專(zhuān)利名稱(chēng)：穩(wěn)定的含有類(lèi)維生素a和類(lèi)維生素a增強(qiáng)劑系統(tǒng)的護(hù)膚組合物的制作方法
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本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的護(hù)膚組合物，它含有類(lèi)維生素A和類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑系統(tǒng)(booster system)，被裝在包裝中，以便使得所述組合物不與氧接觸。
類(lèi)維生素A(例如視黃醇和視黃醇酯)是化妝品中常用的組分。視黃醇(維生素A)是內(nèi)源性化合物，它天然地存在于人體中并且是正常上皮細(xì)胞分化必需的。天然的和合成的維生素A衍生物已廣泛地用于治療各種皮膚病并且已用作皮膚修復(fù)劑和再生劑。視黃酸已用于治療各種皮膚病，例如痤瘡、皺紋、銀屑病、老年斑和脫色。例如參見(jiàn)Vahlquist，A.等人，J.Invest.Dermatol.，94卷，Holland D.B.和Cunliffe，W.J.(1990)，496-498頁(yè)；Ellis，C.N.等人，“Pharmacology of Retinols inSkin，”Basel，Karger，3卷，(1989)，249-252頁(yè)；和PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO93/19743。
然而，在化妝品制劑中，視黃醇特別不穩(wěn)定，因?yàn)橐朁S醇受多種因素的影響而發(fā)生化學(xué)降解，包括氧化、熱不穩(wěn)定性和UV誘導(dǎo)降解。視黃酯也具有這些不穩(wěn)定性，盡管其程度比視黃醇小。類(lèi)維生素A對(duì)皮膚的好處可通過(guò)合用類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑分子得以提高。然而，雖然不是全部，但很多類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑分子也增加視黃醇的不穩(wěn)定性。因此，與只含有視黃醇的制劑需求相比，更需要保護(hù)含有類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑的視黃醇制劑。
在某些參考文獻(xiàn)中試圖創(chuàng)造穩(wěn)定的含有視黃醇的組合物。例如，Johnson&Johnson受讓的美國(guó)專(zhuān)利5,976,555中公開(kāi)了護(hù)膚組合物，它們包括其中含有類(lèi)維生素A、乳化劑系統(tǒng)和助乳化劑的水包油乳劑。該專(zhuān)利描述了一種用于保存組合物的容器的使用以便組合物不與氧接觸。該容器被描述為用于只含有乳化劑系統(tǒng)和助乳化劑的類(lèi)維生素A組合物而不能防止由于與類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑接觸所引起的類(lèi)維生素A降解。
L’Oreal受讓的美國(guó)專(zhuān)利5,800,596中公開(kāi)了一種在分配裝置中含有視黃醇的油包水乳劑，所述分配裝置具有不透氧和UV光的壁和捕氧裝置。該專(zhuān)利中沒(méi)有教導(dǎo)和建議增強(qiáng)劑的使用和在增強(qiáng)劑存在下與類(lèi)維生素A穩(wěn)定性有關(guān)的問(wèn)題。
以上所引用的參考文獻(xiàn)中無(wú)一教導(dǎo)和建議在類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑存在下穩(wěn)定類(lèi)維生素A組合物的系統(tǒng)。因此，仍然需要這樣的穩(wěn)定的含有類(lèi)維生素A和類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑的化妝品組合物。
本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的護(hù)膚組合物，它含有大約0.0001％-大約50％的至少一種類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑；大約0.001％-大約10％的類(lèi)維生素A；和可化妝用載體，其中將穩(wěn)定的護(hù)膚組合物裝在一個(gè)包裝中以便使所述組合物不與氧接觸。
作為優(yōu)選的組分，本發(fā)明組合物包含類(lèi)維生素A，它選自視黃酯、視黃醇、視黃醛和視黃酸，優(yōu)選視黃醇和視黃酯。術(shù)語(yǔ)“視黃醇”包括下列的視黃醇異構(gòu)體全反式-視黃醇、13-順式-視黃醇、11-順式-視黃醇、9-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-視黃醇、3，4-二脫氫-13-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-11-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-9-順式-視黃醇。優(yōu)選的異構(gòu)體是全反式-視黃醇、13-順式-視黃醇、3，4-二脫氫-視黃醇、9-順式-視黃醇。由于具有廣泛的商業(yè)可獲得性，最優(yōu)選的是全反式-視黃醇。
視黃酯是視黃醇的酯。術(shù)語(yǔ)“視黃醇” 定義同上。適用于本發(fā)明的視黃酯是視黃醇的C1-C30酯，優(yōu)選C2-C20酯，并且最優(yōu)選C2、C3和C16酯，因?yàn)樗鼈兏菀淄ㄟ^(guò)商業(yè)渠道獲得。視黃酯的實(shí)例包括但不限制于棕櫚酸視黃酯、甲酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、丁酸視黃酯、戊酸視黃酯、異戊酸視黃酯、己酸視黃酯、庚酸視黃酯、辛酸視黃酯、壬酸視黃酯、癸酸視黃酯、十一烷酸視黃酯、月桂酸視黃酯、十三烷酸視黃酯、十四烷酸視黃酯、十五烷酸視黃酯、十七烷酸視黃酯、硬脂酸視黃酯、異硬脂酸視黃酯、十九烷酸視黃酯、花生四烯酸視黃酯、山萮酸視黃酯、亞油酸視黃酯、油酸視黃酯。
優(yōu)選的用于本發(fā)明的酯選自棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯和丙酸視黃酯，因?yàn)檫@些酯最容易通過(guò)商業(yè)渠道獲得并因此是最便宜的。亞油酸視黃酯和油酸視黃酯因其功效也是優(yōu)選的。
在本發(fā)明組合物中所使用的視黃醇和視黃酯的量大約為0.001％-大約10％，優(yōu)選的量大約為0.01％-大約1％，最優(yōu)選的量大約為0.01％-大約0.5％。
