專利名稱：一種能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體及其制備和應(yīng)用。
1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體。雜交瘤技術(shù)的誕生被認(rèn)為是抗體工程發(fā)展的第一次質(zhì)的飛躍，也是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑。利用這種技術(shù)制備的單克隆抗體在疾病診斷、治療和科學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。其產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞具有雙重特性既能無限生長，又能產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞的抗體。單克隆抗體應(yīng)用十分廣泛，被人們譽(yù)為對(duì)付癌癥的“生物導(dǎo)彈”。如采用抗癌細(xì)胞的單克隆抗體與放射性同位素、化學(xué)藥物或毒素相結(jié)合，注入體內(nèi)同癌細(xì)胞結(jié)合，能在原位殺死癌細(xì)胞，而不損傷其它正常細(xì)胞。
21世紀(jì)，生物技術(shù)將與信息技術(shù)一道為全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供強(qiáng)大的動(dòng)力，“成為全社會(huì)最重要并可能改變未來工業(yè)和經(jīng)濟(jì)格局的技術(shù)”?？贵w工程技術(shù)隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展而不斷完善，并且是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的主力軍，尤其在生物技術(shù)制藥領(lǐng)域占有重要地位。至2000年底為止，在美國藥品市場上生物技術(shù)藥物有76種，其中抗體藥物有15種；正處于臨床研究階段的369種生物技術(shù)藥物中，抗體藥物有70種。我國自1986年實(shí)施“國家高技術(shù)研究與發(fā)展(863)計(jì)劃”以來，生物技術(shù)的研究和開發(fā)都取得了非常大的進(jìn)展，而抗體工程項(xiàng)目一直得到“863”計(jì)劃的重點(diǎn)支持，已經(jīng)具備了一定的科研基礎(chǔ)和出現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化的良好發(fā)展勢頭。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的鼠源性單克隆抗體，該抗體對(duì)腫瘤抗原的選擇性強(qiáng)，抑瘤效果顯著。
本發(fā)明公開的能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的鼠源性單克隆抗體是一種以人或動(dòng)物腫瘤組織提取獲取的總蛋白為抗原，同時(shí)用培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞鋪板，對(duì)得到的抗體進(jìn)行篩選而得的抗體。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述單克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明公開的單克隆抗體的制備方法包括下列步驟一、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備(1)取患腫瘤的人或動(dòng)物的腫瘤組織，用高速組織破碎機(jī)切碎后離心，獲取總蛋白；將腫瘤細(xì)胞破碎后離心，獲取細(xì)胞總蛋白?？偟鞍鬃鳛橹苽鋯慰寺】贵w的抗原。
(2)將抗原注入小鼠腹腔進(jìn)行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時(shí)可加強(qiáng)免疫。短程免疫的步驟為(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(b)約一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(c)約一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；(d)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原；(e)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞按一定的比例(細(xì)胞數(shù)量比0.5-1.5∶10)混合，并在融合劑(PEG1450)作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。然后細(xì)胞培養(yǎng)至少一周，取其上清。
(4)在96孔板內(nèi)用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)以8,000-10,000。CO2孵箱培養(yǎng)24～48小時(shí)，待細(xì)胞長成單層。棄去培養(yǎng)液，向各孔內(nèi)加0.05％戊二醛(PBS為溶劑)100μl，室溫固定15分鐘。PBS洗三次后，每孔加封閉液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室溫封閉1小時(shí)后，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> (5)從-20℃取出細(xì)胞板，于37℃融化后，棄去原來的封閉液，重新加封閉液至滿孔，37℃放置1小時(shí)。用PBS-Tween洗三次，并吸干液體。
