專利名稱：聚亞烷基氧改性的磷脂及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新穎實用的聚亞烷基氧(poly(alkylene oxide))改性的磷脂及其制備方法及用途，特別是涉及生理活性物質的化學改性和乳化、或者脂質體等藥物傳遞系統(tǒng)中可使用的聚亞烷基氧改性的磷脂、其制備方法及用途。
與本發(fā)明相關的背景技術近年，廣泛進行抗癌劑等的脂質體制劑研究，為了利于提高藥物在血中的滯留時間，脂質體的水溶性高分子改性研究正在廣泛地展開。其中之一，就是使用脂質體改性聚亞烷基氧改性的磷脂質。由于在醫(yī)藥用途方面應用，希望盡量減少或避免雜質。
在脂質體改性聚亞烷基氧改性的磷脂質的合成反應中，例如作為催化劑大多使用三乙胺等含有氮的堿。此時，為了除去反應后存在的過量堿，需要將系統(tǒng)調節(jié)成酸性。在此工序中，脂質體改性聚乙二醇改性的磷脂質產生劣化，難以得到高純度產品。
另外，三乙胺等含有氮的堿大多具有氨味或獨特臭味。在操作環(huán)境中，優(yōu)選不使用這樣的堿。
對于聚亞烷基氧改性的磷脂質的合成方法，有M.C.Woodle(Biochimicaet Biophysica Acta，1105，193-200(1992)等，或S.Zalipsky(Bioconjugate Chem，4,296-299(1994))等的報道。具體地是在有機溶劑中，使用1，1’-羰基二咪唑或二琥珀酰亞胺碳酸酯將聚乙二醇的末端活性化后，在三乙胺等堿存在下與磷脂質反應，然后用逆向硅色譜或透析等精制，得到聚亞烷基氧改性的磷脂。
在此方法中，同樣地在反應后，為了除去過量存在的三乙胺等的堿，需要將系統(tǒng)調節(jié)成酸性。此時，生成單酰基磷脂(一般稱為溶血磷脂)。它生理毒性強，作為醫(yī)藥方面應用，例如在藥物傳遞系統(tǒng)利用時成為問題。
另外，若在合成后的精制工序中進行逆向硅膠色譜或透析時，在從柱洗脫時，發(fā)生產品的劣化(生成上述的單?；字?，或在透析中產品產生水解等問題。因此，難以得到高純度產品，在工業(yè)上也有問題。
對于上述現有技術的方法，由于含有三乙胺等的堿，若要除去它，又產生溶血磷脂，所以難以得到高純度品。另外，對于以往的方法，由于產品收率低或溶劑使用量大，也難以進工業(yè)化規(guī)模生產。
為此，希望研究出不含有三乙胺等的具有氮原子的堿或單?；字入s質的、高純度的聚亞烷基氧改性磷脂質的簡單合成方法。
另外，磷脂可作為乳化劑或保濕劑，都具有優(yōu)良的效果，不僅在醫(yī)藥行業(yè)而且將其配合在化妝品的研究也逐漸增加。在化裝品行業(yè)，脂質體通過其他表面活性劑的添加的研究也逐漸增多。但是用于乳液及化裝水時，因提高添加量而遇到溶解度問題。為此，必須提高本發(fā)明以外的表面活性劑用量。
發(fā)明詳述發(fā)明要解決的技術問題本發(fā)明的目的在于提供含有氮原子的堿或單酰基磷脂等雜質含量少的、高純度的聚亞烷基氧改性磷脂質及其制備方法和用途。
進而，由于本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂具有磷脂質的效果，在水溶液中也可溶解，所以可作為表面活性劑使用。技術方案本發(fā)明是以下的聚亞烷基氧改性的磷脂、其制備方法及其用途。
(1)單?；字|體的含量低于重量的3％、且具有氮原子的三乙胺含量低于重量的0.02％，可用下述式(1)表示的聚亞烷基氧改性的磷脂。[化學結構式5] (式(1)中，R1CO及R2CO分別獨立地是碳原子數4～24的?；是1～6、R3O是碳原子數2～4的氧化烯、n是碳原子數2～4的氧化烯的平均加成摩爾數，是10～800的數。M是氫原子、鈉、或鉀，X是碳原子數1～3的2價的烴基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1。p是0時，Y是氫原子或碳原子數1～4的烷基。p是1時，Y是氫原子、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基、或硫羥基。)(2)上述(1)所述的聚亞烷基氧改性的磷脂，其中單酰基磷脂質體的含量低于重量的2％。
(3)上述(1)所述的聚亞烷基氧改性的磷脂，其中p是0時，Y是甲基，單?；字|體的含量低于重量的0.5％。
(4)具有下述工序(A)的聚亞烷基氧改性的磷脂的制備方法。工序(A)在水溶液呈堿性的堿金屬鹽，且不含氮的固體鹽存在下，在有機溶劑中使下述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物的活性化體和用下述式(3)表示的磷脂質反應的工序。[化學結構式6] (式(2)中，R3O是碳原子數2～4的氧化烯、n是碳原子數2～4的氧化烯的平均加成摩爾數是10～800的數。X是碳原子數1～3的2價的烴基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1。p是0時，Y是氫原子或碳原子數1～4的烷基。p是1時，Y是氫原子、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基、或硫羥基。Z是活性賦予基。)[化學結構式7] (式(3)中，R1CO及R2CO分別獨立地是碳原子數4～24的?；是1～6。)(5)上述(4)所述的制備方法，其中R1CO及R2CO是碳原子數12～20的?；?。
(6)上述(4)或(5)所述的制備方法，其中p是0時，Y是甲基。
(7)上述(4)至(6)中任意一所述的制備方法，其中在工序(A)所使用的固體鹽是碳酸鈉、有機溶劑是甲苯或氯仿。
(8)上述(4)至(7)的任意一所述的制備方法，其中在工序(A)后，具有下述工序(B)。
工序(B)使用醋酸乙酯或丙酮除去式(3)表示的磷脂。
(9)上述(4)至(8)的任意一所述的制備方法，其中在工序(A)后，具有下述工序(C)。
工序(C)作為溶劑，使用醋酸乙酯和/或丙酮進行重結晶的工序。
(10)上述(9)所述的制備方法，其中在工序(C)中，進而作為溶劑，選自碳原子數5～8的脂肪族烴或醚的至少一種化合物。
(11)上述(9)或(10)所述的制備方法，其中工序(C)是在工序(B)后進行的。
(12)上述(4)至(11)的任意一所述的制備方法，其中在工序(A)后，具有下述工序(D)。
工序(D)使用吸附劑進行精制的工序。
(13)上述(12)所述的制備方法，其中在工序(D)中使用的吸附劑是含有堿土類金屬氧化物、堿土類金屬氫氧化物、鋁、或者硅的吸附劑、或活性炭。
(14)上述(12)或(13)所述的制備方法，其中工序(D)是在工序(B)后進行。
(15)上述(4)～(14)的任意一個所述的制備方法，其中聚亞烷基氧改性的磷脂，單酰基磷脂質體的含量低于重量的3％，且具有氮原子的堿的含量低于重量的0.02％的下述式(1)表示的化合物。[化學結構式8] (式(1)中，R1CO及R2CO分別獨立地是碳原子數4～24的?；是1～6、R3O是碳原子數2～4的氧化烯、n是碳原子數2～4的氧化烯的平均加成摩爾數是10～800的數；M是氫原子、鈉、或鉀，X是碳原子數1～3的2價的烴基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1；p是0時，Y是氫原子或碳原子數1～4的烷基；p是1時，Y是氫原子、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基、或硫羥基。)(16)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亞烷基氧改性的磷脂組成的表面活性劑。
