨機(jī)切割編碼SEQ ID NO1所示滑膜蛋白的DNA，并將其插入噬菌體載體以產(chǎn)生呈遞結(jié)構(gòu)域肽的噬菌體文庫(kù)也可以獲得滑膜蛋白的片段。如果用識(shí)別滑膜蛋白的抗體對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，就可以測(cè)定具有免疫活性的結(jié)構(gòu)域。測(cè)定免疫活性結(jié)構(gòu)域的技術(shù)無(wú)需經(jīng)過(guò)改動(dòng)，即可用作測(cè)定對(duì)配體有結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域的技術(shù)。關(guān)于克隆的噬菌體，如果能測(cè)定出插入片段的核苷酸序列，那么即可闡明活性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或與其功能等同的蛋白質(zhì)可以是能添加多種修飾的蛋白質(zhì)，所述修飾如糖鏈的生理學(xué)修飾，用熒光、放射性或其它物質(zhì)標(biāo)記，或與其它蛋白質(zhì)融合。特別地，在下文所述的重組體中，根據(jù)表達(dá)宿主的不同而變化的糖鏈有可能會(huì)導(dǎo)致修飾的差異。但是，即使糖鏈的修飾存在差異，只要它們表現(xiàn)出與本說(shuō)明書中公開(kāi)的滑膜蛋白蛋白類似的特性，它們?nèi)远际潜景l(fā)明的滑膜蛋白或與其功能等同的蛋白質(zhì)。
滑膜蛋白不僅可得自生物材料，也可得自基因重組體，在所述重組體中，編碼滑膜蛋白的基因被摻入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)。如果上述編碼滑膜蛋白的多核苷酸被摻入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)并得以表達(dá)，即可通過(guò)基因工程技術(shù)獲得滑膜蛋白。本發(fā)明可以使用的宿主/載體系統(tǒng)的例子包括表達(dá)載體pGEX-5X-3和大腸桿菌。pGEX-5X-3可將外源基因表達(dá)成與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白(Gene，6731-40，1988)。因此，當(dāng)在熱激條件下將含有編碼滑膜蛋白的基因的pGEX-5X-3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21，并培養(yǎng)適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，然后加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)時(shí)，即可誘導(dǎo)GST-融合滑膜蛋白的表達(dá)。通過(guò)以滑膜細(xì)胞的cDNA文庫(kù)等作為模板，經(jīng)PCR等進(jìn)行擴(kuò)增，即可獲得編碼滑膜蛋白的基因。由于本發(fā)明的GST吸附于谷胱甘肽Sepharose 4B上，因此，通過(guò)親和層析可以容易地分離和純化表達(dá)產(chǎn)物。
用于獲得滑膜蛋白重組體的其它宿主/載體系統(tǒng)的例子如下。首先，當(dāng)將細(xì)菌用作宿主時(shí)，使用組氨酸標(biāo)記、HA標(biāo)記、Flag標(biāo)記等的融合蛋白的表達(dá)載體可以商購(gòu)。至于酵母宿主，已知畢赤氏屬的酵母能有效表達(dá)具有糖鏈的蛋白質(zhì)。從添加糖鏈的目的出發(fā)，也可以使用以昆蟲(chóng)細(xì)胞為宿主、利用桿狀病毒載體的表達(dá)系統(tǒng)(Bio/Technology，647-55，1988)。另外，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行使用CMV、RSV或SV40等啟動(dòng)子的載體的轉(zhuǎn)染，這些宿主/載體系統(tǒng)中的每一個(gè)都可用作滑膜蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。另外，也可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或其它病毒載體導(dǎo)入基因。
通過(guò)利用其免疫學(xué)特性，本發(fā)明提供的新蛋白質(zhì)滑膜蛋白以及免疫學(xué)等價(jià)的蛋白質(zhì)可用于診斷RA。在RA患者的血液中，可以高頻率地檢測(cè)到識(shí)別滑膜蛋白的抗體，而在健康人的血液中基本上檢測(cè)不到所述抗體。因此，使用本發(fā)明的滑膜蛋白作為抗原對(duì)受試者的抗體進(jìn)行免疫學(xué)分析能給出有用的信息用于診斷RA。即，如果在受試者的體液中檢測(cè)到與滑膜蛋白反應(yīng)的抗體，那么即可將該受試者診斷為患有RA。
一般可以使用多種對(duì)抗體進(jìn)行免疫學(xué)分析的方法。其中最常用的方法是以下方法即，使抗原致敏平板與樣品中的抗體反應(yīng)，并使用經(jīng)抗體-特異性標(biāo)記的抗體檢測(cè)捕獲于平板表面的待測(cè)抗體(Immunochemistry，8871-879，1971)。使用酶作為標(biāo)記的方法被稱為ELISA法，該方法應(yīng)用廣泛。另外，還有一種已知方法被稱為免疫凝集反應(yīng)，即，使樣品與粘附有抗原的乳膠顆?；旌?，并檢測(cè)抗體(Am.J.Med.，21888-892，1956)。免疫凝集反應(yīng)是能以單個(gè)試劑進(jìn)行快速分析的方法，是一種適用于大規(guī)模篩選的優(yōu)選方法。
另外，免疫層析最近已成為被廣泛使用的簡(jiǎn)單分析方法。為了將該方法應(yīng)用于抗體的免疫學(xué)分析法，構(gòu)建了一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)，其中通過(guò)樣品中的抗體來(lái)阻斷經(jīng)標(biāo)記的滑膜蛋白和抗-滑膜蛋白抗體之間的反應(yīng)。具體地說(shuō)，例如，經(jīng)過(guò)安排，使得經(jīng)標(biāo)記的滑膜蛋白和樣品首先相互接觸，然后通過(guò)層析的展開(kāi)，使它們與抗-滑膜蛋白抗體試劑組分接觸。如果樣品中存在滑膜蛋白抗體，那么經(jīng)標(biāo)記的滑膜蛋白則已經(jīng)反應(yīng)，因此，它不能再與作為試劑組分的抗-滑膜蛋白抗體反應(yīng)。通過(guò)固定抗-滑膜蛋白抗體并觀察固定區(qū)域中經(jīng)標(biāo)記的滑膜蛋白的反應(yīng)狀況，可以僅通過(guò)滴樣品來(lái)進(jìn)行免疫測(cè)定。
在很多免疫測(cè)定法中，可以根據(jù)抗體的類別來(lái)分析抗體。必要時(shí)，通過(guò)組合可識(shí)別不同類免疫球蛋白，如IgG和IgM的抗體，即可獲得與特定類別的抗體有關(guān)的信息。在傳染病中，可觀察到這樣一種轉(zhuǎn)變，其中在感染的第一階段，IgM抗體的測(cè)定值升高，然后，IgM抗體的測(cè)定值降低，而IgG抗體的測(cè)定值升高。在本發(fā)明中，這種不同類別的抗體測(cè)定值也可能與RA的臨床癥狀有關(guān)。更具體地，不同類別的抗體測(cè)定值可能與判斷藥效或預(yù)測(cè)RA發(fā)作相關(guān)聯(lián)。
在檢測(cè)抗體時(shí)，經(jīng)常采用不僅使用抗原分子本身，也使用化學(xué)合成的寡肽作為抗原的方法。這是因?yàn)槭褂锰禺愑谔貏e優(yōu)良的表位或具有一些臨床意義的表位的分析系統(tǒng)受非-特異性反應(yīng)的影響較小。該方法對(duì)滑膜蛋白也有效。具體地說(shuō)，可以根據(jù)上述獲得免疫活性結(jié)構(gòu)域肽的方法，測(cè)定用作表位的結(jié)構(gòu)域。已知表位有時(shí)由至少三個(gè)氨基酸殘基組成。另外，據(jù)說(shuō)至少8個(gè)氨基酸殘基才可能導(dǎo)致與其它蛋白質(zhì)的免疫學(xué)區(qū)別。因此，由選自滑膜蛋白的氨基酸序列的至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，一般為9個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選為10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選為11個(gè)氨基酸殘基組成的、可與患者血清中的抗體反應(yīng)的片段被優(yōu)選用作抗原，用于檢測(cè)本發(fā)明的抗體。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也已知通過(guò)在寡肽上添加多種修飾以增加形成表位之寡肽的免疫反應(yīng)性的方法。例如，添加無(wú)活性的蛋白質(zhì)如人血清白蛋白或無(wú)意義的氨基酸序列的修飾有助于改善免疫反應(yīng)性。
可用于本發(fā)明檢測(cè)RA的方法中的滑膜蛋白，與其功能等同的蛋白質(zhì)，或其部分肽可用作免疫分析試劑，用于分析能識(shí)別這些分子的抗體。本發(fā)明的免疫分析試劑可用于診斷RA和判斷治療的效力。
本發(fā)明的滑膜蛋白也可以用于開(kāi)發(fā)治療或預(yù)防RA的疫苗。據(jù)認(rèn)為滑膜蛋白可通過(guò)與其配體結(jié)合來(lái)誘使滑膜細(xì)胞增殖，因此，通過(guò)提供可產(chǎn)生阻斷滑膜蛋白與其配體結(jié)合的抗體的疫苗，即可治療和預(yù)防RA。由于滑膜蛋白的結(jié)構(gòu)域肽原本就是人類的蛋白質(zhì)，因此，獲得滑膜蛋白疫苗的一般方法是以下配制方法，即將占主要成分的、用作滑膜蛋白表位的結(jié)構(gòu)域肽與佐劑或提供免疫刺激的載體蛋白混合。
另外，本發(fā)明提供了能識(shí)別滑膜蛋白的抗體。通過(guò)已知方法，將本發(fā)明的滑膜蛋白，其免疫學(xué)等價(jià)的蛋白質(zhì)或其片段用作免疫原，即可獲得抗滑膜蛋白的抗體。通過(guò)普通的免疫操作可以獲得多克隆抗體(Harlow，E.&Lane，D.；AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1988)，而通過(guò)克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞可以獲得單克隆抗體(Kohler，G.&Milstein，C.，Nature 256495-7，1975)。單克隆抗體是使免疫測(cè)定法獲得高度敏感性和特異性的重要工具。
在免疫時(shí)，用本發(fā)明的滑膜蛋白(或其免疫學(xué)等價(jià)的蛋白質(zhì)或其片段)以及適當(dāng)?shù)淖魟┟庖呓臃N免疫動(dòng)物。可用作免疫原的滑膜蛋白片段包括含有下列氨基酸序列的肽
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC/SEQ ID NO3)，Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS/SEQ ID NO4)，和Syno-P1(GAATTTAAGTSATAC/SEQ ID NO5)。
通過(guò)使這些肽與載體蛋白連接而制備的免疫原特異于滑膜蛋白，并能給出具有足夠結(jié)合親和性的抗體。匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)等可用作載體蛋白，用于獲得免疫原。通常使用的免疫動(dòng)物包括兔、小鼠、大鼠、山羊或綿羊。通常使用的佐劑包括弗氏完全佐劑(FCA)等(Adv.Tubercl.Res.，1130-148，1956)。以適當(dāng)?shù)拈g隔添加免疫力，在證實(shí)抗體滴度增加后，可以抽血獲得抗血清。另外，通過(guò)純化其抗體組分，可以獲得純化的抗體。
或者，通過(guò)收集抗體生產(chǎn)細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞融合或其它方法克隆這些細(xì)胞，即可獲得單克隆抗體。這些抗體生產(chǎn)細(xì)胞包括得自免疫動(dòng)物的細(xì)胞，以及收集自能產(chǎn)生抗滑膜蛋白自身抗體的RA患者的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。另外，可以根據(jù)所獲得的、得自免疫動(dòng)物的單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體基因，來(lái)構(gòu)建嵌合抗體或人源化抗體。當(dāng)給人施用抗體時(shí)，動(dòng)物抗體不是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儠?huì)作為外來(lái)物而被清除。因此，需要嵌合抗體或人源化抗體，在嵌合抗體中，人抗體取代了強(qiáng)抗原性抗體的恒定區(qū)，在人源化抗體中，人基因不僅取代了恒定區(qū)，還取代了可變區(qū)的構(gòu)架。從這一點(diǎn)上看，通過(guò)使用得自RA患者的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體的可變區(qū)，即可重構(gòu)人型抗體，因此，也可以更容易地構(gòu)建出高度安全的抗體。
能識(shí)別基于本發(fā)明提供的滑膜蛋白的嵌合抗體或人源化抗體可用于能靶向RA患者滑膜細(xì)胞的藥物傳遞系統(tǒng)(DDS)。在使用能識(shí)別本發(fā)明的滑膜蛋白的抗體的DDS中，可以證實(shí)Fas配體或抗-SL抗體等是有望通過(guò)與抗體連接而起作用的物質(zhì)。
或者，本發(fā)明的抗體可用于檢測(cè)滑膜蛋白?；さ鞍自赗A患者的滑膜組織中強(qiáng)表達(dá)。因此，檢測(cè)滑膜細(xì)胞、滑膜組織或體液中的滑膜蛋白能為RA的診斷提供重要信息。具體地說(shuō)，當(dāng)在滑膜組織或血液中檢測(cè)到滑膜蛋白時(shí)，認(rèn)為RA的病情較重。本發(fā)明的抗體可用作免疫檢測(cè)滑膜蛋白的試劑。使用抗體免疫檢測(cè)組織或血液中存在的蛋白質(zhì)的方法是已知的。含有本發(fā)明的抗體的免疫分析試劑可用于診斷RA和測(cè)定治療的效力。
另外，本發(fā)明的抗體可用于分離或檢測(cè)表達(dá)滑膜蛋白的細(xì)胞。在發(fā)育中的AER中觀察到本發(fā)明滑膜蛋白蛋白質(zhì)的表達(dá)，所述蛋白質(zhì)在成為滑膜、軟骨、骨和四肢原基的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞中也有強(qiáng)表達(dá)。因此，滑膜蛋白可用作AER和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記。即，可以使用滑膜蛋白的表達(dá)作為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)和分離AER和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)熒光等適當(dāng)標(biāo)記抗體。例如，可將抗滑膜蛋白的抗體用于細(xì)胞分選等以分離表達(dá)滑膜蛋白的細(xì)胞。分離的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞可用于骨和軟骨的體外形成，或關(guān)節(jié)的重構(gòu)。
在體外或體內(nèi)由未分化的間充質(zhì)細(xì)胞形成骨、軟骨、肌肉、腱、脂肪、骨髓等的基質(zhì)(S.A.Kuznetsov等，J.Bone Miher.Res.12，1335-47，1997；D.J.Prockop，Science 276，71-4，1997；C.M.Thompson和R.A.Young，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4587-90，1995；A.I.Caplan，J.Orthop.Res.9，641-50，1991；A.J.Friedenstein，Int.Rev.Cytol.47，327-59，1976；M.Owen和A.J.Friedenstein，in“Cell.and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues，”D.Evered和S.Harnett，Eds.，Wiley，Chichester，UK，1988，pp.42-60；A.J.Friedenstein等，Cell Tissue Kinet.20，263-72，1987；B.A.Ashton等，Clin.Orthop.Relat.Res.151，294-307，1980；I.Bab等，Clin.Orthop.Relat.Res.187，243-54，1984；S.E.Haynesworth等，Bone 13，81-8，1992；A.I.Caplan，Clin.Plast.Surg.21，429-35，1994；也可參見(jiàn)例如Genzyme網(wǎng)站，http//www.genzymebiosurgery.com/)。
例如，可以在體外使未分化的間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞分化，形成脂肪細(xì)胞譜系、軟骨細(xì)胞譜系和骨細(xì)胞譜系(M.F.Pittenger等，Science 284，143-7，1999)。
通過(guò)例如用1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、地塞米松、胰島素和吲哚美辛處理，可以誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞(M.F.Pittenger，美國(guó)專利號(hào)5,827,740,1998)。通過(guò)例如使用離心等使細(xì)胞成為小團(tuán)塊，然后在不含血清的培養(yǎng)基中用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β3刺激，即可分化成軟骨細(xì)胞(A.M.Mackay等，TissueEng.4，415-28，1998；J.U.Yoo等，J.Bone Joint Surg.Am.80A，1745-57，1998)。通過(guò)例如在10％胎牛血清的存在下，用地塞米松、β-甘油磷酸和抗壞血酸誘導(dǎo)，可以分化成骨細(xì)胞(S.A.Kuznetsov等，J.Bone Miner.Res.12，1335-47，1997；D.J.Prockop Science 276，71-4，1997；C.M.Thompson和R.A.Young，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4587-90，1995；A.I.Caplan，J.Orthop.Res.9，641-50，1991；A.J.Friedenstein，Int.Rev.Cytol.47，327-59，1976；M.Owen和A.J.Friedenstein，in“Cell and Molecular Biology of Vertebrate HardTissues，”D.Evered和S.Harnett，Eds.，Wiley，Chichester，UK，1988，pp.42-60；S.P.Bruder等，J.Cell.Biochem.64，278-94，1997；N.Jaiswal等，J.Cell.Biochem.64，295-312，1997；S.P.Bruder等，J.Bone Miner.Res.13，655-631998)。
另外，關(guān)于體內(nèi)的情況，例如，可將未分化的間充質(zhì)細(xì)胞移植到子宮內(nèi)，使其分化成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和胸腺基質(zhì)細(xì)胞(K.W.Liechty等，Nature Medicine 6，1282-1286，2000)。通過(guò)這些方法，可以在體外或體內(nèi)由分離的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞重構(gòu)組織。重構(gòu)的組織或器官有望用于再生醫(yī)學(xué)。
另外，由于滑膜蛋白在類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，因而可用作類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記。如果將本發(fā)明的抗體用作分離或檢測(cè)細(xì)胞的試劑，那么所述抗體可與其它溶劑或溶質(zhì)組合以形成組合物。例如，所述抗體可與蒸餾水、pH緩沖液、鹽、蛋白質(zhì)、表面活性劑等組合。
滑膜蛋白在RA患者的滑膜組織中強(qiáng)表達(dá)。另外，在RA患者血液中可以高頻率地檢測(cè)出識(shí)別滑膜蛋白的抗體(自身抗體)。另一方面，在健康人的血液中基本上檢測(cè)不到滑膜蛋白抗體。另外，滑膜蛋白在體外抑制經(jīng)培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)。據(jù)認(rèn)為，這是因?yàn)榛さ鞍卓膳c促進(jìn)滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)的配體競(jìng)爭(zhēng)。根據(jù)這一信息，有望得出以下機(jī)理。即，滑膜細(xì)胞中滑膜蛋白的強(qiáng)表達(dá)促使對(duì)滑膜細(xì)胞具有生長(zhǎng)促進(jìn)作用的滑膜蛋白與配體結(jié)合，結(jié)果，促進(jìn)了滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，這些滑膜細(xì)胞本身的異常增殖僅僅是RA的病理學(xué)而已。
根據(jù)上述認(rèn)識(shí)，本發(fā)明提供了檢測(cè)或診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括以下步驟i)檢測(cè)受試者的生物樣品中存在的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎標(biāo)記，和ii)將步驟i)的檢測(cè)結(jié)果與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相聯(lián)系。
本發(fā)明的檢測(cè)或診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法中所用的標(biāo)記可以是下述標(biāo)記中的任何一種。測(cè)定這些標(biāo)記的方法如前所述。
*滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸，
*滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)，*滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的肽，*與滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，和*與滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的肽結(jié)合的抗體。
例如，如果在取自患者的血樣中檢測(cè)到與滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)的抗體，那么患者患有RA的可能性很高?；蛘撸∽曰颊叩幕そM織中的滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的表達(dá)顯示由RA造成的滑膜組織增生。使用蛋白質(zhì)或mRNA的存在作為指標(biāo)，可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)。
另外，基于上述機(jī)理，本發(fā)明的滑膜蛋白及其基因提供了新的方法以開(kāi)發(fā)治療RA的藥物。首先，使用本發(fā)明的滑膜蛋白，以與滑膜蛋白的結(jié)合活性為指標(biāo)，即可檢測(cè)滑膜蛋白的配體。即，本發(fā)明涉及檢測(cè)與滑膜蛋白的結(jié)合活性的方法，所述方法包括下述步驟a)使受試化合物與滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)或肽接觸，和b)觀察受試化合物與所述蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合。
另外，可以根據(jù)上述檢測(cè)方法對(duì)滑膜蛋白的配體進(jìn)行篩選。本發(fā)明的篩選方法具體包括下述步驟a)通過(guò)上述檢測(cè)與滑膜蛋白的結(jié)合活性的方法，檢測(cè)受試化合物與滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)的結(jié)合活性，和b)選擇所述結(jié)合活性高于對(duì)照的受試化合物。
候選的配體化合物不僅包括天然物質(zhì)及其變體，還包括低分子量的有機(jī)化合物。可以通過(guò)標(biāo)記候選化合物，直接檢測(cè)上述蛋白質(zhì)和候選化合物之間的結(jié)合?；蛘?，以阻斷與已知SL的結(jié)合為指標(biāo)，也可以證實(shí)這一點(diǎn)。即，在明顯表現(xiàn)出與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的分子，如S1-5的存在下，使候選化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)接觸?；蛘?，在候選化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)接觸之后，可以通過(guò)進(jìn)一步與SL接觸來(lái)評(píng)價(jià)候選化合物的結(jié)合活性。當(dāng)將阻斷結(jié)合用作指標(biāo)時(shí)，僅需要對(duì)已知的SL進(jìn)行標(biāo)記。因此，這不失為一種簡(jiǎn)單的篩選方法。
作為對(duì)照，優(yōu)選在沒(méi)有受試化合物時(shí)進(jìn)行與步驟a)相同的操作?；蛘?，當(dāng)受試化合物以低于步驟a)中的濃度存在時(shí)，也可以作為對(duì)照。另外，也可以使用已知可與滑膜蛋白結(jié)合的分子替代受試化合物，來(lái)進(jìn)行與步驟a)相同的操作，從而選擇出結(jié)合活性高于該分子的化合物。