(6)向96孔板中加入雜交瘤細(xì)胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小時(shí)后，用PBS-Tween洗三次。加入已標(biāo)記HRP的羊抗鼠單抗(每孔100ul)，37℃放置1小時(shí)后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分鐘后，加入2M H2SO4(每孔50ul)終止反應(yīng)。
(7)測96孔板上各孔內(nèi)的O.D.450。選擇該值大于1.0者為陽性克隆的標(biāo)準(zhǔn)。
(8)重復(fù)步驟4-7，繼續(xù)篩選至陽性率為100％，復(fù)核一次后，擴(kuò)大培養(yǎng)。
二、單克隆抗體蛋白的純化1)用一定量(細(xì)胞數(shù)1,000,000-5,000,000)的細(xì)胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蠟一周后)，等待一周左右的時(shí)間，然后取小鼠腹水；在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞直至數(shù)量達(dá)到10,000,000后，取其上清液。
2)將腹水或上清過Protein G柱，進(jìn)行親和層析，其步驟如下a)取腹水1ml，3000-5000rpm離心至少10分鐘，取上清用PBS稀釋至10倍體積，再用0.45um的微孔濾膜過濾；細(xì)胞上清直接用0.45um的微孔濾膜過濾。
b)用10倍體積的PBS過柱，使柱處于中性狀態(tài)，控制流速在1-2ml/min。
c)樣品上柱并收集最后1-2ml溶液(用以檢測是否達(dá)到飽和)。
d)用10倍體積的PBS過柱洗雜蛋白。
e)用3-4ml甘氨酸洗脫并收集約1ml/管。
f)取50-100ul的管中溶液，測定O.D.280和O.D.260，計(jì)算出其中單克隆抗體蛋白的濃度。
本發(fā)明所述的人或動(dòng)物腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞包括肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他實(shí)體瘤的組織、細(xì)胞。
本發(fā)明單克隆抗體的制備使用了腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中的總蛋白作為抗原進(jìn)行免疫，使得產(chǎn)生的單克隆抗體可識(shí)別腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白。此外，本發(fā)明利用培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞對(duì)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，使得篩選出的細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體針對(duì)于腫瘤細(xì)胞表面蛋白。所以，本發(fā)明獲得的單克隆抗體和腫瘤具有密切的相關(guān)性，經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定方法后，可作為治療相關(guān)腫瘤的臨床藥物的原料。
本發(fā)明的單克隆抗體蛋白一般經(jīng)過以下三種方法的鑒定，可認(rèn)為其具有用于腫瘤臨床治療的潛在價(jià)值a)單克隆抗體蛋白與腫瘤組織抗原進(jìn)行WESTERN實(shí)驗(yàn)。
又稱免疫印跡法，通過電泳鑒定單克隆抗體蛋白的純度以及交叉反應(yīng)的程度。
b)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
利用免疫學(xué)中的抗原抗體反應(yīng)，借助可見的標(biāo)記物，在組織原位顯示抗原或抗體的方法。常見的免疫組織化學(xué)方法有熒光免疫和酶免疫組化技術(shù)、金標(biāo)免疫組化技術(shù)和免疫電鏡，該技術(shù)特點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞涂片、印片、組織切片進(jìn)行處理和染色鏡檢。
c)動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)。
利用接種相應(yīng)腫瘤細(xì)胞并已致瘤的裸鼠作為動(dòng)物模型，研究不同濃度的單克隆抗體動(dòng)物體內(nèi)對(duì)腫瘤抑制的效果，按下式計(jì)算抑瘤率。 本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述單克隆抗體作為制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明公開的單克隆抗體可直接作為治療各種相應(yīng)腫瘤的靶向藥物，如肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他實(shí)體癌。
本發(fā)明公開的單克隆抗體可以用來分子制備人源化抗體。
本發(fā)明公開的單克隆抗體或人源化抗體也可與放射性核素、藥物或毒素形成單抗偶聯(lián)物，作為更有效的抗腫瘤藥物。
本發(fā)明公開的單克隆抗體或人源化抗體與放射性核素、藥物或毒素形成的單抗偶聯(lián)物，可通過口服、注射、滴注等方式使單抗藥物與發(fā)生腫瘤的部位接觸，單抗藥物與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合，阻礙或消除腫瘤細(xì)胞的繁殖，起到治療腫瘤的作用。
本發(fā)明公開的單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞針對(duì)性強(qiáng)，不損傷其他正常細(xì)胞，在開發(fā)抗腫瘤靶向藥物前景廣闊，具有極大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
