專利名稱：一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架及其制備方法，屬生物工程材料技術(shù)領(lǐng)域。
工程科學(xué)與材料科學(xué)交叉與融合產(chǎn)生了組織工程學(xué)langer R and Vacanti JP.Science，1993；260920-926。它的基本實施途徑是在外源三維細胞支架(ECM)上接種細胞，以形成新的組織或器官。這種三維支架可利用兩類生物材料制備天然生物材料及其衍生物與合成高分子聚合物。天然生物材料如膠原，具有與細胞特異性相互作用的優(yōu)點，但存在力學(xué)強度低、制備過程中批與批材料間性能差異較大的特點。與天然材料比，合成高分子具有力學(xué)強度高，易于大規(guī)模生產(chǎn)、材料強度及降解速率可控制等優(yōu)點，但也存在材料表面沒有細胞識別位點的最大缺點Kim SB and Mooney DJ.Trends In Biotech，1998；16224-230。正如Radtner教授Rouhi AM.Chemical Engineering News，1999；77(3)51-59在美國“當(dāng)代生物材料會議上所指出盡管近30年來生物材料的研究取得了較大的進步，但其在臨床應(yīng)用方面卻是失敗的。究其原因則是人們在開發(fā)、研究生物材料的過程中僅從材料力學(xué)強度、降解性能等方面考慮，而沒有從材料的生理反應(yīng)等方面去設(shè)計。
目前存在的人工肝系統(tǒng)可分為三大類第一類是通過血液灌流或血液濾過除去血液中的有毒成分，以期使肝病癥狀改善。這類裝置沒有將肝臟的合成、分泌等功能考慮在內(nèi)，雖然在一定時間內(nèi)對病人有一定的療效，但因不能提高病人的存活率，未被人們普遍接受。第二類為生物人工肝支持系統(tǒng)(Sorrentino F.Prime ricerche per larealization di un fegatoartificiale.Chir.Patol.Sper.1956，41401-1414)。利用動物或人的肝細胞、肝組織或者整個肝臟來對肝衰病人進行治療。缺點是這類外源肝細胞一旦與人體組織接觸，就會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，其應(yīng)用也受到很大的限制。第三類是由生物和非生物兩部分組成的雜化人工肝支持系統(tǒng)，包括生物和非生物兩部分。生物部分最理想的材料是人的原代肝細胞，研究較多的細胞株有C3A細胞Olumide F，Eliashiv A，Kralios N，et al.Hepatic support withhepatocyte suspension in a permeable membrane dialyzer.Surgery，1997；82559-606、HepG2細胞，動物細胞主要有大鼠肝細胞和豬肝細胞。非生物部分是由微載體、中空纖維管組成的灌流器。通過細胞和高分子材料的相互作用，使細胞結(jié)合到高分子上，并保持肝細胞特有的分化功能。這些反應(yīng)裝置只能在體外起到輔助肝臟的使用，而且受到癌細胞的安全性、反應(yīng)器制作工藝的復(fù)雜性及所能容納細胞數(shù)量等的種種限制，還不能完全替代肝組織的功能。天然或合成高分子材料如膠原、殼聚糖、半乳酸海藻酸鈉、聚乳酸等曾被用于體外肝細胞的培養(yǎng)或用作人工皮膚、人工骨的制備，證明其細胞的相容性及體內(nèi)的安全性。但用于體內(nèi)的可降解的人工肝支架材料還未見報道。因此，研制一種能夠提供正常肝臟復(fù)雜的合成、代謝、解毒、分泌、排泄功能的人工肝仍是一個重要的前沿性課題。
本發(fā)明所述的復(fù)合肝支架呈紡錘形。
一種制備體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架方法，其特征在于該方法依次包括以下步驟(1)用具有一定強度的細絲制成多層紡錘形模具，將模具放入與模具外型相吻合的容器中，并在容器中加入細胞相容性好的可降解高分子溶液，凍干后從容器中取出，即可制得紡錘形海綿體6；(2)在上述制備的海綿體6的外壁上涂一層可降解高分子溶液，然后放入交聯(lián)劑中浸泡；濕態(tài)下抽出其中的細絲，形成外層為致密層7，內(nèi)層帶多管道5、多孔的、可接種細胞及細胞生長因子的支持體；(3)在上述支持體的外壁上再涂一層可降解高分子溶液，凍干、再交聯(lián)，即可制得復(fù)合支持體；(4)在復(fù)合支持體外部細胞培養(yǎng)液入口1和培養(yǎng)液出口2之間包覆一層可溶解的凝膠態(tài)物質(zhì)，同時預(yù)制血液入口3和血液出口4；(5)在上述制得的支持體的外壁再涂一層可降解高分子溶液，待溶劑揮發(fā)后，即在支持體外圍形成外套9；(6)將上述復(fù)合支持體放入去離子水中，溶解掉其中的凝膠態(tài)物質(zhì)，在外套9內(nèi)形成血液空腔8，經(jīng)干燥后即可制得多管道、多層次的復(fù)合肝支架材料；(7)將上述制得的復(fù)合肝支架材料在抗凝血藥物中浸泡，然后在丙酮濃度依次遞減的水溶液中縮聚，即可制得抗凝血的多管道、多層次的復(fù)合支架材料。
