專利名稱：抗hiv藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗HIV的藥物，特別是抑制HIV感染個體中該病毒復制的藥物。
背景技術：
導致獲得性免疫缺陷綜合癥的病毒HIV，是一種屬于逆轉錄病毒科(Retroviridae)慢病毒屬(Lentivirus)的RNA病毒。HIV按以下方式進行感染和復制。首先，HIV顆粒的包膜蛋白gp120(糖蛋白120)結合于靶細胞表面上的CD4。隨后結合的Gp120和CD4結合于作為協(xié)同受體的趨化因子受體(主要是巨噬細胞上的CCR5或T細胞上的CXCR4)，形成由gp120、CD4和趨化因子構成的復合物。緊接著另一包膜蛋白gp41結合于靶細胞的細胞膜。這導致包膜與細胞膜融合，從而病毒的核心進入細胞。一旦進入細胞，HIV就脫被膜，并通過病毒帶入的逆轉錄酶用模板RNA基因組合成雙鏈原病毒DNA。然后在整合酶(也是病毒的酶)的協(xié)助下，原病毒DNA整合入宿主細胞染色體DNA中。用原病毒5’端的LTR(長末端重復序列)作啟動子，摻入的原病毒轉錄產生病毒mRNA。在此過程中產生一些不同長度的mRNA，可將它們分成兩組，即合成病毒蛋白質的mRNA與作為病毒基因組RNA的mRNA。病毒蛋白質包括如形成病毒顆粒的結構蛋白質和加速病毒復制的蛋白質。例如，病毒蛋白質Tat結合于摻入宿主基因組的原病毒5’LTR區(qū)域，從而將病毒RNA的轉錄產物增加幾百倍。另一方面，形成病毒顆粒的結構蛋白質與細胞內、細胞膜附近的病毒基因組RNA聯(lián)合裝配成病毒顆粒。隨后通過出芽將如此裝配的病毒顆粒釋放出細胞。裝配和出芽的機制至今未知。在釋放出的顆粒中，蛋白酶被活化，并進行加工，從而產生成熟的傳染性病毒顆粒。通過重復由CD4結合于靶細胞、整合入宿主染色體DNA、復制、出芽和成熟組成的完整過程，HIV迅速再生。隨著HIV的再生，宿主CD4-陽性細胞發(fā)生破壞。為了對付這種狀況，宿主誘導了新鮮CD4-陽性細胞的迅速增殖來彌補這種損失。這種動力學平穩(wěn)將在感染后持續(xù)幾年，但或早或遲CD4-陽性細胞的補充將趕不上其損失，而導致免疫系統(tǒng)的整體瓦解，出現(xiàn)AIDS的各種癥狀。
在HIV感染個體中，為了去除HIV發(fā)生著各種免疫反應。其中有例如中和病毒抗原的抗體的產生和由細胞毒T細胞消滅被感染的細胞。現(xiàn)已知道CD8-陽性細胞產生的一些體液因子在維持HIV感染個體處于無癥狀狀態(tài)中起著重要作用[Levy，J.A.，等人，Immunol.Today，17217-224(1996)，F(xiàn)auci，A.S.，Nature，384529-534(1996)]。在這些因子中迄今已鑒定了趨化因子(RANTES、MIP-α、1β、SDF-1)和IL-16。但它們都不能提供足夠的基礎來完全解釋CD8-陽性細胞產生的抗HIV活性，這提示還有一些未鑒定的HIV-抑制因子參與。
趨化因子起著抑制HIV進入靶細胞(巨噬細胞和T細胞)的作用。另一方面，也有報道表明趨化因子加速巨噬細胞中HIV的復制。已知IL-16能抑制HIV的轉錄過程，但認為顯示出這種作用需要極高的濃度。雖然已進行努力來開發(fā)這些化合物作為AIDS治療藥物，但它們沒有一種達到實際應用階段。另一方面預計存在一些尚未確定的抗-HIV因子可抑制HIV的轉錄過程。然而，只要這些因子還未確定，它們的作用機制就仍然是需要探索的。
以下總結用迄今已報道的具有HIV抑制活性的生物起源的因子所測定的對HIV復制的抑制率。
(1)RANTES(MW＝7,851)用PM1細胞和HIV-1VBaL毒株系統(tǒng)；在0.78ng/ml(＝0.1nM)時5％，1.56ng/ml(＝0.2nM)時50％；和在3.12ng/ml(＝0.4nM)時90％(Cocchi，F(xiàn).等人，Science 2701811-1815(1995)](2)MIP-1α(MW＝7,717)在采用上述RANTEA相同的系統(tǒng)中；3.12nm/ml時0％；6.25ng/ml(＝0.8nM)時5％；和12.5ng/ml(＝1.6nM)時50％[Cocchi，F(xiàn).等人，同上]。
(3)MIP-1β(MW＝7,819)在采用上述RANTES相同的系統(tǒng)中；0.78ng/ml時0％；1.56ng/ml(＝0.2nM)時5％；3.12ng/ml(＝0.4nM)時15％；和6.25ng/ml(＝0.8nM)時60％[Cocchi，F(xiàn).等人，同上](4)IL-16(MW＝12,422)對活躍的四聚體分別為40～70ng/ml(～1nM)時61％；400～700ng/ml(＝10nM)時76％；對單體在20μg/ml時為50％[Baier，M.等人，Nature 378563(1995)，Amiel，C.等人，J.Infect.Dis.17983-91(1999)]。
(5)MDC(MW＝7,936)在25ng/ml(＝3.15nM)時20％；50ng/ml(＝6.3nM)時50％和在200ng/ml(＝25nM)時78％[Pal.R.等人，Science 278695-698(1997)]。
(6)SDF-1(MW＝8,698)當測定病毒滲透的抑制率時，在500ng/ml(＝57.5nM)時30％，在1μg/ml(＝115nM)時60％；當測定病毒復制的抑制率時，700μg/ml(＝80.5nM)時為80-85％[Oberlin，E.等人，Nature 382833-835(1996)]。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了逆轉錄酶抑制劑(其抑制原病毒的形成)和蛋白酶抑制劑(抑制病毒顆粒的成熟)在AIDS的治療中的實際用途。因此，現(xiàn)已可以商品購得6種核苷酸-為基礎的逆轉錄酶抑制劑、2種非-核苷酸-為基礎的逆轉錄酶抑制劑和5種蛋白酶抑制劑。已可以使用3種藥物聯(lián)合治療(HAART高活性抗逆轉錄病毒治療)，其聯(lián)用這些藥物中的3種(通常為2種逆轉錄酶抑制劑和1種蛋白酶抑制劑)，這使得可能將血液中的病毒水平降低至可檢測水平之下。
然而，即使是如此三種藥物聯(lián)合治療也不能完全消滅感染個體中的病毒。因此，為了防止AIDS的發(fā)展，那些HIV感染個體不得不在他們的一生中服用這些藥物。為了有效，必須大劑量服用這些藥物，而且這些藥物的服用時間表是嚴格固定的。有時候按預定的安排表服用藥物有困難，將導致順應性差并降低了治療效果。另外，這些藥物經常會引起嚴重的副作用。
另一方面，在HIV中發(fā)生突變相當頻繁。因此在用一種藥物治療幾個月后就會出現(xiàn)耐藥病毒株。而且當中斷該藥物治療時，這種耐藥病毒迅速復制，從而使得恢復該藥物治療時藥物失效。另外，對某藥物有抗性的病毒通常也會獲得對其它抗-HIV藥物(作用機制相同的藥物)的多藥物抗性。因此為了阻止AIDS發(fā)展并對其進行治療，關鍵是要防止耐藥HIV的產生。為此目的，同時抑制HIV生命周期的多個階段是非常重要的。因此，需要新型的藥物來抑制現(xiàn)有抗-HIV藥物作用的不同階段的HIV復制。在這一方面，預計CD8-陽性細胞所產生的一些體液因子可作為新型AIDSA治療藥物的潛在化合物，因為雖然這些因子的作用機制未知，但它們在抑制HIV的復制中起著顯著作用。
如果在AIDS的治療過程中出現(xiàn)嚴重的副作用或耐藥性HIV，就需要改變所給予的藥物。然而，至今選擇的余地極小。因此，需要與那些已知的常規(guī)藥物作用機制不同的抗HIV藥物，來擴大AIDS治療的選擇范圍并避免耐藥性HIV問題。
在這種情況下，本發(fā)明的目的是提供一種新型的抗HIV藥物，它的作用機制與目前臨床所用的或正開發(fā)的那些藥物不同。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者從受HIV感染的人中分離得到一株CD8-陽性細胞，并利用HTLV-1使它們無限增殖和克隆了它們，然后純化得到一種在細胞上清液中表現(xiàn)出抗HIV活性的未知因子，并對其結構和功能進行了檢驗。結果，發(fā)現(xiàn)該因子是高分子量尿激酶-類型的血纖蛋白溶酶原激活劑的氨基末端片斷(ATF氨酸末端片斷)。還發(fā)現(xiàn)(1)該因子以令人驚訝低的濃度(0.74ng/ml)表現(xiàn)出抗HIV活性，(2)對巨噬細胞-嗜性和T-細胞嗜性HIV毒株都有效，和(3)該因子可能抑制HIV生命周期中病毒mRNA翻譯階段以后的階段，具體是病毒顆粒裝配或出芽階段。雖然ATF具有特異性結合細胞表面CD87的性能，但采用健康人的尿激酶發(fā)現(xiàn)它也具有抗HIV活性，它是高分子量尿激酶類型血纖蛋白溶酶原激活劑(HMW-uPA)，已知其含有分子末端的ATF部分并且是CD87的配體分子。此外，已證實通過降解健康人尿激酶得到的ATF也具有抗HIV活性。而且發(fā)現(xiàn)抗CD87抗體具有ATF樣抗HIV活性，ATF的抗HIV活性由作為抗CD87抗體靶子(即CD87)的同一靶分子所介導。這些發(fā)現(xiàn)顯示有可能通過將潛在的HIV宿主細胞上的CD87與一種特異性結合配體分子(如ATF、HMW-uPA或它們的片段或類似物)接觸，阻斷CD87而抑制HIV的復制。
因此本發(fā)明提供了一種抗-HIV藥物，其包括作為活性成分的一種結合CD87的配體分子。這種配體是例如高分子量尿激酶類型血纖蛋白溶酶原激活劑。另外，這種配體分子可以是高分子量尿激酶類型血纖蛋白溶酶原激活劑的片段或類似物，其具有對CD87特異性結合親和力的片段或類似物。另外，此種配體分子可以是高分子量尿激酶-類型血纖蛋白溶酶原激活劑的氨基末端片斷(ATF)和具有對CD87特異性結合親和力的ATF的片段或類似物。此種配體分子的其它例子包括抗CD87抗體(單克隆或多克隆)以及具有對CD87特異性結合親和力的抗CD87抗體的片段或類似物。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含作為活性成分的能結合CD87的配體分子。這些配體的分子的例子如上所述。在這些配體分子中，特別優(yōu)選ATF和其具有CD87特異性結合親和力的片段或類似物。