(17)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亞烷基氧改性的磷脂組成的脂質體形成劑。
(18)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亞烷基氧改性的磷脂組成的脂質體。
(19)由上述(1)～(3)的任意一所述的聚亞烷基氧改性的磷脂組成的生理活性物的親兩性化學改性劑。本發(fā)明的具體實施方式
在用上述式(1)表示的本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂中，R1CO及R2CO是碳原子數4～24、優(yōu)選的是12～20的?；Ｔ擋；ǔＴ从谥舅?。作為R1CO及R2CO的具體的物質，例如丁酸、異丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、十四酸、十六酸、棕櫚烯酸、硬脂酸、異硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、山俞酸、菜子酸、二十四磷酸等飽和及不飽和的直鏈或支鏈的脂肪酸的?；?。R1CO及R2CO可相同也可不同。
在上述式(1)中，用R3O表示的氧化烯是碳原子數2～4、優(yōu)選的是2或3的氧化烯。作為R3O，例如可舉出氧基亞乙基、氧基亞丙基、氧基三亞甲基、氧基亞丁基等。其中，優(yōu)選的是氧基亞乙基、氧基亞丙基，特別優(yōu)選的是氧基亞乙基。在分子內僅有n個的氧化烯存在，但此氧化烯可以是單獨1種，也可以是2種以上組合，其組合沒有限制。另外可以是嵌段式的，也可以是無規(guī)狀。
在上述式(1)中，n表示氧化烯的平均加成摩爾數，是10～800、優(yōu)選的是20～500的數。若n是10以上，在將本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂用于藥物傳遞系統(tǒng)時，傳輸效果變高。另外，若n是800以下，在制造聚亞烷基氧改性的磷脂時，作為原料的上述式(2)的聚亞烷基氧的化合物的粘度并不明顯上升，所以操作性好。
在上述式(1)中，M是氫原子、鈉、或鉀。用上述式(1)表示的本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，也可以是其混合物。
與磷酸基部分形成鹽的鈉、或鉀，通常是含在用于藥劑等調制的生理食鹽緩沖液中的，進而也可存在于生物體內的。因此，即使將本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂用于藥物傳遞系統(tǒng)，在體內的毒性等問題少。M是鈉或鉀以外的金屬離子時，例如鈣或鎂等二價金屬離子時，由于會成為與磷脂質二分子締合的結構，所以是不理想的。
在上述式(1)中，k是1至6的整數、較好是1至4，優(yōu)選是2至4，最好是2。
在上述式(1)中，X是碳原子數1～3的2價的烴基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)。作為烴基，具體舉例如-CH2-、-CH2-CH2-、-(CH3)3-、-CH(CH3)CH2-等。p是0或1。
在上述式(1)中，p是0時，Y是氫原子或碳原子數1～4的烷基。優(yōu)選的是烷基。作為烷基，具體舉例如甲基、乙基、丙基、丁基等。其中，優(yōu)選的是甲基。
另外，p是1時，Y是氫原子、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基、或硫羥基，優(yōu)選的是氨基。
作為Xp-Y，優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、及氨基甲基，特別優(yōu)選的是甲基。
本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，其源于單?；字|體和溶劑殘留物的具有氮原子的堿的雜質含量少。
存在于本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂中的單?；字|體的含量低于重量的3％、優(yōu)選的是低于重量的2％、更優(yōu)選的是低于重量的0.5％。
另外，對于具有氮原子的堿的含量是低于重量的0.02％、較好的是低于0.01％(重量)、最好是沒有。
帶氮原子的堿，源于三乙胺等溶劑的殘留物的堿，至少具有一個氮原子。作為具有氮原子的堿，例如吡啶、三乙胺、二異丙胺、二甲基氨基吡啶、咪唑、二乙胺、二異丁胺、三-n-辛胺、二-2-乙基己胺等。特別是其中的三乙胺希望其毒性最小。另外，用式(3)表示的磷脂雖然具有氮原子，但由于在分子內中和，所以不適合作具有氮原子的堿。
本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，由于作為生理毒性強的單?；字暮可?，且三乙胺等的具有氮原子的雜質含量少，所以對于機體的安全性高。
另外，本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，由于含有機體內也存在的鈉離子或鉀離子的一價的金屬離子，所以對于機體的安全性高。
由于對于機體的安全性這樣高，所以可作為表面活性劑，特別是機體用的表面活性劑。特別是，可作為生理活性物質用的表面活性劑最適宜。
本發(fā)明的表面活性劑是含有本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂的表面活性劑。通常，對于含有表面活性劑的組成物等的全組分來講，優(yōu)選的是將聚亞烷基氧改性的磷脂配合0.01～30％(重量)使用、更優(yōu)選的是配合成0.1～15％(重量)使用。另外，表面活性劑的使用量，根據表面活性劑的使用目的和組成的不同而適宜地選擇。
用式(1)表示的聚亞烷基氧改性的磷脂，可使用1種或2種以上，也可與其他的表面活性劑并用。
本發(fā)明的表面活性劑適用于1)用水或緩沖液等分散溶劑使不溶或難溶于水的物質乳化的乳化劑；2)用水或緩沖液等分散溶劑使不溶或難溶于水的物質溶解的增溶劑；3)用水或緩沖液等分散溶劑使不溶或難溶于水的物質分散的分散劑；4)向對象物質中導入親水性基和疏水性基的親兩性化學改性劑等。
使用本發(fā)明的表面活性劑可以得到增溶劑、乳化劑、分散劑。
本發(fā)明的表面活性劑，可特別適宜作為增溶劑、乳化劑、分散劑使用時，乳化劑、增溶劑、分散劑，僅使用本發(fā)明的表面活性劑也可，其中含有乳化、增溶、分散劑等眾所周知的其他成分也行。
增溶劑、乳化劑、分散劑的形式沒有限制，都是將生理活性物質加入水或緩沖液等分散劑當中溶解的溶解液，使生理活性物質加入水或或緩沖液等分散劑當中分散的分散劑。