在上述制備方法中，步驟(1)所述的細絲為細金屬絲或細塑料絲。
在上述制備方法中，步驟(1)、(2)、(3)所述的可降解高分子溶液為膠原鹽(醋)酸溶液、明膠水溶液、明膠與海藻酸鈉混合液、膠原與海藻酸鈉混合液、膠原與半乳酸海藻酸鈉混合液(海藻酸鈉中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)、殼聚糖醋酸溶液、殼聚糖/膠原混合液、殼聚糖/明膠混合液、殼聚糖/海藻酸鈉混合液的任意一種。
在上述制備方法中，所述的可降解高分子溶液中還可復(fù)合細胞(如肝細胞、內(nèi)皮細胞)生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-α)。以促進細胞生長、防止細胞癌變。
在上述制備方法中，步驟(2)與(3)中所述的交聯(lián)劑對于可降解高分子為膠原、明膠類蛋白質(zhì)的溶液，交聯(lián)劑可選擇1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/丙酮體系或1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/2-(N-嗎啉)-乙烷-磺酸體系；對于可降解高分子為含海藻酸鈉或半乳酸-1，4-乙二氨基海藻酸鈉的溶液，交聯(lián)劑還可選擇乙二胺/1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/氯化鈣體系。對于只含可降解高分子殼聚糖的溶液，不需交聯(lián)。
在上述制備方法中，步驟(1)、(2)、(3)、(5)中可直接將抗凝血藥物復(fù)合在可降解高分子溶液中，然后按步驟(6)進行，即可制得抗凝血的多管道、多層次的復(fù)合支架材料。
在上述制備方法中，步驟(5)中所述的可降解高分子溶液可采用聚乳酸、聚乳酸/與聚羥基乙酸、聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的1，4-二氧六環(huán)或氯仿溶液中的任一種。
由于本發(fā)明所使用的生物材料既具有一定的機械強度與韌性，又具有非常好的細胞、血液相容性。多管道、多層復(fù)合結(jié)構(gòu)至少可維持在一個月以上，內(nèi)皮細胞與肝細胞可以在支架的管道與孔隙中充分生長、分裂。以利于后期體內(nèi)植入時微血管的形成及對肝細胞數(shù)量的要求。
下面結(jié)合附圖
具體說明本發(fā)明的一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架及其制備方法。
本發(fā)明的一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架主要包括由可降解高分子材料制成的培養(yǎng)液入口1，培養(yǎng)液出口2，血液入口3，血液出口4，其內(nèi)部帶管道5的海綿體6，致密層7，血液空腔8以及外套9。
本發(fā)明的一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架制備方法為本發(fā)明使用的明膠、海藻酸鈉、鹽酸、丙酮、1、4-二氧六環(huán)、肝素鈉、氯化鈉均為分析純，由北京化工試劑店購買。I型膠原蛋白由北京摯友酒精制品廠購買。金屬絲(不銹鋼絲、銅絲、鎢絲)、聚丙稀睛纖維、聚丙烯纖維、聚乳酸、聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物、聚乳酸與聚己內(nèi)脂共聚物、殼聚糖(脫乙酰度DD為78％，分子量Mw為4.15×105)、半乳酸-1，4-乙二氨基海藻酸鈉(海藻酸鈉中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)由山東或上海醫(yī)療器械廠購買。2-(N-嗎啉)-乙烷-磺酸(MES)為美國，Sigma公司產(chǎn)品。1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC HCI)為上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品。凍干機(Labconco型，德國)。孔徑、孔隙率的測定采用壓汞儀(Quantachrome Autosorb-60，American)，壓力范圍0～400MPa。(1)紡錘形多管道海綿體的制備取直徑為0.1～1mm、長3～6cm的細絲數(shù)(10～20)根，兩端用細線緊密纏繞成束，然后由外向內(nèi)用鑷子逐層彎曲成紡錘形模具。