本發(fā)明還提供了一種篩選抗-HIV藥物的方法，包括分別使待測試的化合物接觸CD87，并從這些化合物中選出能特異性結合CD87的化合物。
本發(fā)明還提供了一種制備抗-HIV藥物的方法，包括如下步驟分別使待測試的化合物與CD87接觸，從這些化合物中選出能特異性結合CD87的化合物，證實所選出的化合物具有抗-HIV活性，并將這種已證明具有抗HIV活性的化合物作為抗-HIV藥物以給予人的藥物制劑形式提供。
本發(fā)明還提供了一種篩選抗HIV的藥物的方法，包括如下步驟提供一種含有受HIV慢性感染細胞和未感染細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，將已知濃度的待測試化合物加到此共培養(yǎng)系統(tǒng)中后分別進行共培養(yǎng)，測定釋放到共培養(yǎng)上清液中的HIV顆粒的量，將測得的HIV顆粒的量與不加任何測試化合物進行共培養(yǎng)的上清液中釋放的HIV顆粒的量進行比較，并根據(jù)比較的結果選出顯示能抑制HIV顆粒釋放的測試化合物作為抗HIV藥物。
本發(fā)明還提供了一種制備抗-HIV藥物的方法，包括如下步驟提供一種含有HIV慢性感染細胞和未感染細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，將已知濃度的待測試化合物加到此共培養(yǎng)系統(tǒng)中后分別進行共培養(yǎng)，測定釋放到共培養(yǎng)上清液中的HIV顆粒的量，將測得的HIV顆粒的量與不加任何測試化合物進行共培養(yǎng)的上清液中釋放的HIV顆粒的量進行比較，根據(jù)比較的結果篩選出顯示能抑制HIV顆粒釋放的測試化合物作為抗HIV藥物，并將此抗HIV藥物以給予人的藥物制劑形式提供。
本發(fā)明還提供了一種方法，來治療HIV感染的人以抑制人體內HIV的復制，該方法包括給予人HIV復制抑制量的能結合CD87的配體分子。這種配體分子的例子如上所述。
本發(fā)明還提供了將能結合CD87的配體分子用于制備一種藥物組合物來抑制HIV感染者體內的HIV復制的用途。這些配體分子的例子如上所述。
附圖簡述

圖1顯示了尿激酶-類型血纖蛋白溶酶原激活劑和ATF的一級結構。
圖2顯示了pSEAP-Basic的結構。
圖3顯示了pSEP7的結構。
圖4顯示了pSBR的結構。
圖5顯示了pNL4-3的結構和PCR擴增的區(qū)域。
圖6顯示了pSBR-HIV的結構。
圖7顯示了羥基磷石灰柱洗脫組分的抗HIV活性和相應于這些組分的蛋白質濃度。
圖8顯示了羥基磷石灰柱洗脫組分的SDS/PAGE電泳圖譜。
圖9顯示了加樣人尿激酶材料的HiPrep Sephacryl S-100柱洗脫組分的抗HIV活性和這些組分相應的蛋白質濃度。
圖10顯示了加樣人尿激酶材料的HiPrep Sephacryl S-100柱洗脫組分電泳圖譜。
圖11顯示了共培養(yǎng)物(T細胞系)的抗-HIV活性實驗結果(p17)。
圖12顯示了共培養(yǎng)物(巨噬細胞細胞系)的抗-HIV活性實驗結果(p17)。
圖13顯示了非感染細胞(MC141)培養(yǎng)物的SEAP報道子實驗結果。
圖14顯示了非感染細胞(CL35)培養(yǎng)物的SEAP報道子實驗結果。
圖15顯示了用感染性HIV-DNA進行瞬時轉染實驗的結果。
圖16顯示了用慢性感染的細胞(U1)進行單-培養(yǎng)實驗的結果。
圖17顯示了在急性感染后的幾天內HIV數(shù)量的曲線圖。
圖18的一組圖分別顯示了感染后的不同天時ATF對病毒復制的抑制。
圖19顯示了在T細胞系中抗CD87抗體對ATF的抗HIV活性的影響。
圖20顯示了在巨噬細胞系中抗CD87抗體對ATF的抗HIV活性的影響。
發(fā)明詳述CD87(一種CD抗原)是無細胞內結構域的一種膜蛋白，屬于GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定類家族。它在細胞如T細胞和單核細胞(包括巨噬細胞)的表面表達。已知這種蛋白質對尿激酶原以及高分子量的尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑具有高親和力，其作用是作為這些細胞如T細胞和單核細胞表面上的受體。首先，合成由氨基酸1-335構成的原形式的人CD87，然后加工從其切下信號肽部分(氨基酸1-22)，再切下羧基末端氨基酸(306-335)。在如此產生的羧基末端(305Gly)上加一個糖脂(GPI)，通過該糖脂將此蛋白質固定在細胞膜上。在CD87中，與配體分子(如尿激酶原和高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑)結合中起主要作用的是N-末端結構域1(CD87的氨基酸1-92)[Seki等人，Seikagaku，71(5)350-352(1999)]。
在本發(fā)明中，術語“結合于CD87的配體分子”指任何能特異性結合CD87的化合物，包括(但不限制于)列舉的多肽/蛋白質如尿激酶原、高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑、ATF和抗CD87抗體以及它們的具有特異性結合CD87能力的片段或類似物，還包括任何其它具有特異性結合CD87能力且可以給予患者的化合物。
HIV可分成HIV-1和HIV-2兩亞型。HIV-1和HIV-2都是通過出芽而從宿主釋放出的病毒類型，且它們在遺傳學上幾乎難以區(qū)分。它們具有相同的生命周期而且以相同的方式復制。因此，就抗HIV的藥物而言無需將它們彼此區(qū)分開來，而且實際上用常規(guī)抗-HIV藥物治療時它們通常也被視為相等的。在本說明書中(除非特別指出)，術語“HIV”包括“HIV-1”和“HIV-2”。
高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑(HMW-μPA)(圖1(b)氨基酸21-178+氨基酸179-431)是由二硫鍵連接起來的兩條肽鏈構成的蛋白質。通過在尿激酶原的氨基酸178和179之間的酶促切割形成這兩條鏈，長A和B，即通過除去稱為尿激酶原(sc-uPA)(圖1(a)；氨基酸1-431)的單鏈蛋白質中的N-端信號肽(氨基酸1-20)而形成。HMW-uPA包括EGF樣結構域、Kringle結構域和尿激酶受體(CD87)結合結構域。
然后體內在氨基酸155和156之間切斷HMW-uPA，從而得到低分子量的尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑(LMW-uPA)(圖1(c)氨基酸156-178和氨基酸179-431)和無血纖蛋白溶酶原激活劑活性的氨基末端片斷(ATF)(圖1(d)氨基酸21-155)。在用如磷酸鹽緩沖鹽水(pH8)培育過程中還在氨基酸155和156之間發(fā)生切割。因此，通過在緩沖液(25-37℃)中簡單培育HMW-uPA可產生ATF。ATF包括EGF樣結構域、Kringle結構域和HMW-uPA的尿激酶受體(CD87)結合結構域。在序列表中，分別以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2列出了編碼sc-uPA的核苷酸序列及其氨基酸序列。在SEQ ID NO1和NO2所示的序列中，氨基酸1-20相應于信號肽、氨基酸21-431相應于尿激酶原、氨基酸21-431(在氨基酸178和179間有切割)相應于HMW-uPA、氨基酸21-155相應于ATF、和氨基酸156-431(在氨基酸178和179間有切割)相應于LMW-uPA。
巨噬細胞嗜性HIV引起HIV在人與人之間的傳播。感染后隨著時間的推移，感染人體中出現(xiàn)了T細胞嗜性HIV，認為這是預后不良相關因素。T細胞和巨噬細胞上出現(xiàn)CD87，且ATF抑制HIV感染的T細胞和巨噬細胞中的HIV復制(通過抑制這些細胞釋放HIV)。這意味著感染后無論時間的推移，ATF將作為抗-HIV藥物有效地起作用。此外，即使在很低濃度(0.74ng/ml)ATF也有效。因此，給予患者的ATF的量將少于常規(guī)抗-HIV藥物。這可能減少病人因服藥所產生的心理負擔。N端包含ATF的HMW-uPA也具有抗HIV活性，雖然比ATF弱些，但可以與ATF相同的方式使用。無論是某完整的主體分子還是自主體上切下產生的ATF形式，一旦給予受感染患者，預計HMW-uPA將表現(xiàn)出抗HIV活性。另一方面，能抑制HIV感染T細胞中HIV復制的抗CD-87抗體可用于抑制感染后出現(xiàn)T細胞嗜性HIV后的HIV復制。
以下所述的測試結果表明作為本發(fā)明的抗-HIV藥物活性成分之一的ATF，能抑制病毒mRNA翻譯以后階段的病毒生命周期(尤其是病毒顆粒裝配或出芽的階段)，這是與已知的其它抗-HIV藥物不同的作用機制。ATF不影響宿主細胞的生長，因此不表現(xiàn)出細胞毒性癥狀。所以當ATF與常規(guī)抗-HIV藥物聯(lián)合使用時，將使感染患者的HIV復制動力學平衡朝有益于患者的方向移動，同時較易避免耐藥病毒的產生和副作用問題，從而為AIDS提供改進的治療方法。
<天然的ATF和重組ATF>
在本發(fā)明中，可以從例如健康人尿中得到的尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑制備ATF[Stoppelli，P.M.等人，Proc.Natl.Acacd.Sci.USA，824939-4943(1985)]。例如，在含有0.2M氯化鈉的50mM磷酸鹽緩沖鹽水(pH8)中培育HMW-uPA8小時或更久，將反應產物進行凝膠過濾(如Sephadex G-100)。通過將相應于UV吸收曲線最后峰的洗脫組分與相應于先前峰(即峰1(HMW-uPA)和峰2(LMW-uPA))的組分分開，得到ATF?？蓪⒑蠥TF的組分加樣于離子交換層析柱(如Mono S HR5/5柱；50mM乙酸鈉緩沖液，pH4.8，氯化鈉梯度為0-1.0M)上進行進一步的純化。