乳化液或助溶液的形態(tài)也沒有限制。用本發(fā)明的表面活性劑形成的膠體溶液，也就是在其內部含有親油性生理活性物質膠溶液。另外于水或緩沖液等分散劑中，利用本發(fā)明的表面活性劑和親油性生理活性物質作用形成的分散粒子的膠質粒子，或大于此粒子存在的乳膠溶液。作為乳膠溶液，有分散粒子為10-30nm的高分子膠溶液。乳膠溶液無論是油相中混入生理活性物的水包油型(O/W)，或水相中混入生理活性物的多層水包油型(W/O/W)均可。
本發(fā)明的表面活性劑，由于具有來自氧化烯的親水性和來自?；氖杷?，所以可作為乳化劑或增溶化劑使用，并且保存穩(wěn)定性優(yōu)良。進而，由與機體細胞構成成分相同的磷脂質及毒性低的氧化烯組成，同時，由于機體毒性強的單酰基磷脂質的含量少，所以安全性高。通過使用含有這樣的聚亞烷基氧改性的磷脂的乳化劑，例如可得到安全性高的生理活性物質的溶化液或增溶化液。
作為乳化或增溶化的對象物質，可舉出生理活性物質、脂溶性物質等。
作為生理活性物質，具體地可舉出酶、抗體、其他的蛋白質、糖、脂質、糖蛋白質、糖脂質、或激素等。
作為脂溶性物質，可舉出磷脂質等的脂質、紫杉酚等的脂溶性藥劑或者通常用于油相的高級醇、酯油、三甘油、生育酚、及高級脂肪酸等。
在不損失本發(fā)明效果的范圍內，可以含有甘油、丙二醇等的多元醇、脂肪酸酯、防腐劑、抗氧劑等公知的其他成分。
使用本發(fā)明的表面活性劑，可以得到高分子膠粒溶液。含在高分子膠粒溶液中的高分子膠?？捎糜谥苄运巹┑脑鋈芑饔玫?。
作為含有本發(fā)明的聚亞烷基氧鏈的高分子表面活性劑使用時，就能得粒徑為10-300nm的微粒存在的高分子膠溶液。
高分子膠可以僅使用前式(1)表示的高分子表面活性劑，也可加入其他公知的成分，如后述的前式(1)所述的介于反應性基之外的公知的高分子結合的表面活性劑。包含在高分子溶液中的高分子膠，可用于脂溶性藥劑的增溶等。
與通常使用的表面活性劑的膠粒相比，本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，如上述由于接近機體細胞構成成分，進而由于含有高分子的聚亞烷基氧鏈，所以調制的高分子膠粒溶液具有水合層，所以穩(wěn)定性高、對于機體的毒性也低。
高分子膠粒，配合對象物質為0.05～2％％(重量)、本發(fā)明的表面活性劑對于總量，為0.2～0.8％(重量)。
用動態(tài)光散射測定得到的高分子膠粒的重量平均粒徑是10～300nm、優(yōu)選的是20～100nm。
乳化的調制是將對于水被乳化的對象物質和本發(fā)明的表面活性劑加熱到30～90℃、優(yōu)選的是45～85℃、最優(yōu)選的是60～80℃進行均勻混練，再緩慢地加入水和緩沖液混合后得到乳化液，也可在水中加入其他溶解在水中的水溶性物質。
乳化液的調制也可如上述將油相和水相分開后混合，也可用均化器、超聲器等將全部的成分進行混合。通常對象物質，對于總量配合成0.01～30％(重量)、優(yōu)選的是0.1～10％(重量)使用，本發(fā)明的表面活性劑，對于總量配合成0.1～40％(重量)、優(yōu)選的是0.5～10％(重量)使用。
增溶化液的配制是被溶解在水的對象物質和本發(fā)明的表面活性劑在通常室溫、優(yōu)選的是30～45℃下混合，向其中慢慢添加水或緩沖液相，進行混合得到增溶化液，此時也可向其中慢慢添加含有其他水溶性物質的水相。對于混合，使用均化器及超聲器等。通常對象物質，對于總量配合成0.01～10％(重量)、優(yōu)選的是0.1～5％(重量)使用，本發(fā)明的表面活性劑，對于總量配合成0.1～30％(重量)、優(yōu)選的是1～10％(重量)使用。
本發(fā)明的式(1)的Y是氫原子以外的反應性官能團時，可將本發(fā)明的表面活性劑作為生理活性物質的兩親性化學改性劑使用。
兩親性化學改性劑，可以含有1種或2種以上的本發(fā)明的表面活性劑，進而可以含有用于生理活性物質的化學改性的公知的其他成分。
被化學改性的生理活性物質，只要是具有氨基、羧基、羥基、硫羥基等的官能團的就沒有特別限制，例如可舉出酶、抗體、其他的低聚物及多肽、蛋白質、糖、脂質、糖蛋白質、糖脂質、激素等。
在將本發(fā)明的表面活性劑作為生理活性物質的兩親性化學改性劑使用時，作為式(1)的Y，優(yōu)選的是氨基、羧基、醛基及硫羥基。在具有氨基、羧基、醛基、及硫羥基時，可易于存在于生理活性物質中的官能團反應。例如Y是羧基時，通過與生理活性物質中的氨基形成CONH鍵，可在生理活性物質中導入聚亞烷基氧改性的磷脂骨架。
可將生理活性物質的兩親性化學改性劑作為增溶化液、乳化液、分散液、高分子膠粒溶液使用。例如使用本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂，用前述方法，調制高分子膠粒溶液，進而在Y是羧基等的反應性官能團時，通過與抗體蛋白質的氨基反應結合，可得到向靶部位投與的高分子膠粒制劑。
在將使用本發(fā)明的兩親性化學改性劑化學改性了的生理活性物質作為脂質體成分使用時，可將生理活性物質存在于脂質體表面上。例如生理活性物質是抗體的蛋白質時，可將生理活性物質作為靶細胞的配體使用，所以可將脂質體向靶細胞集中輸送。
在作為生理活性物質的兩親性化學改性劑使用時，可作為增溶化液、乳化液、分散液、高分子膠粒溶液及脂質體溶液使用。
本發(fā)明的脂質體是由含有本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂的脂質體形成劑構成的脂質體。另外，也可含有用于形成脂質體膜的公知的其他脂質作為成分。
通常，優(yōu)選的是對于磷脂質1摩爾將聚亞烷基氧改性的磷脂配合成0.002～0.2摩爾、優(yōu)選的是配合成0.01～0.1摩爾使用。聚亞烷基氧改性的磷脂，對于脂質體的總組成，最好配合成1～20％(重量)使用。
使用本發(fā)明的脂質體形成劑得到的脂質體，可使用本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂和其他的脂質進行制造。
作為其他的脂質，可舉出具有磷脂質、甾醇類、其他碳原子數8～22的飽和及不飽和的具有?；幕衔?。
其他的脂質也可以是含有磷脂酰膽堿的單獨磷脂質，也可以是與其以外的脂質的混合脂質。
所說的磷脂質是指甘油磷脂質、鞘氨醇磷脂質、甘油糖脂質，所說的甾醇類是指膽固醇、二氫膽固醇、麥角甾醇、羊毛甾醇。
作為甘油磷脂質，可舉出碳原子數4～24、優(yōu)選的是12～20的飽和及不飽和的直鏈或支鏈的具有酰基的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸。另外，也可與蛋黃卵磷脂及大豆卵磷脂類的來自天然的混合脂質體使用。
碳原子數4～24的?；膳e出來自辛酸、癸酸、月桂酸、十四酸、十六酸、棕櫚烯酸、硬脂酸、異硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、山俞酸等的?；?。
其他的脂質，具體地也可以例如是由以下所示的組成比的混合脂質構成的。
磷脂酰膽堿/膽固醇/磷脂酰甘油是20～90/10～60/2～40摩爾％、優(yōu)選的是30～60/20～50/15～25摩爾％。
可以用公知的方法制造由本發(fā)明的脂質體形成劑得到的脂質體。