其中1為蛋白Marker，2為正常肝組織的總蛋白，3為肝癌組織的總蛋白圖2肝癌組織的免疫組化結(jié)果圖3正常組織的免疫組化結(jié)果圖4單克隆抗體蛋白與食道癌組織及相應(yīng)的正常食道組織總蛋白的Western實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
其中1為蛋白Marker，2為正常食道組織的總蛋白，3為食道癌組織的總蛋白圖5食道癌組織的免疫組化結(jié)果圖6正常組織的免疫組化結(jié)果實(shí)施例1 可識(shí)別肝癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的制備、純化和鑒定一、可識(shí)別肝癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的制備(1)取人的肝癌組織，用高速組織破碎機(jī)切碎后離心，獲取總蛋白；總蛋白作為制備單克隆抗體的抗原。
(2)將抗原注入小鼠腹腔進(jìn)行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時(shí)可加強(qiáng)免疫。短程免疫的步驟為(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(b)約一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(c)約一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；(d)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原；(e)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)量比1∶10的比例混合，并在融合劑(PEG 1450)作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。然后細(xì)胞培養(yǎng)至少一周，取其上清。
(4)在96孔板內(nèi)用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)為10,000。CO2孵箱培養(yǎng)24～48小時(shí)，待細(xì)胞長成單層。棄去培養(yǎng)液，向各孔內(nèi)加0.05％戊二醛(PBS為溶劑)100μl，室溫固定15分鐘。PBS洗三次后，每孔加封閉液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室溫封閉1小時(shí)后，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> (5)從-20℃取出細(xì)胞板，于37℃融化后，棄去原來的封閉液，重新加封閉液至滿孔，37℃放置1小時(shí)。用PBS-Tween洗三次，并吸于液體。
(6)向96孔板中加入雜交瘤細(xì)胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小時(shí)后，用PBS-Tween洗三次。加入已標(biāo)記HRP的羊抗鼠單抗(每孔100ul)，37℃放置1小時(shí)后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分鐘后，加入2M H2SO4(每孔50ul)終止反應(yīng)。
(7)測96孔板上各孔內(nèi)的O.D.450。選擇該值大于1.0者為陽性克隆的標(biāo)準(zhǔn)。
(8)重復(fù)步驟4-7一次，陽性率達(dá)到100％，復(fù)核一次。
二、可識(shí)別肝癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體蛋白的純化1)用一定量(細(xì)胞數(shù)1,000,000-5,000,000)的細(xì)胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蠟一周后)，等待一周左右的時(shí)間，然后取小鼠腹水；在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞直至數(shù)量達(dá)到10,000,000以上，取其上清液。2)腹水或上清過Protein G柱，進(jìn)行親和層析，其步驟如下a)取腹水1ml，4000rpm離心10分鐘，取上清用PBS稀釋至10倍體積，再用0.45um的微孔濾膜過濾；細(xì)胞上清直接用0.45um的微孔濾膜過濾。b)用10倍體積的PBS過柱，使柱處于中性狀態(tài)，控制流速在1-2ml/min。c)樣品上柱并收集最后2ml溶液(用以檢測是否達(dá)到飽和)。d)用10倍體積的PBS過柱洗雜蛋白。e)用3-4ml甘氨酸洗脫并收集約1ml/管。f)取50-100ul的管中溶液，測定其O.D.280為2.41，按公式計(jì)算單克隆抗體蛋白的濃度為1.67mg/ml。
三、可識(shí)別肝癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的鑒定a)WESTERN鑒定。
取人的肝癌組織和相應(yīng)的正常肝組織，分別用高速組織破碎機(jī)切碎后離心，獲取總蛋白。用單克隆抗體蛋白與上述總蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)僅在分子量為6.5kd處出現(xiàn)一條帶。說明用肝癌組織總蛋白為抗原制備的單克隆抗體能與肝癌組織中某一特定蛋白有特異性結(jié)合能力(見

圖1)。
b)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
按常規(guī)方法進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖2、圖3)表明，該抗體可結(jié)合在肝癌組織的多個(gè)部位，而不會(huì)與正常肝組織的蛋白相結(jié)合。