已確信，類(lèi)維生素A在皮膚中按照流程1的機(jī)理通過(guò)酶轉(zhuǎn)化為視黃酸。
視黃醇在表皮中的代謝酶的名稱(chēng) ARAT/LRAT＝乙酰輔酶A(CoA)視黃醇乙?；D(zhuǎn)移酶/卵磷脂視黃醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶CRABPII＝細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白II意外地發(fā)現(xiàn)，某些化合物抑制ARAT/LRAT、視黃醛還原酶、CRABPII和視黃酸氧化(后者通過(guò)細(xì)胞色素(cytochrome)P450系統(tǒng)催化)，而某些其他化合物增強(qiáng)視黃醇脫氫酶的作用。所述化合物在本文統(tǒng)稱(chēng)為“增強(qiáng)劑”并且編碼為B1-B5組，如上文流程1所示。增強(qiáng)劑單獨(dú)或彼此聯(lián)合應(yīng)用通過(guò)增加可轉(zhuǎn)化成視黃酸的視黃醇的量和抑制視黃酸的降解來(lái)增強(qiáng)類(lèi)維生素A的作用。增強(qiáng)劑與類(lèi)維生素A(例如視黃醇、視黃酯、視黃醛、視黃酸)聯(lián)合起作用，后者是皮膚中內(nèi)源性存在的。然而，為了達(dá)到最佳性能，優(yōu)選的組分包括在所述組合物中的類(lèi)維生素A和共同存在的增強(qiáng)劑。
本發(fā)明部分包括第二種組合物，它包含占所述組合物重量的大約0.0001％-大約50％，優(yōu)選大約0.001％-大約10％，最優(yōu)選大約0.001％-大約5％的至少一種增強(qiáng)劑化合物和可化妝用載體，其中所述化合物單獨(dú)或以10mM的組合濃度在體內(nèi)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶測(cè)定中抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶至50％以上。
本發(fā)明組合物中所包含的增強(qiáng)劑選自(a)、兩種增強(qiáng)劑，其中二者都選自由B2、B3和B4組成的相同組中；(b)、增強(qiáng)劑的二元組合，選自B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3；B2/B4；B2/B5；B3/B4；B3/B5；B4/B5(c)、增強(qiáng)劑的三元組合，選自B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5(d)、增強(qiáng)劑的四元組合，選自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和(e)、五組增強(qiáng)劑的組合B1/B2/B3/B4/B5。
優(yōu)選的組合物包括至少一種來(lái)自不同組(即上述(b)-(e)組)的增強(qiáng)劑。然而，在本發(fā)明組合物中，也可以使用選自不同組的增強(qiáng)劑的任何組合來(lái)提供所需要的激活作用。
如下2.1-2.7節(jié)所述，首先根據(jù)化合物以表A中所列出的某濃度通過(guò)特定酶體外微粒體測(cè)定的能力來(lái)選擇在本發(fā)明中用作增強(qiáng)劑的該化合物。然后，如下所述，將化合物(單獨(dú)或與另一增強(qiáng)劑一起)以10mM的單一或組合濃度進(jìn)行體外谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶測(cè)定。如果所述組合抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶至50％以上，那么它適用于本發(fā)明。如果對(duì)增強(qiáng)劑進(jìn)行單獨(dú)的測(cè)試并且該增強(qiáng)劑通過(guò)了谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶測(cè)定，那么它可以與另一通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶測(cè)定的增強(qiáng)劑或組合物聯(lián)合使用。
優(yōu)選的本發(fā)明組合物包括至少以10mM的各自濃度抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶至50％以上的增強(qiáng)劑的組合物。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)理”是指預(yù)防和治療干燥皮膚、痤瘡、光損傷性皮膚、皺紋、老年斑、皮膚老化，增加角質(zhì)層柔韌性、使皮膚的顏色變明亮、控制皮脂排泄和一般性地增加皮膚的質(zhì)量。該組合物可用于改善皮膚脫屑和表皮分化。
增強(qiáng)劑是通過(guò)下文2.1-2.7節(jié)所描述的體外微粒體測(cè)定的化合物。適用于本發(fā)明的化合物在表A所列出的濃度下將酶至少抑制或增加到表A所列出的寬范圍百分?jǐn)?shù)。
表A增強(qiáng)劑試驗(yàn)濃度和抑制/增加百分?jǐn)?shù)(％)ARAT/LRAT的測(cè)定 (用于識(shí)別B1增強(qiáng)劑)
視黃醇脫氫酶的測(cè)定 (用于識(shí)別B2增強(qiáng)劑)
視黃醛還原酶的測(cè)定 (用于識(shí)別B3增強(qiáng)劑)
CRABPII拮抗劑的測(cè)定 (用于識(shí)別B4增強(qiáng)劑)
視黃酸氧化的測(cè)定 (用于識(shí)別B5增強(qiáng)劑)
下面是用于確定本發(fā)明組合物中化合物包合(inclusion)的適應(yīng)性的體外微粒體測(cè)定法1、材料全反式-視黃醇、全反式-視黃酸、棕櫚?；?CoA、二月桂?；字Ｄ憠A、NAD和NADPH購(gòu)于Sigma化學(xué)公司。用HPLC級(jí)乙腈配制用于微粒體測(cè)定的類(lèi)維生素A貯備液。所有用于HPLC分析的類(lèi)維生素A的標(biāo)準(zhǔn)貯備液都用乙醇配制，在-70℃、N2環(huán)境下貯存并且當(dāng)離開(kāi)貯存條件時(shí)，在琥珀色光照下保存在冰上。其他化學(xué)品和抑制劑通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)于化妝材料供應(yīng)商或化學(xué)品公司如Aldrich或InternationalFlavors and Fragrances。