例如，作為一般的Bangahm法將原料的脂質溶解到可溶解的有機溶劑中，使用蒸發(fā)器等除去溶劑后，形成脂質薄膜，在相轉移點以上的溫度下水合乳化后，用超聲波處理得到脂質體溶液。另外，將上述原料的脂質進行水合，使用均化器等在相轉移點以上的溫度下乳化后，使用聚碳酸酯的膜進行加壓過濾的方法(HopeM.Jetal，Biochimica et Biophysica Acta，812，55(1985))得到脂質體溶液，另外，得到的脂質體即使是多層脂質體或單層脂質體都可調節(jié)成適當的粒徑。優(yōu)選的是粒徑60～300nm、更優(yōu)選的是90～200nm的單層脂質體。
本發(fā)明的脂質體形成劑由于含有本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，所以作為脂質體溶液，保存穩(wěn)定性優(yōu)良，同時，機體毒性強的單?；字|的含量少，例如三乙胺等的含有氮的雜質的含量少，所以對于機體是安全的。為此，通過使用本發(fā)明的脂質體形成劑，可得到可作為安全性高的藥物傳遞系統(tǒng)利用的脂質體。
作為脂質體溶液保存穩(wěn)定性優(yōu)良的理由，可推測如下。由于單?；字|比二酰磷脂質的疏水性低，所以容易從脂質體表面脫離。為此，單酰基磷脂質的含量多的以往的脂質體，單?；字|從脂質體表面脫離，脂質體表面的水合層減少，所以脂質體粒子發(fā)生凝集引起相分離容易造成不穩(wěn)定。與此相反，本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，由于單酰基體含量少，所以難以發(fā)生從脂質體表面脫離的磷脂質。為此，脂質體溶液的保存穩(wěn)定性優(yōu)良。
對于本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂的合成法，作為催化劑不使用三乙胺等的含有氮的堿。因此，在聚亞烷基氧改性的磷脂中不殘存有害的堿，可得到對于機體安全且純度高的聚亞烷基氧改性的磷脂。
本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂，可通過以下的工序(A)制造。
工序(A)在水溶液顯示堿性的堿金屬鹽，且不含氮的固體鹽存在下，在有機溶劑中使上述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物的活性化體和用上述式(3)表示的磷脂質反應的工序。
在工序(A)使用的上述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物及用上述式(3)表示的磷脂質中，R1CO、R2CO、R3O、k、n、X、p及Y與上述式(1)說明的相同。
在用上述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物中，Z是賦予活性基，是對于聚亞烷基氧化合物賦予和上述式(3)表示的磷脂質的反應活性的基團，含有電子吸引基、其他的基。作為這樣的基團，具體舉例有咪唑、4-硝基苯基氧基、苯并三唑基、氯、甲氧基、乙氧基、丙氧基、羰氧基-N-2-吡咯烷酮基、羰基-2-氧代嘧啶基、N-琥珀酰亞胺基氧基、五氟苯甲?；取Ｆ渲?，優(yōu)選的是咪唑、4-硝基苯基氧基、苯并三唑基、氯、N-琥珀酰亞胺基氧基，特別優(yōu)選的是4-硝基苯基氧基。
用上述式(3)表示的磷脂質，可以是天然磷脂質，也可以是合成磷脂質。作為具體的例子，例如可舉出大豆及大豆加氫磷脂酰乙醇胺、蛋黃及蛋黃加氫磷脂酰乙醇胺等的天然及合成磷脂酰乙醇胺等。作為用上述式(3)表示的磷脂質，優(yōu)選的是k是2的磷脂酰乙醇胺。
在工序(A)中使用的固體鹽是水溶液顯示堿性的堿金屬鹽，是不含氮的固體鹽。作為固體鹽，只要可將用式(2)表示的聚亞烷基氧化合物的活性化體和式(3)的磷脂質的氨基結合的化合物都可使用。
具體地，固體鹽是溶解在水中作成水溶液時的pH顯示堿性的物質。優(yōu)選的是pH是7.1～13的、更優(yōu)選的是7.1～11的。作為固體鹽，優(yōu)選的是含有鈉或鉀的固體鹽。作為固體鹽，可舉出碳酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等。具體地是碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、醋酸鈉、醋酸鉀等。其中，優(yōu)選的是碳酸氫鈉、碳酸鈉，特別優(yōu)選的是碳酸鈉。
固體鹽的使用量，優(yōu)選的是用上述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物的0.1～1000倍摩爾。若是1000倍摩爾以下，由于容易攪拌，所以是理想的。固體鹽的使用量，特別優(yōu)選的1～500倍摩爾。
使用的式(2)的聚亞烷基氧化合物的活性化體和式(3)的磷脂質的加入量，希望摩爾比越接近1∶1越好，但優(yōu)選的是磷脂質過剩地設定。具體地，聚亞烷基氧化合物的活性化體和磷脂質的摩爾比是1∶1～1∶5、優(yōu)選的是1∶1.1～1∶2，最好的是1∶1。
在磷脂質過剩時，在后述的工序中，可從生成物除去。另一方面，在聚亞烷基氧化合物過剩時，在反應終了后殘存未反應的聚亞烷基氧化合物。此時，在聚亞烷基氧化合物的分子量是約100～約3000時，通過將殘存的聚亞烷基氧化合物重結晶或晶析等的方法除去。但是，往往有時會使聚亞烷基氧改性的磷脂的收率降低。另一方面，在聚亞烷基氧化合物的分子量是約3000以上時，殘存的聚亞烷基氧化合物大多難以除去。此時，難以得到高純度的聚亞烷基氧改性的磷脂，所以前述摩爾比不夠理想。
本發(fā)明的制備方法，可在上述固體鹽存在下使上述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物和上述式(3)表示的磷脂質反應?？墒牵鶕闆r，本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂可使磷脂質的活性化體和聚亞烷基氧化合物反應而得到。
用于工序(A)反應的有機溶劑，只要是沒有羥基的官能團的就沒有什麼限制地使用。例如可以舉出醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯及甲苯等非質子性溶劑。這些中優(yōu)選的是甲苯、氯仿。乙醇等的具有羥基的有機溶劑，由于與上述(2)所示的聚亞烷基氧化合物的活性化體的末端基反應，所以是不合適的。二氯甲烷等在反應性上雖然沒有問題，但是由于沸點低，在操作上是不適宜的。
工序(A)的反應溫度是30～90℃，優(yōu)選的是40～80℃。反應時間是1小時以上。優(yōu)選的是2～10小時以上。
用上式(2)表示的聚亞烷基氧化合物和用上式(3)表示的磷脂質反應，可以得到用上述式(1)表示的本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂。
在工序(A)中，用上式(2)表示的聚亞烷基氧化合物的末端是氨基、羧基、和硫羥基，特別是末端為氨基時，最好是將這些基團保護后再進行反應。例如對于氨基可用叔丁氧羰基或9-芴基甲基羰基等的保護基，對于羧基可用甲基酯化后進行保護，對于硫羥基可用S-t-丁基硫基等的保護基進行保護。