將模具放入兩頭細(直徑3～10mm)、中間粗(直徑8～15cm)的與紡錘形模具外型相吻合的容器中，加入細胞相容性好的可降解高分子0.5～1.5wt％的I型膠原鹽酸(5～50mM)溶液或0.5～1.5wt％的I型膠原(5～50mM)鹽酸溶液、體積比為1～5∶1(v/v)的1～30wt％的明膠/1～3wt％海藻酸鈉混合液、體積比為1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％的I型膠原(5～50mM)鹽酸溶液/1～3wt％海藻酸鈉混合液、體積比為1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％的I型膠原(5～50mM)鹽酸溶液/1～3.5wt％半乳酸海藻酸鈉(海藻酸鈉中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)混合液、0.5～1.5wt％殼聚糖醋酸(10～100mM)溶液、體積比為1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％殼聚糖醋酸(10～100mM)/0.5～1.5wt％的I型膠原醋酸(5～50mM)混合液、體積比為1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％殼聚糖醋酸(10～100mM)/1～30wt％的明膠混合液、或體積比為1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％殼聚糖/海藻酸鈉混合液中的任一種。于-20～-70℃下冷凍，凍干后從容器中取出，即可制得紡錘形海綿體6；(2)支持體的形成取上述制備的紡錘形海綿體6，外涂一層天然高分子溶液，然后放入交聯(lián)劑(如5～20mL含20～200mg的1-乙基-3-(3二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC HCI)水/丙酮(比例為1∶9v/v)溶液中或1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/2-(N-嗎啉)-乙烷-磺酸體系；或乙二胺/1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/氯化鈣體系，室溫下浸泡6～72小時。濕態(tài)下抽出其中的細絲，形成外層為致密層7，可防止細胞穿過，內(nèi)層帶多管道5、多孔(孔徑為5～120μm，孔隙率30～70％)的、可接種細胞及細胞生長因子的支持體；(3)復(fù)合支持體的形成在上述制備的支持體的外壁上再涂一層厚為0.5～1mm的可降解高分子溶液(如1～30wt％的明膠)，然后凍干、再交聯(lián)，即可制得復(fù)合支持體；(4)預(yù)制血液通道將由(3)制得的復(fù)合支持體外部培養(yǎng)液入口1與培養(yǎng)液出口2之間包覆一層可溶性高分子(如10～30wt％的明膠水)溶液，(操作溫度40～50℃)。同時用兩根長5～15mm的細絲狀物(如干或凝膠態(tài)明膠絲)分別插在兩端涂有可溶性高分子的地方(如距一端細胞培養(yǎng)液入口1/4與3/4處)，短絲的外壁上同樣涂一層明膠水溶液。同時預(yù)制血液入口3和血液出口4；在前期體外培養(yǎng)階段，培養(yǎng)液可由入口1進，由出口2出，血液由入口3進，由出口4出。在后期體內(nèi)植入階段入口1與出口2也可直接通血液；(5)疊加外套待室溫下上述明膠溶液凝固后，整個材料外再涂一層可降解高分子聚乳酸(Mw3×104～5)或聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(70～90∶30～10，Mw3×104～5)或聚乳酸與聚己內(nèi)酯共聚物(摩爾比為70～90∶30～10，Mw10×104～5)的1，4-二氧六環(huán)溶液(濃度為5～35w/v％)。等有機溶劑揮發(fā)后，即在支持體外圍形成外套9；(6)血液空腔的形成將復(fù)合材料放入37℃去離子水中，溶解掉其中的明膠溶液、抽出絲狀物、在外套9內(nèi)形成血液空腔8，經(jīng)干燥后即可制得多管道、多層次的復(fù)合肝支架材料；(7)抗凝血處理將上述制得的復(fù)合肝支架材料在抗凝血藥物中浸泡，然后在丙酮濃度依次遞減的水溶液中縮聚，即可制得抗凝血的多管道、多層次的復(fù)合支架材料。
(4)將由(3)制得的紡錘體的外圍4mm處開始涂一層30wt％的明膠水溶液，操作溫度40℃。同時用兩根長10mm的凝膠態(tài)明膠絲分別插在距一端口1/5與4/5處，外圍同樣涂一層明膠水溶液，預(yù)制血液入口3和血液出口4；(5)待由(4)制得樣品在室溫下明膠溶液凝固后，整個材料外壁上再涂一層復(fù)合肝素鈉(1∶50w/v％)的聚乳酸與聚羥基乙酸(6∶1M/M，Mw5×104～5)的1，4-二氧六環(huán)溶液(濃度為30w/v％)。待有機溶劑揮發(fā)掉后，將在支持體外圍形成外套9；(6)將上述復(fù)合材料放入40℃去離子水中，將其中的明膠溶液溶解，在外套9內(nèi)形成血液空腔8，經(jīng)干燥后即可制得多管道、多層次的復(fù)合肝支架材料。