2、方法2.1、RPE微粒體的分離(改良的J.C.Saari & D.L.Bredberg，“CoAand Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal PigmentEpithelium”，J.Bill.Chem.263，8084-8090(1988))。
從W.L.Lawson Co.，Lincoln，NE，USA獲得50個(gè)除去視網(wǎng)膜和水狀液的冷凍對(duì)切牛眼杯。將眼解凍過(guò)夜并通過(guò)用鑷子剝皮除去有色的彩虹膜。各眼用2×0.5ml冷緩沖液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)洗滌并用藝術(shù)家的刷子或橡膠膜擦去黑色素沉著的細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮液加到彩虹膜中并將該懸浮液在燒杯中用聚四氟乙烯攪拌棒攪拌幾分鐘。懸浮液通過(guò)粗濾器(Spectra/Por 925μ孔徑聚乙烯篩)過(guò)濾以便除去大顆粒，所得到的深色懸浮液用Glas-Col和馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的聚四氟乙烯均化器攪拌均勻，將細(xì)胞均化物在20,000g下(Sorvaal RC-5B型離心機(jī)，具有SS34馬達(dá)，2.5×10cm離心管，14,000RPM轉(zhuǎn)速)離心30分鐘。所得到的上清液在150,000g下(Becman L80型超速離心機(jī)，具有SW50.1馬達(dá)，13×51mm離心管，40,000RPM轉(zhuǎn)速)進(jìn)一步離心60分鐘。將所得到的沉降物利用Heat Systems Ultrasonics，Inc.的W185D型Sonifier Cell Disruptor分散到～5ml 0.1M PO4/5mM DTT，pH7緩沖液中，并將所得到的微粒體分散液等分到小管子中并在-70℃下貯存。利用BioRad Dye結(jié)合測(cè)定法，用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定微粒體中蛋白質(zhì)的濃度。
2.2、鼠肝臟微粒體的分離(R.Martini & M.Murray，“Participation ofp450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-hydroxylation”，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993))。
將6g冷凍鼠肝臟(由Accurate Chemical and Scientific Corp.的Harlan Sprague Dawley鼠獲得)在3體積的0.1M tris/0.1M KCl/1mMEDTA/0.25M蔗糖，pH7.4緩沖液中用Brinkmann Polytron攪拌均勻。所得到的組織懸浮液進(jìn)一步在上述馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的聚四氟乙烯均化器中攪拌均勻。將所得到的均化物相繼在10,000g下離心30分鐘，在20,000g下離心30分鐘和在30,000g下離心15分鐘，所得到的上清液在105,000g下超速離心80分鐘。所得到的沉降物在上述～5ml 0.1M PO4/0.1mMEDTA/5mM MgCl2，pH7.4緩沖液中進(jìn)行聲處理并在-70℃下以等份試樣貯存。如上測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
2.3、測(cè)定ARAT和LRAT活性(用于識(shí)別B1)下列方法是改良的J.C.Saari & D.L.Bredberg，“ARAT&LRATActivities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes”，MethodsEnzymol.190，156-163(1990)方法。制備下列緩沖液并在4℃下貯存0.1M PO4/5mM二硫蘇糖醇，pH7.0(PO4/DTT)。在測(cè)定的當(dāng)天，每ml緩沖液加入2mg BSA得到PO4/DTT/BSA工作緩沖液。在乙腈中制備1mM視黃醇底物并在-20℃和氮?dú)庀沦A存在琥珀色瓶子中。制備4mM棕櫚?；?CoA在工作緩沖液中的溶液(以等份試樣貯存)和4mM二月桂?；字Ｄ憠A的乙醇溶液并在-20℃下貯存。制備10mM抑制劑的H2O、乙醇、乙腈或DMSO儲(chǔ)備液。利用含有50μg/ml丁化羥基甲苯(BHT)的純乙醇制備淬火溶液并利用含有50μg/ml BHT的己烷溶液來(lái)提取。
向2英錢(qián)玻璃小瓶中按順序加入下列組分500μl總體積的PO4/DTT/BSA緩沖液、5μl?；w(4mM棕櫚?；鵆oA和/或二月桂酰基磷脂酰膽堿)、5μl抑制劑或溶劑空白(10mM原料或其他稀釋劑)，然后加入大約15μg RPE微粒體蛋白質(zhì)(大約15μl、～1mg/ml的微粒體蛋白質(zhì)等份試樣)。在37℃下培養(yǎng)5分鐘至與反應(yīng)溫度平衡，然后加入5μl1mM視黃醇。給小瓶蓋上蓋子，渦流攪拌5秒鐘并在37℃下培養(yǎng)30-90分鐘。通過(guò)加入0.5ml乙醇/BHT淬滅反應(yīng)。通過(guò)加入3ml己烷/BHT提取類(lèi)維生素A，渦流攪拌提取管幾次，每次數(shù)秒鐘，并在低轉(zhuǎn)速下將提取管離心5分鐘至迅速分層。將上層的己烷層轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中，并如上所述用另外3ml己烷/BHT再提取水層。合并己烷層并通過(guò)在37℃和氮?dú)饬飨拢诩訜岬匿X塊上干燥蒸發(fā)己烷。干燥的殘?jiān)?20℃下貯存直至HPLC分析。通過(guò)如下所述對(duì)HPLC信號(hào)積分，分別就ARAT和LRAT活性對(duì)棕櫚酸視黃酯和月桂酸視黃酯的量進(jìn)行定量。
注意，所述培養(yǎng)溶液中包含40μM乙?；w、100μM或更少的抑制劑、10μM視黃醇、大約30μg/ml微粒體蛋白質(zhì)和接近0.1M PO4、pH7/5mM DTT/2mg/ml BSA。加入視黃醇后的所有步驟都在暗光線(xiàn)或琥珀色光線(xiàn)下進(jìn)行。
2.4、測(cè)定視黃醇脫氫酶的活性(用于識(shí)別B2)制備下列濃儲(chǔ)備液50mM KH2PO4、pH7.4緩沖液，無(wú)菌過(guò)濾過(guò)。
10mM全反式視黃醇(Sigma R7632)的DMSO溶液。
200mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽(NADP)(Sigma N0505)的無(wú)菌水溶液。
40mM試驗(yàn)化合物在適宜的溶劑(水、緩沖液、乙醇、氯仿或DMSO)中的溶液。