從工序(A)得到的反應液過濾固體鹽后，將濾液濃縮或加入到弱溶劑中后，采用結晶化等的方法，可以高純度且高收率地得到上述式(1)表示的本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂質。用于過濾所使用的濾材，只要是可以除去被處理液中的雜質就沒有什麼特別的限制，通?？梢允褂帽Ａ袅Ｗ蛹毧讖綖?～10μm耐溶劑性的紙、玻璃等各種材質的過濾器。對于過濾方法沒有特別的限制，例如可以使用減壓過濾、加壓過濾、離心過濾等的方法。
另外，通過調節(jié)從工序(A)得到的濾液的pH值，可以將聚亞烷基氧改性的磷脂質變換成前式(1)的磷酸基部的M是氫的氫型、及M是鈉或鉀的堿性鹽型。
將得到的聚亞烷基氧改性的磷脂質或含有聚亞烷基氧改性的磷脂質的工序(A)的溶液通過下述的工序(B)～(D)可以得到更高純度的聚亞烷基氧改性的磷脂質。另外工序(B)～(D)最好是通過上述的過濾從工序(A)的反應液除去固體鹽后進行。
在工序(B)，是將工序(A)得到的結晶溶解在有機溶劑時，作為雜質而存在的過剩的磷質脂進行除去的工序。
使用的有機溶劑，可以使用溶解作為目的物的聚亞烷基氧改性的磷脂質，但是最好是不溶解過剩存在磷質脂的溶劑或者磷質脂溶解度低的溶劑。作為有機溶劑優(yōu)選的是醋酸乙酯或丙酮，特別優(yōu)選的是丙酮。
工序(B)的溶解溫度優(yōu)選的是0～80℃，特別優(yōu)選的是20～70℃。有機溶劑的使用量，對于結晶是1～100重量倍，優(yōu)選的是2～50重量倍。
從工序(B)溶液過濾不溶物后，將濾液濃縮或加入到弱溶劑中后，采用結晶化等的方法，可以高純度且高收率地得到用上述式(1)表示的本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂質。
只是將得到的濾液進行冷卻也可以進行結晶，但是根據溶劑的種類，有可能用上述式(1)表示的本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂質不能充分地析出，殘存在溶液中而降低了收率。
另外，也可以通過蒸餾除去有機溶劑進行結晶化，在蒸餾出有機溶劑時，最好是在80℃以下的減壓下進行。有機溶劑的蒸餾出溫度超過80℃時，可能引起用上述式(1)表示的本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂質分解等的不需要的副反應。
另外，如上所述，通過調節(jié)從工序(B)得到的濾液的pH值，可以將聚亞烷基氧改性的磷脂質變換成氫型或堿性鹽型。
工序(B)可以在工序(A)后進行，也可以在下述的工序(C)、工序(D)任何一個前進行，也可以在工序(C)和/或工序(D)后進行。
工序(B)得到的結晶可以直接地作為本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂質，也可以進一步精制。
在本發(fā)明的方法中，工序(A)后，最好通過下述工序(C)和/或(D)除去工序(A)中由于作為原料式(2)所示的聚亞烷基氧化合物的活性體生成的活性賦予基Z所生成的的化合物。工序(C)(D)，分別在工序(A)的后，可以在工序(B)前或后，工序(C)和(D)哪一個在前都可以，但是，最好在工序(B)后進行工序(C)(D)，另外，最好在工序(C)后進行工序(D)。
工序(C)中，溶解工序(A)得到的結晶，通過冷卻或加入弱溶劑，析出的結晶以除去源于Z的化合物，進行精制。
在工序(C)中使用的溶劑，最好是能溶解工序(A)得到的結晶，通過冷卻能析出聚亞烷基氧改性的磷脂質結晶的溶劑、或通過加入弱溶劑可以使聚亞烷基氧改性的磷脂質結晶化的溶劑。特別優(yōu)選的是結晶析出時，使作為目的物的聚亞烷基氧改性的磷脂質進行結晶化，使源于Z化合物溶解的溶劑。
在工序(C)中使用的溶劑量，對于結晶是1～100重量倍，優(yōu)選的是2～50重量倍。
在工序(C)中，重結晶后可進行冷卻，或者使用弱溶劑進行結晶化。最好是冷卻到10℃以下時，可以充分地進行結晶化，可以良好的收率得到結晶。
也可以蒸餾出溶劑后進行結晶。蒸餾出溶劑時，最好是在80℃以下減壓下進行。有機溶劑的蒸餾出溫度超過80℃時，就可能產生上述式(1)表示的聚亞烷基氧改性的磷脂質的?；纸獾牟幌Ｍ母狈磻?。
工序(C)的具體方法，可以舉出以下的方法。
1)溶解在醋酸乙酯、丙酮選出的至少一種溶劑中后，通過冷卻析出聚亞烷基氧改性的磷脂質的結晶。
2)溶解在醋酸乙酯、丙酮選出的至少一種溶劑中后，通過使用醚或碳原子數為5～8的脂肪族烴析出聚亞烷基氧改性的磷脂質的結晶。
3)溶解在醋酸乙酯、丙酮選出的至少一種溶劑和醚或碳原子數為5～8的脂肪族烴的組合溶劑后，通過冷卻析出聚亞烷基氧改性的磷脂質的結晶。
以上的方法中，特別優(yōu)選的是1)的使用醋酸乙酯溶解后，冷卻，進行結晶化的方法。
在工序(C)中使用的上述碳原子數為5～8的脂肪族烴沒有特別的限制。可以舉出例如，戊烷、異戊烷、新戊烷、己烷、異己烷、3-甲基戊烷、新己烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基-己烷、3-乙基戊烷、2，2-二甲基戊烷、2，3-二甲基戊烷、3，3-二甲基戊烷、2，3，3-三甲基丁烷、辛烷、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、4-甲基庚烷、3-乙基己烷、2，2-二甲基己烷、2，3-二甲基己烷、2，4-二甲基己烷、2，5-二甲基己烷、3，3-二甲基己烷、3，4-二甲基己烷、2-甲基-3-乙基戊烷、3-甲基-3-乙基戊烷、2，2，3-三甲基戊烷、2，2，4-三甲基戊烷、2，2，3，3-四甲基丁烷等。其中優(yōu)選的是己烷或庚烷。
進行工序(C)時，想進一步提高純度時，通過數次重復工序(C)的操作可以得到純度更加優(yōu)良的聚亞烷基氧改性的磷脂質。
由工序(C)得到的結晶可以直接地作為本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂質，也可以進而提供給其他的精制工序。
在工序(D)中，結晶溶解在溶劑中后，通過添加吸附劑后攪拌的方法，可以除去源于Z的化合物。另外在工序(D)中，也可以使用過濾工序(A)得到的反應液后的濾液來進行。
工序(D)中所使用的溶劑，優(yōu)選的是醋酸乙酯、氯仿、甲苯、丙酮等。這些中特別優(yōu)選的是醋酸乙酯。
使用吸附劑后的處理溫度是10～85℃，優(yōu)選的是40～70℃，時間是10分鐘～5小時，優(yōu)選的是30分鐘～3小時。
可以用加熱溶解工序(A)得到的結晶，進行吸附劑處理的方法，但是在上述溫度下由于結晶不溶解的情況和溶液粘度高的情況多，所以最好是用稀釋醋酸乙酯等的溶解本發(fā)明聚亞烷基氧改性的磷脂質的溶劑后，進行處理。處理溫度低于10℃時，有時聚亞烷基氧改性的磷脂質析出，在除去吸附劑時，聚亞烷基氧改性的磷脂質也被一起除去，所以收率下降，是不理想的。另外超過85℃時，存在微量水分時，在吸附劑處理中可能引起聚亞烷基氧改性的磷脂質的加水分解。
吸附劑的使用量，對于處理結晶的100重量份是0.1～200重量份，優(yōu)選的是1～50重量份，吸附劑的量是0.1～200重量份時，可以充分有效地除去源于Z的化合物。