c)小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)。
無菌操作，取人體肝癌組織，以生理鹽水制成勻漿，接種于裸鼠腋窩皮下，接種次日將小鼠隨機(jī)分為3組陰性對(duì)照組，腹腔注射等體積生理鹽水組；陽性對(duì)照組，腹腔注射阿霉素20mg/m2；治療組，腹腔注射單克隆抗體50mg/m2、。隔日給藥1次，共6次。第14天處死動(dòng)物，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單克隆抗體的抑瘤率為47.1％。
實(shí)施例2 可識(shí)別食道癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的制備、純化和鑒定一、可識(shí)別食道癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的制備(1)取人的食道癌細(xì)胞，破碎后離心，獲取細(xì)胞總蛋白；總蛋白作為制備單克隆抗體的抗原。
(2)將抗原注入小鼠腹腔進(jìn)行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時(shí)可加強(qiáng)免疫。短程免疫的步驟為(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(b)約一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(c)約一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；(d)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原；(e)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)量比1∶10的比例混合，并在融合劑(PEG 1450)作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。然后細(xì)胞培養(yǎng)至少一周，取其上清。
(4)在96孔板內(nèi)用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)為10,000。CO2孵箱培養(yǎng)24～48小時(shí)，待細(xì)胞長成單層。棄去培養(yǎng)液，向各孔內(nèi)加0.05％戊二醛(PBS為溶劑)100μl，室溫固定15分鐘。PBS洗三次后，每孔加封閉液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室溫封閉1小時(shí)后，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> (5)從-20℃取出細(xì)胞板，于37℃融化后，棄去原來的封閉液，重新加封閉液至滿孔，37℃放置1小時(shí)。用PBS-Tween洗三次，并吸干液體。
(6)向96孔板中加入雜交瘤細(xì)胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小時(shí)后，用PBS-Tween洗三次。加入已標(biāo)記HRP的羊抗鼠單抗(每孔100ul)，37℃放置1小時(shí)后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分鐘后，加入2M H2SO4(每孔50ul)終止反應(yīng)。
(7)測96孔板上各孔內(nèi)的O.D.450。選擇該值大于1.0者為陽性克隆的標(biāo)準(zhǔn)。
(8)重復(fù)步驟4-7二次，陽性率為100％，復(fù)核一次。
二、可識(shí)別食道癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體蛋白的純化1)用一定量(細(xì)胞數(shù)1,000,000-5,000,000)的細(xì)胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蠟一周后)，等待一周左右的時(shí)間，然后取小鼠腹水；在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞直至數(shù)量達(dá)到10,000,000以上，取其上清液。3)腹水或上清過Protein G柱，進(jìn)行親和層析，其步驟如下a)取腹水1ml，4000rpm離心10分鐘，取上清用PBS稀釋至10倍體積，再用0.45um的微孔濾膜過濾；細(xì)胞上清直接用0.45um的微孔濾膜過濾。b)用10倍體積的PBS過柱，使柱處于中性狀態(tài)，控制流速在1-2ml/min。c)樣品上柱并收集最后2ml溶液(用以檢測是否達(dá)到飽和)。d)用10倍體積的PBS過柱洗雜蛋白。e)用3-4ml甘氨酸洗脫并收集約1ml/管。f)取50-100ul的管中溶液，測定其O.D.280為2.78，按公式計(jì)算單克隆抗體蛋白的濃度為1.93mg/ml。三、可識(shí)別食道癌細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的鑒定a)WESTERN鑒定取人的食道癌組織和相應(yīng)的正常食道組織，分別用高速組織破碎機(jī)切碎后離心，獲取總蛋白。用單克隆抗體蛋白與上述總蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)僅在分子量20.5kd處出現(xiàn)一條帶。說明用食道癌細(xì)胞總蛋白為抗原制備的單克隆抗體能與食道癌組織中某一特定蛋白有特異性結(jié)合能力(見圖4)。b)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖5、圖6所示)表明該抗體可結(jié)合在食道癌組織的多個(gè)部位，而不會(huì)結(jié)合正常食道組織中的蛋白。c)小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)無菌操作，取人體食道癌組織，以生理鹽水制成勻漿，接種于裸鼠腋窩皮下，接種次日將小鼠隨機(jī)分為3組陰性對(duì)照組，腹腔注射等體積生理鹽水組；陽性對(duì)照組，腹腔注射阿霉素20mg/m2；治療組，腹腔注射單克隆抗體60mg/m2、。隔日給藥1次，共6次。第14天處死動(dòng)物，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。