1∶10稀釋的鼠肝臟微粒體的50mM KH2PO4、pH7.4緩沖液(4ug/ul)。
在具有螺帽的2英錢(qián)玻璃小瓶中按順序加入下列物質(zhì)緩沖液，至終體積為400μl25μl稀微粒體(最終量＝100μg)-利用煮過(guò)的微粒體作對(duì)照和常規(guī)的微粒體作為試驗(yàn)樣品。
4μl200mM NADP(最終量＝2mM)1μl40mM試驗(yàn)化合物(最終量＝100μM)8μl10mM視黃醇(最終量＝200μM)將小瓶在37℃振蕩水浴中培養(yǎng)45分鐘。向各小瓶中加入500μl冰冷卻的乙醇使得反應(yīng)淬滅。用冰冷卻的己烷(每次2.7ml)提取類(lèi)維生素A兩次。在第一次提取過(guò)程中，向各小瓶中加入乙酸視黃酯(5μl900μM的儲(chǔ)備液)作為監(jiān)測(cè)各樣品提取功效的手段。將樣品渦流攪拌10秒鐘，然后在5℃的Beckman GS-6R離心機(jī)上，在1000rpm轉(zhuǎn)速下輕輕地離心5分鐘。每次提取后，將上層含有類(lèi)維生素A的己烷從水層中轉(zhuǎn)移到干凈的2英錢(qián)小瓶中。在微弱的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)除去己烷。干燥的殘?jiān)?20℃下貯存直至HPLC分析。
2.5、測(cè)定視黃醛還原酶的活性(用于識(shí)別B3)如上所述，用下列物質(zhì)代替上述物質(zhì)制備所有儲(chǔ)備液l0mM全反式視黃醛(Sigma R2500)的DMSO溶液-代替視黃醇。
200mM，還原型(reduced form)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四鈉鹽(NADPH)(Sigma N7505)的無(wú)菌水溶液-代替NADP。
在具有螺帽的2英錢(qián)玻璃小瓶中按順序加入下列物質(zhì)緩沖液，至終體積為400μl25μl稀微粒體(最終量＝100μg)-利用煮過(guò)的微粒體作對(duì)照和常規(guī)的微粒體作為試驗(yàn)樣品。
4μl200mM NADPH(最終量＝2mM)1μl40mM試驗(yàn)化合物(最終量＝100μM)3μl10mM視黃醛(最終量＝75μM)如上所述進(jìn)行相同的培養(yǎng)和提取過(guò)程。
2.6、測(cè)定CRABPII拮抗劑(用于識(shí)別B4)2.6.1、CRABPII的合成
a.表達(dá)系統(tǒng)在pET29a-c(+)質(zhì)體(Novagen)中克隆基因CRABPII?？寺〉幕蛱幱趶?qiáng)噬菌體T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)的控制下。T7聚合酶源是由宿主細(xì)胞E.Coli BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供的。后者具有在lacUV5控制下由所存在的IPTG誘導(dǎo)的染色體復(fù)制的T7聚合酶。按照制造商(Novagen)教導(dǎo)的方法，通過(guò)轉(zhuǎn)換將質(zhì)體轉(zhuǎn)移到E.Coli BLR(DE3)pLysS細(xì)胞中。
b.誘導(dǎo)將過(guò)夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞按照1∶100的比例在含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2×YT中稀釋。細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)在37℃下振搖直至在600nm下OD達(dá)到0.6-0.8。然后加入IPTG至終濃度為1mM并將培養(yǎng)基再培養(yǎng)2小時(shí)。通過(guò)在5000g轉(zhuǎn)速下在室溫下離心10分鐘捕獲細(xì)胞。沉積物在-20℃下貯存。
2.6.2、純化按照Norris和Li，1997中所描述的方法進(jìn)行純化。
a.溶胞作用將冷凍的沉積物在RT下解凍并再懸浮在1-2體沉積物體積的新制備溶胞緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8、10％(w/v)蔗糖、1mMEDTA、0.05％(w/v)疊氮化鈉、0.5mM DTT、10mM MnCl2、2.5mM苯甲基磺酰氟、2.5mM苯甲脒、6μg/mL DNase)中。溶胞產(chǎn)物在室溫下再培養(yǎng)30分鐘。通過(guò)聲處理(在10,000psi壓力下脈沖6個(gè)30-秒與在冰上延遲5個(gè)30-秒交替進(jìn)行)進(jìn)一步溶胞。溶胞產(chǎn)物不溶性部分通過(guò)在4℃15000rpm下離心1小時(shí)除去并且將上清液在-20℃下貯存。
b.在Sephacryl S300上進(jìn)行凝膠過(guò)濾將步驟a.得到的上清液在室溫下裝載到sephacryl S-300(Pharmacia)的2.5×100cm柱子。洗脫緩沖液為20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％疊氮化鈉(緩沖液A)。流速為2mL/min。所收集的2-mL餾分在280nm下檢查紫外吸收。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查代表峰值的餾分中CRABPII的存在。
c.陰離子-交換色譜法將2mL含有CRABPII的凝膠過(guò)濾餾分裝載到FPLC(快速蛋白質(zhì)液體色譜法)monoQ型(Pharmacia)的季銨陰離子交換柱上。CRABPII在室溫下用100％緩沖液A-30％緩沖液B的梯度緩沖液(100％緩沖液B＝緩沖液A+250mM NaCl)洗脫20分鐘。每分鐘收集1mL-餾分。再次通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢查CRABPII的存在。將CRABPII在4℃下貯存，然后用具有安放小瓶平臺(tái)附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards High Vacuum International)冷凍干燥。將干燥的樣品在室溫下貯存直至結(jié)合測(cè)定時(shí)使用。
d.檢測(cè)CRABPII的存在利用變性的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)分析，在7-15％聚丙烯酰胺凝膠(Biorad)上進(jìn)行CRABPII的表達(dá)和純化。將10μL樣品與10μL 2X填充緩沖液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并通過(guò)加熱變性(在80℃下加熱2min)。將樣品裝載到浸在1X Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)中的凝膠上并在室溫下施加恒電流(25mA)1小時(shí)?？捡R斯藍(lán)染色后，按照用Benchmark預(yù)染色蛋白梯(Gibco BRL)測(cè)定的蛋白質(zhì)分子量來(lái)識(shí)別所述蛋白質(zhì)。