在工序(D)中不進行吸附劑處理，用過濾等的方法除去吸附劑后，可以用冷卻的方法或者使用弱溶劑進行結晶化。優(yōu)選的是冷卻到10℃以下進行的話可以充分地進行結晶，可以得到良好的收率。
除去吸附劑后，可以在蒸餾出溶劑后進行結晶化，但是在蒸餾出溶劑時最好是在80℃以下的減壓條件下進行。有機溶劑的蒸餾出溫度超過80℃時就有可能引起上述式(1)所示的聚亞烷基氧改性的磷脂質的?；纸獾牟恍枰母狈磻?。
在工序(D)中使用的吸附劑，是含有堿土類金屬氧化物、堿土類金屬氫氧化物、鋁或硅的吸附劑或者活性碳，例如含有氫氧化鋁、氧化鋁、氧化鎂、氫氧化鎂、氧化硅等的吸附劑、活性炭等。含有這些化合物的市售品可以舉出協(xié)和200、協(xié)和300、協(xié)和500、協(xié)和600、協(xié)和700、協(xié)和1000、協(xié)和2000(協(xié)和化學工業(yè)(株)制、商標)、特密克斯AD300、特密克斯AD500、特密克斯AD700(富田制藥(株)制、商標)等?？梢詥为毷褂靡环N吸附劑，也可以兩種以上組合使用。
在工序(D)中得到的結晶也可以直接作為本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂質，也可以不結晶工序(D)的濾液，進一步用吸附劑處理，進而，進行結晶。
利用以上制備方法，副產品單酰基磷脂質的含量少，而且用以前方法使用溶劑從最終生成物中去除是困難的，為此擁有殘在最終生成物中氮原子堿等不純物少，可容易地、高收率地制造，具有氮原子的雜質含量少的高純度的聚亞烷基氧改性的磷脂質。發(fā)明的效果本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂是新穎而且是有用的化合物。本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂中單?；字|和具有氮原子的雜質含量少，是對機體的安全性高的高純度的聚亞烷基氧改性磷脂，所以適用于表面活性劑，特別適用于乳化劑、增溶劑、高分子膠形成劑、分散劑、兩親性化學改性劑，以及脂質體形成劑等。
本發(fā)明的制備方法中，將上述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物和用式(3)表示的磷脂質溶解在水中時，在顯示堿性的堿金屬鹽且不含有氮的固體鹽的存在下，在有機溶劑中進行反應。因此，可高收率地制造單?；字|體的含量少，具有氮原子的雜質含量少的高純度的聚亞烷基氧改性的磷脂。
過濾碳酸鈉后，向濾液加入己烷(300ml)，進行結晶化。過濾結晶后(該結晶1g作為樣品，將其作為工序(A)的樣品①，以下同樣地得到樣品②～⑥)，向結晶中加入丙酮(80ml)升溫到50℃。用玻璃過濾器進行過濾，除去雜質。向濾液加入己烷(160ml)，析出結晶，冷卻到5℃，而后過濾結晶(工序B中的樣品②)。
向結晶中加入醋酸乙酯(400ml)在65℃下溶解，攪拌30分鐘后，冷卻到5℃。過濾析出的結晶(工序(C)中的樣品③)。同樣地再進行醋酸乙酯工序的操作(工序(C)中的樣品④)。
用醋酸乙酯(400ml)溶解結晶后，加入吸附劑協(xié)和#2000(5g)、協(xié)和#700(0.8g)，在65℃下，攪拌一小時。過濾吸附劑后冷卻到5℃，結晶化(樣品⑤)。過濾結晶后，同樣地，再一次進行吸附劑處理。用己烷洗滌結晶后，過濾、干燥，得到目的化合物14.6g(收率52.2％)(工序(D)中的樣品⑥)。最終得到的結晶的純度是98.4％。
各步驟中生成物的分析通過使用硅膠板的薄層色譜(TLC)進行。展開溶劑是使用氯仿和甲醇的混合比為85∶15重量比的混合溶劑，用碘蒸汽發(fā)色后，與已知量的標準物質比較，進行含有物質的定量。
同樣，也可以重量混合比為65∶25∶4∶0.1的氯仿、甲醇、水、氨水的混合溶劑為展開劑 進行薄層層析(TLC)。
前者，作為可以定量的雜質溶血磷脂、游離的磷脂質、游離的聚乙二醇衍生物、三乙胺，后者可以定量聚亞烷基氧改性的磷脂質中的磷酸部的三乙胺鹽中的三乙胺量。
用這些方法求出的純度結果表示在表1中。
另一方面，為了測定含有在各工序物質中的源于Z的化合物量，也對于樣品①～⑥進行分析。減壓下干燥樣品①～⑥后，分別在試管中取50mg，用乙醇稀釋全量到5g，進行溶解。用分光光度計測定來自1，1’-羰基二咪唑(CDI)的248nm的吸光度。從各個樣品的測定值求出各工序中的來自1，1’-羰基二咪唑的化合物的除去率，得到的各個除去率分別表示在表2中。
從表2的結果可以確認，在各工序中源于Z的化合物減少，聚亞烷基氧改性的磷脂質得到了精制。最終含有0.02％程度的來自1，1’-羰基二咪唑的化合物，但是，這種程度的值，作為雜質的含有量是可以忽視的量。
過濾碳酸鈉后，向濾液加入己烷(500ml)，冷卻到5℃后，過濾析出的結晶。向結晶中加入丙酮(200ml)，升溫到50℃后，用玻璃過濾器進行過濾，除去雜質(工序B)。
向濾液中加入己烷(500ml)，冷卻到5℃。過濾析出結晶后，供給工序(C)。在工序(C)中，加入醋酸乙酯(750ml)在65℃下溶解，攪拌30分鐘后，冷卻到5℃。過濾析出的結晶。同樣地再進行一次使用醋酸乙酯工序(C)的操作。
用醋酸乙酯(750ml)溶解結晶后，加入吸附劑協(xié)和#2000(12g)、協(xié)和#700(1g)，在60℃下，攪拌一小時。過濾吸附劑后，冷卻到5℃，過濾析出結晶(工序(D))。同樣地，進行二次工序(D)的用吸附劑處理。
用己烷(300ml)洗滌結晶后，過濾、干燥，得到目的化合物38.2g(收率54.6％)，純度是99.5％，純度的結果表示在表1中。
過濾碳酸鈉后，向濾液加入己烷(200ml)，過濾析出的結晶。向結晶中加入丙酮(150ml)，加熱到50℃后，用玻璃過濾器除去雜質(工序(B))。
加入己烷(300ml)，析出結晶。過濾后向結晶中加入醋酸乙酯(400ml)，在65℃下溶解，攪拌30分鐘后，冷卻到5℃。過濾析出的結晶(工序(C))。同樣地再進行二次使用醋酸乙酯工序(C)的操作。
用醋酸乙酯(360ml)溶解結晶后，加入吸附劑協(xié)和#2000(4g)、協(xié)和#700(0.2g)，在65℃下，攪拌一小時。過濾吸附劑后冷卻到5℃，過濾析出結晶(工序(D))。同樣地，進行二次用吸附劑的工序(D)的處理。
用己烷(90ml)洗滌結晶后，過濾、干燥，得到目的化合物15.2g(收率65.4％)，純度是98.4％，純度的結果表示在表1中。
過濾碳酸鈉后，向濾液加入己烷(200ml)，冷卻到5℃，過濾析出的結晶，得到結晶。向結晶中加入丙酮(150ml)，加熱到50℃后，用玻璃過濾器除去雜質(工序(B))。
向溶液中加入己烷(300ml)，析出結晶。過濾后向得到的結晶中加入醋酸乙酯(400ml)，在65℃下溶解，攪拌30分鐘后，冷卻到5℃。過濾析出的結晶(工序(C))。進而進行二次使用醋酸乙酯工序(C)的處理。
用醋酸乙酯(360ml)溶解結晶后，加入吸附劑協(xié)和#2000(4g)、協(xié)和#700(0.2g)。過濾吸附劑后冷卻到5℃，過濾析出結晶(工序(D))。同樣地，進行二次用吸附劑的工序(D)的處理。