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架，其特征在于該復(fù)合肝支架主要包括由可降解高分子材料制成的培養(yǎng)液入口[1]，培養(yǎng)液出口[2]，血液入口[3]，血液出口[4]，其內(nèi)部帶管道[5]的海綿體[6]，致密層[7]，血液空腔[8]以及外套[9]。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架，其特征在于所述的復(fù)合肝支架呈紡錘形。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架材料的方法，其特征在于該方法依次包括以下步驟(1)用一定強度的細絲制成多層紡錘形模具，將模具放入與模具外型相吻合的容器中，并在容器中加入細胞相容性好的可降解高分子溶液，凍干后從容器中取出，即可制得紡錘形海綿體[6]；(2)在上述制備的海綿體[6]的外壁涂一層可降解高分子溶液，然后放入交聯(lián)劑中浸泡；濕態(tài)下抽出其中的細絲，形成外層為致密層[7]，內(nèi)層帶多管道[5]、多孔、可接種細胞及細胞生長因子的支持體；(3)在上述支持體的外壁上再涂一層可降解高分子溶液，凍干、再交聯(lián)，即可制得復(fù)合支持體；(4)在復(fù)合支持體外部細胞培養(yǎng)液入口[1]和培養(yǎng)液出口[2]之間包覆一層可溶解的凝膠態(tài)物質(zhì)，同時預(yù)制血液入口[3]和血液出口[4]；(5)在上述制得的支持體的外壁再涂一層可降解高分子溶液，待溶劑揮發(fā)后，即在支持體外圍形成外套[9]；(6)將上述復(fù)合支持體放入去離子水中，溶解掉其中的凝膠態(tài)物質(zhì)，在外套[9]內(nèi)形成血液空腔[8]，經(jīng)干燥后即可制得多管道、多層次的復(fù)合肝支架材料；(7)將上述制得的支持體在抗凝血藥物中浸泡，然后在丙酮濃度依次遞減的水溶液中縮聚，即可制得抗凝血的多管道、多層次的復(fù)合支架材料。
4.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的細絲為細金屬絲或細塑料絲。
5.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的可降解高分子溶液為膠原鹽(醋)酸溶液、明膠水溶液、明膠與海藻酸鈉混合液、膠原鹽酸溶液與海藻酸鈉混合液、膠原鹽(醋)酸溶液與半乳酸海藻酸鈉混合液(海藻酸鈉中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)、殼聚糖醋酸溶液、殼聚糖/膠原混合液、殼聚糖/明膠混合液、殼聚糖/海藻酸鈉混合液的任意一種。
6.按照權(quán)利要求3或5所述的制備方法，其特征在于所述的可降解高分子溶液中還可復(fù)合細胞(肝細胞、內(nèi)皮細胞)生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-α)。以促進細胞生長、防止細胞癌變。
7.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(2)與(3)中所述的交聯(lián)劑對于可降解高分子為膠原、明膠類蛋白質(zhì)的溶液，交聯(lián)劑可選擇1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽或其穩(wěn)定體系1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/2-(N-嗎啉)-乙烷-磺酸(MES)；對于可降解高分子為含海藻酸鈉或半乳酸-1，4-乙二氨基海藻酸鈉的溶液，交聯(lián)劑還可選擇乙二胺/1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/氯化鈣體系；對于可降解高分子為殼聚糖醋酸的溶液，不需交聯(lián)。
8.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(1)、(2)、(3)、(5)中可直接將抗凝血藥物復(fù)合在可降解高分子溶液中，然后按步驟(6)進行，即可制得抗凝血的多管道、多層次的復(fù)合支架材料。
9.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中所述的可降解高分子溶液可采用聚乳酸、聚乳酸/與聚羥基乙酸、聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的1，4-二氧六環(huán)溶液或聚醚氧酯的四氧呋喃溶液中的任一種。
全文摘要
一種體內(nèi)可降解的復(fù)合肝支架及其制備方法,涉及生物工程材料技術(shù)領(lǐng)域。其特征是該支架呈紡錘形,它含有外套、致密層、血液空腔及內(nèi)部帶管道的海綿體。其制備方法是先將可降解高分子溶液倒入紡錘形模具中制成海綿體,將海綿體外壁涂一層可降解高分子溶液后在交聯(lián)劑中浸泡,形成外層致密,內(nèi)層帶多管道、多孔的支持體;將支持體再交聯(lián)后制得復(fù)合支持體;將復(fù)合支持體中的凝膠態(tài)物質(zhì)溶解后即在外套內(nèi)形成血液空腔;干燥后在抗凝血藥物中浸泡,并在丙酮溶液中縮聚,即可制得具有抗凝血的多管道、多層的復(fù)合肝支架材料。本支架可使內(nèi)皮細胞與肝細胞在管道與孔隙中充分生長、分裂,以利于后期體內(nèi)植入時微血管的形成及對肝細胞數(shù)量的要求。
文檔編號A61L31/12GK1363400SQ02103610
公開日2002年8月14日 申請日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月29日
發(fā)明者王小紅, 崔福齋, 馮慶玲, 徐迎新 申請人:清華大學(xué)