利用蛋白質(zhì)印跡來(lái)確定CRABPII的存在。利用Biorad暗盒將SDS-PAGE分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜(Millipore)上。所述轉(zhuǎn)移在1X Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)+10％甲醇中進(jìn)行。施加3小時(shí)電流(60mA)以便讓蛋白質(zhì)通過(guò)膜遷移。然后，該膜在室溫下用5％干奶的1X TBS溶液阻斷1小時(shí)并在4℃下用具有初級(jí)抗體的探針探測(cè)在相同緩沖液中的CRABPII(1/1000稀釋的鼠抗克隆5-CRA-B3)過(guò)夜。接下來(lái)，將膜用PBS洗滌(3×5分鐘)，然后與1∶2000稀釋的二級(jí)抗體、軛合過(guò)氧化物酶的抗鼠抗體(ECLTM，Amersham)一起在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。將膜用1×PBS洗滌(3×5分鐘)并如生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)(Amersham)中所述，利用ECL檢測(cè)工具包檢測(cè)蛋白質(zhì)。
利用BSA工具包(Pierce)測(cè)定純CRABPII的濃度。
2.6.3、放射性結(jié)合測(cè)定將220pmol CRABPII在總體積為70uL的20mM Tris-HCl緩沖液pH7.4和15pmol放射性全反式視黃酸(NEN)中一起培養(yǎng)。為了進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，將另一過(guò)量的配體(6670∶1、670∶1或70∶1)加到該混合物中。反應(yīng)在室溫下和暗處下進(jìn)行1小時(shí)。為了將未結(jié)合的全反式視黃酸與結(jié)合的全反式視黃酸分離，使用6kD斷流微型色譜柱(Biorad)。如生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)(Pharmacia)中所述，利用Microplex多支管棄去儲(chǔ)備緩沖液。將樣品裝載到柱子上并通過(guò)重力作用分離30分鐘。濾液中出現(xiàn)與CRABPII結(jié)合的視黃酸(″RA″)，而游離的RA保留在柱子上。通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定濾液的放射性。
2.7、測(cè)定NADPH依賴(lài)性視黃酸氧化作用(用于識(shí)別B5)下列方法是R.Martini & M.Murray，″Participation of P450 3AEnzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-hydroxylation″，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)中所述方法的改良。制備下列測(cè)定緩沖液并在4℃下貯存0.1M PO4/0.lmM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。在測(cè)定當(dāng)天，制備60mM NADPH在緩沖液中的溶液。如上所述制備抑制劑儲(chǔ)備液、酸化乙醇/BHT淬滅液和己烷/BHT。通過(guò)用乙醇稀釋15mM儲(chǔ)備液(在DMSO中)制備1mM視黃酸工作液。
向2英錢(qián)小瓶中按順序加入物質(zhì)測(cè)定緩沖液至終體積500μL，20μL 60mM NADPH，5μL抑制劑或溶劑空白，然后大約2mg鼠肝臟微粒體蛋白質(zhì)。在37℃下培養(yǎng)5分鐘，然后加入5μL 1mM視黃酸工作液。在37℃下連續(xù)培養(yǎng)60分鐘-不要給小瓶加蓋，因?yàn)樵撗趸^(guò)程除需要NADPH外需要分子O2。如上所述用酸化乙醇/BHT淬滅并用己烷/BHT提取。通過(guò)如下所述對(duì)HPLC信號(hào)整合來(lái)確定快速洗脫的極性視黃酸代謝物(推測(cè)為4-氧代視黃酸)的量。
注意，加入視黃酸后的所有步驟都在暗光線(xiàn)或琥珀色光線(xiàn)下進(jìn)行。最終的培養(yǎng)液中包含2.4mM NADPH、100μM或更少的抑制劑、10μM視黃酸、大約4mg/mL鼠肝臟微粒體蛋白質(zhì)和接近0.1M PO4/0.lmMEDTA/5mM MgCl2。
各種類(lèi)維生素A的HPLC分析通過(guò)在各小瓶中用100μL甲醇溶解殘?jiān)鼇?lái)制備通過(guò)HPLC確定類(lèi)維生素A量的樣品。將該溶液轉(zhuǎn)移到在lmL外殼小瓶?jī)?nèi)的150μL玻璃錐形管中，蓋緊并放在Waters 715自動(dòng)進(jìn)樣器中。立即注射60μL等份試樣量并分析類(lèi)維生素A的含量。
色譜分析設(shè)備包括Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器和Waters 474掃描熒光檢測(cè)器。兩組HPLC記錄用于類(lèi)維生素A的分析。在ARAT和LRAT分析中，用Waters3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保護(hù)柱進(jìn)行視黃醇和視黃酯的分離，用調(diào)至流速為lmL/分鐘的80∶20(v/v)甲醇/THF無(wú)梯度流動(dòng)相洗脫10分鐘。洗脫液在325nm下監(jiān)測(cè)吸收度并在325ex/480em下監(jiān)測(cè)熒光。在利用A.B.Barua，″Analysisof Water-Soluble CompoundsGlucuronides″，Methods Enzymol.189，136-145(1990)中所描述的改良梯度系統(tǒng)進(jìn)行視黃醇和視黃酸氧化分析時(shí)，利用較短的Waters 3.9×l50mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保護(hù)柱來(lái)分離視黃酸和醇。該系統(tǒng)包括從含有10mM乙酸胺的68∶32(v/v)甲醇/水開(kāi)始至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷結(jié)束的20分鐘線(xiàn)性洗脫和在lmL/min的流速下保持5分鐘。在300nm-400nm下監(jiān)測(cè)該柱洗脫液。