用己烷(90ml)洗滌結晶后，過濾、干燥，得到目的化合物15.2g(收率65.6％)，純度是98.5％，純度的結果表示在表1中。比較例1吡啶二硫丙酰氨基 聚乙二醇 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的合成(1)將吡啶二硫丙酰氨基 聚乙二醇 琥珀酰亞胺碳酸酯(1g，0.42mmol)溶解在氯仿(10ml)中，加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(0.36g，0.44mmol)，接著加入三乙胺(0.33ml，2.37mmol)。在40℃下，攪拌混合物10分鐘。在減壓下，用蒸發(fā)器濃縮溶液后，加入乙腈(50ml)，將此溶液在4℃下冷藏一夜。接著進行離心分離，分離出透明的溶液。溶液經蒸發(fā)器濃縮后得到干燥結晶。收量是1.15g。收率是90.8％。純度的結果表示在表3中。
表3所示的游離三乙胺的含有量及游離堿的含有量，在薄層色譜(TLC)的點中，可以定量到5％，但在此以上喪失定量性，因此對于超過5％的，用＞5表示。比較例2(2)單甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂?；字Ｒ掖及返暮铣上蚓垩鮼喴一谆?分子量2000，20g，10mmol)中加入苯(75ml)，回流，脫水。加入羰基二咪唑(1.78g，11mmol)回流2小時。加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(7g，9.36mmol)及三乙胺(3.1ml，22mmol)回流20小時。用蒸發(fā)器濃縮反應液得到粗提物。
此粗提物用C-18逆相硅膠色譜精制。C-18逆相硅膠使用(Bio-Gel A-1.5m)，洗脫液使用乙醇/水＝4/1。收量是5.0g。收率是18％。純度的結果表示在表3中。比較例3(3)單甲基聚氧乙烯氨基甲酰 1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺的合成將聚氧亞乙基甲基醚(分子量2000，5g，2.5mmol)溶解在氯仿/甲苯＝50/2(wt/wt)(25ml)中后，加入三光氣(0.89g，3mmol)，在40℃下反應3小時。向該溶液中加入乙醚(75ml)，使之沉淀。過濾沉淀物后，干燥，得到單甲基聚氧乙烯氯甲酸酯(4.7g，91％)。
將單甲基聚氧乙烯氯甲酸酯(4g，1.94mmol)及1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(1.65g，2.3mmol)溶解在氯仿(20ml)中，加入三乙胺(0.39ml，2.76mmol)，在60℃下反應3小時。
過濾出雜質后，用蒸發(fā)器濃縮反應液。向殘渣中加入水(20ml)溶解，加入0.1N鹽酸(5.0ml)將水溶液酸化。向水溶液中加入二氯甲烷(25ml)進行萃取。同樣地重復二次萃取，向合并的萃取液中加入硫酸鈉(30g)，脫水。過濾出硫酸鈉后，用蒸發(fā)器濃縮。用硅膠柱色譜精制殘渣，得到目的化合物1.5g。收率是28％。純度的結果表示在表3中。比較例4(4)叔丁氧羰基酰肼 聚氧乙烯琥珀酰 磷脂酰乙醇胺的合成將叔丁氧羰基酰肼聚氧乙烯琥珀酰碳酸酯(1g，0.42mmol)溶解在氯仿(6ml)中后，加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(0.292g，0.39mmol)及三乙胺(0.144ml，1.04mmol)，在45℃下反應10分鐘。
向反應液中加入醋酸(0.06ml，1.05mmol)，用蒸發(fā)器濃縮。向殘渣中加入水(7.5ml)溶解后，用蒸發(fā)器蒸餾出少量的氯仿后。將反應液加入到Spectrapor CE透析管(MWCO 30萬)，用50mM的生理鹽水(1500ml×3)在4℃下進行透析(8-16小時/1次透析)。進而，用離子交換水透析后，用0.2μm的滅菌的過濾器過濾。冷凍干燥后，得到目的物。收量是0.55g，收率是43.3％。純度的結果表示在表3中。表1
表2
表3
表1，表3的注釋*1 純度1上述式1表示的聚亞烷基氧改性的磷脂質的純度(單位％)*2 溶血磷脂含有量單乙酰基磷脂質體的含有量(單位％)*3 游離PE含有量未反應的磷脂質體的含有量(單位％)*4 游離PEG衍生物含有量聚乙二醇及該衍生物的含有量(單位％)*5 游離三乙胺含有量三乙胺含有量(單位％)*6 游離鹽中的三乙胺含有量磷酸三乙胺鹽中的三乙胺含有量(單位％)從表1、表3的結果可以看出實施例的制備方法與比較例比較，溶血磷脂和三乙胺等的雜質含有量少，可以高純度地制造聚亞烷基氧改性的磷脂質。
3穩(wěn)定的狀態(tài)2稍微不均勻的狀態(tài)1乳油化或分離的狀態(tài)另外，將剛剛制作好的乳液涂敷在皮膚上，進行感官試驗。感官評價是由5人的專門參加者來進行的。評價的方法，是將上臂洗凈后涂敷試樣，對剛剛涂敷后及經過一夜后的皮膚刺激的評價，分別用以下的三個階段進行記分，5人的合計分數表示在表6中。
3普通，完全沒有異常2有異樣感，稍微有癢感1有癢感，皮膚發(fā)紅實施例6使用實施例2的單甲基聚氧乙烯氨基甲酰 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺作成脂膏。即在表5構成的基材中，將含有乳化劑的油相部加熱到60℃均一的溶解后，在該溫度下一邊攪拌一邊加入水相部而作成的。表5
對制作的脂膏與實施例5進行同樣的評價，其結果表示在表6中。比較例5及比較例6使用比較例3的的單甲基聚氧乙烯氨基甲酰 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，與實施例5及實施例6進行同樣的試驗，其結果表示在表6中。表6
實施例7脂質體溶液穩(wěn)定性的評價將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(1.92g，2.64mmol)、膽固醇(0.45g，1.32mmol)、實施例2得到的單甲基聚氧乙烯氨基甲酰 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(0.42g，0.15mmol)加入到梨型的燒瓶內，加入氯仿50ml使其溶解，用輥筒蒸發(fā)器脫溶劑，在燒瓶內壁形成脂質的薄膜。減壓下充分除去溶劑，加入pH7的磷酸緩沖生理食鹽水溶液30ml后，分散，進而，用超聲波洗滌器進行5分鐘的處理，作成脂質體溶液。
得到的脂質體溶液在室溫下放置一個月。一個月后的脂質體溶液的分散狀態(tài)，用目測沒有看到變化，是均勻的脂質體溶液。比較例7使用比較例2得到的單甲基聚氧乙烯氨基甲酰 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，與實施例7進行同樣的評價，其結果，脂質體溶液不均勻，脂質粒子沉淀下來。實施例8使用羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的天冬酰胺酶的改性將與實施例3相同得到的羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(5g、0.86mmol)溶解在氯仿50ml中，添加N-羥基琥珀酰亞胺(0.15g、1.29mmol)，添加溶解在少量的氯仿中的二環(huán)己基碳酰亞胺(0.27g、1.29mmol)在室溫下攪拌2小時。然后，在過濾除去不溶物的溶液中添加乙醚，過濾析出的結晶而得到。在減壓下除去溶劑，用于以下的工序。