另外，也可以使用基于實(shí)施例中所示基因的配體篩選方法。例如，可以使用市售的雙-雜合系統(tǒng)篩選含有編碼候選配體之基因的文庫(kù)，以獲得編碼與滑膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因。該方法是篩選天然配體的有效方法?；蛘?，通過(guò)使用摻入了cDNA的噬菌體文庫(kù)和經(jīng)標(biāo)記的滑膜蛋白進(jìn)行表達(dá)篩選，也可以克隆配體。本發(fā)明人使用該篩選方法發(fā)現(xiàn)了滑膜蛋白的天然配體，即SL。SL可能會(huì)與滑膜細(xì)胞表面的滑膜蛋白結(jié)合并刺激細(xì)胞增殖。因此，測(cè)定血液中的SL水平可能與RA的病理學(xué)相關(guān)?？梢愿鶕?jù)與滑膜蛋白的結(jié)合活性來(lái)測(cè)定SL。當(dāng)然，可以用抗-SL抗體進(jìn)行免疫測(cè)定，也可以通過(guò)聯(lián)合使用這兩者的夾心法測(cè)定SL。
本發(fā)明人證實(shí)當(dāng)將滑膜蛋白加入經(jīng)培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞時(shí)，它可以起到抑制細(xì)胞增殖的作用。就中和培養(yǎng)基中的SL而言的解釋如下阻斷滑膜蛋白與其配體的結(jié)合和對(duì)滑膜細(xì)胞異常增殖的抑制作用相關(guān)，從而賦予治療RA的效果。通過(guò)本發(fā)明的篩選方法可以獲得的配體競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷滑膜蛋白與其天然配體的結(jié)合，因此，它們有望具有有效抑制RA滑膜細(xì)胞增殖的活性(作為拮抗劑)。
另外，通過(guò)本發(fā)明的篩選方法可以獲得的滑膜蛋白配體有望具有按照與上述SL相同的方式刺激滑膜蛋白活性的活性(作為激動(dòng)劑)。刺激滑膜蛋白的配體可用作滑膜蛋白刺激劑或骨形成促進(jìn)劑。更具體地，刺激滑膜蛋白的配體可用作治療骨質(zhì)疏松癥、骨折或運(yùn)動(dòng)損傷等的藥物。
可以擴(kuò)展這些檢測(cè)結(jié)合活性的方法和篩選方法，從而本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)阻斷滑膜蛋白或功能等同的蛋白質(zhì)與滑膜蛋白配體結(jié)合的活性的方法，以及篩選化合物的方法?；诒景l(fā)明的檢測(cè)阻斷滑膜蛋白與滑膜蛋白配體結(jié)合的活性的方法包括下述步驟a)在受試化合物的存在下，使滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白質(zhì)或肽與其配體接觸，和b)檢測(cè)與所述蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的配體和/或受試化合物。
另外，根據(jù)上述檢測(cè)方法，本發(fā)明提供了篩選化合物的方法，所述化合物能阻斷滑膜蛋白或其功能等同的蛋白質(zhì)與滑膜蛋白配體結(jié)合。即，本發(fā)明涉及下述篩選方法，該方法包括以下步驟
a)通過(guò)上述檢測(cè)方法檢測(cè)受試化合物阻斷滑膜蛋白或其功能等同的蛋白質(zhì)與其配體結(jié)合的活性，和b)選擇所述阻斷活性高于對(duì)照的受試化合物。
作為對(duì)照，優(yōu)選在沒(méi)有受試化合物時(shí)進(jìn)行與步驟a)相同的操作?；蛘?，當(dāng)受試化合物以低于步驟a)中的濃度存在時(shí)，也可以作為對(duì)照。另外，例如，也可以使用已知可阻斷滑膜蛋白與其配體之間的結(jié)合的分子替代受試化合物，來(lái)進(jìn)行與步驟a)相同的操作，從而選擇出結(jié)合活性高于該分子的化合物。
通過(guò)上述篩選，可以獲得作為滑膜蛋白或其功能等同的蛋白質(zhì)的拮抗劑來(lái)發(fā)揮作用的化合物。滑膜蛋白配體的例子包括實(shí)施例中提到的SL(S1-5)。具體地說(shuō)，可以使用由登錄號(hào)AAA65590，138449，NP_061489，NP_004096或Q12805鑒定的S1-5蛋白或類似的蛋白質(zhì)，只要它們具有與滑膜蛋白蛋白結(jié)合的活性即可(Lecka-Czernik，B等，Mol.Cell.Biol.15，120-128，1995；Heon，E等，Arch.Ophthalmol.114，193-198，1996；Ikegawa，S等，Genomics 35，590-592，1996；Katsanis，N等，Hum.Genet.106，66-72，2000；Giltay，R等，Matrix Biol.18，469-480，1999；Stone，E.M等，Nat.Genet.22，199-202，1999)?？梢栽谑褂煤蜻x化合物之前、之后或同時(shí)使滑膜蛋白與滑膜蛋白配體接觸。
本文所篩選的化合物是據(jù)認(rèn)為能結(jié)合滑膜蛋白并阻斷滑膜蛋白與配體結(jié)合的化合物，以及能阻斷配體的化合物。通過(guò)標(biāo)記配體并使其與候選化合物競(jìng)爭(zhēng)，可以篩選出與滑膜蛋白結(jié)合的化合物。如果與配體結(jié)合的化合物是候選化合物，則反其道而行之。在每次篩選中，優(yōu)選使用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，因?yàn)樗鼈儗?duì)活性的影響小。預(yù)計(jì)所得的滑膜蛋白拮抗劑也具有抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用，它們有望具有治療RA的作用。
另外，有人提出滑膜蛋白配體S1-5是Malattia Leventinese(ML)和Doyne蜂窩狀視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良(DHRD)的致病基因(Stone，E.M等，Nature Genetics22，199-202，1999)。所述疾病具有類似于與年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)的癥狀，其中出現(xiàn)了稱為脈絡(luò)膜小疣的沉積物。因此，滑膜蛋白可能也會(huì)導(dǎo)致ML和DHRD。通過(guò)研究滑膜蛋白的突變和多態(tài)性，可對(duì)ML和DHRD進(jìn)行診斷。另外，可通過(guò)本發(fā)明的篩選獲得的、作為滑膜蛋白配體起作用的化合物，能阻斷滑膜蛋白和S1-5之間的相互作用的化合物等有望用作有助于預(yù)防或治療這些疾病的藥物。
另外，可以使用本發(fā)明的滑膜蛋白來(lái)評(píng)價(jià)化合物調(diào)節(jié)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性，或篩選能調(diào)節(jié)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在存在或不存在滑膜蛋白配體時(shí)，使受試化合物與滑膜蛋白接觸，和b)檢測(cè)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
另外，本發(fā)明涉及篩選具有調(diào)節(jié)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)上述方法檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性，和b)選擇所述調(diào)節(jié)活性高于對(duì)照的受試化合物。
作為對(duì)照，優(yōu)選在沒(méi)有受試化合物時(shí)進(jìn)行與步驟a)相同的操作。或者，當(dāng)受試化合物以低于步驟a)中的濃度存在時(shí)，也可以作為對(duì)照。另外，例如，也可以使用已知具有促進(jìn)或阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之活性的分子替代受試化合物，來(lái)進(jìn)行與步驟a)相同的操作，從而選擇出調(diào)節(jié)活性高于該分子的化合物。
在本發(fā)明中，經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被定義為施加于滑膜蛋白的刺激被轉(zhuǎn)導(dǎo)至不同的分子。對(duì)刺激的類型沒(méi)有限制。已知體內(nèi)存在有很多種模式的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的代表性例子是通過(guò)修飾蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)活性。例如，通過(guò)磷酸化或乙?；瘉?lái)調(diào)節(jié)某些類型蛋白質(zhì)的活性。另外，已知蛋白質(zhì)的活性可通過(guò)其裂解受到控制。為了以更具特異性的方式裂解蛋白質(zhì)，遍在蛋白等分子的存在是至關(guān)重要的。通過(guò)將構(gòu)成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子活性或結(jié)構(gòu)的變化作為指標(biāo)，即可檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中所述變化是通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的?；蛘?，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成作為指標(biāo)也可以檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的例子特別地包括磷酸化或去磷酸化信號(hào)。已知大多數(shù)細(xì)胞增殖信號(hào)經(jīng)由基于蛋白質(zhì)磷酸化或去磷酸化的蛋白質(zhì)修飾被轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游的信號(hào)分子。由于本發(fā)明的滑膜蛋白也具有細(xì)胞增殖作用，這暗示通過(guò)蛋白質(zhì)的磷酸化也可以轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。實(shí)際上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了滑膜蛋白表達(dá)的磷酸化作用。因此，通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化，即可測(cè)定經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
與細(xì)胞增殖或分化有關(guān)的受體具有下述結(jié)構(gòu)域作為酶活性位點(diǎn)(JikkenIgaku Bessatsu Bioscience Yogo Raiburari，Kaiteiban Saitokain Zoshoku Inshi[Experimental Medicine，Supplement-Bioscience Terminology Library，Revised VersionCytokines/Growth Factors]，Yodosha Co.，Ltd.，1998)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(VEGF受體，PDGF受體，HGF受體，EGF受體等)，酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域(RPTP等)，和絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(TGFβ受體等)。
經(jīng)推測(cè)，滑膜蛋白直接或間接地保持這些酶活性。術(shù)語(yǔ)“間接具有酶活性”指的是滑膜蛋白分子中沒(méi)有酶活性位點(diǎn)，但與滑膜蛋白結(jié)合的分子具有酶活性。所述分子的已知例子包括TNF受體、GM-CSF受體等。因此，通過(guò)例如檢測(cè)對(duì)酪氨酸、絲氨酸和/或蘇氨酸的磷酸化活性，即可評(píng)價(jià)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此時(shí)，通過(guò)在滑膜蛋白配體的存在下評(píng)價(jià)受試化合物的作用，即可評(píng)價(jià)受試化合物對(duì)由滑膜蛋白配體引發(fā)的滑膜蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。具體地說(shuō)，可以檢測(cè)阻斷或抑制經(jīng)由滑膜蛋白配體至滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性。可將本文描述的滑膜蛋白配體S1-5用作滑膜蛋白配體?；蛘?，通過(guò)在沒(méi)有滑膜蛋白配體時(shí)評(píng)價(jià)受試化合物的作用，可以評(píng)價(jià)受試化合物對(duì)滑膜蛋白的刺激活性。
為了檢測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化，例如，在存在和不存在滑膜蛋白配體時(shí)，將表達(dá)滑膜蛋白的細(xì)胞以及受試化合物和[32P]正磷酸一起保溫。接著，通過(guò)免疫沉淀，從該細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收磷酸化的蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離后，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)所回收蛋白質(zhì)的磷酸化。通過(guò)TLC或其它已知的肽分析方法即可鑒定磷酸化的氨基酸。
或者，可以使用磷酸化酪氨酸的抗體等特異于磷酸化蛋白質(zhì)的抗體來(lái)檢測(cè)特定氨基酸的磷酸化。
通常，細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的磷酸化被依次轉(zhuǎn)導(dǎo)至多個(gè)分子。即，一系列轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑構(gòu)成級(jí)聯(lián)。因此，通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞中全部蛋白質(zhì)的磷酸化水平的變化，即可比較細(xì)胞中出現(xiàn)的磷酸化信號(hào)的大小。評(píng)價(jià)細(xì)胞中總蛋白質(zhì)磷酸化水平的方法是已知的。例如，用滑膜蛋白配體等刺激細(xì)胞之后，通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離蛋白質(zhì)，并印跡到濾膜上，然后使用抗-磷酸化酪氨酸的抗體等進(jìn)行Western印跡，即可評(píng)價(jià)全部蛋白質(zhì)的磷酸化水平。另外，例如，可用[32P]正磷酸標(biāo)記細(xì)胞，并用滑膜蛋白配體等刺激細(xì)胞。然后，用二維電泳擴(kuò)展細(xì)胞蛋白質(zhì)。用考馬斯藍(lán)染色蛋白質(zhì)，進(jìn)行放射自顯影。通過(guò)檢測(cè)磷酸化的點(diǎn)，即可評(píng)價(jià)磷酸化水平。
或者，可以特異性地測(cè)定身為滑膜蛋白的底物的磷酸化蛋白質(zhì)中磷酸化水平的變化。例如，身為滑膜蛋白的底物的磷酸化蛋白質(zhì)回收自上述二維電泳中的磷酸化點(diǎn)，并可通過(guò)微量測(cè)序或質(zhì)譜分析法鑒定該蛋白質(zhì)。例如，使用特異于底物蛋白質(zhì)的抗體，對(duì)鑒定出的底物蛋白質(zhì)的磷酸化水平的變化進(jìn)行免疫沉淀，通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離之后，通過(guò)放射自顯影可以測(cè)定[32P]的攝入，或者，使用抗-磷酸化酪氨酸的抗體，通過(guò)Western印跡來(lái)評(píng)價(jià)[32P]的攝入(Baio Manyuaru Shirizu-Bunshi Seibutsugaku Kenkyu noTame no Tampaku Jikken Ho[Bio Manual Series-Protein ExperimentalMethods for Molecular Biology Research]，Tadaomi Takenawa，Masaki Inagakieds.)。
上述方法中使用的細(xì)胞例子包括滑膜細(xì)胞(例如RTF)和外源性轉(zhuǎn)移了滑膜蛋白基因的細(xì)胞。如果某種受試化合物因滑膜蛋白所致的磷酸化或去磷酸化水平有所降低，那么可以判斷該化合物是能阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物。另外，如果某種受試化合物因滑膜蛋白所致的磷酸化或去磷酸化水平有所提高，那么可以判斷該化合物是能促進(jìn)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物。
例如，當(dāng)滑膜蛋白作為受體-型酪氨酸激酶起作用，且下游分子經(jīng)由酪氨酸的磷酸化被激活以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)時(shí)，如果受試化合物抑制酪氨酸的磷酸化，那么可以判斷該化合物是能阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物。另外，本發(fā)明涉及使用例如酪氨酸激酶、酪氨酸磷酸酶或絲氨酸/蘇氨酸激酶或其它蛋白質(zhì)激酶或磷酸酶阻斷劑，阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。
另外，另一個(gè)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的較好例子是遍在蛋白化信號(hào)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)系統(tǒng)(SMARTSimple Modular Architecture Research Tool(也可參見(jiàn)網(wǎng)站http//smart.embl-heidelberg.de/)Schultz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864，1998；Schultz等，Nucleic Acids Res.28，231-234，2000)闡明了滑膜蛋白中環(huán)指基元的存在(Joazeiro，C.A等，Science 286，309-312，1999)。已知該基元存在于與蛋白質(zhì)分解有關(guān)的E3遍在蛋白-蛋白質(zhì)連接酶中。另外，據(jù)認(rèn)為環(huán)指基元是E2遍在蛋白-綴合酶的結(jié)合位點(diǎn)。
因此，通過(guò)檢測(cè)因滑膜蛋白所致的遍在蛋白化信號(hào)，就可以評(píng)價(jià)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，可通過(guò)使用抗-遍在蛋白的抗體檢測(cè)底物蛋白質(zhì)的遍在蛋白化，從而評(píng)價(jià)遍在蛋白化信號(hào)。此外，也可以檢測(cè)滑膜蛋白與E2遍在蛋白-綴合酶或底物蛋白質(zhì)的結(jié)合，或者含有滑膜蛋白的遍在蛋白連接酶復(fù)合物等。具體地說(shuō)，例如，破碎用表達(dá)經(jīng)標(biāo)記的滑膜蛋白的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，加入經(jīng)[32P]標(biāo)記的遍在蛋白進(jìn)行反應(yīng)。然后，用抗-標(biāo)記的抗體進(jìn)行免疫沉淀。通過(guò)SDS-PAGE和進(jìn)行放射自顯影，即可檢測(cè)滑膜蛋白的遍在蛋白連接酶活性(Hashizume，R等，J.Biol.Chem.276，14537-14540，2001)。
可以特異性地測(cè)定滑膜蛋白底物蛋白質(zhì)中的遍在蛋白化水平的變化。通過(guò)例如以滑膜蛋白為餌的酵母雙-雜合篩選，可以鑒定出滑膜蛋白的底物蛋白質(zhì)?？砂聪率鲈u(píng)價(jià)鑒定出的底物蛋白質(zhì)的遍在蛋白化水平的變化純化經(jīng)標(biāo)記的底物，在其中加入經(jīng)純化的E1，E2，E3和遍在蛋白。反應(yīng)之后，用抗-標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫沉淀，用抗-遍在蛋白抗體進(jìn)行染色(Yokouchi，M等，J.Biol.Chem.274，31707-31712，1999)。
如果某種受試化合物經(jīng)由滑膜蛋白的遍在蛋白化信號(hào)的激活有所降低，那么可以判斷該化合物是能阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物。另外，如果某種受試化合物經(jīng)由滑膜蛋白的遍在蛋白化信號(hào)的激活有所提高，那么可以判斷該化合物是能促進(jìn)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物。例如，能抑制滑膜蛋白和E2遍在蛋白激活酶之間的相互作用的化合物可有效抑制經(jīng)由滑膜蛋白的遍在蛋白化信號(hào)。另外，本發(fā)明提供了使用與遍在蛋白化信號(hào)有關(guān)的酶的抑制劑來(lái)阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。例如，通過(guò)給細(xì)胞使用E2遍在蛋白綴合酶或E3遍在蛋白連接酶抑制劑，可以阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
可以使用上述方法選擇具有調(diào)節(jié)經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之活性的化合物。能阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物可用作藥物，用于治療因滑膜蛋白的激活而導(dǎo)致的疾病。例如，能阻斷經(jīng)由滑膜蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物可用于阻斷滑膜增生。通過(guò)施用這些化合物，可以抑制滑膜增生，從而可以預(yù)防或治療與滑膜增生有關(guān)的疾病，如RA。另外，這些化合物還可用作治療ML和DHRD的藥物?；蛘?，能促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物可用作滑膜蛋白刺激劑，或用作骨形成促進(jìn)劑等。例如，它們可用作治療骨質(zhì)疏松癥、骨折或運(yùn)動(dòng)損傷等的藥物。
根據(jù)對(duì)滑膜蛋白基因的發(fā)現(xiàn)，使下述與RA和其它涉及滑膜蛋白的疾病有關(guān)的新方法成為可能。首先，可以測(cè)定控制滑膜蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)。即，可以根據(jù)SEQ ID NO1所示的滑膜蛋白基因的核苷酸序列，促進(jìn)基因組的克隆，并分析表達(dá)控制結(jié)構(gòu)域的序列。所得的滑膜蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可用于研究滑膜蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。
另外，在本發(fā)明的滑膜蛋白敲除動(dòng)物中，如果嵌入了標(biāo)記基因，并在滑膜蛋白基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)標(biāo)記基因，則可以使用所述動(dòng)物或得自該動(dòng)物的細(xì)胞，以標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)，對(duì)能控制滑膜蛋白基因表達(dá)的藥物進(jìn)行篩選。例如，如果轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的識(shí)別序列為雙鏈形式，那么它可作為引誘(decoy)核酸藥物起作用。
另外，可以使用本發(fā)明的多核苷酸檢查本發(fā)明的蛋白質(zhì)在動(dòng)物中的生物學(xué)作用。為了實(shí)現(xiàn)此目的，例如，可導(dǎo)入本發(fā)明的DNA，過(guò)量表達(dá)或在不同的位置表達(dá)(或在不同的時(shí)間表達(dá))本發(fā)明的蛋白質(zhì)，通過(guò)證實(shí)其效果即可檢查其作用。通過(guò)制備本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可將基因轉(zhuǎn)移至整個(gè)身體內(nèi)?；蛘?，通過(guò)基因靶向和施用反義寡核苷酸、核酶等，關(guān)于抑制本發(fā)明DNA的表達(dá)和功能的功能喪失實(shí)驗(yàn)也是有效的。即，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因的非人脊椎動(dòng)物，其中本發(fā)明DNA的表達(dá)可被修飾，或所述修飾可被誘導(dǎo)。與野生型相比，表達(dá)可被修飾，或者當(dāng)誘導(dǎo)修飾時(shí)，與誘導(dǎo)前相比，表達(dá)可被修飾。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括在基因組中轉(zhuǎn)移了外源性核酸的動(dòng)物。另外，“DNA的表達(dá)”可以是DNA轉(zhuǎn)錄水平上的，或是轉(zhuǎn)錄物翻譯水平上的。另外，“誘導(dǎo)修飾”可包括通過(guò)外部刺激物誘導(dǎo)修飾，或?qū)﹄A段-特異性表達(dá)進(jìn)行修飾，或者因雜交育種而在后代中修飾表達(dá)。另外，還包括一些細(xì)胞或組織中的表達(dá)修飾。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物的例子優(yōu)選包括哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔、豬、山羊、綿羊、馬和牛)，而特別優(yōu)選使用嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠和大鼠等。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物包括外源性導(dǎo)入編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物。通過(guò)例如在受精卵中注射表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的載體，即可產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