這些分析方法可根據(jù)其在各測(cè)定中清楚地解析有關(guān)視黃酸、視黃醇、視黃醛和/或視黃酯的能力和相對(duì)分離速度來(lái)選擇。通過(guò)HPLC識(shí)別各類(lèi)維生素A是基于未知峰與可獲得的可信的類(lèi)維生素A標(biāo)準(zhǔn)品滯留時(shí)間的準(zhǔn)確匹配和未知峰與可獲得的可信的類(lèi)維生素A的UV光譜分析(300-400nm)進(jìn)行的。
適用于谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶測(cè)定中進(jìn)一步測(cè)試的增強(qiáng)劑包括但不限制于下文表B1-B5中所列出的增強(qiáng)劑。
ARAT/LRAT抑制劑(B1)
視黃醇脫氫酶活化劑(B2)
視黃醛還原酶抑制劑(B3)
CRABPII拮抗劑(B4)
視黃酸氧化抑制劑(B5)
在下文所描述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶測(cè)定中，增強(qiáng)劑或其組合物在10mM濃度下抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(以下稱(chēng)“Tgase”)至至少50％。
Tgase測(cè)定
谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的測(cè)定和角質(zhì)化細(xì)胞的分化在表皮末端分化過(guò)程中，在細(xì)胞外周的內(nèi)表面形成15nm厚的蛋白質(zhì)層，已知為角質(zhì)化膜(CE)。CE由許多已通過(guò)形成Nε-(Y-谷氨酰)賴(lài)氨酸異二肽鍵交聯(lián)在一起的不同的蛋白質(zhì)構(gòu)成，所述交聯(lián)作用是由至少兩種不同的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGases)在表皮上的表達(dá)作用催化的。Tgase I大量地在表皮分化層特別是在粒層中表達(dá)，但不存在于未分化的基底表皮。因此Tgase I是有用的表皮角質(zhì)化細(xì)胞分化標(biāo)志，高TGaseI水平表示一種更分化狀態(tài)。利用Tgase I抗體進(jìn)行基于ELISA的Tgase I測(cè)定以評(píng)定下列實(shí)施例中所培養(yǎng)角質(zhì)化細(xì)胞的分化狀態(tài)。
將角質(zhì)化細(xì)胞(如上所述培養(yǎng)的)以每孔200μl培養(yǎng)基中4,000-5,000個(gè)細(xì)胞的密度放在96孔平板中。培養(yǎng)2-3天或者直至～50％的細(xì)胞融合后，將培養(yǎng)基改換未含試驗(yàn)化合物的培養(yǎng)基(每次試驗(yàn)平行測(cè)定5次)。將該細(xì)胞再培養(yǎng)96小時(shí)，然后吸出培養(yǎng)基并將平板在-70℃下貯存。從冷凍器中取出平板，用200μl lx PBS洗滌細(xì)胞兩次。該細(xì)胞在室溫(R/T)下與TBS/5％BSA(洗滌緩沖液，牛血清白蛋白)一起再培養(yǎng)1小時(shí)。接下來(lái)加入Tgase初級(jí)抗體50μl單克隆抗-Tgase I Ab B.C.，在洗滌緩沖液中稀釋1∶2000倍。初級(jí)抗體在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)，然后用洗滌緩沖液沖洗6x。將該細(xì)胞與50μl在洗滌緩沖液中稀釋1∶4,000倍的二級(jí)抗體(由Amersham獲得的Fab片段，軛合過(guò)氧化物酶的抗鼠IgG)一起在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)，然后用洗滌緩沖液沖洗3次。用洗滌緩沖液沖洗后，該細(xì)胞用PBS沖洗3x。為了比色顯色，將細(xì)胞與100ul底物溶液(在10ml 0.1M pH5.0的枸櫞酸緩沖液中含4mg鄰苯二胺和3.3μl 30％H2O2)一起在R/T下，在暗處(在鋁箔遮蓋下)精確培養(yǎng)5分鐘。通過(guò)加入50μl4NH2SO4終止反應(yīng)。在492nm下，在96孔平板UV分光光度計(jì)中測(cè)定樣品的吸收度。在5份平行測(cè)定的樣品中，4份用兩種抗體處理，第5份用作Tgase背景對(duì)照。測(cè)定Tgase水平并以對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示。
測(cè)定谷氨酰胺水平并如上表B1-B5表示為(i)％(增強(qiáng)劑+視黃醇抑制/對(duì)照抑制)-％(ROH抑制/對(duì)照抑制)，它測(cè)定了與單獨(dú)的視黃醇相比，所加入的增強(qiáng)劑+視黃醇誘導(dǎo)的Tgase抑制作用，或(ii)在測(cè)定多個(gè)濃度增強(qiáng)劑的抑制作用時(shí)所得到的IC50值-它提供與10-7M恒定濃度的視黃醇合用抑制Tgase達(dá)50％時(shí)所需要增強(qiáng)劑的濃度。
IC50值用作本發(fā)明中的基準(zhǔn)。
用于谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試驗(yàn)的最佳增強(qiáng)劑組B1化合物
B2化合物
B3化合物
B4化合物
B5化合物
可滲透最小量氧的包裝如上所討論的，包含類(lèi)維生素A的組合物通常是不穩(wěn)定的并且可發(fā)生化學(xué)降解。而且，意外地發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)劑，盡管有利于增強(qiáng)類(lèi)維生素A的益處，但也導(dǎo)致類(lèi)維生素A的化學(xué)不穩(wěn)定性。增強(qiáng)劑誘導(dǎo)的視黃醇的不穩(wěn)定作用急劇地降低了當(dāng)兩種組分同時(shí)包含在一種制劑中時(shí)激活的類(lèi)維生素A系統(tǒng)的總功效。因此，與只含有類(lèi)維生素A的組合物相比，更需要保護(hù)含有增強(qiáng)劑的制劑中的類(lèi)維生素A組合物以避免破壞至較高程度。具體地說(shuō)，需要制備穩(wěn)定的含有類(lèi)維生素A和類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑的組合物以便提供類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑有益的激活作用，同時(shí)防止類(lèi)維生素A在激活作用前可能發(fā)生降解。因此，本發(fā)明提供一種包裝，它可最少地滲透氧以便穩(wěn)定類(lèi)維生素A和增強(qiáng)劑的組合物，因此使得增強(qiáng)劑誘導(dǎo)的類(lèi)維生素A降解最小。