將天冬酰胺酶0.1g溶解在pH7.4的磷酸緩沖液生理鹽水液50ml中，添加由上述得到的琥珀酰亞胺羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，在5℃下攪拌4小時。將此反應液，對于pH7.4、4℃的磷酸緩沖液生理食鹽水液進行透析除去未反應物，然后凍結干燥，得到羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺與天冬酰胺酶結合了的干燥品。實施例9使用羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的大豆加氫磷脂酰膽堿的高分子膠粒溶液的配制將大豆加氫磷脂酰膽堿(0.1g、0.13mmol)和與實施例3相同地得到的羧基甲基聚氧乙烯氨基甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(1g、0.17mmol)添加到蒸餾水(5ml)中攪拌混合。將蒸餾水(95ml)慢慢添加到均勻的混合溶液中進行攪拌，得到均勻的、透明的高分子膠粒溶液。使用粒度測定裝置(NICOMP Model 370野崎產業(yè)株式會社制)測定粒度分布。其結果平均粒徑是35nm。
將得到的高分子膠粒溶液在室溫下放置1個月。1個月后的高分子膠粒溶液的狀態(tài)是目測看不到變化而沒有沉淀物的均勻的脂質體溶液。
權利要求
1.單?；字|體的含量低于重量的3％、且具有氮原子的堿基的含量低于重量的0.02％的下述式(1)表示的聚亞烷基氧改性的磷脂，[化學結構式式1] 式(1)中，R1CO及R2CO分別獨立地是碳原子數4～24的?；?、k是1～6、R3O是碳原子數2～4的氧化烯、n是碳原子數2～4的氧化烯的平均加成摩爾數是10～800的數；M是氫原子、鈉、或鉀；X是碳原子數1～3的2價的烴基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1；p是0時，Y是氫原子或碳原子數1～4的烷基；p是1時，Y是氫原子、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基或硫羥基。
2.根據權利要求1所述的聚亞烷基氧改性的磷脂，其中單酰基磷脂質體的含量低于重量的2％。
3.根據權利要求2所述的聚亞烷基氧改性的磷脂，其中p是0、Y是甲基、單?；字|體的含量是低于重量的0.5％。
4.具有下述工序(A)的聚亞烷基氧改性的磷脂的制備方法，工序(A)在水溶液呈堿性的堿金屬鹽，且不含氮的固體鹽存在下，在有機溶劑中使下述式(2)表示的聚亞烷基氧化合物的活性化體和用下述式(3)表示的磷脂質反應的工序，[化學結構式2] 式(2)中，R3O是碳原子數2～4的氧化烯、n是碳原子數2～4的氧化烯的平均加成摩爾數是10～800的數，X是碳原子數1～3的2價的烴基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)、p是0或1；p是0時，Y是氫原子或碳原子數1～4的烷基，p是1時，Y是氫原子、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基或硫羥基，Z是活性賦予基；[化學結構式3] 式(3)中，R1CO及R2CO分別獨立地是碳原子數4～24的?；是1～6。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其中R1CO及R2CO是碳原子數12～20的?；?br> 6.根據權利要求4或5所述的制備方法，其中p是0、Y是甲基。
7.根據權利要求4～6任何一項所述的制備方法，其中在所述工序(A)中使用的固體鹽是碳酸鈉，有機溶劑是甲苯或氯仿。
8.根據權利要求4～7任何一項所述的制備方法，其中在所述工序(A)后，并具有下述工序(B)，工序(B)使用醋酸乙酯或丙酮除去所述式(3)表示的磷脂。
9.根據權利要求4～8任何一項所述的制備方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(C)，工序(C)使用醋酸乙酯和/或丙酮作為溶劑進行重結晶的工序。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其中在所述工序(C)中，進而作為溶劑，使用的化合物由碳原子數5～8的脂肪族烴和醚中選擇。
11.根據權利要求9或10所述的制備方法，其中所述工序(C)是在所述工序(B)后進行。
12.根據權利要求4～11中任何一項所述的制備方法，其中在所述工序(A)后，具有下述工序(D)，工序(D)使用吸附劑進行精制的工序。
13.根據權利要求12所述的制備方法，其中在所述工序(D)中使用的吸附劑是含有堿土類金屬氧化物、堿土類金屬氫氧化物、鋁、或者硅的吸附劑，或活性炭。
14.根據權利要求12或13所述的制備方法，其中所述工序(D)是在所述工序(B)后進行。
15.根據權利要求4～14任何一項所述的制備方法，其中聚亞烷基氧改性的磷脂，單酰基磷脂質體的含量低于重量的3％，且具有氮原子的堿的含量低于重量的0.02％的下述式(1)表示的化合物，[化學結構式4] 式(1)中，R1CO及R2CO分別獨立地是碳原子數4～24的?；?、k是1～6、R3O是碳原子數2～4的氧化烯、n是碳原子數2～4的氧化烯的平均加成摩爾數是10～800的數；M是氫原子、鈉、或鉀；X是碳原子數1～3的2價的烴基或-C(＝O)(CH2)q-(其中，q是1～4)；p是0或1；p是0時，Y是氫原子或碳原子數1～4的烷基；p是1時，Y是氫原子、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基或硫羥基。
16.含有權利要求1～3任何一項所述的聚亞烷基氧改性的磷脂的表面活性劑。
17.含有權利要求1～3任何一項所述的聚亞烷基氧改性的磷脂的脂質體形成劑。
18.含有權利要求1～3任何一項所述的聚亞烷基氧改性的磷脂的脂質體。
19.含有權利要求1～3任何一項所述的聚亞烷基氧改性的磷脂的生理活性物質的兩親性化學改性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及聚亞烷基氧改性的磷脂及其制備方法,特別是涉及生理活性物質的化學改性和乳化、或者脂質體等藥物傳遞系統(tǒng)中可使用的聚亞烷基氧改性的磷脂及其制備方法和用途。本發(fā)明的目的在于提供含有氮原子的堿或單酰基磷脂等雜質含量少的、高純度的聚亞烷基氧改性磷脂質及其制備方法和用途。進而,由于本發(fā)明的聚亞烷基氧改性的磷脂具有磷脂質的效果,在水溶液中也可溶解,所以可作為表面活性劑使用。
文檔編號A61K8/14GK1374313SQ0210681
公開日2002年10月16日 申請日期2002年3月4日 優(yōu)先權日2001年3月2日
發(fā)明者久保和弘, 伊藤智佳, 大橋俊輔, 安河內徹 申請人:日本油脂株式會社