也可將編碼ATF的DNA摻入適當?shù)牟《据d體中，然后用此載體轉化合適的宿主細胞(如大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞)，也可產生呈重組肽的ATF。天然形成的ATF沒有糖鏈，用編碼天然ATF的cDNA轉化細胞產生的重組ATF具有相同的結構，因此具有與天然ATF相同的活性?？梢灾苽渚哂刑禺愋越Y合CD87能力的ATF或HMW-uPA的片斷或模擬肽，例如通過部分修飾ATF或HMW-uPA，例如通過從它們的分子末端除去或加入一個或多個氨基酸殘基，或取代一個或多個不同的具有類似化學特性的氨基酸殘基。雖然這些加工是以化學方式進行的，但這比用已知方法將預定的突變引入編碼TFA或尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑的cDNA中要容易得多。
<篩選配體分子的方法>
可以用表面攜帶有CD87的細胞(T細胞、巨噬細胞)進行本發(fā)明的篩選抗-HIV藥物的方法，該方法包括分別將待測試的化合物與CD87接觸，并從這些化合物中篩選出能特異性結合CD87的化合物。測試化合物與CD87的特異性結合可以通過用本領域已知的檢測配體分子與其受體特異性結合的方法進行檢測。例如，將待測試的化合物與重組方法產生的CD87混合，培育然后與抗CD-87抗體進行免疫沉淀。通過測定該化合物的共沉淀，可以評估特異性結合的發(fā)生。
參考以下的實施例，可實施本發(fā)明的篩選抗HIV藥物的方法，該方法包括如下步驟提供一種含有HIV慢性感染細胞和未感染細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，將已知濃度的待測試化合物加到此共培養(yǎng)系統(tǒng)中后分別進行共培養(yǎng)，測定釋放到共培養(yǎng)上清液中的HIV顆粒的量，將測得的HIV顆粒的量與不加任何測試化合物進行共培養(yǎng)的上清液中釋放的HIV顆粒的量進行比較，根據(jù)比較的結果挑選出顯示能抑制HIV顆粒釋放的測試化合物作為抗HIV藥物。對選擇用于測定上清液中HIV顆粒量的細胞和方法而言，無需局限于本發(fā)明實施例中所公開的細胞和方法，本領域技術人員可以選擇任何所需的材料和方法，只要它們適用于本發(fā)明的目的。
通過腸胃外途徑如注射或植入以及經鼻或經肺給藥，將本發(fā)明的抗-HIV藥物給予HIV感染患者。當本發(fā)明的抗-HIV藥物以注射形式制備時，可以將制劑制備成適用于例如靜脈內、腹腔內、肌內或皮下注射用的。對注射而言，本發(fā)明的抗-HIV藥物可以無菌、水溶液或非水溶液、懸浮液或乳劑的形式提供。水性介質的例子包括水和一種或多種藥學上可接受的惰性溶劑(如鹽、多糖多元醇)的水溶液?？梢杂盟帉W上可接受的緩沖液將它們的pH值調節(jié)至合適的范圍內。這些水性介質的例子包括(但不限制于)氯化鈉溶液、Ringer-葡萄糖溶液、葡萄糖溶液和乳酸Ringer溶液。為了改善制劑保存期中的穩(wěn)定性，可以將其冷凍干燥。
對注射用制劑的非水性介質而言，可以使用任何腸胃外給藥常規(guī)使用的非水性介質，例如多元醇如甘油和丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油、豆油、菜籽油)、有機酯如油酸乙酯。
當將本發(fā)明的抗-HIV藥物以植入物形式使用時，可采用任何緩釋載體，以建立所用CD87配體分子如ATF的持久釋放。優(yōu)選使用能減少給予配體分子頻率和/或劑量的載體，以簡化給藥和提高或延長效果。這些載體的例子包括(但不限制于)脂質體、微球體和由天然或合成聚合物制成的微型膠囊。另外，適用于在大部分環(huán)境中延長和緩釋的載體例子包括明膠、阿拉伯樹膠、黃原膠聚合物、聚乳酸、聚羥乙酸和乳酸/聚羥乙酸共聚物。
經鼻或經肺給藥(吸入法)是特別有效的減少患者因給藥方法的負擔的給藥方法。在經鼻或經肺給藥(吸入法)中，本發(fā)明的抗HIV藥物可以任何適合于噴霧和吸入的小顆粒形式，如溶液或粉末。這種制劑的例子包括CD87配體分子(如ATF)和載體(顆粒直徑小于10μm)的混合物組成的干粉。用于此目的的載體的例子包括單糖如葡萄糖和果糖，雙糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖，多糖如淀粉、纖維素、透明質酸、殼多糖和殼聚糖，糖醇如山梨糖醇和甘露醇，有機結合劑如纖維素衍生物如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素和羥乙基纖維素以及聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇、非離子表面活性劑，蛋白質如明膠和酪蛋白，和合成的聚合物如聚乙二醇。用于經鼻或經肺給藥的其它制劑例子是懸浮于碳氟推進劑中的CD87配體分子如干ATF。
在本發(fā)明中，感染患者每份體重的抗-HIV藥物中活性成分的劑量ATF約為10μg-10mg/kg/天，HMW-uPA 10μg-10mg/kg/天和抗-CD87抗體10μg-10mg/kg/天。
實施例通過以下的實施例進一步描述本發(fā)明。但這些實施例對本發(fā)明并無任何限制。
以下列出了用于純化、鑒定ATF和測定ATF、HMW-uPA和抗-CD87抗體的抗HIV活性所用的材料和方法。
<材料>
1)質粒(i)pNL4-3使用由NIH AIDS研究和參考試劑程序分類號No.114保存的質粒(圖5)。該質粒是將從一位HIV-1感染者基因組分離出的HIV-1原病毒基因組DNA摻入pUC18質粒載體構建的[Adachi，A.等人，J.Virol.，59(2)284-291(1986)]。用此質粒轉染細胞將使該細胞產生感染性HIV-1病毒。
(ii)pSBR-HIV這是一種將pNL4-3的LTR區(qū)域作為啟動子摻入到pSEAP-Basic基礎質粒(CLONTECH，Palo Alto，CA，USA)中位于其報道基因(即分泌型堿性磷酸酶(SEAP)基因)上游，并進一步摻入潮霉素抗性基因作為選擇標記物而構建的質粒。
按如下流程制備此質粒(a)用Notl和SalI消化pSEAP-Basic(圖2)(CLONTECH)，切下包括SEAP基因的區(qū)域(圖2中以弓弧顯示)，并用T4聚合酶將其NotI位點加工成鈍端。
(b)分別用SalI和ClaI消化pREP7(圖3)(INVITROGEN，9704CH，Groningen，the Netherlands)，切下包括潮霉素抗性基因(潮霉素)、ColE1和氨芐青霉素抗性基因(Amp)的區(qū)域(圖3中以弓弧顯示)，并用T4聚合酶將其ClaI位點加工成鈍端。
(c)將上述(a)得到的片斷與(b)得到的片斷連接，構建pSBR(圖4)。
(d)分別用包含XhoI或HindIII位點的引物，PCR擴增pNL4-3的HIV-LTR(圖5)，用XhoI和HindIII消化PCR產物，和(e)用HindIII消化上述(c)得到的pSBR，然后插入到步驟(d)得到的消化產物HIV-LTR中，構建pSBR-HIV(圖6)。
如上所述，構建的pSBR-HIV可作為一種類型質粒的例子，這類質粒具有作為啟動子的HIV-LTR并表達報道子基因(在該實施例中為SEAP)。也可構建其它質粒，其同樣具有作為啟動子的HIV-LTR并能表達合適的報道基因。
2)細胞(i)HUT.78使用由NIH AIDS研究和參考試劑程序分類號No.89保藏的細胞。這是從一位患有賽塞利綜合癥(一種慢性皮膚淋巴瘤)患者的外周血建立的一株CD4-陽性T細胞系。在含有10％FCS(Gibco/BRL)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞。
(ii)U937使用ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)保藏的細胞(分類號No.CRL-1593.2)和國立健康科學研究院(日本)保藏的細胞(JCPB分類號No.9021)。這是從一位患有真組織細胞性淋巴瘤患者的腹水建立的一株CD4-陽性成單核細胞系。用含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞。
(iii)TALL-1購得國立健康科學研究院(日本)保藏的細胞JCPB分類號No.0086)。這是從一位患有急性淋巴細胞白血病患者的外周血建立的一株CD4-陽性T細胞系。用含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞。
(iv)T4/NL4-3用pNL4-3轉染TALL-1細胞產生此細胞系。這是一株HIV-1慢性感染的細胞系。用含有10％FCS和5μM AZT的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞。
(v)U1從NIH AIDS研究和參考試劑程序購得其保藏的細胞(分類號NO.165)。這是一株巨噬細胞-嗜性HIV-1慢性感染的細胞系，通過用一位HIV-1感染者的外周血分離出的臨床HIV-1菌株感染U937細胞產生的[Chen，B.K.，等人，J.Virol.，68(2)654-660(1994)]。用含有10％FCS和5μM AZT的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞。
(vi)MC141通過用pSBR-HIV轉染HUT.78細胞，將HIV-LTR-SEAP報道基因引入HUT.78細胞產生此細胞系。這是一直表達SEAP的一種轉染子。在含有10％FCS和300μg/ml潮霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞。
(vii)CL-35此細胞系是一種一直表達SEAP的轉染子，是通過用pSBR-HIV轉染U937細胞將HIV-LTR-SEAP報道基因引入U937細胞產生的。用含有10％FCS和300μg/ml潮霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞。