可滲透最少量氧的包裝可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法制造。具體地說(shuō)，本發(fā)明組合物不應(yīng)該直接與氧或空氣接觸，并且應(yīng)該防止氧通過(guò)包裝的外壁滲透?？墒褂貌煌腹夂筒粷B透氧的包裝。例如可使用鋁作為包裝的壁或包裝的內(nèi)襯。
可化妝用載體本發(fā)明產(chǎn)品也包含化妝品可用載體作為第一種或第二種組合物中或兩種組合物中活性組分的稀釋劑、分散劑或載體，以便于當(dāng)所述組合物應(yīng)用于皮膚時(shí)促進(jìn)其分配。
非水的或除水以外的載體還可包括液體或固體潤(rùn)膚劑、溶劑、潤(rùn)濕劑、增稠劑和粉劑。特別優(yōu)選的非水載體是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發(fā)明聚硅氧烷可以是那些在25℃下粘度范圍大約為10-10,000,000厘沲的聚硅氧烷。特別可取的是低粘度和高粘度的聚硅氧烷的混合物。這些聚硅氧烷以Vicasil，SE和SF為商標(biāo)購(gòu)于通用電氣公司和以200和550Series為商標(biāo)購(gòu)于Dow Corning公司?？稍诒景l(fā)明組合物中使用的聚硅氧烷的量為組合物重量的5-95％，優(yōu)選25-90％范圍。
任選的益膚材料和化妝用輔助物油或油性材料可以與乳化劑一起存在以便提供油包水或水包油乳劑，這主要依賴(lài)于所使用的乳化劑的平均親水親油平衡值(HLB)。
本發(fā)明化妝組合物中可存在各種活性組分并描述于下文中?；钚詣┒x為除潤(rùn)膚劑和僅僅改善組合物物理特性的組分外的益膚劑或益發(fā)劑。盡管不限制于該種類(lèi)，但一般的實(shí)例包括防曬劑、皮膚光亮劑、曬黑劑。
防曬劑包括那些常用于阻斷紫外光的材料。例舉的化合物是PABA、肉桂酸酯(鹽)和水楊酸酯(鹽)的衍生物。例如，可使用辛基甲氧基肉桂酸酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮(也稱(chēng)作oxybenzone)。辛基甲氧基肉桂酸酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮可分別以Parsol MCX和二苯酮-3為商標(biāo)購(gòu)得。
乳劑中所使用的防曬劑的確切量取決于對(duì)太陽(yáng)紫外照射所需防護(hù)的程度。
另一種優(yōu)選的任選組分選自必需脂肪酸(EFAs)，即，所有細(xì)胞質(zhì)膜形成所必需的那些脂肪酸，在角質(zhì)化細(xì)胞中EFA缺乏導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖。補(bǔ)充EFA可矯正這種過(guò)度增殖。EFA也增強(qiáng)表皮的磷脂生物合成并為表皮屏障形成提供磷脂。這些必需脂肪酸優(yōu)選選自亞油酸、Y-亞麻酸、高-Y-亞麻酸、columbinic acid、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、己烯酸及其混合物。
通常將潤(rùn)膚劑混合到本發(fā)明化妝組合物中。所述潤(rùn)膚劑的含量可以為總組合物重量的大約0.5％-大約50％，優(yōu)選大約5％-大約30％。按照這樣的一般化學(xué)種類(lèi)，潤(rùn)膚劑可以分類(lèi)為酯、脂肪酸和醇、多元醇和烴。
酯可以是一酯或二酯。公認(rèn)的脂肪酸二酯的實(shí)例包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、diisopropyl dimerate和琥珀酸二辛酯。公認(rèn)的支鏈脂肪酸酯包括肉豆蔻酸2-乙基-己基酯、硬脂酸異丙酯和異硬脂醇棕櫚酸酯。公認(rèn)的三元酸酯包括三亞油酸三異丙酯和枸櫞酸三月桂酯。公認(rèn)的直鏈脂肪酸酯包括棕櫚酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、oleyl eurcate和硬脂醇油酸酯。優(yōu)選的酯包括可可辛酸酯/可可癸酸酯(可可辛酸酯和可可癸酸酯的混合物)、丙二醇肉豆蔻基醚乙酸酯、己二酸二異丙酯和鯨蠟醇辛酸酯。
適宜的脂肪醇和脂肪酸包括那些具有10-20個(gè)碳原子的化合物。特別優(yōu)選的是這樣的化合物如鯨蠟醇、肉豆蔻醇、棕櫚醇和硬脂醇及其相應(yīng)的酸。
可用作潤(rùn)膚劑的多元醇是直鏈或支鏈烷基多羥基化合物。例如丙二醇、山梨糖醇和甘油是優(yōu)選的。也可以使用聚多元醇如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也是特別優(yōu)選的滲透增強(qiáng)劑。
可用作潤(rùn)膚劑的烴的實(shí)例是那些具有12-30個(gè)碳原子的烴鏈的烴。具體的實(shí)例包括礦物油、凡士林、角鯊烯和異鏈烷烴。
本發(fā)明化妝組合物中的另一類(lèi)功能性組分是增稠劑。增稠劑通常以所述組合物重量的大約0.1-大約20％，優(yōu)選大約0.5％-大約10％的量存在。增稠劑的實(shí)例是以Carbopol為商標(biāo)購(gòu)于B.F.Goodrich公司的交聯(lián)聚丙烯酸酯材料?？墒褂脴?shù)膠如黃原膠、角叉菜膠、明膠、梧桐膠、果膠和槐樹(shù)豆膠。在某些情況下，可通過(guò)一種也可以作為硅氧烷或潤(rùn)膚劑的材料實(shí)現(xiàn)增稠功能。例如，過(guò)量10厘沲的硅樹(shù)膠和酯如硬脂酸甘油酯具有雙重功能性。
粉劑可以混合到本發(fā)明的化妝組合物中。這些粉劑包括白堊、滑石粉、漂白土、高嶺土、淀粉、綠土粘土、化學(xué)改變的硅酸鎂鋁、有機(jī)改性的蒙脫石粘土、水合硅酸鋁、燒制二氧化硅、淀粉辛烯基琥珀酸鋁及其混合物。
本發(fā)明組合物中也可以混合其他輔助性少量成分。這些組分可包括著色劑、遮光劑和香料。這些組分的量的范圍可以為組合物重量的0.001％-20％。
本發(fā)明的組合物主要作為局部用于人皮膚的產(chǎn)品，特別是作為調(diào)理和光滑皮膚的以及防止或減少外部皺紋或老化皮膚的試劑。
在使用中，從合適的容器或者涂覆器中取少量的組合物，例如1到5ml，施用于皮膚暴露的區(qū)域，然后如果需要，用手或者手或指或者合適的器具在皮膚上鋪展和/或摩擦進(jìn)入皮膚。
產(chǎn)品形式和包裝本發(fā)明的局部皮膚治療組合物可被配制成化妝水、流體霜、乳油或凝膠。