通過(guò)在混合載體與受精卵之后用磷酸鈣處理、電穿孔或在倒置顯微鏡下進(jìn)行微量注射等，可以進(jìn)行載體的轉(zhuǎn)移。另外，通過(guò)將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)移至胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，并將選定的ES細(xì)胞微量注射至受精卵(胚泡)中，也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
通過(guò)與結(jié)扎輸精管的雄性個(gè)體交配誘使雌性受體假孕，將所得的受精卵植入受體的輸卵管中，從而獲得新生動(dòng)物。由新生動(dòng)物的尾部等制備DNA，使用PCR證實(shí)保留了轉(zhuǎn)移的DNA(Brigid Hogan等編，“Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory，1994，Gordon，J.W等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777380-7384，1980；Jaenisch，R.and B.Mintz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 711250-1254，1974)。可從通過(guò)與正常動(dòng)物交配而將基因轉(zhuǎn)移至種系的嵌合動(dòng)物中獲得雜合子。通過(guò)使兩個(gè)雜合子交配可以獲得純合子。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物包括這些動(dòng)物和它們的后代。
用于在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明DNA的啟動(dòng)子的例子包括整體表達(dá)型啟動(dòng)子和組織-特異性和階段-特異性的啟動(dòng)子。
整體表達(dá)型啟動(dòng)子的例子包括β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。例如，可以使用pCAGGS中包含的與人巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子相連的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。當(dāng)制備以位點(diǎn)-特異性或階段-特異性方式表達(dá)本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，可以使用Cre-loxP系統(tǒng)等。例如，制備在位點(diǎn)-特異性或階段-特異性啟動(dòng)子的下游具有Cre重組酶基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并另外制備具有載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在所述載體中，編碼本發(fā)明多肽的DNA與常用啟動(dòng)子的下游連接。此時(shí)，將處于一對(duì)loxP的夾層的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)等或終止密碼子插入啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的DNA之間。通過(guò)使兩個(gè)個(gè)體交配，可以在表達(dá)Cre的同時(shí)表達(dá)本發(fā)明的多肽。
另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物包括其中編碼本發(fā)明內(nèi)源性蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物。通過(guò)例如基因靶向可以制備這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，為了產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因的非人脊椎動(dòng)物，將通過(guò)取代、缺失、添加和/或插入等使其中含有的本發(fā)明DNA中的部分或全部發(fā)生缺損的靶向載體插入胚胎干(ES)細(xì)胞，選擇與染色體DNA發(fā)生同源重組的細(xì)胞。為了選擇同源重組體，可以進(jìn)行已知的正選擇和負(fù)選擇。正選擇使用的標(biāo)記的例子包括新霉素抗性基因等藥物抗性基因，而負(fù)選擇使用的標(biāo)記的例子包括白喉毒素(DT)-A基因、HSK-tk基因等?？梢允褂肧outhern印跡、PCR等選擇正確重組的細(xì)胞。將所得細(xì)胞注入大致為8-細(xì)胞期的受精卵中，或注入胚泡的囊胚腔中，并轉(zhuǎn)移至通過(guò)與結(jié)扎輸精管的雄性個(gè)體交配而制備的假孕雌性個(gè)體的子宮內(nèi)。按照與上述相同的方式，對(duì)新生動(dòng)物進(jìn)行基因組DNA分析，即可獲得雜合子或純合子。不僅可以敲除靶基因，還可以嵌入另一個(gè)基因。對(duì)嵌入的基因沒(méi)有特別的限制。例子包括lacZ基因等標(biāo)記基因。
另外，可以使用反義法或核酶法制備編碼本發(fā)明內(nèi)源性蛋白質(zhì)的DNA表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物。在反義法中，將含有編碼RNA的DNA的載體，所述RNA與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)，或在核酶法中，例如，將含有編碼RNA的DNA的載體，所述RNA能切割編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以與上述相同的方式插入哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞。將所述細(xì)胞注射至哺乳動(dòng)物的胚胎中，由胚胎獲得個(gè)體。
由于滑膜蛋白能誘導(dǎo)RA的滑膜細(xì)胞增殖癥狀，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的下述應(yīng)用是可信的。即，在將滑膜蛋白基因或SL基因摻入適當(dāng)動(dòng)物以形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之后，通過(guò)誘導(dǎo)強(qiáng)表達(dá)可將所述動(dòng)物用作RA模型。在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，可以進(jìn)行能控制滑膜增殖機(jī)理的藥物的篩選?；蛘撸诰哂腥嘶さ鞍?SL，但不出現(xiàn)RA癥狀的動(dòng)物中，通過(guò)強(qiáng)表達(dá)這些基因，可將這些動(dòng)物用作提供滑膜蛋白或SL的來(lái)源。
表達(dá)滑膜蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表現(xiàn)出與RA共有的癥狀，如伴隨有滑膜增生的關(guān)節(jié)炎。即，這些動(dòng)物成為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型動(dòng)物?？梢允褂眠@些動(dòng)物在包括藥物候選化合物的多種化合物中檢驗(yàn)或篩選RA藥物。通過(guò)給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物施用受試化合物，可以觀察癥狀的減輕或加劇，以證實(shí)化合物的效力或進(jìn)行篩選。使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行檢驗(yàn)或篩選的方法的例子包括下述方法。
檢驗(yàn)或篩選導(dǎo)致關(guān)節(jié)異常減輕或加劇的化合物的方法，所述方法包括下述步驟(a)給外源性插入本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物施用受試化合物，和(b)評(píng)價(jià)施用了化合物的動(dòng)物的關(guān)節(jié)異常。
另外，滑膜蛋白基因敲除動(dòng)物可以用于檢查通過(guò)抑制滑膜蛋白的作用而導(dǎo)致的副作用，或用于篩選可降低這些副作用的藥物。另外，通過(guò)在敲除動(dòng)物中局部或瞬時(shí)表達(dá)滑膜蛋白，可以特異性地證實(shí)滑膜蛋白的作用。另外，從SL(S1-5)和ML/DHRD的相關(guān)性上看，滑膜蛋白可能對(duì)SL的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用，因此，滑膜蛋白敲除動(dòng)物可成為ML或DHRD的模型。例如，滑膜蛋白基因的組織特異性或階段特異性(純合子或雜合子)敲除是可以想到的。
可以使用在敲除滑膜蛋白基因的同時(shí)導(dǎo)入標(biāo)記基因等的嵌入動(dòng)物來(lái)檢測(cè)化合物增加或降低滑膜蛋白基因表達(dá)的活性。即，本發(fā)明涉及檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)將受試化合物應(yīng)用于上述嵌入動(dòng)物或嵌入細(xì)胞，和b)測(cè)定標(biāo)記基因的表達(dá)水平。
可在篩選調(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的化合物時(shí)使用該檢測(cè)方法。該方法是調(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的化合物的篩選方法，所述方法包括下述步驟a)將受試化合物應(yīng)用于上述嵌入動(dòng)物或嵌入細(xì)胞，b)測(cè)定標(biāo)記基因的表達(dá)水平，和c)選擇增加或降低嵌入基因的表達(dá)的化合物。
即，在使用了受試化合物的動(dòng)物或細(xì)胞中，檢測(cè)標(biāo)記基因的表達(dá)，并選擇增加或降低標(biāo)記基因的表達(dá)的化合物。當(dāng)將LacZ用作標(biāo)記時(shí)，可通過(guò)實(shí)施例中提及的方法對(duì)標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)此方法，除了可使用個(gè)體進(jìn)行檢驗(yàn)或篩選外，還可以使用例如分離的器官或組織，或使用得自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞進(jìn)行類似的檢驗(yàn)或篩選。
在使用個(gè)體進(jìn)行篩選時(shí)，經(jīng)適當(dāng)途徑施用受試化合物?？赏ㄟ^(guò)已知給藥方法，如靜脈注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、腹內(nèi)注射、口服、直腸給藥、鼻腔給藥等施用受試化合物。在使用試管培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行篩選時(shí)，例如，可在培養(yǎng)基中加入受試化合物?；蛘撸赏ㄟ^(guò)微量注射等方法將受試化合物注射至細(xì)胞中。當(dāng)受試化合物是基因時(shí)，可將裸露的DNA與合乎需要的轉(zhuǎn)染試劑混合，或?qū)⑵鋼饺胍阎谋磉_(dá)載體中并將基因?qū)爰?xì)胞。包括滑膜蛋白基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域序列的核酸有望用作引誘(decoy)核酸，并能抑制滑膜蛋白的表達(dá)。
例如，可通過(guò)下述步驟檢測(cè)調(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的活性
a)使受試化合物與表達(dá)系統(tǒng)接觸，所述表達(dá)系統(tǒng)在滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子控制之下表達(dá)報(bào)道基因，和b)測(cè)定報(bào)道基因的表達(dá)水平。
此外，基于此檢測(cè)方法，可以篩選調(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的化合物。即，本發(fā)明涉及篩選化合物的方法，所述化合物能調(diào)節(jié)滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子的活性，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)上述檢測(cè)活性的方法，測(cè)定受試化合物調(diào)節(jié)滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性的活性，和b)選擇所述活性與對(duì)照相比有所不同的受試化合物。
作為對(duì)照，可在沒(méi)有受試化合物時(shí)進(jìn)行與步驟a)相同的操作。或者，當(dāng)受試化合物以低于步驟a)中的濃度存在時(shí)，也可以作為對(duì)照。另外，例如，也可以使用不同的化合物，例如，選擇作用高于該化合物的化合物來(lái)進(jìn)行與步驟a)相同的操作?；虻谋磉_(dá)包括轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)或翻譯水平上的表達(dá)。連接于滑膜蛋白基因內(nèi)源性啟動(dòng)子下游的基因可以是天然滑膜蛋白基因本身，或是人工連接的報(bào)道基因。通過(guò)例如使用連接于下游的基因的cDNA片段作為探針而進(jìn)行的Northern雜交，RT-PCR，使用抗由滑膜蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行的Western印跡，免疫沉淀，ELISA等方法檢測(cè)所述基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物，即可測(cè)定滑膜蛋白基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性。
另外，通過(guò)產(chǎn)生將報(bào)道基因連接于滑膜蛋白基因啟動(dòng)子下游而構(gòu)建的構(gòu)建體，并使用通過(guò)將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞而獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以將報(bào)道基因的表達(dá)用作指標(biāo)來(lái)進(jìn)行篩選。通過(guò)將所需報(bào)道基因連接于含有滑膜蛋白基因啟動(dòng)子的滑膜蛋白基因上游結(jié)構(gòu)域基因組DNA的下游，即可制備構(gòu)建體。對(duì)報(bào)道基因沒(méi)有特別的限制，其例子包括LacZ、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢光素酶、GFP(綠色熒光蛋白)等。能降低滑膜蛋白基因表達(dá)的化合物是治療RA的候選藥物。
對(duì)本發(fā)明的檢驗(yàn)或篩選中使用的受試化合物沒(méi)有特別的限制，其例子包括有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、肽、蛋白質(zhì)、天然或合成的低分子化合物、天然或合成的高分子化合物、組織或細(xì)胞提取物、微生物培養(yǎng)上清或得自植物或海洋生物的天然成分等，但并不局限于此。也可以使用基因文庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物或表達(dá)cDNA文庫(kù)等。另外，通過(guò)上述篩選與滑膜蛋白結(jié)合的化合物的方法，或通過(guò)篩選阻斷滑膜蛋白與SL結(jié)合的化合物的方法獲得的化合物也可以作為受試化合物來(lái)施用。
對(duì)施用化合物的方法沒(méi)有特別的限制，可在體外通過(guò)與細(xì)胞接觸，包括添加至培養(yǎng)基中，或通過(guò)使用微量注射器或轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入細(xì)胞等來(lái)施用化合物。通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腹內(nèi)注射、口服、直腸給藥、肌內(nèi)給藥、滴眼液、鼻腔給藥、局部注射至關(guān)節(jié)等，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法體內(nèi)施用受試化合物?？梢允┯猛ㄟ^(guò)與水、生理鹽水溶液、緩沖溶液、鹽、穩(wěn)定劑、防腐劑、懸浮劑等混合而獲得的適當(dāng)組合物。
另外，不僅可以使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，也可以使用正常動(dòng)物或得自這些動(dòng)物的細(xì)胞等來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的化合物的篩選。例如，本發(fā)明涉及檢測(cè)調(diào)節(jié)滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表達(dá)之活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在受試化合物的存在下培養(yǎng)表達(dá)滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的細(xì)胞，和b)測(cè)定所述多核苷酸的表達(dá)水平。
另外，基于此檢測(cè)方法，可以篩選調(diào)節(jié)滑膜蛋白基因表達(dá)的化合物。即，本發(fā)明涉及篩選化合物的方法，所述化合物能調(diào)節(jié)滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表達(dá)，所述方法包括下述步驟a)根據(jù)上述檢測(cè)活性的方法，檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表達(dá)的活性，和b)選擇所述活性與對(duì)照相比有所不同的受試化合物。
通過(guò)上述方法可以測(cè)定滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表達(dá)水平。另外，所有在上述和其它篩選方法中可用作受試化合物的化合物也可在此篩選方法中用作受試化合物。如上所述，作為對(duì)照，可在沒(méi)有受試化合物時(shí)進(jìn)行與步驟a)相同的操作。
通過(guò)本發(fā)明的檢驗(yàn)或篩選方法鑒定的化合物成為RA或與滑膜蛋白有關(guān)的其它疾病的候選藥物，因此，它們可用于預(yù)防或治療RA等疾病。這些化合物可與活性成分以外的其它適當(dāng)溶質(zhì)或溶劑組合，從而形成藥物組合物。當(dāng)將通過(guò)本發(fā)明的篩選方法分離的化合物用作藥物時(shí)，可以直接給患者施用分離的化合物本身，或以通過(guò)已知制劑方法制備的藥物組合物的形式施用化合物。
例如，可與可藥用載體或介質(zhì)、具體是無(wú)菌水、生理鹽水溶液、植物油、乳化劑、懸浮劑等適當(dāng)組合，制成制劑后施用化合物。本發(fā)明的藥物組合物形式可以是水溶液、片劑、膠囊、錠劑、口腔片、酏劑、懸浮劑、糖漿、滴鼻劑、吸入溶液等?？梢赃m當(dāng)測(cè)定化合物的含量。一般通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、口服、關(guān)節(jié)內(nèi)注射或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法給患者施用化合物。
盡管劑量隨著患者的體重和年齡、給藥方法、癥狀等的不同而有所不同，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能適當(dāng)選擇劑量。典型的劑量會(huì)隨著有效血藥濃度和藥物代謝時(shí)間的不同而有所不同，但據(jù)認(rèn)為每天的維持劑量約為0.1mg/kg至約1.0g/kg，或優(yōu)選為約0.1mg/kg至約10mg/kg，更優(yōu)選為約0.1mg/kg至約1.0mg/kg?？梢砸淮位蚍殖蓭状蝸?lái)進(jìn)行給藥。另外，只要所述化合物由多核苷酸編碼，即可通過(guò)將所述多核苷酸摻入基因治療載體來(lái)進(jìn)行基因治療。
本文提及的所有現(xiàn)有技術(shù)的參考文獻(xiàn)都列入本文作為參考。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為使用抗-滑膜細(xì)胞抗血清的免疫篩選中的陽(yáng)性集落照片。
圖2為顯示滑膜蛋白重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)的照片。
圖3為放射自顯影照片，它顯示了翻譯自滑膜蛋白cDNA的滑膜蛋白蛋白質(zhì)的體外表達(dá)。
圖4為放射自顯影照片，它顯示了使用滑膜蛋白的cDNA為探針，經(jīng)Northern印跡分析滑膜蛋白基因表達(dá)的結(jié)果。
圖5的照片顯示了使用抗-滑膜細(xì)胞抗血清對(duì)多種細(xì)胞提取物進(jìn)行Western印跡的結(jié)果，以及用GST-部分滑膜蛋白進(jìn)行抗體吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。箭頭表示被吸附的帶。各條帶的分子量從上至下依次約為220、185和140kDa。
圖6為放射自顯影照片，它顯示了使用抗-滑膜細(xì)胞抗血清對(duì)滑膜細(xì)胞提取物進(jìn)行Western印跡的結(jié)果。左泳道(免疫前)是免疫滑膜細(xì)胞之前的兔抗-血清，而右泳道(免疫后)是滑膜細(xì)胞抗-血清。
圖7為熒光顯微照片，它顯示了用抗-滑膜細(xì)胞抗血清(A)和純化的抗-滑膜細(xì)胞抗體(B)對(duì)滑膜細(xì)胞進(jìn)行熒光免疫染色的結(jié)果。
圖8為顯微照片，它顯示了使用抗-滑膜細(xì)胞抗血清對(duì)滑膜組織進(jìn)行免疫染色的結(jié)果，和用GST-部分滑膜蛋白進(jìn)行抗體吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖9為顯微照片，它顯示了使用純化的抗-滑膜細(xì)胞抗體對(duì)滑膜組織進(jìn)行免疫染色的結(jié)果。其中顯示了使用通過(guò)GST親和柱純化的抗血清(上圖的實(shí)驗(yàn)組)和通過(guò)GST-部分滑膜蛋白親和柱純化的抗血清(下圖的實(shí)驗(yàn)組)的結(jié)果。
圖10為放射自顯影照片，它顯示了通過(guò)Western印跡檢測(cè)多種類型的人血清中的抗-滑膜蛋白抗體的結(jié)果。
圖11為放射自顯影照片，它顯示了使用SL的cDNA為探針，通過(guò)Northern印跡分析滑膜細(xì)胞中的SL基因表達(dá)的結(jié)果。
圖12為放射自顯影照片，它顯示了[35S]-標(biāo)記的HA-滑膜蛋白-HAHA和GST-SL融合蛋白之間的結(jié)合。
圖13以顯示了通過(guò)MTT試驗(yàn)分析滑膜蛋白對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的作用的結(jié)果。使用了GST-部分滑膜蛋白。
圖14以顯示了滑膜蛋白基因?qū)胼d體的結(jié)構(gòu)。使用具有CMV增強(qiáng)子的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子全身性表達(dá)滑膜蛋白。使用抗-Flag-標(biāo)記抗體證實(shí)Flag標(biāo)記-融合滑膜蛋白的表達(dá)。
圖15為顯示含有滑膜蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎的腳趾關(guān)節(jié)的照片。其中顯示出被迫表達(dá)滑膜蛋白的小鼠的腳趾外形和軟性X-射線圖像。右圖顯示出正常小鼠腳趾的軟性X-射線圖像以供比較。被迫表達(dá)滑膜蛋白的小鼠表現(xiàn)出顯著的腳趾腫脹。
圖16為顯示含有滑膜蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎的腳趾關(guān)節(jié)的組織學(xué)觀察照片。在表現(xiàn)出顯著腫脹的腳趾關(guān)節(jié)部分，發(fā)現(xiàn)了伴隨著顯著滑膜增生的骨損壞和異常骨形成。
圖17為顯示基因?qū)胄∈蟮恼Ｄ_趾關(guān)節(jié)的組織學(xué)觀察照片。未發(fā)現(xiàn)異常的關(guān)節(jié)軟骨、骨損壞或滑膜增生。右下圖的實(shí)驗(yàn)組顯示了用抗-Flag抗體進(jìn)行免疫染色的結(jié)果。未觀察到陽(yáng)性信號(hào)。
圖18為顯示滑膜蛋白基因轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎的腳趾關(guān)節(jié)中的滑膜蛋白表達(dá)的照片。用抗-Flag抗體進(jìn)行免疫染色。在表現(xiàn)出顯著腫脹的腳趾關(guān)節(jié)區(qū)域增生的滑膜組織和軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了滑膜蛋白表達(dá)。