抗食道癌單克隆抗體的小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如下表所示)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗食道癌單克隆抗體的抑瘤率為45.3％。
權(quán)利要求
1.一種能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，其特征在于該抗體是一種以人或動(dòng)物腫瘤組織提取的總蛋白為抗原免疫小鼠，同時(shí)用培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞鋪板，對(duì)得到的抗體進(jìn)行篩選而得的抗體。
2.一種如權(quán)利要求1所述的能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的制備方法，其特征在于該抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備方法包括下列步驟a)取患腫瘤的人或動(dòng)物的腫瘤組織，用高速組織破碎機(jī)切碎后離心，獲取總蛋白；將腫瘤細(xì)胞破碎后離心，獲取細(xì)胞總蛋白?？偟鞍鬃鳛橹苽鋯慰寺】贵w的抗原。b)將抗原注入小鼠腹腔進(jìn)行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時(shí)可加強(qiáng)免疫；c)取小鼠的脾臟制成細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞按一定的比例混合，并在融合劑作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞；進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)日，獲得細(xì)胞上清；d)用腫瘤細(xì)胞鋪在96孔板底部進(jìn)行培養(yǎng)，使其長成單層；將雜交瘤細(xì)胞的上清加入96孔板的各孔，用此96孔板對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選直至陽性率為100％，獲得具有穩(wěn)定分泌單克隆抗體能力的雜交瘤細(xì)胞系；e)將上法制備的雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，取細(xì)胞數(shù)為1,000,000-5,000,000的細(xì)胞注射到Balb/C小鼠，等待一周左右后取小鼠腹水；將上法制備的雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)直至數(shù)量達(dá)到10,000,000以上，取細(xì)胞上清；f)用Protein G的親和層析柱對(duì)小鼠腹水或細(xì)胞上清進(jìn)行純化，得到純的單克隆抗體蛋白；g)測定單克隆抗體蛋白的O.D.280和O.D.260，計(jì)算出單克隆抗體蛋白的濃度。
3.一種如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.一種如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于可以以該單克隆抗體為模式分子制備人源化抗體。
5.一種如權(quán)利要求3或4所述的單克隆抗體或人源化抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于該單克隆抗體或人源化抗體可單獨(dú)作為抗腫瘤藥物，也可與放射性核素、藥物或毒素形成單抗偶聯(lián)物作為抗腫瘤藥物。
6.一種如權(quán)利要求3或4所述的單克隆抗體或人源化抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于其中所述的腫瘤為肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他實(shí)體瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能識(shí)別體內(nèi)腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體及制備方法及其在制藥領(lǐng)域的用途。本發(fā)明公開的單克隆抗體是一種以人或動(dòng)物腫瘤組織經(jīng)獲取的總蛋白為抗原進(jìn)行免疫，同時(shí)利用培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞對(duì)得到的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，使得篩選出的細(xì)胞株產(chǎn)生體針對(duì)于腫瘤細(xì)胞表面蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明還公開了該抗體的制備方法。本發(fā)明公開的單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞針對(duì)性強(qiáng)，不損傷其他正常細(xì)胞，在開發(fā)抗腫瘤的靶向藥物方面前景廣闊，具有極大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1443777SQ02110978
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者胡賡熙 申請(qǐng)人:胡賡熙