(viii)克隆#62首先從一位HIV-1感染的長期無癥狀病史的日本患者的外周血中分離出CD8-陽性T細胞，用包被有抗CD8抗體的磁性小珠進行陽性篩選，并使得到的細胞與等量的產生HTLV-1的T細胞系(MT-2)(100拉德照射)接觸，最后在培養(yǎng)1個月以后用有限稀釋法克隆，獲得無限增殖的此克隆。此克隆培養(yǎng)物的上清液表現(xiàn)出強SHIF(可溶性的HIV復制抑制因子)活性。將這些細胞在含有15％FCS、10單位/ml IL-2和10％PBMC(人外周血單個核細胞)條件培養(yǎng)液的RPMI1640培養(yǎng)基中傳代保持。
(ix)PBMC這是用Ficoll-Plaque(Amersham Pharmacia)從鮮血者的血液白細胞層(buffy coat)純化得到的。在用作條件培養(yǎng)液之前，在含有3μg/ml PHA、1單位/ml IL-2和10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天，用相同的但無PHA的培養(yǎng)液替換后再培養(yǎng)6天。
<制備CD8-陽性克隆培養(yǎng)物的上清液>
用含有5％FCS和10單位/ml IL-2的PM1000培養(yǎng)基[Eiken Kagaku]替代RPMI1640培養(yǎng)液后，將原在RPMI1640培養(yǎng)液中保持傳代的克隆#62培養(yǎng)3-4天。收集一半培養(yǎng)液，加入相同量的新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)此細胞培養(yǎng)。用0.22μm膜過濾收集的上清液，以除去任何沉淀物，-80℃保存。
<抗-HIV活性的測定>
1)共培養(yǎng)試驗在共培養(yǎng)試驗中，培養(yǎng)由HIV慢性感染細胞系的細胞和未感染細胞系的細胞構成的細胞混合物。這提供了包括病毒生命周期所有階段的一種測試系統(tǒng)，包括未感染細胞上病毒的吸附、感染、感染細胞中病毒的復制和病毒顆粒的釋放。因此，用這種共培養(yǎng)系統(tǒng)，通過測定細胞釋放出的病毒量并將存在或不存在測試化合物這兩種情況下測得的值相比較，可以檢測某給定測試化合物的抗病毒活性，而不論該化合物作用于何階段的病毒。另外，聯(lián)用T細胞系(HUT.78和T4/NL4-3)或巨噬細胞系(U1和U937)作為HIV慢性感染細胞和未感染細胞，可分別評估測試化合物對T細胞嗜性HIV和巨噬細胞嗜性HIV的抗HIV活性。
測試流程將300μl用PM1000培養(yǎng)液稀釋的樣品和100μl含有6ng/mlTNFα和20％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液置于48孔板上。在其中加入100μl用OPTI-MEM I培養(yǎng)液調節(jié)至2×105個細胞/ml的HUT.78細胞，和100μl(5×104個細胞/ml懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中)的T4/NL4-3細胞(感染的T4/NL4-3未感染的HUT.78＝1∶4)，培養(yǎng)此混合物3天。然后用含有相同濃度樣品的新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。收集培養(yǎng)6天的上清液，測定病毒(p17)的數(shù)量和HIV-LTR轉錄物(SEAP)的量。在測定中，按制造商的說明使用HIV p17抗原ELISA試劑盒(Eiken Kagaku)和SEAP報道基因試驗化學發(fā)光試劑盒(ROCHE)。在已培養(yǎng)6天的細胞中加入50μl MTS分析試劑(水溶性的四唑鹽)(PROMEGA)。再培養(yǎng)此混合物4小時讓顏色顯色，在490nm測定光密度，其代表測試時活細胞的數(shù)量。
用相同的方法，測定由U1(慢性感染細胞系)和U937(未感染細胞系)(U1∶U937＝1∶4)構成的另一共培養(yǎng)系統(tǒng)。
2)慢性感染的細胞的單培養(yǎng)試驗為了收集ATF抑制HIV生命周期的哪個階段的信息，作為觀察抗HIV總活性的基礎，測試了在慢性感染的U1細胞構成的單培養(yǎng)系統(tǒng)中ATF的抗HIV活性。因為已知在U1細胞中不發(fā)生HIV的多重感染，故在U1細胞的單培養(yǎng)系統(tǒng)中任何檢測到的抗HIV活性即提供證據(jù)，表明ATF在HIV原病毒DNA轉錄階段或之后的階段起作用。
測試流程將300μl用PM1000培養(yǎng)液稀釋的樣品和200μl含有6ng/mlTNFα和15％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液置于48孔板上。在其中加入100μl用OPTI-MEM I培養(yǎng)液調節(jié)至2×105個細胞/ml的慢性感染的細胞(U1)，培養(yǎng)此混合物3天。然后用含有相同濃度樣品的新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。收集培養(yǎng)6天的上清液，測定病毒(p17)的數(shù)量。
3)用感染性HIV-DNA瞬時轉染通過用脂質體強制性地將病毒DNA引入細胞，可以人工地將感染性HIV-DNA置于其進入核的階段。用此系統(tǒng)，可以檢驗其給定的測試化合物對HIV生命周期比滲入宿主細胞更后階段的抑制活性。
測試流程將4μg感染性HIV-1 DNA(pNL4-3)和10μl DMRIE-C試劑(GIBCO/BRL)混合。用此混合物轉染2×106MC141細胞。24小時后，收集細胞并用OPTI-MEM I培養(yǎng)液將它們的密度調節(jié)至2×105個細胞/ml。將300μl用PM1000培養(yǎng)液稀釋的樣品和200μl含有6ng/ml TNFα和15％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液置于48孔板上。在其中加入100μl轉染的MC141細胞(2×105個細胞/ml)，培養(yǎng)此混合物3天。然后用含有相同濃度樣品的新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)4天。收集轉染后8天的上清液，測定病毒(p17)的數(shù)量和HIV-LTR轉錄物(SEAP)量。
4)未感染細胞中的SEAP報道子試驗用TNFα刺激已摻入了HIV-LTR-SEAP報道基因的HIV-未感染的細胞(MC141細胞和CL35細胞)，觸發(fā)了HIV啟動子LTR的活化，導致?lián)饺朐搯幼酉掠蔚姆置谛蛪A性磷酸酶(SEAP)基因表達。因此，可用這些細胞來檢驗某給定的測試化合物是否在HIV生命周期的原病毒轉錄階段表現(xiàn)出抑制活性，而不HIV的實際復制。通過測定培養(yǎng)上清液中SEAP的量可確定HIV-LTR轉錄活性的程度。
測試流程將50μl用無血清PM1000培養(yǎng)基稀釋的樣品和25μl含有6ng/mlTNFα和15％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液置于96孔板上。然后用以OPTI-MEM I培養(yǎng)液(GIBCO/BRL)配制的2×105個細胞/ml密度的25μl MC141細胞或C135細胞接種此板。分別用和不用ATF培養(yǎng)這些細胞，收集6天培養(yǎng)物的上清液，用SEAP報道基因試驗化學發(fā)光試劑盒(ROCHE)測定其中所含有的SEAP的量。
5)測定急性感染中對HIV復制的抑制活性(轉染試驗)將4μg感染性HIV-1 DNA(pNL4-3)和10μl DMRIE-C試劑(GIBCO/BRL)混合，用此混合物轉染2×106個HUT.78細胞。24小時后，收集細胞并用OPTI-MEM I培養(yǎng)液洗滌，密度調節(jié)至2×105個細胞/ml。將300μl用含有逐步稀釋樣品或緩沖液的PM1000培養(yǎng)液和200μl含有6ng/ml TNFα和15％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液置于48孔板上。在其中加入100μl轉染的HUT.78細胞(2×105個細胞/ml)，培養(yǎng)此混合物4天。然后收集一半培養(yǎng)液，用含有相同濃度樣品或緩沖液的新鮮培養(yǎng)基替換。感染后培養(yǎng)繼續(xù)12天，此期間每4天重復取樣和替換一半培養(yǎng)液。
一式兩份進行試驗(n＝2)，用HIV p17抗原ELISA試劑盒(Eiken Kagaku)測定了培養(yǎng)上清液中病毒的數(shù)量。
6)研究抗CD-87抗體對ATF的抗HIV活性的影響因為已知ATF和HMW-uPA都能特異性結合細胞表面上的CD87，故預計ATF和HMW-uPA所觀察到的抗HIV活性是通過它們與CD87的結合而介導的。為了驗證這一預計，進行了確定抗CD87抗體能否封阻ATF的抗HIV活性的研究。
測試流程將300μl用PM1000培養(yǎng)液(#3936AMERICAN DIAGNOSTICAINC.)稀釋的抗CD87單克隆抗體和100μl含有6ng/ml TNFα和20％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液置于48孔板上。在其中加入100μl用OPTI-MEM I培養(yǎng)液調節(jié)至2×105個細胞/ml密度的MC141細胞，和100μl(5×104個細胞/ml懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中)的T4/NL4-3細胞，培養(yǎng)此混合物2小時(此抗體的終濃度為10μg/ml)。2小時后，加入12μl含有ATF的樣品(ATF的終濃度約為3.3ng/ml)。培養(yǎng)3天后，用含有相同濃度抗體和樣品的新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。收集培養(yǎng)6天的上清液，測定其中所含病毒(p17)的數(shù)量。作為對照，分別用不含抗體或不含ATF或不含這兩者的培養(yǎng)液，和含有非特異性IgG替代抗CD87抗體的培養(yǎng)液進行類似的培養(yǎng)。