圖19圖解顯示了使滑膜蛋白基因缺損的靶向載體的結(jié)構(gòu)。在小鼠滑膜蛋白基因片段的翻譯起始位置(翻譯第一個(gè)蛋氨酸的ATG密碼子；以“*”表示)處導(dǎo)入lacZ基因，導(dǎo)入新霉素抗性(neo)基因作為正選擇標(biāo)記基因。另外，還連接白喉毒素A(DT-A)基因以形成負(fù)選擇標(biāo)記。發(fā)生同源重組的個(gè)體缺乏滑膜蛋白基因的表達(dá)，但取而代之的是β-半乳糖苷酶的表達(dá)，通過(guò)利用其酶活性的LacZ染色即可檢測(cè)出由滑膜蛋白基因啟動(dòng)子起始的表達(dá)(參見(jiàn)圖22)。圖中還顯示了為了證實(shí)基因型的Southern印跡分析所用探針的位置(參見(jiàn)圖20)。
圖20為顯示滑膜蛋白基因-缺損小鼠基因型分析結(jié)果的照片。DNA提取自約2周齡的小鼠尾(野生型和雜合-缺損的小鼠)和妊娠14.5天后(dpc)的小鼠胎兒(純合-缺損的小鼠)，用PstI消化之后，使用圖19顯示的探針進(jìn)行Southern印跡。
圖21為顯示滑膜蛋白基因-缺損小鼠的Northern印跡分析結(jié)果的照片。mRNA提取自野生型(+/+)，滑膜蛋白基因雜合敲除小鼠(+/-)和純合敲除小鼠(-/-)，使用滑膜蛋白基因片段作為探針進(jìn)行Northern印跡(上圖的實(shí)驗(yàn)組)。下圖的實(shí)驗(yàn)組顯示了瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色。
圖22的照片顯示了通過(guò)LacZ染色研究滑膜蛋白表達(dá)位置的結(jié)果。使用LacZ染色妊娠后12.5天和妊娠后13.5天的野生型和雜合-缺損小鼠。發(fā)現(xiàn)在胚胎期的頂骨、四肢、耳等形成骨和軟骨的位置存在強(qiáng)滑膜蛋白表達(dá)。
圖23的照片顯示了四肢形成期的滑膜蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與FGF4、BMP2和BMP4的表達(dá)方式相同，在四肢形成期的尖端外胚層嵴(AER)中存在強(qiáng)滑膜蛋白表達(dá)。
圖24的照片顯示了雜合-缺損小鼠妊娠后13天肢芽的凍干切片的LacZ染色。染色進(jìn)行了4小時(shí)。LacZ的藍(lán)色深染出未分化的間充質(zhì)細(xì)胞(骨和軟骨的原基)。原始放大倍數(shù)×40。
圖25的照片顯示了雜合-缺損小鼠妊娠后13天肢芽的凍干切片的LacZ染色。染色進(jìn)行了4小時(shí)。LacZ的藍(lán)色深染出未分化的間充質(zhì)細(xì)胞(骨和軟骨的原基)。原始放大倍數(shù)×200。A、B和C對(duì)應(yīng)于圖24。
圖26的照片顯示了妊娠后12.5天和13天的滑膜蛋白基因純合-缺損小鼠的表型。妊娠后12.5天和13天的滑膜蛋白基因純合-缺損小鼠表現(xiàn)出從頂骨區(qū)至臀部的長(zhǎng)度短，且提前形成頭顱和四肢的趨勢(shì)。在妊娠后13天的雜合-缺損小鼠和野生型小鼠之間沒(méi)有顯著的表型差異。
圖27的照片顯示了妊娠后14.5天的滑膜蛋白基因-缺損小鼠的表型。在妊娠后14.5天的滑膜蛋白基因純合-缺損小鼠中發(fā)現(xiàn)了肢芽異常。
圖28的照片顯示了妊娠后14.5天的滑膜蛋白基因純合-缺損小鼠的后肢中的LacZ表達(dá)(反映了滑膜蛋白表達(dá))。在純合-缺損小鼠的異常后肢中，在AER和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞集中的位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了LacZ表達(dá)。
圖29的照片顯示了妊娠后15.5天的滑膜蛋白基因-缺損小鼠的表型。在純合-缺損小鼠中發(fā)現(xiàn)了肢芽異常、上下頜骨異常和耳的形態(tài)異常。未發(fā)現(xiàn)心跳，小鼠未存活。
圖30的照片顯示了妊娠后15.5天的滑膜蛋白基因-缺損小鼠的骨骼。其中顯示出愛(ài)茜藍(lán)和茜素紅染色。在滑膜蛋白純合-缺損小鼠中未發(fā)現(xiàn)被愛(ài)茜藍(lán)染色的軟骨和被茜素紅染色的鈣化骨。
圖31的照片顯示了在滑膜蛋白敲除小鼠中使用抗-膠原抗體混合物的小鼠關(guān)節(jié)炎模型。給野生型小鼠[373(+/+)]和滑膜蛋白雜合敲除小鼠[372(-/+)]施用抗-膠原抗體混合物以引發(fā)關(guān)節(jié)炎(圖中的+)。同時(shí)觀察未給藥的野生型小鼠(-)[371(+/+)]。結(jié)果，與野生型相比，滑膜蛋白雜合敲除小鼠中前肢和后肢關(guān)節(jié)的腫脹和發(fā)紅癥狀有所減輕。即，與野生型小鼠中引發(fā)的關(guān)節(jié)炎相比，滑膜蛋白雜合敲除小鼠中關(guān)節(jié)炎的發(fā)生較弱。
圖32的照片顯示了得自滑膜蛋白基因純合-缺損小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培養(yǎng)細(xì)胞的LacZ染色和愛(ài)茜藍(lán)染色。LacZ陽(yáng)性集落(即表達(dá)滑膜蛋白的細(xì)胞)與愛(ài)茜藍(lán)染色陽(yáng)性集落一致。該結(jié)果暗示滑膜蛋白對(duì)骨和軟骨的分化起作用。傳代數(shù)為1(p1)。
圖33的照片顯示了得自妊娠后13天的胎鼠肢芽的原代培養(yǎng)細(xì)胞的LacZ染色。其中顯示了得自野生型小鼠(+/+)，和滑膜蛋白基因雜合(-/+)和純合(-/-)缺損小鼠的細(xì)胞。僅觀察滑膜蛋白基因-缺損小鼠(嵌入了lacZ基因)中的LacZ表達(dá)。傳代數(shù)為1(p1)。
圖34的照片顯示了得自滑膜蛋白基因雜合-缺損小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培養(yǎng)細(xì)胞的LacZ染色和愛(ài)茜藍(lán)染色。LacZ陽(yáng)性集落(即表達(dá)滑膜蛋白的細(xì)胞)與愛(ài)茜藍(lán)染色陽(yáng)性集落一致。傳代數(shù)為1(p1)。
圖35的照片顯示了得自野生型小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培養(yǎng)細(xì)胞的LacZ染色和愛(ài)茜藍(lán)染色。未觀察到LacZ染色。傳代數(shù)為1(p1)。
圖36的照片顯示了得自滑膜蛋白基因雜合-缺損小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培養(yǎng)細(xì)胞的LacZ染色。甚至在典型的雙核軟骨細(xì)胞中也可確定LacZ染色(滑膜蛋白表達(dá))(參見(jiàn)放大200倍的圖像)。
圖37的照片顯示了得自胎鼠肢芽的原代培養(yǎng)細(xì)胞的von Kossa染色。其中顯示了得自野生型小鼠(WT)、滑膜蛋白基因雜合(Hetero)和純合(Homo)缺損小鼠的細(xì)胞。在滑膜蛋白基因-缺損小鼠(Homo)中觀察到骨形成能力的降低。傳代數(shù)為1(p1)。
圖38的照片顯示了得自滑膜蛋白基因純合-缺損胎鼠肢芽的原代培養(yǎng)細(xì)胞(傳代數(shù)為3；p3)的LacZ染色。持續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞變成次鋪滿。進(jìn)行LacZ染色(過(guò)夜)之后，進(jìn)行蘇木精伊紅(HE)染色。
圖39圖解顯示了滑膜蛋白基因雜合敲除小鼠(嵌入了lacZ基因)的原代細(xì)胞的β-gal試驗(yàn)結(jié)果。平行測(cè)定三份樣品，顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖40圖解顯示了通過(guò)滑膜蛋白基因雜合敲除小鼠(嵌入了lacZ基因)的原代細(xì)胞的β-gal試驗(yàn)檢查多種藥物對(duì)滑膜蛋白啟動(dòng)子活性的作用的結(jié)果。平行測(cè)定三份樣品，顯示平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖41圖解顯示了用Syno-P3免疫的小鼠血清的ELISA結(jié)果。以所示比率稀釋得自三個(gè)個(gè)體(第1-3號(hào))的血清，然后進(jìn)行ELISA。將得自未經(jīng)免疫的小鼠(圖中的“正?！?的血清用作對(duì)照。
圖42圖解顯示了用Syno-P2免疫的小鼠血清的ELISA結(jié)果。以所示比率稀釋得自三個(gè)個(gè)體(第1-3號(hào))的血清，然后進(jìn)行ELISA。將得自未經(jīng)免疫的小鼠(圖中的“正?！?的血清用作對(duì)照。
圖43圖解顯示了用Syno-P1免疫的小鼠血清的ELISA結(jié)果。以所示比率稀釋得自三個(gè)個(gè)體(第1-3號(hào))的血清，然后進(jìn)行ELISA。將得自未經(jīng)免疫的小鼠(圖中的“正?！?的血清用作對(duì)照。
圖44的照片顯示了得自具有抗-滑膜蛋白單克隆抗體的RA和OA患者的滑膜細(xì)胞的Western印跡(A)和熒光免疫染色(B)結(jié)果。
圖45的照片顯示了得自具有抗-滑膜蛋白單克隆抗體的RA患者的滑膜組織的免疫染色結(jié)果。其中還顯示了蘇木精伊紅(HE)染色圖像。
圖46的照片顯示了滑膜蛋白的自身-遍在蛋白化活性。在GST-HA-遍在蛋白、ATP、E1和E2的存在下反應(yīng)FLAG-滑膜蛋白，用抗-FLAG抗體和抗-HA抗體檢測(cè)滑膜蛋白的遍在蛋白化。CE細(xì)胞提取物。IP免疫沉淀物。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式[實(shí)施例1]制備抗-滑膜細(xì)胞抗-血清使用通過(guò)下述方法制備的滑膜細(xì)胞作為免疫原來(lái)獲得抗-滑膜細(xì)胞抗-血清。在無(wú)菌狀態(tài)下，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗經(jīng)滑膜切除術(shù)從10個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者體內(nèi)提取的滑膜組織。將經(jīng)清洗的組織切成大小約為5mm的方塊，37℃用0.25％胰蛋白酶/PBS消化20分鐘。從經(jīng)消化的滑膜組織中除去過(guò)量的組織塊，將所得細(xì)胞懸浮于含有10％胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Virology，8，396，1959)(10％FCS-DMEM)中，于5％CO2，37℃中，在無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時(shí)。棄去培養(yǎng)上清，使用10％FCS-DMEM進(jìn)行清洗，除去未貼壁的細(xì)胞，以獲得粘附于平皿的細(xì)胞，即為得自類風(fēng)濕患者的滑膜細(xì)胞(The Journal of ClinicalInvestigation，92，186，1993)。將經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞用作細(xì)胞庫(kù)，作為下述得自RA患者的滑膜細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)中。
將得自患者的滑膜細(xì)胞(1×105)懸浮于20ml的10％FCS-DMEM中，在76cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每3天換一次培養(yǎng)基，兩周后，培養(yǎng)物表面長(zhǎng)滿細(xì)胞，此時(shí)除去培養(yǎng)基，加入各為7ml的0.05％EDTA/PBS和0.1％胰蛋白酶/PBS以脫附和回收細(xì)胞。用PBS清洗回收的細(xì)胞以除去培養(yǎng)基組分，懸浮于1ml PBS中以形成免疫原。
在制備后2小時(shí)內(nèi)使用該免疫原，通過(guò)靜脈注射至耳來(lái)免疫一只兔。以一周為間隔，共免疫6次。第6次免疫時(shí)，從兔耳抽取的數(shù)ml血液檢測(cè)抗血清，通過(guò)熒光抗體法發(fā)現(xiàn)抗血清與類風(fēng)濕患者滑膜細(xì)胞的反應(yīng)。第6次免疫后一周，使用導(dǎo)管從心臟中抽取盡可能多的血液。將血液在4℃放置過(guò)夜以使其凝結(jié)，分離血清。在血清中加入0.1％疊氮化鈉作為防腐劑，將血清儲(chǔ)存于4℃作為抗-滑膜細(xì)胞抗血清。
抗-滑膜細(xì)胞抗血清所識(shí)別抗原(滑膜蛋白)的基因克隆使用酸胍/苯酚氯仿法提取實(shí)施例1中獲得的10個(gè)RA患者滑膜細(xì)胞的總RNA，使用poly T珠純化mRNA(Analytical Biochemistry，162，159，1987)。通過(guò)常規(guī)方法使用λZAP載體(Stratagene)制備RA患者滑膜細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。使用picoBlue免疫篩選試劑盒(Stratagene)，用上述實(shí)施例1的抗-滑膜細(xì)胞抗血清進(jìn)行免疫篩選(圖1)。用輔助噬菌體將所得陽(yáng)性克隆(噬菌體)轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)粒pBluescript II SK(+)。利用M13PrimerM4和M13PrimerRV(Takara)，基于染料終止子法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，74，5463，1977)通過(guò)ABI PRISM377 DNA測(cè)序儀(PERKIN ELMER)測(cè)定插入pBluescript II SK(+)的DNA的核苷酸序列。從編碼被上述抗-滑膜細(xì)胞抗血清識(shí)別的抗原的基因(即“滑膜蛋白”)的3’末端測(cè)定核苷酸序列，闡明了包括poly(A)+鏈的2990bp核苷酸序列(SEQ ID NO1，第42-3031位)。使用該核苷酸序列，通過(guò)5′-RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，858998-9002，1988)，從滑膜細(xì)胞cDNA文庫(kù)中測(cè)定3031bp的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，該序列包括全長(zhǎng)滑膜蛋白的編碼區(qū)，5’-非編碼區(qū)的一部分和poly(A)+鏈。在GenBank中進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列是新基因，尚未報(bào)道過(guò)類似的序列。
在大腸桿菌中表達(dá)部分滑膜蛋白重組蛋白從通過(guò)使用抗-滑膜細(xì)胞抗血清進(jìn)行免疫篩選而獲得的cDNA克隆中，用限制性酶EcoRI和XhoI處理編碼滑膜蛋白的一部分的cDNA(1799 bp；SEQ ID NO1，第1233-3031位)，并提取所述cDNA。將末端具有能被EcoRI/XhoI識(shí)別的序列的cDNA插入谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達(dá)載體pGEX-5X-3，進(jìn)行亞克隆。通過(guò)以42℃熱激45秒，將已插入部分滑膜蛋白cDNA的pGEX-5X-3導(dǎo)入BL21大腸桿菌菌株，獲得BL21/滑膜蛋白-GST基因/pGEX-5X-3。在含有0.1mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)該BL21菌株，加入0.1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于37℃再培養(yǎng)2小時(shí)以誘導(dǎo)上述融合蛋白的表達(dá)。用PBS洗滌通過(guò)離心回收的BL21之后，用1mg/ml溶菌酶消化BL21，并用0.1％Triton X-100溶解。將得自BL21、含有溶解的GST融合蛋白的蛋白質(zhì)懸浮液上樣于谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)，然后用PBS洗滌，使用50mM還原型谷胱甘肽/PBS純化合乎需要的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白。
在大腸桿菌中表達(dá)全長(zhǎng)滑膜蛋白重組蛋白質(zhì)將含有編碼實(shí)施例2所得滑膜蛋白的cDNA(1851 bp；SEQ ID NO1，第60-1910位)，且3’末端添加有兩個(gè)流感病毒血凝素(HA)-標(biāo)記分子的滑膜蛋白cDNA(syno-HAHA)插入谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達(dá)載體pGEX-5X-1，進(jìn)行亞克隆。通過(guò)以42℃熱激45秒，將已插入syno-HAHA基因的pGEX-5X-1導(dǎo)入BL21大腸桿菌菌株，獲得BL21/syno-HAHA/pGEX-5X-1。在含有0.1mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)該BL21菌株，加入0.1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于30℃再培養(yǎng)3小時(shí)以誘導(dǎo)N末端與GST融合、C末端與HA融合的滑膜蛋白蛋白質(zhì)(GST-滑膜蛋白-HAHA)的表達(dá)。用PBS洗滌通過(guò)離心回收的BL21之后，用1mg/ml溶菌酶消化BL21，并用0.1％Triton X-100溶解。將得自BL21、含有溶解的GST-滑膜蛋白-HAHA蛋白的蛋白質(zhì)懸浮液上樣于谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)，然后用PBS洗滌，使用50mM還原型谷胱甘肽/Tris-HCl(pH8.0)純化合乎需要的GST-滑膜蛋白-HAHA蛋白。
通用PBS過(guò)200倍和2000倍地稀釋用50mM還原型谷胱甘肽洗脫的級(jí)分，用25mM Tris-HCl(pH6.8)、0.25％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.05％巰基乙醇和0.1％甘油對(duì)其進(jìn)行處理，然后通過(guò)將它們上樣于8％SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)，即可進(jìn)一步證實(shí)表達(dá)。SDS-PAGE之后，通過(guò)電印跡將GST-滑膜蛋白-HAHA蛋白轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。室溫下用含有5％脫脂乳的PBS將所述尼龍膜封閉60分鐘，然后在室溫下與用含有5％脫脂乳的PBS稀釋400倍的抗-HA單克隆抗體(Boehringer Mannheim)進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)60分鐘。反應(yīng)之后，用0.1％吐溫20/PBS洗滌，室溫下與第二抗體，即經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的小鼠IgG抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)60分鐘，用0.1％吐溫20/PBS洗滌，通過(guò)檢測(cè)HRP活性來(lái)檢測(cè)靶抗原。使用ECL試劑盒(Amersham)進(jìn)行HRP活性的檢測(cè)(Clinical Chemistry，25，p1531，1979)。結(jié)果示于圖2。由上述GST-滑膜蛋白-HAHA融合蛋白的分子量大小估計(jì)滑膜蛋白蛋白質(zhì)的分子量約為80kDa。
體外表達(dá)全長(zhǎng)滑膜蛋白重組蛋白質(zhì)用限制性酶EcoRI修飾滑膜蛋白基因(SEQ ID NO1)的末端，插入pBluescript II KS載體(syno/pBluescript)。然后，使用syno/pBluegcript(1μg)和與TNT-偶聯(lián)的翻譯系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行體外翻譯以在體外將滑膜蛋白蛋白質(zhì)表達(dá)成經(jīng)[35S]-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。將經(jīng)[35S]-標(biāo)記的滑膜蛋白蛋白質(zhì)上樣于10％SDS-PAGE，用圖像分析儀(BAS2000，F(xiàn)ujix)檢測(cè)其放射性。結(jié)果示于圖3。發(fā)現(xiàn)體外翻譯自滑膜蛋白基因的滑膜蛋白蛋白質(zhì)基于SDS-PAGE的分子量約為80kDa。
通過(guò)Northern印跡證實(shí)滑膜蛋白基因的表達(dá)通過(guò)一般方法，從實(shí)施例1中獲得的得自RA患者的滑膜細(xì)胞、A549細(xì)胞系、Jurkat細(xì)胞系和HeLa細(xì)胞系中獲得mRNA。通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分離1μg上述mRNA，通過(guò)接觸印跡將其轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。80℃處理尼龍膜2小時(shí)，42℃在Denhardt溶液中預(yù)雜交2小時(shí)。接著，使用經(jīng)32P放射性標(biāo)記的滑膜蛋白cDNA(1799 bp；SEQ ID NO1，第1233-3031位)作為探針，42℃雜交12小時(shí)。反應(yīng)之后，用300mM NaCl和30mM檸檬酸鈉洗滌尼龍膜，然后于50℃用15mM NaCl和1.5mM檸檬酸鈉再次進(jìn)行洗滌。通過(guò)暴露于X-射線膠片來(lái)檢測(cè)所需的mRNA。圖4顯示了放射自顯影的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)得自RA患者的滑膜細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)滑膜蛋白基因。
通過(guò)Western印跡證實(shí)多種細(xì)胞中的滑膜蛋白表達(dá)使用下述細(xì)胞為樣品，通過(guò)Western印跡進(jìn)一步證實(shí)滑膜蛋白的表達(dá)狀態(tài)。
*實(shí)施例1中制備的得自RA患者的滑膜細(xì)胞*人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)*HEK(人胚胎腎)-293T*實(shí)施例3中制備的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白(陽(yáng)性對(duì)照)首先，將用作樣品的多種細(xì)胞溶解于1％NP-40以制備細(xì)胞裂解液。用25mM Tris-HCl(pH6.8)、0.25％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.05％巰基乙醇和0.1％甘油處理每一種細(xì)胞裂解液，然后用8％SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離。SDS-PAGE之后，通過(guò)電印跡將得自多種細(xì)胞的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上。在此NC膜上，用含有2.0mg/mL GST-部分滑膜蛋白融合蛋白和5％脫脂乳的Tris緩沖鹽水(TBS)將抗-滑膜細(xì)胞抗血清稀釋1000倍，室溫下進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)60分鐘。另外，作為陰性對(duì)照，同時(shí)需進(jìn)行相同抗體溶液與NC膜反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，或抗體溶液中的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白被GST替代的實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)之后，用0.1％吐溫20/PBS洗滌NC膜，室溫下與第二抗體，即經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗-兔IgG抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)60分鐘，用0.1％吐溫20/PBS洗滌，通過(guò)檢測(cè)HRP活性來(lái)檢測(cè)靶抗原。使用ECL試劑盒(Amersham)進(jìn)行HRP活性的檢測(cè)(ClinicalChemistry，25，p1531，1979)。結(jié)果示于圖5。
GST-部分滑膜蛋白阻斷了抗-滑膜細(xì)胞抗血清與220kDa蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，所述蛋白質(zhì)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)(圖5；+GST)中的得自RA患者的滑膜細(xì)胞中可以檢測(cè)到，但在HUVEC和HEK-293細(xì)胞中卻檢測(cè)不到，GST-部分滑膜蛋白也部分阻斷了所述抗血清與約140kDa蛋白質(zhì)和約185kDa蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)(圖5；+GST-部分滑膜蛋白)。
據(jù)推測(cè)，在除220-kDa帶以外的帶中觀察到的反應(yīng)性是通過(guò)它們與其它抗體的反應(yīng)性而測(cè)定的纖連蛋白(分子量約為240kDa)或?qū)诱尺B蛋白亞單位(分子量約為200kDa)。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，推測(cè)滑膜蛋白的分子量為220kDa。然而，實(shí)施例5中證實(shí)的滑膜蛋白分子量約為80kDa。從這兩者的差異上看，可以相信滑膜蛋白具有在SDS中不解離的多聚體結(jié)構(gòu)。