實(shí)施例1方法將視黃醇(50％的吐溫80溶液)溶于大約50％乙醇水溶液中得到360nm處OD大約為0.6的溶液，所述OD值是使用標(biāo)準(zhǔn)96孔分光光度計(jì)在200μl體積的96孔板中測(cè)定的。
以大約0.1％的濃度加入增強(qiáng)劑分子并如上立即和在室溫下暗處放置60小時(shí)后測(cè)定OD360。對(duì)60小時(shí)后的OD進(jìn)行矯正(除以0.85)用來(lái)計(jì)算視黃醇因溶劑從板孔中蒸發(fā)而增加的濃度。
結(jié)果
試驗(yàn)的增強(qiáng)劑引起的視黃醇不穩(wěn)定性明顯增加。
這使得有必要使用制劑/包裝選擇以便在使用增強(qiáng)劑時(shí)提供比單獨(dú)使用視黃醇更好的視黃醇穩(wěn)定性。
實(shí)施例2為了確定是否協(xié)同抑制因B1和B5活性化合物與視黃醇組合發(fā)生的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，有必要確定當(dāng)各自在視黃醇存在下測(cè)定時(shí)活性化合物的劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)(包括IC50值)。該數(shù)據(jù)用于確定各活性化合物適宜的次最大抑制濃度，以可以確定在視黃醇存在下，活性化合物混合物的協(xié)同作用。為了證明兩種化合物的協(xié)同作用，必需選擇至多為IC20的測(cè)試濃度，換句話(huà)說(shuō)，各自激活視黃醇20％抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)時(shí)化合物濃度。兩種所述化合物應(yīng)該具有40％的相加抑制作用。利用該方案來(lái)確定濃度為發(fā)現(xiàn)兩種化合物在檢測(cè)條件下對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶其他抑制作用的協(xié)同性留下40-100％的窗口。更具有挑戰(zhàn)性的濃度標(biāo)準(zhǔn)是選擇單獨(dú)使用未顯示激活視黃醇抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶抑制作用的化合物濃度。然而，在該研究中，甚至選擇更具有挑戰(zhàn)性的標(biāo)準(zhǔn)。選擇比最小有效谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶抑制濃度低10倍和100倍的化合物濃度。利用所述非常低的濃度來(lái)確定協(xié)同組合意味著所確定的協(xié)同組合是最有效的。
下表中的數(shù)據(jù)表示比化合物最小抑制濃度低2個(gè)對(duì)數(shù)的化合物的濃度。這些是B1/B5組合研究中所使用的濃度。
表1
為了研究B1和B5活性化合物與視黃醇組合對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的協(xié)同抑制作用，在上表提供的濃度下測(cè)試所選擇的化合物組合。得到下列數(shù)據(jù)表2
B1/B5組合的功效分為兩類(lèi)-特別有效的組合(上表下劃線(xiàn)部分，即最先的14個(gè)組合)和幾乎無(wú)效的組合(非下劃線(xiàn)部分，即最后的6個(gè)組合)。意外地發(fā)現(xiàn)，某些B1/B5組合比其他組合作用更好。那些幾乎無(wú)效的組合是(i)脂肪酸酰胺+唑類(lèi)、(ii)羥基脂肪酸酰胺+唑類(lèi)和(iii)柑桔素/槲皮黃酮+唑類(lèi)。有效的組合包含B1增強(qiáng)劑與下列類(lèi)的B5增強(qiáng)劑的組合脂肪羥乙基咪唑啉表面活性劑、環(huán)狀脂肪族不飽和化合物、多環(huán)狀三萜、n-取代脂肪酸酰胺。
盡管本文就某些特性和參考某些優(yōu)選的具體實(shí)例描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員公認(rèn)，可以進(jìn)行已描述過(guò)的許多改變、修飾和取代并且它們都包含在本發(fā)明范圍和精神內(nèi)。也就是說(shuō)所有這些修飾和改變都包含在本文所描述和要求保護(hù)的范圍內(nèi)，本發(fā)明僅受下文權(quán)利要求的范圍限制，所述權(quán)利要求盡可能以合理寬的范圍解釋。在本說(shuō)明書(shū)全文中，引用了各種出版物和書(shū)籍。這些出版物和書(shū)籍各全文引入供參考。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的護(hù)膚組合物，它包含大約0.0001％-大約50％至少一種類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑；大約0.001％-大約10％類(lèi)維生素A；和可化妝用載體，其中所述穩(wěn)定的護(hù)膚組合物包在包裝中使得所述組合物不與氧接觸。
2.權(quán)利要求1的穩(wěn)定的護(hù)膚組合物，其中所述組合物含有至少兩種大約0.0001％-大約50％量的增強(qiáng)劑。
3.權(quán)利要求1的穩(wěn)定的護(hù)膚組合物，其中所述包裝包含鋁層。
4.權(quán)利要求3的穩(wěn)定的護(hù)膚組合物，其中所述包裝是由鋁制造的。
5.一種調(diào)理皮膚的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的組合物局部應(yīng)用到皮膚。
6.一種模擬視黃酸對(duì)皮膚作用的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的組合物應(yīng)用到皮膚。
7.權(quán)利要求1的穩(wěn)定的護(hù)膚組合物在制備調(diào)理皮膚的藥物中的應(yīng)用。
8.用于調(diào)理皮膚的權(quán)利要求1的穩(wěn)定的護(hù)膚組合物。
全文摘要
一種穩(wěn)定的護(hù)膚組合物，它包含大約0.0001％－大約50％至少一種類(lèi)維生素A增強(qiáng)劑，大約0.001％－大約10％類(lèi)維生素A，和可化妝用載體，其中所述穩(wěn)定的護(hù)膚組合物包在包裝中使得所述組合物不與氧接觸。
文檔編號(hào)A61K8/63GK1575161SQ01822921
公開(kāi)日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2001年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者S·P·格蘭格爾, P·錢(qián)達(dá), I·R·斯科特 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司