用相同的方法，用由感染的U1和未感染的C135細胞(U1∶CL35＝1∶4)組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)進行了研究。
<具有抗HIV活性的因子的制備>
除非特別指出，以下純化的整個過程都是在4℃進行的。
1)首先，將1N鹽酸加到上清液中，將上清液的pH調節(jié)至2.5，然后將此上清液在4℃中靜置24小時。經過如此處理后，消除了病毒感染的潛在危險，而且使富含的干擾素γ失活。然后加入1N氫氧化鈉溶液，將混合物的pH調節(jié)至3.8。將500ml經過pH處理的培養(yǎng)上清液加到SP瓊脂糖高效(AMERSHAMPHARMACIA)柱(26mm×10cm)上，該柱已用含有50mM氯化鈉的25mM乙酸緩沖液(pH 3.8)平衡。用175ml相同緩沖液洗滌后，用175ml 50mM HEPES/NaOH緩沖液(pH 7.4)(E1)洗滌后，用175ml含有250mM氯化鈉的50mMHEPES/NaOH緩沖液(pH 7.4)(E2)洗脫。將緩沖液交換下的各組分通過NAP-5柱，測試其在50％濃度時的抗HIV活性。
2)在從SP瓊脂糖高效柱收集的E2組分中發(fā)現(xiàn)了活性。將氯化鈉加到兩批E2組分(相應于1L培養(yǎng)上清液)中，終濃度為500mM。將此溶液加到已用含有500mM氯化鈉的50mM HEPES/NaOH緩沖液(pH 7.4)平衡的Blue Sepharose6FF(AMERSHAM PHARMACIA)柱(26mm×10cm)上。用175ml相同緩沖液洗滌后，用200ml含有1.8M氯化鈉和0.1％CHAPS的50mM HEPES/NaOH緩沖液(pH 7.4)(E1)洗脫該柱。將此組進行分緩沖液交換通過NAP-5柱，測試其在33％濃度時的抗HIV活性。
3)在從Blue Sepharose 6FF柱上收集的E1組分中發(fā)現(xiàn)了活性。將該組分加到已用含1.8M氯化鈉和0.1％CHAPS(P)的50mM HEPES/NaOH緩沖液(pH7.4)平衡的HiPreP Butyl(丁基)4FF(AMERSHAM PHARMACIA)柱(16mm×10cm)上。用50ml相同緩沖液(W)洗滌后，用100ml 0.1％CHAPS/水(E)洗脫此柱。將此組分進行緩沖液交換通過NAP-5柱，測試其在33％濃度時的抗HIV活性。
4)在丁基瓊脂糖柱收集的非吸附組分(P和W)中發(fā)現(xiàn)了活性。將氯化鈉加到3批非吸附組分(相應于3L培養(yǎng)上清液)中，終濃度達到2M。將此溶液加到已用含有2M氯化鈉和0.1％CHAPS的50mM HEPES/NaOH緩沖液(pH 7.4)平衡的HiPreP Phenyl(HighSub)6FF(AMERSHAM PHARMACIA)柱(16mm×10cm)上。用175ml相同緩沖液洗滌后，用150ml含有250mM氯化鈉和0.1％CHAPS(E1)的50mM HEPES/NaOH緩沖液(pH 7.4)洗脫該柱，然后再用100ml0.1％CHAPS/水(E2)洗脫。將此組分進行緩沖液交換通過NAP-5柱，測試其在25％濃度時的抗HIV活性。
5)在收集的E1組分中發(fā)現(xiàn)了活性。將此組分加到已用含有0.1％CHAPS的10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.3)平衡的羥基磷石灰(CHT-2，20μm；BioRad)柱(10mm×10cm)上。用50ml磷酸鈉緩沖液(W)洗滌后，用含有0.1％CHAPS(E200)的200mM磷酸鈉緩沖液洗脫該柱。將此組分進行緩沖液交換通過NAP-5柱，測試其在25％濃度時的抗HIV活性。
6)在收集的羥基磷石灰(P)非吸附組分中發(fā)現(xiàn)了活性。用CentriPlus-10(MW10,000cut)超濾膜(AMICON MILLIPORE)將此組分濃縮約40倍。將濃縮的活性組分(3.75ml)加到已用含有0.1％CHAPS和5％甘油的10mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.4)平衡的HiPrep Sephacryl S-100HR(AMERSHAM PHARMACIA)柱(16mm×60cm)上。用144ml相同緩沖液洗脫該柱，收集各2.5ml洗脫液。將此組分進行緩沖液交換通過NAP-5柱，測試其在12.5％濃度時的抗HIV活性。
7)收集活性組分，然后用含有0.1％CHAPS的10mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.4)稀釋2倍，并加到已用相同緩沖液平衡過的Resource S(AMERSHAMPHARMACIA)柱(0.64×3cm)中。用10ml相同緩沖液洗滌后，用含有0.1％CHAPS和氯化鈉梯度為0-500mM(共25ml)的10mM磷酸鈉緩沖液洗脫該柱，收集各1ml洗脫液。測試這些組分在2.5％濃度時的抗HIV活性。
8)收集活性組分。用含有0.1％CHAPS的10mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.35)將3批Resource S活性組分(相應于9L培養(yǎng)上清液)稀釋2.5倍，并加到已用此緩沖液平衡過的羥基磷石灰(CHT-2，20μm；BioRad)柱(0.5×5cm)上。用5ml此緩沖液洗滌后，用含有0.1％CHAPS和梯度為10mM-400mM(pH6.35)(共25ml)的磷酸鉀緩沖液洗脫該柱，收集各0.5ml洗脫液。
測試了這些組分在1％濃度時的抗HIV活性。對各組分，用釋放到HIV慢性感染細胞系和未感染細胞系(1∶4)組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中的p17抗原的ELISA進行抗病毒活性的測定。
當樣品的濃度為5％或更高時，將樣品通過已用培養(yǎng)液平衡過(為了排除色層分析中過量鹽的影響)的NAP-5柱(AMERSHAM PHARMACIA)，進行緩沖液交換，換成無血清PM1000培養(yǎng)液。當樣品的濃度低于5％時，直接加樣，且將此層析柱空白跑樣得到的組分用作對照以消除層析過程中鹽的影響。
圖7和8顯示了結果。在圖7中，實心小方塊代表所測試組分的抗病毒活性，虛線代表洗脫液的UV吸收曲線，斜線分別代表相應于各組分磷酸鉀的濃度。圖8顯示組分8-19的SDS/PAGE電泳(還原條件)結果。如圖7和8所示，在表現(xiàn)出抗HIV活性的組分(以抑制p17釋放形式測定)中檢測到約18kDa的條帶。
9)收集活性組分，并用Centricon-10(MW10,000cut)超濾膜(MILLIPORE)濃縮15倍。為了濃縮羥基磷石灰柱兩批活性組分(相應于18L培養(yǎng)上清液)，加入三氟乙酸(TFA)至終濃度為0.2％，將此混合物加到已用0.2％三氟乙酸/水平衡過的Resource PRC柱(AMERSHAM PHARMACIA)(0.64×3cm)上。用5ml緩沖液洗滌后，用5ml梯度為0.2％TFA/30％乙腈的洗脫液洗脫該柱，然后用15ml梯度為0.2％TFA/50％乙腈的洗脫液洗脫，最后用5ml梯度為0.2％TFA/100％乙腈的洗脫液洗脫，收集各0.5ml洗脫液。在10℃進行反相柱層析。測定了0.2％濃度時的抗HIV活性。結果，在SDS/PAGE上也從Resource RPC柱得到的表現(xiàn)出抗HIV活性的各洗脫組分中檢測到18kDa條帶。
收集活性組分并減壓干燥得到約0.9μg(500pmol)的18kDa蛋白質。在活性試驗中，將該蛋白質溶于含有0.5％BSA和0.1％CHAPS的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。將用于測序的蛋白質溶解于SDS/PAGE樣品緩沖液中。
<氨基酸測序>
將一部分上述純化的18kDa蛋白質加到SDS/PAGE上，用考馬斯亮藍(CBB)染色，并切下相應的條帶。直接用胰酶消化所切下的凝膠片，并作肽圖。在測序儀上分析了獲得的3個峰的氨基酸序列。結果，發(fā)現(xiàn)存在如下內序列。
SEQ ID NO3所示的氨基酸序列(片斷1)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列(片斷2)SEQ ID NO5所示的氨基酸序列(片斷3)片斷1、2和3的氨基酸序列與尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑的氨基端片斷(ATF，也稱為“長A鏈)的序列相匹配。肽圖和氨基酸測序的結果表明上述純化的蛋白質是ATF。
<從尿激酶粗品材料純化ATF>
在該活性組分中，未檢測到相應于單鏈尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑、HMW-uPA或LMW-uPA的條帶。這強烈提示ATF表現(xiàn)出抗HIV活性。隨后本發(fā)明的發(fā)明者從人尿的尿激酶粗品材料制備了ATF并如下所述評估了它的抗HIV活性。
將4.5ml等量的Seishin Factory of JCR Pharmaceuticals Co.，Ltd生產的人尿尿激酶粗品材料(JUN-9604)，加到已用10mM(含有0.1％CHAPS和100mM NaCl)的磷酸鈉緩沖液(pH 6.4)平衡過的HiPrep Sephacryl S-100柱(16mm×60cm)上。用144ml此緩沖液洗脫此柱，收集各2.5ml洗脫液。測定1％濃度時的活性。
由分析結果發(fā)現(xiàn)上述尿激酶材料含有9∶1∶1比例的HMW-uPA、LMW-uPA和ATF。將這些組分通過HiPrep Sephacryl S-100柱，那些僅含有ATF(No.27-33)的組成表現(xiàn)出抗HIV強活性(抑制p17的釋放)(圖9和10)。這表明ATF具有抗HIV活性，如先前用可溶性、HIV復制抑制因子(從克隆#62上清液純化的)進行的測試所預計的一樣。