通過(guò)Western印跡證實(shí)得自RA患者的滑膜細(xì)胞中的滑膜蛋白蛋白表達(dá)將實(shí)施例1中制備的得自RA患者的滑膜細(xì)胞溶解于1％NP-40以制備細(xì)胞提取物組分。用25mM Tris-HCl(pH6.8)、0.25％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.05％巰基乙醇和0.1％甘油處理該滑膜細(xì)胞提取物，然后用8％SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離。SDS-PAGE之后，通過(guò)電印跡將得自滑膜細(xì)胞的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上。將此NC膜室溫下用含有5％脫脂乳的Tris緩沖鹽水(TBS)封閉1小時(shí)，然后用含有5％脫脂乳的Tris緩沖鹽水(TBS)將通過(guò)免疫得自RA患者的滑膜細(xì)胞而獲得的抗-滑膜細(xì)胞抗血清(在圖中，免疫后)稀釋1000倍，室溫下進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)1小時(shí)。同時(shí)，將用滑膜細(xì)胞免疫兔之前從兔中抽取的血清(免疫前)用作陰性對(duì)照。反應(yīng)之后，用0.1％吐溫20/PBS洗滌NC膜，室溫下與第二抗體，即經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗-兔IgG抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)1小時(shí)，用0.1％吐溫20/PBS洗滌，通過(guò)檢測(cè)HRP活性來(lái)檢測(cè)靶抗原。使用ECL試劑盒(Amersham)進(jìn)行HRP活性的檢測(cè)(Clinical Chemistry，25，p1531，1979)。結(jié)果示于圖6。
通過(guò)免疫染色證實(shí)多種細(xì)胞和滑膜組織中的滑膜蛋白表達(dá)通過(guò)常規(guī)方法將滑膜細(xì)胞固定于玻璃載玻片上以進(jìn)行免疫染色，使用實(shí)施例1的純化抗-滑膜細(xì)胞抗血清進(jìn)行免疫染色。用1％牛血清白蛋白(BSA)將樣品封閉30分鐘，室溫下，使樣品與用1％BSA稀釋100倍的抗-滑膜細(xì)胞抗血清免疫反應(yīng)60分鐘。另外，在用抗血清進(jìn)行觀察的同時(shí)，使用純化自該抗血清的純化抗-滑膜細(xì)胞抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)使用GST-部分滑膜蛋白融合蛋白作為配體進(jìn)行免疫親和純化來(lái)制備純化的抗-滑膜細(xì)胞抗體。所用的配體是將含有1799bp滑膜蛋白基因(SEQ ID NO1的第1233-3031位)的GST-融合蛋白表達(dá)載體pGEX-5X-3轉(zhuǎn)化至BL21之后表達(dá)的融合蛋白。通過(guò)Pharmacia公司的方法制備谷胱甘肽Sepharose柱，以制備GST-部分syno-GS柱。在使用純化的抗-滑膜細(xì)胞抗體時(shí)，作為對(duì)照，使用了按照相同的方式，但將GST用作配體，經(jīng)免疫親和純化抗血清所得的抗-GST抗體。
反應(yīng)之后，用PBS洗滌樣品，然后使用經(jīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗-兔IgG抗體作為第二抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。用聚焦激光顯微鏡證實(shí)與抗-滑膜細(xì)胞抗血清進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗原。結(jié)果示于圖7。該抗血清表現(xiàn)出與得自RA患者的滑膜細(xì)胞的強(qiáng)免疫反應(yīng)，經(jīng)證實(shí)，實(shí)施例3中制備的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白可以阻斷該免疫反應(yīng)(圖7，上圖)。另外，還證實(shí)了制備自該抗血清的純化抗-滑膜細(xì)胞抗體的免疫反應(yīng)甚至更強(qiáng)和更確定(圖7，下圖)。
通過(guò)常規(guī)方法將滑膜組織固定于玻璃載玻片上以對(duì)得自RA患者的滑膜組織進(jìn)行染色。用1％BSA將樣品封閉30分鐘，室溫下，使樣品與用1％BSA稀釋100倍的抗-滑膜細(xì)胞抗血清免疫反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)之后，用PBS洗滌樣品，然后與第二抗體，即經(jīng)HRP標(biāo)記的抗-兔IgG抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。通過(guò)基于HRP活性的3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸化物顯色來(lái)證實(shí)與抗-滑膜細(xì)胞抗血清發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原。按照與上述Western印跡相同的方式，使用GST-部分滑膜蛋白融合蛋白進(jìn)行與滑膜組織染色有關(guān)的抗-滑膜細(xì)胞抗血清吸附試驗(yàn)。通過(guò)在抗-滑膜細(xì)胞抗血清中加入2.0mg/ml GST-部分滑膜蛋白融合蛋白或GST(2.0mg/ml)以進(jìn)行組織染色。結(jié)果示于圖8。發(fā)現(xiàn)GST-部分滑膜蛋白融合蛋白使對(duì)照中出現(xiàn)的抗-滑膜細(xì)胞抗血清對(duì)滑膜組織的染色變?nèi)?圖8)。另外，與得自GST-GS的抗體相比，發(fā)現(xiàn)使用上述得自GST-部分Syno-GS的純化抗體的滑膜組織免疫染色反應(yīng)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖9)。
根據(jù)Western印跡(實(shí)施例8)和免疫染色的結(jié)果，證實(shí)得自RA患者的滑膜細(xì)胞和滑膜組織中表達(dá)了能被抗-滑膜細(xì)胞抗血清識(shí)別的滑膜蛋白蛋白質(zhì)。
RA患者的血清中抗-滑膜蛋白抗體的存在本發(fā)明人嘗試使用GST-部分滑膜蛋白融合蛋白作為抗原，通過(guò)Western印跡檢測(cè)RA患者血清中的抗-滑膜蛋白抗體。使用與實(shí)施例7中相同的方法，首先，通過(guò)SDS-PAGE電泳GST-部分滑膜蛋白融合蛋白(100ng/泳道)，并轉(zhuǎn)移至NC膜上。用Tris緩沖鹽水(TBS)將RA患者血清(5例)稀釋1000倍以用作第一抗體，室溫下，與其上轉(zhuǎn)移有GST-部分滑膜蛋白融合蛋白的NC膜進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)60分鐘。用0.1％吐溫20/TBS洗滌NC膜，室溫下與第二抗體，即經(jīng)HRP標(biāo)記的抗-人IgG抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)達(dá)60分鐘，用0.1％吐溫20/TBS洗滌，通過(guò)檢測(cè)HRP活性來(lái)檢測(cè)與靶抗原反應(yīng)的人IgG。按照與實(shí)施例7相同的方法進(jìn)行HRP活性的檢測(cè)。結(jié)果示于圖10。在RA-患者(全部5個(gè))的血清中發(fā)現(xiàn)了抗GST-部分滑膜蛋白融合蛋白的抗-IgG抗體(圖10)。另一方面，在得自變形性關(guān)節(jié)病(OA)患者的血清和正常人的血清中未發(fā)現(xiàn)能識(shí)別GST-部分滑膜蛋白的抗體。
通過(guò)篩選表達(dá)文庫(kù)來(lái)鑒定滑膜蛋白配體使用得自實(shí)施例2中制備的RA患者滑膜細(xì)胞的cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行滑膜蛋白配體的篩選(Tadaomi Takenawa，Toshiki Watanabe，eds.，Baiomanyuaru UP Shirizu“Tampakushitsu no Bunshikan Sogosayo Jikken Ho”[Bio-Manual UP Series“Protein Intermolecular Interaction ExperimentalMethod”]，pp.66-67，Yodosha Co.，Ltd.；Kaelin，W.G等，Cell 70，351-364，1992；Skolnik，E.Y等，Cell 65，83-90，1991；Sambrook，J等，Molecular Cloning，a laboratory manual second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press 12.16-12.20，1989)。通過(guò)于37℃保溫20分鐘，將文庫(kù)噬菌體接種于大腸桿菌(XL1-Blue MRF’)，與頂層瓊脂糖混合之后鋪于平板上。42℃培養(yǎng)3.5小時(shí)之后，將硝酸纖維素膜浸泡于10mM IPTG中并干燥，然后將膜放置在平板上，于37℃再培養(yǎng)3.5小時(shí)。回收膜之后，在洗滌緩沖液[10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％脫脂乳、0.1％Triton X-100、150mM NaCl、1mM EDTA、5mMMgCl2、1mM DTT、蛋白酶抑制劑(完全的，Boehringer Mannheim)]中洗滌5次，每次5分鐘，在封閉緩沖液[10mM Tris-HCl(pH8.0)、5％脫脂乳、0.1％Triton X-100、150mM NaCl、1mM EDTA、5mM MgCl2、1mM DTT、5％甘油、蛋白酶抑制劑(完全的，Boehringer Mannheim)]中浸泡1小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌5次，每次5分鐘，加入用蛋白質(zhì)激酶A進(jìn)行32P-標(biāo)記的GST-滑膜蛋白(實(shí)施例3中純化的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白)作為探針(約為106cpm/ml)，然后進(jìn)行保溫。更換洗滌緩沖液重復(fù)進(jìn)行洗滌，直至每個(gè)膜的計(jì)數(shù)約為1kcpm，然后通過(guò)放射自顯影檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果，獲得與滑膜蛋白結(jié)合的克隆。將該克隆稱為滑膜蛋白配體(SL)。
關(guān)于SL的cDNA，測(cè)定其5’末端附近的100bp和3’末端附近的100bp的核苷酸序列。根據(jù)所得的核苷酸序列信息進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)末端100bp部分的序列與已知的被稱為S1-5的基因[Lecka-Czernik，B等，Molecular and Cellular Biology，15，120-128，1995；登錄號(hào)為U03877(cDNA)，AAA65590(蛋白質(zhì))，也稱為“EFEMP1”Stone，E.M等，Nature Genetics22，199-202，1999；登錄號(hào)為Q12805(蛋白質(zhì))]相同。這兩個(gè)基因的大小大致相同，其翻譯產(chǎn)物的大小大致相同，這表明它們是相同的蛋白質(zhì)。
通過(guò)Northern印跡表達(dá)SL基因按照與實(shí)施例6相同的方法，從多種細(xì)胞中提取mRNA，使用實(shí)施例11中獲得的SL cDNA作為探針進(jìn)行Northern印跡。所用細(xì)胞如下。發(fā)現(xiàn)得自RA患者的滑膜細(xì)胞表現(xiàn)出SL基因的強(qiáng)表達(dá)(圖11)。
HEK-293T實(shí)施例1中制備的得自RA患者的滑膜細(xì)胞A549HeLa[實(shí)施例13]滑膜蛋白與SL的結(jié)合按照與實(shí)施例3相同的方法，將SL cDNA插入pGEX載體以制備GST-SL融合蛋白，將GST-SL(500ng)上樣于10％SDS-PAGE，以GST(1μg)作為對(duì)照。SDS-PAGE之后，通過(guò)電印跡將其轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。室溫下，用含有6M鹽酸胍和5mM 2-巰基乙醇的50mM Tris-HCl(pH8.0)將尼龍膜變性1小時(shí)，于4℃，在含有5mM 2-巰基乙醇和0.05％吐溫20的50mM Tris-HCl(pH8.0)中使尼龍膜再生過(guò)夜。用封閉緩沖液[10mM Tris-HCl(pH8.0)，5％脫脂乳，0.1％Triton X-100，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM MgCl2，1mM DTT，5％甘油，蛋白酶抑制劑(完全的，Boehringer Mannheim)]處理再生的尼龍膜，并用封閉緩沖液(除了0.5％脫脂乳外，其余與上述相同)洗滌。然后，使用與TNT-偶聯(lián)的翻譯系統(tǒng)(Promega)和pcDNA3-HA-滑膜蛋白-HAHA(SEQ ID NO1滑膜蛋白cDNA 1851 bp；插入表達(dá)載體pcDNA3中的、在第60-1910位添加有HA-標(biāo)記的滑膜蛋白cDNA)進(jìn)行體外翻譯，將經(jīng)[35S]-標(biāo)記的HA-滑膜蛋白-HAHA融合蛋白([35S]HA-滑膜蛋白-HAHA)用作探針，室溫下使尼龍膜上的GST-SL和GST反應(yīng)2小時(shí)。用10mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5％脫脂乳，0.1％Triton X-100，150mM NaCl，1mM EDTA，5mMMgCl2，1mM DTT和蛋白酶抑制劑(完全的，Boehringer Mannheim)洗滌所述尼龍膜，用圖像分析儀(BAS2000，F(xiàn)ujix)檢測(cè)其放射性。觀察轉(zhuǎn)移至尼龍膜上的GST-SL融合蛋白與[35S]HA-滑膜蛋白-HAHA之間的結(jié)合。另外，在GST和[35S]HA-滑膜蛋白-HAHA對(duì)照中未觀察到結(jié)合(圖12)。從此結(jié)果上看，可推測(cè)滑膜蛋白和SL通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合。
另外，在實(shí)施例14中，所得結(jié)果表明通過(guò)培養(yǎng)物中基于滑膜蛋白的滑膜蛋白配體中和可阻斷滑膜細(xì)胞的增殖。根據(jù)這些結(jié)果，可以認(rèn)為具有對(duì)應(yīng)于SL的滑膜蛋白結(jié)合位點(diǎn)之結(jié)構(gòu)的SL突變體可能具有通過(guò)對(duì)滑膜蛋白與SL結(jié)合的拮抗阻斷作用而抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用。另外，具有對(duì)應(yīng)于滑膜蛋白的SL結(jié)合位點(diǎn)之結(jié)構(gòu)的滑膜蛋白突變體也有望具有與SL突變體相同的拮抗阻斷作用。
MTT試驗(yàn)使用實(shí)施例1中制備的得自RA患者的滑膜細(xì)胞制備96孔培養(yǎng)板，使得每孔有5×103個(gè)細(xì)胞，在細(xì)胞上清中加入GST或GST-部分滑膜蛋白，使得終濃度為0.01至1μM。培養(yǎng)3天后，在細(xì)胞上清中加入3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)/PBS，在37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)之后，取出細(xì)胞上清，用二甲基亞砜溶解MTT甲臜的晶體，進(jìn)行吸光度測(cè)定(Journal of Immunological Methods，65，55，1983)。在10％-FCS/DMEM，37℃，5％CO2的條件下，GST-部分滑膜蛋白能顯著抑制得自RA患者的滑膜細(xì)胞增殖(1μM)(圖13)。
制備導(dǎo)入了滑膜蛋白基因的小鼠通過(guò)將Flag標(biāo)記連接至編碼滑膜蛋白蛋白質(zhì)之DNA的N末端，并將poly(A)信號(hào)連接至3’方向的下游，構(gòu)建導(dǎo)入滑膜蛋白基因的載體。根據(jù)以β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子，以人巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子作為增強(qiáng)子的pCAGGS(Niwa，H等，Gene 108193-9，1991)來(lái)構(gòu)建載體(圖14)。
通過(guò)在顯微鏡下使用與操作器相連的顯微玻璃移液管進(jìn)行微量注射，將導(dǎo)入滑膜蛋白基因的載體注射至小鼠卵細(xì)胞中。將DNA注射至受精卵的雄前核中，將經(jīng)注射操作的卵轉(zhuǎn)移至通過(guò)與結(jié)扎輸精管的雄性小鼠交配而誘導(dǎo)假孕的雌性小鼠(受體小鼠)的輸卵管中。轉(zhuǎn)移后19天，通過(guò)自然分娩或剖腹產(chǎn)獲得幼鼠。進(jìn)行剖腹產(chǎn)時(shí)，讓單獨(dú)制備的雌性小鼠作為養(yǎng)母來(lái)照顧幼鼠。從每只新生小鼠的尾部取DNA，使用PCR證實(shí)它攜有轉(zhuǎn)基因。
結(jié)果，在滑膜蛋白強(qiáng)表達(dá)的小鼠中，觀察到明顯的關(guān)節(jié)腫脹。發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入滑膜蛋白基因的小鼠中關(guān)節(jié)病的發(fā)病率為33％(30只小鼠中有10只患病)。因此，可以認(rèn)為關(guān)節(jié)腫脹不是自然發(fā)作的小鼠畸形(C57B6小鼠的腦積水發(fā)病率低于1％)，而是滑膜蛋白分子作用的結(jié)果。圖15顯示了滑膜蛋白強(qiáng)表達(dá)小鼠左后肢的軟性X-射線照片。
關(guān)節(jié)的組織學(xué)研究本發(fā)明人對(duì)導(dǎo)入滑膜蛋白基因的小鼠(1只)的腳趾關(guān)節(jié)進(jìn)行了組織學(xué)研究。對(duì)腳趾關(guān)節(jié)部分的組織切片進(jìn)行蘇木精伊紅(HE)染色。根據(jù)已知方法進(jìn)行蘇木精伊紅染色。
HE染色的結(jié)果表明在表現(xiàn)出關(guān)節(jié)病的部分出現(xiàn)伴隨有顯著滑膜增生的骨損壞和異常骨形成(圖16)。另一方面，在用作對(duì)照的、導(dǎo)入基因的小鼠的正常腳趾關(guān)節(jié)中未觀察到上述現(xiàn)象(圖17，上圖)。
另外，在腳趾關(guān)節(jié)中用抗-Flag抗體進(jìn)行免疫染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入滑膜蛋白基因的小鼠中表現(xiàn)出增生的滑膜組織和軟骨細(xì)胞中存在滑膜蛋白表達(dá)(圖18)，但在導(dǎo)入基因的小鼠的正常腳趾關(guān)節(jié)中未觀察到上述現(xiàn)象(圖17，下圖)。
制備敲除小鼠將lacZ基因插入小鼠滑膜蛋白基因片段的翻譯起始位置(翻譯第一個(gè)蛋氨酸的ATG密碼子)以構(gòu)建靶向載體。插入新霉素抗性(neo)基因以作為標(biāo)記基因還連接有白喉毒素A(DT-A)基因以排除發(fā)生非-同源重組的細(xì)胞系(圖19)。
通過(guò)電穿孔將該靶向載體轉(zhuǎn)移至小鼠ES細(xì)胞TT-2，選擇發(fā)生同源重組的細(xì)胞系。將所得細(xì)胞注射至小鼠胚泡或8-細(xì)胞期胚胎，直接移植到代孕小鼠的輸卵管中，或在培養(yǎng)1天以發(fā)育成胚泡之后移植到代孕小鼠的子宮內(nèi)。然后，通過(guò)與制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相同的方法制備敲除小鼠。使所得的雜合突變小鼠(F1)彼此交配以獲得雜合和純合突變的小鼠。在所得的突變小鼠中，在應(yīng)該表達(dá)滑膜蛋白的組織中表達(dá)了LacZ蛋白(β-半乳糖苷酶)而不是滑膜蛋白。
通過(guò)Southern印跡分析證實(shí)基因型。從出生后約2周的野生型小鼠(14只)和滑膜蛋白雜合敲除小鼠(32只)的距尾端約3mm的點(diǎn)提取DNA。在立體顯微鏡下，從受孕后14.5天的滑膜蛋白純合敲除小鼠的尾和前后肢中取樣，并提取DNA。用限制性酶PstI消化所得的DNA待用。圖20顯示了分析結(jié)果。在野生型小鼠中檢測(cè)到6.5kbp的帶，在純合突變的小鼠中檢測(cè)到8.5kbp的帶，而在雜合突變的小鼠中同時(shí)檢測(cè)到這兩條帶。
通過(guò)Northern印跡進(jìn)一步證實(shí)滑膜蛋白基因的表達(dá)。從野生型、雜合敲除小鼠和純合敲除小鼠個(gè)體(受孕后12.5天的全胚胎)中提取mRNA，在1.2％瓊脂糖凝膠中，每個(gè)泳道上樣20μg進(jìn)行電泳。結(jié)果，在純合敲除小鼠(-/-)個(gè)體中未檢測(cè)到滑膜蛋白mRNA，而雜合敲除小鼠(+/-)個(gè)體中的mRNA表達(dá)弱于野生型(+/+)個(gè)體(圖21)。
研究滑膜蛋白表達(dá)位點(diǎn)本發(fā)明人使用LacZ染色研究實(shí)施例17所得突變小鼠個(gè)體中的滑膜蛋白表達(dá)位點(diǎn)。即，使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)染色全胚胎，并檢查L(zhǎng)acZ(作為β-半乳糖苷酶活性)表達(dá)的分布。所觀察的胚胎數(shù)目為32。
結(jié)果，在受孕后12.5天的小鼠頂骨和四肢，以及受孕后13.5天的小鼠耳和四肢中發(fā)現(xiàn)了LacZ的強(qiáng)表達(dá)(圖22)。所有這些都是骨或軟骨的形成位點(diǎn)。另外，對(duì)四肢形成期的四肢組織切片進(jìn)行LacZ染色和HE染色，結(jié)果在尖端外胚層嵴(AER)以及軟骨和骨的原基(或軟骨和骨)中觀察到強(qiáng)表達(dá)(圖23)。
另外，切下受孕后13天的肢芽，制備凍干切片。然后，進(jìn)行蘇木精伊紅(HE)或LacZ染色。具體地說(shuō)，用PBS(-)洗滌凍干切片三次，每次5分鐘，將載有切片的玻璃載玻片浸入X-gal染色溶液[X-gal(20mg/ml)1.25ml，HEPES(1M)2.2ml，氰鐵酸鉀溶液(100mM)1.5ml，NaCl(5M)150μl，MgCl2(1M)65μl，10×PBS(-)5ml，加入milli-Q水(Millipore)至體積為50ml]，于37℃開(kāi)始反應(yīng)。染色之后，用乙醇系列和二甲苯進(jìn)行脫水，并進(jìn)行密封。結(jié)果，未分化的間充質(zhì)細(xì)胞(骨和軟骨原基)被LacZ染成了深藍(lán)色(圖24和25)。
研究表型另外，本發(fā)明人還研究了滑膜蛋白基因敲除小鼠的表型。
在受孕后12.5天，與雜合小鼠相比，純合小鼠表現(xiàn)出從頂骨區(qū)至臀部的長(zhǎng)度縮短，并且頭顱和四肢的形成不成熟，但在受孕后13天，雜合小鼠和野生型的表型沒(méi)有顯著差異(圖26)。除此之外，未發(fā)現(xiàn)新生的純合小鼠個(gè)體，在受孕后的至少17天之后，未發(fā)現(xiàn)活的純合小鼠胚胎。因此，可以認(rèn)為它們已胎死腹中(表1)。
表1

受孕14.5天，雜合小鼠和純合小鼠從頂骨區(qū)至臀部的長(zhǎng)度沒(méi)有顯著差異。然而，雜合小鼠中形成了腳趾和關(guān)節(jié)，但純合小鼠中卻未形成腳趾和關(guān)節(jié)，并且還出現(xiàn)了肢異常(圖27)。
另外，對(duì)純合小鼠表現(xiàn)出異常的后肢進(jìn)行LacZ和HE染色，結(jié)果在AER和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞(未來(lái)的趾骨形成位置)集中的位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了反映滑膜蛋白表達(dá)的LacZ表達(dá)(圖28)。
受孕15.5天，純合小鼠死亡，表現(xiàn)出肢芽、上下頜和耳的形態(tài)學(xué)異常(圖29)。另外，用愛(ài)茜藍(lán)染色軟骨組織，用茜素紅染色骨(鈣化)組織。即，除去小鼠的表皮、真皮和內(nèi)容物，浸泡于固定液(乙醇∶雙氧水＝9∶1)中，用乙醇系列脫水，然后用茜素紅和愛(ài)茜藍(lán)染色，用堿性溶液使組織變得透明。變得透明之后，將其置于甘油溶液中，觀察染色。結(jié)果，在純合小鼠中未發(fā)現(xiàn)軟骨組織(染成藍(lán)色)或骨(鈣化)組織(染成紅色)形成(圖30)。
從上述結(jié)果看，滑膜蛋白基因敲除小鼠表現(xiàn)出胎兒期肢芽發(fā)育異常。另外，未發(fā)現(xiàn)軟骨和骨的形成，在肢芽、軟骨和骨的發(fā)育位置發(fā)現(xiàn)了滑膜蛋白表達(dá)。因此，完全可以相信滑膜蛋白分子能對(duì)骨骼形成起作用。
給滑膜蛋白基因敲除小鼠施用混合物以治療關(guān)節(jié)炎用膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎(CIA)被廣泛用作人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎模型。給實(shí)施例17中制備的滑膜蛋白基因敲除小鼠(雜合型)和野生型小鼠施用抗-膠原抗體混合物，觀察所引發(fā)的關(guān)節(jié)炎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在滑膜蛋白雜合敲除小鼠中對(duì)關(guān)節(jié)炎的引發(fā)要弱于野生型小鼠(圖31)。這些結(jié)果也支持以下事實(shí)滑膜蛋白有助于誘導(dǎo)RA中的關(guān)節(jié)炎。