除了ATF的抗HIV活性外，還發(fā)現(xiàn)含有HMW-uPA(No.15-18)的組分具有抗HIV活性(p17)，雖然其弱于ATF(圖9和10)。
<ATF在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗HIV活性的試驗結果>
純化的ATF濃度依賴性地減少了由T細胞系或巨噬細胞系組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中存在的p17的量。濃度1.5ng/ml時抑制率約為40％(圖11和12)。由于加入ATF不改變培養(yǎng)的細胞的增殖速率(與對照相比)(圖11和12)，顯然ATF不影響細胞的增殖且無細胞毒性。這些發(fā)現(xiàn)表明ATF所觀察到的抗HIV活性不是因為某些類型細胞毒性，ATF在極低的濃度表現(xiàn)出抗HIV活性，且ATF表現(xiàn)出對T細胞嗜性HIV和巨噬細胞嗜性HIV基本相同的抗HIV活性。
<在未感染細胞的培養(yǎng)物中進行SEAP報道子試驗的結果>
見圖13和14。在MC141和CL35細胞單培養(yǎng)物中進行的SEAP報道子試驗中，ATF不影響兩類細胞培養(yǎng)上清液中堿性磷酸酶的量(圖13和14)。這表明ATF不抑制處于HIV-LTR促進的轉錄或其后翻譯階段的HIV的復制。在所述條件下，還證實了ATF不影響細胞的增殖速率(圖13和14)。
<用感染性HIV-DNA瞬時轉染的結果>
見圖15。同樣在用感染性HIV-DNA(pNL4-3)瞬時轉染MC141細胞的試驗中，1.5ng/ml ATF抑制了60％HIV p17釋放到培養(yǎng)上清液中。然而，ATF對SEAP的表達沒有影響，從而對LTR的轉錄促進活性沒有影響。也沒有觀察到對細胞增殖速率的影響。
事實上，當ATF抑制p17釋放時，LTR促進的轉錄水平未受ATF的影響，這表明所觀察到的ATF抗HIV活性不是因為對LTR促進的轉錄、HIV-tat-增強的轉錄或隨后的翻譯階段的任何抑制，并且提示所觀察到的抗HIV活性是對翻譯之后的某些階段(即HIV顆粒的裝配或出芽)的抑制結果。
<慢性感染細胞的單培養(yǎng)試驗結果>
見圖16。在慢性感染細胞(U1)的單培養(yǎng)試驗中，1.5ng/ml ATF抑制了50％釋放到培養(yǎng)上清液中的病毒抗原p17。然而，細胞內的p17未受ATF的影響。ATF也不影響細胞的增殖速率。
因為眾所周知在U1細胞中不發(fā)生HIV的多重感染，故在U1細胞單培養(yǎng)中可檢測到的抗HIV活性限于在原病毒DNA轉錄階段或之后階段的活性。因此，在U1細胞單培養(yǎng)物中ATF對病毒顆粒(p17)釋放的抑制表明，ATF具有抑制原病毒DNA轉錄階段或其之后階段的活性。另一方面，由于ATF不影響細胞內p17的量，看來ATF不影響HIV原病毒DNA轉錄到HIVmRNA翻譯的任何階段。慢性感染細胞的單培養(yǎng)試驗的結果與上述瞬時轉染試驗得到的結果相同。這些發(fā)現(xiàn)強烈提示ATF抑制HIV mRNA翻譯之后的某些后期階段，即HIV顆粒的裝配到病毒顆粒出芽的階段。
<急性感染(轉染試驗)中對HIV復制抑制活性試驗的結果>
見圖17，其顯示了從培養(yǎng)開始后各天的病毒數(shù)量分布圖。從圖中可以看出在對照組在開始培養(yǎng)后的第8到第12天期間病毒的數(shù)量迅速增加。發(fā)現(xiàn)所用的緩沖液的影響極小。另一方面在ATF組中，病毒復制的速度顯著降低，且發(fā)現(xiàn)對病毒復制的抑制取決于ATF的濃度。另外，對病毒復制的抑制率隨著培養(yǎng)時間的推移而增加(參見圖18)，顯示感染后12天0.74ng/ml ATF時大于75％，2.22ng/ml ATF時大于87％。
<抗CD87抗體對ATF的抗HIV活性的影響>
見圖19。在T細胞系即T4/NL4-3和MC141的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，無論使用何種培養(yǎng)液即僅含有3.3ng/ml ATF的培養(yǎng)液或含有3.3ng/ml ATF和10μg/mlCD87單克隆抗體(CD87是ATF和HMW-uPA的受體)的培養(yǎng)液都觀察到對釋放到培養(yǎng)上清液中的p17的幾乎相同的抑制。另一方面，發(fā)現(xiàn)10μg/ml抗-CD87抗體本身具有可與3.3ng/ml ATF大致相比的抗HIV活性。因為用含有抗CD87抗體或ATF或這兩者的培養(yǎng)液觀察到對p17釋放的抑制水平相當，故認為ATF和抗CD87抗體二者通過細胞上的共同靶分子起作用。另外，用非特異性IgG替代抗CD87抗體進行的培養(yǎng)得到的結果，與不用任何抗體培養(yǎng)所得到的結果相同。此發(fā)現(xiàn)表明所觀察到的抗CD87抗體的抗HIV活性取決于它的特異性。因此，認為此抗體通過特異性結合于細胞上的CD87而抑制HIV的釋放。認為將ATF加到含有抗CD87抗體的培養(yǎng)液中不提高對HIV釋放的抑制，是因為ATF不能與CD87結合，CD87已被抗CD87的抗體封閉了。更重要的是，由于抗CD87抗體和ATF都在T細胞系中表現(xiàn)出抗HIV活性(p17)而且這兩種化合物都特異性結合于CD87，上述試驗得到的結果表明CD87與其配體分子的特異性結合(由細胞中的一些未知機理所引起)導致對HIV釋放(裝配或出芽階段)的抑制。
另外，在由巨噬細胞系U1和U937組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)中(參見圖20)，加入抗CD87抗體完全封阻了ATF的抗HIV活性。另外，在這些細胞系中抗CD87抗體未顯示出抗HIV活性。因此這些結果與上述在T細胞中得到的結果不同。然而，這種矛盾可如下解釋在含ATF和抗CD87抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞中，抗CD87抗體由于某些原因不能對巨噬細胞顯示抗HIV活性，僅起到封阻CD87的作用，從而防止ATF結合CD87。因此上述結論，即ATF通過結合于CD87抑制了HIV的復制，也得到了巨噬細胞系中抗CD87抗體封阻了ATF的抗HIV活性這一事實的支持。
CD87及其復合物位于被稱為“脂類運輸筏”的富含神經鞘酯的細胞表面結構上[Koshelnic，Y.等人，Thromb.Haemost.，82(2)305-311(1999)]，而據(jù)報道HIV的出芽選擇性地發(fā)生在脂類運輸筏區(qū)域[Nguyen，D.H.等人，J.Virol.，74(7)3264-3272(2000)]。另外，已知也位于脂類運輸筏區(qū)域的Thy-1被HIV選擇性攝入其包膜中[Nguyen，D.H.等人，J.Virol.，74(7)3264-3272(2000)]。綜合來看，這些報道和本發(fā)明實驗的發(fā)現(xiàn)提出了一可能的機制，即CD87的配體分子如ATF，通過CD87對脂類運輸筏成分分子的作用，抑制HIV的出芽。
<制備實施例1>制備靜脈內、皮下或肌內注射劑按以下配方，將必要量的成分混合形成溶液，并將此溶液用孔徑為0.22μm的濾膜過濾除菌，制備所需的制劑。
ATF………………………………10mg甘露醇……………………………50mg蒸餾水……………………………至1ml<制備實施例2>制備靜脈內、皮下或肌內注射劑按以下配方，將必要量的基本成分混合形成溶液。加入ATF后，將溶液配制到一定體積，并用孔徑為0.22μm的濾膜過濾除菌，制備所需的制劑。
ATF………………………………50mg氯化鈉……………………………8.6mg氯化鉀……………………………0.3mg氯化鈣……………………………0.33mg注射用蒸餾水……………………至1ml<制備實施例3>制備靜脈內、皮下或肌內注射劑按以下配方，將必要量的基本成分混合形成溶液。加入ATF后，將溶液配制到一定體積，并用孔徑為0.22μm的濾膜過濾除菌，制備所需的制劑。
ATF………………………………50mg氯化鈉……………………………8.3mg氯化鉀……………………………0.3mg氯化鈣……………………………0.33mg磷酸氫二鈉·12H2O……………1.8mg1N鹽酸…………………………q.s.(pH 7.4)注射用蒸餾水……………………至1ml<制備實施例4>制備靜脈內、皮下或肌內注射劑按以下配方，將必要量的基本成分混合形成溶液。加入ATF后，將溶液配制到一定體積，并用孔徑為0.22μm的濾膜過濾除菌，制備所需的制劑。
ATF……………………………………50mg氯化鈉………………………………8.3mg氯化鉀………………………………0.3mg氯化鈣………………………………0.33mg葡萄糖………………………………0.4mg磷酸氫二鈉·12H2O…………………1.8mg1N鹽酸………………………………q.s.(pH 7.4)注射用蒸餾水………………………至1ml<制備實施例5>制備肺給藥制劑按以下配方，稱取ATF和乳糖并將它們溶于120ml純水中得到噴霧溶液，用常規(guī)方法噴霧干燥形成用于肺部給藥的制劑。
ATF…………………………………100mg乳糖(一水合物)…………………2900mg總計………………………………3000mg<制備實施例6>制備肺給藥制劑按以下配方，稱取ATF和羥丙基纖維素并將它們溶于120ml純水中得到噴霧溶液，用常規(guī)方法噴霧干燥形成用于肺部給藥的制劑。
ATF…………………………………100mg
羥丙基纖維素……………………2900mg總計………………………………3000mg<制備實施例7>制備肺給藥制劑按以下配方，稱取ATF和氫化卵磷脂并將它們溶于120ml純水中得到噴霧溶液，用常規(guī)方法噴霧干燥形成用于肺部給藥的制劑。