分析滑膜蛋白基因敲除小鼠的胎肢芽細(xì)胞的原代培養(yǎng)物在(通過(guò)外植塊法)得自敲除(KO)小鼠的細(xì)胞中，僅在被認(rèn)為是軟骨、骨和四肢原基的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了LacZ染色，即滑膜蛋白表達(dá)。另外，在胎肢芽細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中，LacZ陽(yáng)性集落(即表達(dá)滑膜蛋白的細(xì)胞)與愛(ài)茜藍(lán)染色-陽(yáng)性集落一致，另外，還在典型的雙核軟骨細(xì)胞中觀察到LacZ(作為β-半乳糖苷酶活性)染色(滑膜蛋白表達(dá))。這一結(jié)果支持滑膜蛋白參與骨和軟骨分化的事實(shí)。另外，通過(guò)堿性磷酸酶染色、Kossa染色等方法，可以進(jìn)一步證實(shí)在得自純合敲除小鼠的細(xì)胞中，形成骨和軟骨的能力被延遲(圖32-38)。
在Kossa染色中，洗滌細(xì)胞之后，溶液用硝酸銀溶液(5％w/v)替代。用蒸餾水輕洗細(xì)胞之后，用硫代硫酸鈉溶液(5％w/v)進(jìn)行還原和固定。洗滌之后，用Kernechtrot溶液(0.1％w/v Kernechtrot(Nuclear Fast Red)，5％w/v硫酸鋁)進(jìn)行復(fù)染(Masaji Seki，Soshiki Kensa Ho-Soshiki Kozo to KyokushoKagaku-[Tissue Test MethodsTissue Structure and Local Chemistry]，257-258，Kyorin-Shoin，1961；L.Lison，Tadashi Imaizumi，trans.，Histochimie etCytochimie AnimalesPrincipes et Methodes[Animal Histochemistry andCytochemistryPrinciples and Methods]，625-636，Hakusuisha Publishing Co.Ltd.，1962；Yutaka Sano，Soshikikagaku Kenkyu Ho-Riron toJutsushiki[Histochemistry Research MethodsTheory and Practice]，616-621，Nanzando Co.，Ltd.，1965)。用堿性磷酸酶組織染色試劑盒(Sigma，DiagnosticKits and Reagents，堿性磷酸酶(AP)，白細(xì)胞，目錄號(hào)為86-R)進(jìn)行堿性磷酸酶活性的檢測(cè)。
使用得自滑膜蛋白基因敲除小鼠的細(xì)胞進(jìn)行受試化合物試驗(yàn)使用滑膜蛋白基因雜合敲除小鼠(嵌入了lacZ基因)的原代培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)β-gal試驗(yàn)評(píng)價(jià)受試樣品對(duì)滑膜蛋白基因表達(dá)的作用。以0,1×103、3×103、1×104、3×104和1×105個(gè)細(xì)胞/孔的量，將傳代3次之后的滑膜蛋白基因雜合敲除小鼠的原代培養(yǎng)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在含有10％胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)過(guò)夜。首先，在沒(méi)有刺激時(shí)，以足以完全覆蓋細(xì)胞層的量(100μl/孔)在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入細(xì)胞裂解溶液(Promega)。然后，將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至振蕩的機(jī)器上，室溫下緩慢振蕩15分鐘，使細(xì)胞層總浸泡在裂解溶液中。
按照下述方法測(cè)定細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性。在20μl所得細(xì)胞提取物溶液中加入1μl Mg溶液(0.1M MgCl2，4.5M β-巰基乙醇)、22μl ONPG溶液(鄰硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷)(溶于0.1M磷酸緩沖液(pH7.5)，濃度為4mg/ml)，和57μl 0.1M磷酸緩沖液(pH7.5)，使總體積為100μl。37℃保溫6小時(shí)，同時(shí)注意不要使其變干。通過(guò)加入150μl 1M碳酸鈉溶液(通過(guò)將21.2g碳酸鈉溶解于水，調(diào)整至200ml并用0.45μm的濾器過(guò)濾而制備)以終止反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定420nm的光吸收值來(lái)定量β-半乳糖苷酶活性。平行進(jìn)行3份實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，在lacZ基因嵌入小鼠的細(xì)胞中檢測(cè)到取決于細(xì)胞數(shù)目的β-半乳糖苷酶活性(圖39)。本發(fā)明人證實(shí)使用β-半乳糖苷酶活性作為指標(biāo)可以評(píng)價(jià)啟動(dòng)子活性(β-gal試驗(yàn))。
接著，按照相同的方法，通過(guò)在原代培養(yǎng)細(xì)胞中加入多種藥物來(lái)進(jìn)行β-gal試驗(yàn)，然后，評(píng)價(jià)多種藥物對(duì)滑膜蛋白啟動(dòng)子活性的作用。僅加入培養(yǎng)基進(jìn)行相同的測(cè)定以用作陰性對(duì)照。所用試驗(yàn)藥物是強(qiáng)的松龍(0.01-1μM)和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA；0.001-0.1μM)。強(qiáng)的松龍是類固醇抗-炎癥藥物，TPA是蛋白質(zhì)激酶C激活劑。
在每孔中接種5×104個(gè)原代培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜之后，以上述濃度加入多種藥物。加入藥物之后，培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)，測(cè)定每孔的β-半乳糖苷酶活性以評(píng)價(jià)啟動(dòng)子活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些藥物以濃度依賴性方式影響滑膜蛋白啟動(dòng)子活性(圖40)。即，這證實(shí)了用基于本發(fā)明的試驗(yàn)系統(tǒng)可以評(píng)價(jià)藥物對(duì)滑膜蛋白啟動(dòng)子的活性。從上述結(jié)果看，可以使用這種試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)多種藥物對(duì)滑膜蛋白啟動(dòng)子活性的作用，因此，可以篩選出能促進(jìn)或抑制滑膜蛋白啟動(dòng)子活性的化合物。
制備抗-滑膜蛋白單克隆抗體按下述方法制備抗滑膜蛋白的單克隆抗體。合成下列三種含有人滑膜蛋白的部分氨基酸序列的肽作為免疫用的肽。這些氨基酸序列選自據(jù)推測(cè)具有抗原性的結(jié)構(gòu)域。
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC/SEQ ID NO3)，Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS/SEQ ID NO4)，和Syno-P1(GAATTTAAGTSATAC/SEQ ID NO5)。
經(jīng)由氨基酸序列內(nèi)的Cys使匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)與每一種合成肽綴合。將50μg每種與KLH綴合的合成肽溶解于0.1ml生理鹽水溶液中，加入0.1ml弗氏完全佐劑(FCA)以制備免疫原。將每種免疫原(0.2ml)皮下注射至8只小鼠(BALB/c雌性小鼠，5周齡)的后背，從而對(duì)其進(jìn)行免疫。每?jī)芍苓M(jìn)行一次免疫，總共進(jìn)行4次，1周后再進(jìn)行一次免疫。最后一次免疫后8天，從心臟取血以獲得200μl或更多的血清。從經(jīng)ELISA證實(shí)抗體滴度有所增加的個(gè)體中取脾細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞融合。
圖41-43顯示了通過(guò)ELISA測(cè)定三個(gè)個(gè)體的小鼠血清中與每種免疫原有關(guān)的抗體滴度的結(jié)果。對(duì)每種血清樣品平行進(jìn)行三份試驗(yàn)，圖中顯示的是平均值。當(dāng)使用任一種免疫原時(shí)，都證實(shí)了抗體滴度有所增加的個(gè)體。因此，進(jìn)一步證實(shí)了這些免疫原中的每一種都可以用作滑膜蛋白的免疫原。
以1∶10的比率混合骨髓瘤細(xì)胞系(P3U1)細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞，在50％PEG(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的PEG1540)的存在下進(jìn)行細(xì)胞融合。融合之后，接種96孔培養(yǎng)板，以使脾細(xì)胞計(jì)數(shù)為5×105/ml。將細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-14天之后，證實(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)并檢測(cè)培養(yǎng)上清。使用固定有多種合成肽的ELISA板檢測(cè)培養(yǎng)上清。檢測(cè)方法如下。將培養(yǎng)上清與ELISA板反應(yīng)之后，使用抗-小鼠IgG山羊-痘來(lái)選擇陽(yáng)性孔。選擇用于克隆的孔，凍干和儲(chǔ)存其它陽(yáng)性孔的細(xì)胞。
幾天后，以100個(gè)細(xì)胞/板的量將每個(gè)細(xì)胞株(20個(gè)細(xì)胞/ml)接種于一個(gè)96孔板中，培養(yǎng)10-14天。測(cè)定集落，對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)將50μl上清液上樣于上述固定有抗原的篩選用ELISA板，對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。將抗-小鼠IgG山羊-痘用作第二抗體。培養(yǎng)之后，重新克隆選定的集落，培養(yǎng)10-14天。然后，按照與上述相同的方法進(jìn)行集落測(cè)定和培養(yǎng)上清的檢測(cè)。根據(jù)親代細(xì)胞株選擇孔，在24孔板中培養(yǎng)選定的克隆?；厥丈锨逡海瑱z查克隆。然后，檢測(cè)抗體亞類和抗體的產(chǎn)生?？寺〉慕Y(jié)果，使用Syno-P2(SEQ ID NO4)作為免疫原，將兩個(gè)克隆10Db和7Bc選擇為能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，所述抗體對(duì)滑膜蛋白具有高親和性。
使用抗-滑膜蛋白單克隆抗體檢測(cè)患者樣品中的滑膜蛋白<1>用抗-滑膜蛋白單克隆抗體對(duì)得自患者的滑膜細(xì)胞進(jìn)行Western印跡使用兩種能識(shí)別實(shí)施例23中獲得的Syno-P2的抗-滑膜蛋白單克隆抗體(10Db和7Bc)，通過(guò)SDS-PAGE分離得自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的滑膜細(xì)胞的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行Western印跡。Western印跡的方法如實(shí)施例8所述，不同的是將實(shí)施例23中的單克隆抗體10Db和7Bc用作抗體，將抗-小鼠IgG綿羊-HRP用作標(biāo)記抗體。同時(shí)分析得自變形性關(guān)節(jié)病(OA)患者的滑膜細(xì)胞以用作對(duì)照。結(jié)果，檢測(cè)到特異于得自RA患者的滑膜細(xì)胞的信號(hào)(圖44A)。證實(shí)實(shí)施例23中獲得的單克隆抗體能特異性地識(shí)別RA患者的滑膜細(xì)胞。這些單克隆抗體可用于檢測(cè)RA。
<2>用抗-滑膜蛋白單克隆抗體對(duì)得自RA患者的滑膜細(xì)胞進(jìn)行熒光免疫染色使用單克隆抗體10Db對(duì)得自RA患者的滑膜細(xì)胞進(jìn)行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)分析。免疫染色的方法如實(shí)施例9中所述，不同的是將實(shí)施例23中的單克隆抗體10Db用作抗體，將抗-小鼠IgG綿羊-FITC用作標(biāo)記抗體。在得自RA患者的滑膜細(xì)胞中檢測(cè)到強(qiáng)烈的滑膜蛋白蛋白信號(hào)，但在僅與第二抗體反應(yīng)的對(duì)照中未檢測(cè)到信號(hào)(圖44B)。
<3>用抗-滑膜蛋白單克隆抗體對(duì)得自RA患者的滑膜組織進(jìn)行免疫染色使用單克隆抗體10Db和7Bc對(duì)取自RA患者的滑膜組織切片進(jìn)行免疫染色。免疫染色的方法如實(shí)施例9中所述，不同的是將實(shí)施例23中的單克隆抗體10Db和7Bc用作抗體，將抗-小鼠IgG綿羊-HRP用作標(biāo)記抗體。在得自RA患者的滑膜組織中檢測(cè)到強(qiáng)烈的滑膜蛋白蛋白信號(hào)(圖45)。通過(guò)同時(shí)進(jìn)行的HE染色觀察到滑膜細(xì)胞的增殖層，經(jīng)證實(shí)該部分被單克隆抗體染色。根據(jù)這些結(jié)果，可以證實(shí)本發(fā)明的單克隆抗體特異性地識(shí)別RA患者的滑膜組織。如上所述，通過(guò)使用滑膜蛋白抗體檢測(cè)患者樣品中的滑膜蛋白，即可進(jìn)行RA檢驗(yàn)和診斷。
檢測(cè)滑膜蛋白的遍在蛋白連接酶活性已知E3遍在蛋白-蛋白質(zhì)連接酶會(huì)遭受自身-遍在蛋白化(Hashizume R等，J.Biol.Chem.276，14537-14540，2001)。因此，本發(fā)明人研究了滑膜蛋白是否具有自身-遍在蛋白化活性。將FLAG-滑膜蛋白基因插入pCAGGS載體，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，36小時(shí)之后回收細(xì)胞。用緩沖液A[15mM Tris-HCl pH7.5，0.5M NaCl，0.35％NP-40，1mM PMSF，2μg/ml抑蛋白酶肽，2μg/ml亮抑蛋白酶肽]獲得細(xì)胞提取物。用高速離心機(jī)離心細(xì)胞提取物。在0.6ml上清液中加入3μg抗-FLAG抗體和7.5μl A蛋白珠，進(jìn)行免疫沉淀過(guò)夜。用緩沖液A或加入了0.1％SDS的緩沖液A將珠洗滌3次，然后用緩沖液B[25mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl，0.01％Nonidet P-40，10％甘油，1mM EDTA]洗滌2次。然后，加入30μl遍在蛋白連接酶反應(yīng)溶液[50mM Tris-HCl pH7.4，5mM MgCl2，2mM NaF，10nM岡田酸，2mM ATP，0.6mM DTT，1.5μg GST-HA-遍在蛋白，40ng得自酵母的E1，0.3μgUbcH5c(E2)]37℃反應(yīng)30分鐘。加入30μl含有0.1M DTT的2×Laemmli SDS-上樣緩沖液并煮沸。然后，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分級(jí)分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將抗-FLAG抗體(SIGMA)和抗-HA抗體(Roche Diagnostics)用作第一抗體。按照與實(shí)施例7相同的方法進(jìn)行HRP活性檢測(cè)。作為對(duì)照，使用了僅被FLAG-滑膜蛋白基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物(在免疫沉淀之前)，以及通過(guò)對(duì)細(xì)胞提取物(即僅為FLAG-滑膜蛋白蛋白及其免疫復(fù)合物)進(jìn)行免疫沉淀而獲得的溶液。另外，不加GST-HA-遍在蛋白、ATP、E1和E2中的任何一種以進(jìn)行反應(yīng)(當(dāng)不加GST-HA-遍在蛋白時(shí)，使用GST進(jìn)行反應(yīng))。圖46顯示了使用滑膜蛋白的結(jié)果，所述滑膜蛋白通過(guò)用含有0.1％SDS的緩沖液A洗滌而被免疫純化。在用抗-HA抗體進(jìn)行印跡時(shí)，檢測(cè)到大于滑膜蛋白分子量(圖46中的*)的大小約為35kDa的帶(圖46中的箭頭)。在用抗-FLAG抗體進(jìn)行印跡時(shí)，也觀察到該帶，可以認(rèn)為該蛋白質(zhì)帶是與滑膜蛋白融合的GST-HA-遍在蛋白。另外，缺失ATP、E1和E2中的任一種的反應(yīng)系統(tǒng)表明未發(fā)生滑膜蛋白的自身-遍在蛋白化。當(dāng)僅用緩沖液A洗滌珠時(shí)獲得了相同的結(jié)果。從這些結(jié)果可以明顯地看出1)E1-和E2-依賴型遍在蛋白連接酶活性存在于含有滑膜蛋白的免疫復(fù)合物中，并且，從免疫純化的結(jié)果看，2)滑膜蛋白具有E3遍在蛋白-蛋白質(zhì)連接酶活性。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了編碼新蛋白質(zhì)的基因“滑膜蛋白”，所述蛋白質(zhì)對(duì)滑膜的發(fā)育和骨、軟骨和四肢的發(fā)育起作用。本發(fā)明的基因與RA有關(guān)，RA患者體內(nèi)產(chǎn)生了抗該基因產(chǎn)物的抗體。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)成為可用于診斷RA的新標(biāo)記。RA患者的關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)本發(fā)明的“滑膜蛋白”，所述滑膜蛋白可用于通過(guò)原位雜交和原位PCR診斷RA和判斷療效。另外，在RA患者的血液中可以高頻率地檢測(cè)到抗滑膜蛋白抗體。使用該抗體作為標(biāo)記可以特異性診斷RA。本發(fā)明提供的滑膜蛋白蛋白質(zhì)或其部分肽可用于檢測(cè)患者血清中的抗滑膜蛋白抗體。
另外，未分化的間充質(zhì)細(xì)胞中也表達(dá)滑膜蛋白。如果將滑膜蛋白用作細(xì)胞標(biāo)記，則可以從胎細(xì)胞等中回收未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。未分化的間充質(zhì)細(xì)胞是分化成骨和軟骨的細(xì)胞，它有望用于再生醫(yī)學(xué)。即，如果使用滑膜蛋白作為細(xì)胞標(biāo)記而回收的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞是在體外或體內(nèi)分化的，即可進(jìn)行骨或軟骨的形成或關(guān)節(jié)的重構(gòu)，這樣就可以使受損的骨、軟骨組織或關(guān)節(jié)重新再生。
已證實(shí)本發(fā)明的滑膜蛋白及其配體與RA的主要病理學(xué)，即關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖有密切的關(guān)系。因此，本發(fā)明提供的滑膜蛋白或其配體為開(kāi)發(fā)RA治療方法提供了重要的信息。更具體地，通過(guò)篩選參與滑膜蛋白與其配體之間的結(jié)合的化合物，可以采取與以前完全不同的方法來(lái)進(jìn)行RA治療技術(shù)的開(kāi)發(fā)。另外，在滑膜蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中，高頻率出現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜增生和伴隨有關(guān)節(jié)炎的腳趾關(guān)節(jié)腫脹。本發(fā)明提供的滑膜蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為開(kāi)發(fā)治療技術(shù)和藥物的RA模型十分有用。
序列表序列表<110>羅克莫基因株式會(huì)社(Locomogene，Inc.)<120>滑膜細(xì)胞蛋白<130>BHP-A0001Y1P<140><141><150>JP 2000-405082<151>2000-12-22<150>JP 2001-266492<151>2001-06-27<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3374<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(403)..(2256)<400>1gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg 60ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa 120gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat 180tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca 240ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag 300tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga 360gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc acg414
Met Phe Arg Thr1gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg gct462Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala5 10 15 20cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac ctg510His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr Leu25 30 35acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt gtc558Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe Val40 45 50ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg caa606Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly Gln55 60 65ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt tcc tgg tac gcc654Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr Ala70 75 80gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg gat gac ttc agc702Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg Asp Asp Phe Ser85 90 95 100ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt ttc750Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe105 110 115cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc aac798His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro Asn120 125 130atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt atg ttc ctc ctg846Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu Met Phe Leu Leu135 140 145ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat cac agc atc ctg894Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr His Ser Ile Leu150 155 160acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt gag tat gcc atc942Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe Glu Tyr Ala Ile165 170 175 180ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat gtg ctg cac tcc990Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr Val Leu His Ser185 190 195gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag gct gtg tac atg1038Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr Met200 205 210ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt ctg ctg tac atg1086Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr Met215 220 225gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc cca ctc ttt gcc1134Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe Pro Leu Phe Ala230 235 240atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag aaa gct gtg aca1182Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys Lys Ala Val Thr245 250 255 260gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg aac acc ctg tat1230Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met Asn Thr Leu Tyr265 270 275cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac aat gtc tgc atc1278Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp Asn Val Cys Ile280 285 290atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga ctg ccc tgc aac1326Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg Leu Pro Cys Asn295 300 305cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc cag cgg cag cag1374His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe Gln Arg Gln Gln310 315 320acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca tcg ctg cca gcg1422Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala325 330 335 340cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg cca ccc cct gcc1470Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly Pro Pro Pro Ala345 350 355ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac ttc ccc cag ggc1518Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn Phe Pro Gln Gly360 365 370ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg tgg ccc ccc atg1566Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu Trp Pro Pro Met375 380 385ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca gga gag gct gtg1614Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu Ala Val390 395 400gct cct cca tcc acc agt gca gca gcc ctt tct cgg ccc agt gga gca1662Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly Ala405 410 415 420gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct tct gcc aca1710Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala Thr425 430 435gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc cct gcc cct1758Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly Pro Ala Pro440 445 450ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg cct cca ccc1806Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu Pro Pro Pro455 460 465ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt gct ggg ctg1854Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe Ala Gly Leu470 475 480acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg cag cac ctg1902Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg Gln His Leu485 490 495 500gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg ctg gac gcc1950Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Asp Ala505 510 515gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc tcc ttg ggg1998Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ser Leu Gly520 525 530ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg act gcc act2046Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly Thr Ala Thr535 540 545aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc tca gag gcc2094Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser Ser Glu Ala550 555 560acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct 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45Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val50 55 60Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg65 70 75 80Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg85 90 95Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe100 105 110Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu115 120 125Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu130 135 140Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr145 150 155 160His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe165 170 175Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr180 185 190Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys195 200 205Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val210 215 220Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe225 230 235 240Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys245 250 255Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met260 265 270Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp275 280 285Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg290 295 300Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe305 310 315 320Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala325 330 335Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly340 345 350Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn355 360 365Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu370 375 380Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser385 390 395 400Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg405 410 415Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala420 425 430Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala435 440 445Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro450 455 460Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly465 470 475 480Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu485 490 495Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr500 505 510Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu515 520 525Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu530 535 540Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro545 550 555 560Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro565 570 575Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met580 585 590Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu595 600 605Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His610 615<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的說(shuō)明人工合成的序列<400>3Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Cys1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的說(shuō)明人工合成的序列<400>4Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala Gln Ser1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的說(shuō)明人工合成的序列<400>5Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Cys1 5 10 15<210>6<211>3028<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(60)..(1910)<400>6gcagtcgcgc ggattgagcg ggctcgcggc gctgggttcc tggtctccgg gccagggca 59atg ttc cgc acg gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg 107Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly1 5 10 15gct gtg gtg gct cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act 155Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr20 25 30gtg gtg tac ctg acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc 203Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile35 40 45cag gcc ttt gtc ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg 251Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val50 55 60ttc ttt ggg caa ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt 299Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg65 70 75 80tcc tgg tac gcc gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg347Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg85 90 95gat gac ttc agc ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc395Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe100 105 110ctc aaa tgt ttc cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa443Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu115 120 125cgc agc ccc aac atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt491Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu130 135 140atg ttc ctc ctg ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat539Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr145 150 155 160cac agc atc ctg acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt587His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe165 170 175gag tat gcc atc ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat635Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr180 185 190gtg ctg cac tcc gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag683Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys195 200 205gct gtg tac atg ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt731Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val210 215 220ctg ctg tac atg gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc779Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe225 230 235 240cca ctc ttt gcc atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag827Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys245 250 255aaa gct gtg aca gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg875Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met260 265 270aac acc ctg tat cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac923Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp275 280 285aat gtc tgc atc atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga971Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg290 295 300ctg ccc tgc aac cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc1019Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe305 310 315 320cag cgg cag cag acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca1067Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala325 330 335tcg ctg cca gcg cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg1115Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly340 345 350cca ccc cct gcc ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac1163Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn355 360 365ttc ccc cag ggc ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg1211Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu370 375 380tgg ccc ccc atg ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca1259Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser385 390 395 400gga gag gct gtg gct cct cca tcc acc agt gca gcc ctt tct cgg ccc1307Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Leu Ser Arg Pro405 410 415agt gga gca gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct1355Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala420 425 430tct gcc aca gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc1403Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly435 440 445cct gcc cct ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg1451Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu450 455 460cct cca ccc ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt1499Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe465 470 475 480gct ggg ctg acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg1547Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg485 490 495cag cac ctg gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg1595Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu500 505 510ctg gac gcc gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc1643Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala515 520 525tcc ttg ggg ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg1691Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly530 535 540act gcc act aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc1739Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser545 550 555 560tca gag gcc acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa1787Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu565 570 575atg gaa agg cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct1835Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro580 585 590gag gat gga gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag1883Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln595 600 605aag ctg gag tct cct gtt gcc cac tga cactgcccca gcccagcccc 1930Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His610 615agcctctgct cttttgagca gccctcgctg gaacatgtcc tgccaccaag tgccagctcc 1990ctctctgtct gcaccaggga gtagtacccc cagctctgag aaagaggcgg catcccctag 2050gccaagtgga aagaggctgg ggttcccatt tgactccagt cccaggcagc catggggatc 2110tcgggtcagt tccagccttc ctctccaact cttcagccct gtgttctgct ggggccatga 2170aggcagaagg tttagcctct gagaagccct cttcttcccc cacccctttc caggagaagg 2230ggctgcccct ccaagcccta cttgtatgtg cggagtcaca ctgcagtgcc gaacagtatt 2290agctcccgtt cccaagtgtg gactccagag gggctggagg caagctatga acttgctcgc 2350tggcccaccc ctaagactgg tacccatttc cttttcttac cctgatctcc ccagaagcct 2410cttgtggtgg tggctgtgcc ccctatgccc tgtggcattt ctgcgtctta ctggcaacca 2470cacaactcag ggaaaggaat gcctgggagt gggggtgcag gcgggcagca ctgagggacc 2530ctgccccgcc cctcccccca ggcccctttc ccctgcagct tctcaagtga gactgacctg 2590tctcacccag cagccactgc ccagccgcac tccaggcaag ggccagtgcg cctgctcctg 2650accactgcaa tcccagcgcc caaggaaggc cacttctcaa ctggcagaac ttctgaagtt 2710tagaattgga attacttcct tactagtgtc ttttggctta aattttgtct tttgaagttg 2770aatgcttaat cccgggaaag aggaacagga gtgccagact cctggtcttt ccagtttaga 2830aaaggctctg tgccaaggag ggaccacagg agctgggacc tgcctgcccc tgtcctttcc 2890ccttggtttt gtgttacaag agttgttgga gacagtttca gatgattatt taatttgtaa 2950atattgtaca aattttaata gcttaaattg tatatacagc caaataaaaa cttgcattaa 3010caaaaaaaaa aaaaaaaa 3028<210>7<2ll>616<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly1 5 10 15Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr20 25 30Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile35 40 45Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val50 55 60Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg65 70 75 80Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg85 90 95Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe100 105 110Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu115 120 125Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu130 135 140Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr145 150 155 160His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe165 170 175Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr180 185 190Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys195 200 205Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val210 215 220Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe225 230 235 240Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys245 250 255Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met260 265 270Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp275 280 285Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg290 295 300Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe305 310 315 320Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala325 330 335Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly340 345 350Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn355 360 365Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu370 375 380Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser385 390 395 400Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Leu Ser Arg Pro405 410 415Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala420 425 430Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly435 440 445Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu450 455 460Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe465 470 475 480Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg485 490 495Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu500 505 510Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala515 520 525Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly530 535 540Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser545 550 555 560Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu565 570 575Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro580 585 590Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln595 600 605Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His610 61權(quán)利要求
1.下述(a)至(e)任意一項(xiàng)記載的多核苷酸(a)編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，(c)編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列，但其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加的蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)的功能等同于由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(d)在嚴(yán)緊條件下能與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸，所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)功能等同于由SEQ IDNO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，和(e)含有與SEQ ID NO1所示核苷酸序列具有至少70％或更高同一性的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)功能等同于由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.編碼由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的部分肽的多核苷酸。
3.由根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)或肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽，它具有至少一個(gè)選自下述(1)至(3)的活性(1)與在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血液中發(fā)現(xiàn)的抗體結(jié)合，(2)與滑膜蛋白配體S1-5結(jié)合，和(3)促使滑膜增生。
5.插入根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的載體。
6.攜有根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求5的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
7.制備根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括下述步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞或培養(yǎng)上清中回收表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽。
8.與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的抗體。
9.用于分析能識(shí)別根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽的抗體的免疫分析試劑，所述試劑含有根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的免疫分析試劑，其中該試劑被用于診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或判斷治療效果。
11.用于分析根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的免疫分析試劑，所述試劑含有能與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)的抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的免疫分析試劑，其中該試劑被用于診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或判斷治療效果。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的免疫分析試劑，其中待分析的根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)存在于滑膜細(xì)胞中。
14.測(cè)定生物樣品中的抗體的方法，其中所述抗體與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)和/或其部分肽結(jié)合，所述方法包括下述步驟(1)使生物樣品與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)和/或其部分肽接觸，和(2)檢測(cè)與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)和/或其部分肽結(jié)合的抗體。
15.測(cè)定生物樣品中的根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)和/或其部分肽的方法，所述方法包括下述步驟(1)使生物樣品與根據(jù)權(quán)利要求8的抗體接觸，和(2)檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)和/或其部分肽結(jié)合。
16.含有至少15個(gè)核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。
17.測(cè)定生物樣品中的根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟(1)使生物樣品與根據(jù)權(quán)利要求16的多核苷酸接觸，和(2)檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求16的多核苷酸，其中所述多核苷酸與根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸雜交。
18.測(cè)定根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的試劑盒，所述試劑盒含有根據(jù)權(quán)利要求16的多核苷酸。
19.檢測(cè)或分離表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的細(xì)胞的方法，所述方法以所述蛋白質(zhì)或編碼所述蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)為指標(biāo)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述細(xì)胞是類風(fēng)濕的滑膜細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述細(xì)胞是未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。
22.檢測(cè)或分離表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的細(xì)胞的試劑，所述試劑含有根據(jù)權(quán)利要求8的抗體。
23.檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記是選自根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)、根據(jù)權(quán)利要求3的肽、與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體和與根據(jù)權(quán)利要求3的肽結(jié)合的抗體中的至少一種，所述方法包括下述步驟i)檢測(cè)受試者生物樣品中存在的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎標(biāo)記，和ii)將步驟i)的檢測(cè)結(jié)果與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相聯(lián)系。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中生物樣品是受試者的血液，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記是與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體和/或與根據(jù)權(quán)利要求3的肽結(jié)合的抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中生物樣品是受試者的滑膜組織或滑膜細(xì)胞，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記是根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸和/或根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)。
26.檢測(cè)受試化合物與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合活性的方法，所述方法包括下述步驟a)使受試化合物與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽接觸，和b)觀察受試化合物與所述蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合。
27.篩選對(duì)根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽具有結(jié)合活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求26的方法檢測(cè)受試化合物與根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合活性，和b)選擇所述結(jié)合活性高于對(duì)照的受試化合物。
28.檢測(cè)阻斷根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)與其配體結(jié)合的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在受試化合物的存在下使根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽與其配體接觸，和b)檢測(cè)與所述蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的配體和/或受試化合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中配體是滑膜蛋白配體S1-5。
30.篩選對(duì)根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合具有阻斷活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求28的方法檢測(cè)受試化合物阻斷根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合的活性，和b)選擇所述阻斷活性高于對(duì)照的受試化合物。
31.檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)經(jīng)由根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在存在或不存在所述蛋白質(zhì)的配體時(shí)，使受試化合物與所述蛋白質(zhì)接觸，和b)檢測(cè)經(jīng)由所述蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
32.篩選具有調(diào)節(jié)經(jīng)由根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求31的方法檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)經(jīng)由所述蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性，和b)選擇所述調(diào)節(jié)活性高于對(duì)照的受試化合物。
33.檢測(cè)調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸表達(dá)的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)在受試化合物的存在下培養(yǎng)表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸的細(xì)胞，和b)測(cè)定所述多核苷酸的表達(dá)水平。
34.篩選能調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸表達(dá)的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求33的方法檢測(cè)受試化合物調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸表達(dá)的活性，和b)選擇所述活性與對(duì)照相比有所不同的受試化合物。
35.滑膜蛋白刺激劑，其含有通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求27的篩選方法獲得的化合物作為活性成分。
36.阻斷滑膜蛋白和滑膜蛋白配體之間的結(jié)合的阻斷劑，其含有通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求30的篩選方法獲得的化合物作為活性成分。
37.滑膜增生阻斷劑，其含有通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求30或32的篩選方法獲得的化合物作為活性成分。
38.藥物組合物，其含有選自根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)或肽，或根據(jù)權(quán)利要求5的載體的組分作為活性成分。
39.轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的表達(dá)被修飾，或所述修飾是可誘導(dǎo)的。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸是經(jīng)外源導(dǎo)入的。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中所述脊椎動(dòng)物是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物。
42.轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中根據(jù)權(quán)利要求1或2的內(nèi)源性多核苷酸的表達(dá)被抑制。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物，其中嵌入了其它基因。
44.得自根據(jù)權(quán)利要求40或42的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物的細(xì)胞。
45.檢測(cè)調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性的活性的方法，所述方法包括下述步驟a)使受試化合物與表達(dá)系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)在根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子的控制之下表達(dá)報(bào)道基因，和b)測(cè)定報(bào)道基因的表達(dá)水平。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述表達(dá)系統(tǒng)是根據(jù)權(quán)利要求43的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動(dòng)物或得自所述脊椎動(dòng)物的細(xì)胞。
47.篩選能調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求45的方法測(cè)定受試化合物調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸的內(nèi)源性啟動(dòng)子活性的活性，和b)選擇所述活性與對(duì)照相比有所不同的受試化合物。
48.用于調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸表達(dá)的藥物組合物，所述藥物組合物含有通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求34或47的篩選方法得到的化合物作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種被稱為滑膜蛋白的新蛋白質(zhì)和編碼該蛋白質(zhì)的基因。該蛋白質(zhì)由滑膜組織特異性表達(dá)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中還伴隨有能識(shí)別該蛋白質(zhì)的自身抗體的存在。本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其抗體有望用作RA的特異性診斷標(biāo)記。另外，本發(fā)明的基因或蛋白質(zhì)可用于篩選治療RA的藥物。另外，本發(fā)明提供了滑膜蛋白基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可在開(kāi)發(fā)治療RA的藥物時(shí)用作RA模型動(dòng)物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1491280SQ01822761
公開(kāi)日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月22日
發(fā)明者中島利博, 天野徹也, 也 申請(qǐng)人:羅克莫基因株式會(huì)社