ATF…………………………………100mg氫化卵磷脂………………………2900mg總計………………………………3000mg<制備實施例8>制備肺給藥制劑按以下配方，稱取ATF、羥丙基纖維素和D-甘露醇并將它們溶于90ml純水中得到噴霧溶液，用常規(guī)方法噴霧干燥形成用于肺部給藥的制劑。
ATF…………………………………240mg羥丙基纖維素……………………129mgD-甘露醇…………………………2631mg總計………………………………3000mg本發(fā)明提供了一種新型抗-HIV的藥物，其通過與常規(guī)藥物已知的不同作用機制抑制感染患者中的HIV復制。因此，本發(fā)明為AIDS治療方法拓展了選擇余地，用于發(fā)病前預防和發(fā)病后治療目的，與常規(guī)抗-HIV藥物聯(lián)用從而改善AIDS的治療效果。
序列表<110>日本化學研究株式會社(JCR Pharmaceuticals Co.，Ltd.)<120>抗HIV藥物<130>GP47<160>5<210>1<211>1296<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atg aga gcc ctg ctg gcg cgc ctg ctt ctc tgc gtc ctg gtc gtg agc 48Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 10 15gac tcc aaa ggc agc aat gaa ctt cat caa gtt cca tcg aac tgt gac 96Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30tgt cta aat gga gga aca tgt gtg tcc aac aag tac ttc tcc aac att 144Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45cac tgg tgc aac tgc cca aag aaa ttc gga ggg cag cac tgt gaa ata 192His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile50 55 60gat aag tca aaa acc tgc tat gag ggg aat ggt cac ttt tac cga gga 240Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 75 80aag gcc agc act gac acc atg ggc cgg ccc tgc ctg ccc tgg aac tct 288Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser85 90 95gcc act gtc ctt cag caa acg tac cat gcc cac aga tct gat gct ctt 336Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu100 105 110cag ctg ggc ctg ggg aaa cat aat tac tgc agg aac cca gac aac cgg 384Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115 120 125agg cga ccc tgg tgc tat gtg cag gtg ggc cta aag ccg ctt gtc caa 432Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140gag tgc atg gtg cat gac tgc gca gat gga aaa aag ccc tcc tct cct 480Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro145 150 155 160cca gaa gaa tta aaa ttt cag tgt ggc caa aag act ctg agg ccc cgc 528Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg165 170 175ttt aag att att ggg gga gaa ttc acc acc atc gag aac cag ccc tgg 576Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp180 185 190ttt gcg gcc atc tac agg agg cac cgg ggg ggc tct gtc acc tac gtg 624Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val195 200 205tgt gga ggc agc ctc atc agc cct tgc tgg gtg atc agc gcc aca cac 672Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His210 215 220tgc ttc att gat tac cca aag aag gag gac tac atc gtc tac ctg ggt 720Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly225 230 235 240cgc tca agg ctt aac tcc aac acg caa ggg gag atg aag ttt gag gtg 768Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val245 250 255gaa aac cta atc cta cac aag gac tac agc gct gac acg ctt gct cac 816Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His260 265 270cac aac gac att gcc ttg ctg aag atc cgt tcc aag gag ggc agg tgt 864His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys275 280 285gcg cag cca tcc cgg act ata cag acc atc tgc ctg ccc tcg atg tat 912Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr290 295 300aac gat ccc cag ttt ggc aca agc tgt gag atc act ggc ttt gga aaa 960Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys305 310 315 320gag aat tct acc gac tat ctc tat ccg gag cag ctg aaa atg act gtt 1008Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val325 330 335gtg aag ctg att tcc cac cgg gag tgt cag cag ccc cac tac tac ggc 1056Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly340 345 350tct gaa gtc acc acc aaa atg ctg tgt gct gct gac cca cag tgg aaa 1104Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys355 360 365aca gat tcc tgc cag gga gac tca ggg gga ccc ctc gtc tgt tcc ctc 1152Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu370 375 380caa ggc cgc atg act ttg act gga att gtg agc tgg ggc cgt gga tgt 1200Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys385 390 395 400gcc ctg aag gac aag cca ggc gtc tac acg aga gtc tca cac ttc tta 1248Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu405 410 415ccc tgg atc cgc agt cac acc aag gaa gag aat ggc ctg gcc ctc tga 1296Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu420 425 430<210>2<211>431<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 10 15Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile50 55 60Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 75 80Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser85 90 95Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu
100 105 110Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115 120 125Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro145 150 155 160Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg165 170 175Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp180 185 190Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val195 200 205Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His210 215 220Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly225 230 235 240Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val245 250 255Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His260 265 270His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys275 280 285Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr290 295 300Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys305 310 315 320Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val325 330 335Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly340 345 350Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys355 360 365Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu370 375 380Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys385 390 395 400Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu405 410 415Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu420 425 430<210>3<211>4<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Lys Lys Phe Gly<210>4<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gln5 10
權利要求
1.一種抗HIV的藥物，其特征在于，所述的藥物包含作為活性成分的結合CD87的配體分子。
2.如權利要求1所述的抗HIV藥物，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑。
3.如權利要求1所述的抗HIV藥物，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
4.如權利要求1所述的抗HVI藥物，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是ATF。
5.如權利要求1所述的抗HIV藥物，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是ATF的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
6.如權利要求1所述的抗HIV藥物，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是抗CD87抗體。
7.如權利要求1所述的抗HIV藥物，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是抗CD87抗體的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
8.一種抗HIV的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含活性成分ATF或其具有對CD87特異性結合親和力的片段或類似物。
9.一種篩選抗HIV藥物的方法，其特征在于，所述方法包括分別將待測試的化合物與CD87接觸，并從這些化合物中挑選出能特異性結合CD87的化合物。
10.一種制備抗HIV藥物制劑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟分別將待測試的化合物與CD87接觸，從這些化合物中挑選出能特異性結合CD87的化合物，證明所選出的化合物具有抗-HIV活性，并將這種已證明具有抗HIV活性的化合物作為抗-HIV藥物以給予人的藥物制劑形式提供。
11.一種篩選抗HIV藥物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟提供一種由HIV慢性感染細胞和未感染細胞組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)，將已知濃度的待測試化合物加到此共培養(yǎng)系統(tǒng)中后，分別進行共培養(yǎng)，測定釋放到共培養(yǎng)上清液中的HIV顆粒的量，將測得的HIV顆粒的量與不加任何測試化合物進行共培養(yǎng)的上清液中釋放的HIV顆粒的量進行比較，根據(jù)比較的結果選出顯示能抑制HIV顆粒釋放的測試化合物作為抗HIV藥物。
12.一種制備抗-HIV藥物的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟提供一種由HIV慢性感染細胞和未感染細胞組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)，將已知濃度的待測試化合物加到此共培養(yǎng)系統(tǒng)中后分別進行共培養(yǎng)，測定釋放到共培養(yǎng)上清液中的HIV顆粒的量，將測得的HIV顆粒的量與不加任何測試化合物進行共培養(yǎng)的上清液中釋放的HIV顆粒的量進行比較，根據(jù)比較的結果選出顯示能抑制HIV顆粒釋放的測試化合物作為抗HIV藥物，并將此抗HIV藥物以給予人的藥物制劑形式提供。
13.一種通過抑制人體中HIV的復制來治療HIV感染的人的方法，其特征在于，所述的方法包括將HIV復制抑制量的能結合CD87的配體分子給予所述的人。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是高分子量的尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
16.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是ATF。
17.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是ATF的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
18.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是抗CD87抗體。
19.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是抗CD87抗體的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
20.一種結合CD87的配體分子的用途，其特征在于，可用于制備抑制HIV感染的人體中的HIV復制的藥物組合物。
21.如權利要求20所述的用途，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是高分子量的尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑。
22.如權利要求20所述的用途，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
23.如權利要求20所述的用途，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是ATF。
24.如權利要求20所述的用途，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是ATF的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
25.如權利要求20所述的用途，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是抗CD87抗體。
26.如權利要求20所述的用途，其特征在于，所述結合CD87的配體分子是抗CD87抗體的片段或類似物，這種片段或類似物具有對CD87的特異性結合親和力。
全文摘要
公開了抗－HIV藥物。該藥物包含有作為活性成分之一的結合CD87的配體分子。這種配體分子的例子包括高分子量尿激酶類血纖蛋白溶酶原激活劑、其氨基端片斷、它們的類似物和抗－CD87抗體。
文檔編號A61P31/00GK1371747SQ0210515
公開日2002年10月2日 申請日期2002年2月20日 優(yōu)先權日2001年2月20日
發(fā)明者和田學, 和田直子 申請人:日本化學研究株式會社