專利名稱：白藜蘆醇的免疫增強用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白藜蘆醇的用途，尤其涉及白藜蘆醇在增強機體免疫功能中的用途。
已知該化合物具有抗炎、抗腫瘤、心血管保護(hù)等作用。白藜蘆醇對花生四烯酸代謝過程中的兩個關(guān)鍵的酶脂氧化酶(lipoxygenase)和環(huán)氧化酶(cyclooxygenase)有較強的抑制活性(Jang M.等，Science 1997，275218-220)，從而抑制PGE2、白三烯(LTs)等的生成。白藜蘆醇還能抑制巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞活性氧自由基及一氧化氮的生成(Jang D.S.等，Biochem.Pharmacol.1999，57(6)705-712)，抑制TNF-α的產(chǎn)生(Kawada N.等，Hepatology 1998，27(5)1265-1274)，從而起到抗炎作用。在抗腫瘤方面，白藜蘆醇能競爭性抑制誘癌劑二惡英(Dioxin)、多環(huán)芳香烴與受體結(jié)合，選擇性抑制細(xì)胞色素P4501A1活性，從而抑制致癌劑的代謝活化(Casper R.F.等，Mol.Pharmacol.1999，56(4)784-790；Ciolino H.P.等，Mol.Pharmacol.1999，56(4)760-767)；同時能抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡(Damianaki A.等，J.Cell Biochem.2000，78(3)429-441；Delmas D.等，Oncol.Rep.2000，7(4)847-852)。白藜蘆醇對心血管的保護(hù)作用表現(xiàn)為抑制血管收縮性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖(NaderaliE.K.等，Clin.Sci.(Colch)2000，98(5)537-543)；抑制血小板聚集(DobrydnevaY.等，Br.J.Pharmacol.1999，128(1)149-157)；抑制低密度脂蛋白的氧化修飾從而抑制冠心病的誘導(dǎo)(Fremont L.等，Life Sci.1999，64(26)2511-2521)；防止心肌缺血再灌注損傷(Salo M.等，F(xiàn)ree Radic.Res.2000，32(2)135-144)。
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能通過增強抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫反應(yīng)功能，促進(jìn)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，對免疫反應(yīng)異常低下或抑制的機體作用尤為顯著。
在機體免疫系統(tǒng)中，T淋巴細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，主要包括T輔助性淋巴細(xì)胞(TH)和T殺傷性淋巴細(xì)胞(CTL)兩大類，負(fù)責(zé)清除入侵體內(nèi)的病毒、細(xì)菌等微生物及腫瘤；但T淋巴細(xì)胞的激活，取決于抗原提呈細(xì)胞(包括樹突狀細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等)的抗原提呈和輔助作用；抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞活化時，產(chǎn)生分泌的細(xì)胞因子可根據(jù)引起的免疫效應(yīng)的不同分為Th1型(IL-12，IFN-γ，IL-2等)和Th2型(IL-10等)。Th1型細(xì)胞因子可促進(jìn)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，而Th2型細(xì)胞因子則抑制細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞等分泌的IL-12可促進(jìn)T細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生也可歸為Th1型細(xì)胞因子。
遲發(fā)型超敏(DTH)模型是經(jīng)典的反映T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的實驗動物模型，巨噬細(xì)胞是其主要的效應(yīng)細(xì)胞之一。
多量的乙醇攝入可導(dǎo)致機體免疫反應(yīng)功能的下降和低下，主要表現(xiàn)在對巨噬細(xì)胞功能的抑制；腫瘤病人晚期出現(xiàn)免疫功能反應(yīng)低下，容易并發(fā)各種感染，主要是T淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力降低，同時伴隨巨噬細(xì)胞抗原提呈功能的下降。
本發(fā)明采用淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生、整體DTH動物模型，以及腫瘤小鼠免疫反應(yīng)、效應(yīng)細(xì)胞功能分子表達(dá)，來科學(xué)有效地評價藥物對機體免疫系統(tǒng)的影響作用。
下面通過白藜蘆醇對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，細(xì)胞因子產(chǎn)生，DTH反應(yīng)，對乙醇誘導(dǎo)的DTH免疫反應(yīng)功能低下型小鼠和免疫反應(yīng)抑制型荷瘤小鼠中作用的藥理實驗來說明該化合物在增強機體免疫功能中的作用。
整體實驗白藜蘆醇采用灌胃給藥，用無菌0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)-生理鹽水配制成均勻懸液，對照以0.5％CMC代替，每只小鼠給藥量0.2毫升。
ELISA檢測細(xì)胞因子產(chǎn)生及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面功能分子表達(dá)所用抗體均為Pharmegen公司產(chǎn)品，刀豆蛋白(Conannavalin A，ConA)及細(xì)菌脂多糖(Lipopolysacchride，LPS)為Sigma公司產(chǎn)品，金黃色葡萄球菌菌體Sac(Staphylococcus aureus Cowan strain 1)為Biosciences公司產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)液及小牛血清為GIBCOL公司產(chǎn)品，[3H]-胸腺嘧啶核苷為上海原子能研究所產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。實施例1白藜蘆醇對正常小鼠免疫細(xì)胞功能的影響1、淋巴細(xì)胞增殖實驗；(1)無菌取小鼠脾臟，常規(guī)制成單細(xì)胞懸液，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為4×106/毫升。
(2)取96孔板，每孔加入上述細(xì)胞懸液100μL，以及不同濃度的白藜蘆醇及T細(xì)胞刺激劑ConA(終濃度5μg/mL)，對照組以培養(yǎng)液代替，培養(yǎng)總體積200μL。
(3)在含5％二氧化碳，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時。
(4)每孔加入1.9×1010Bq的[3H]-胸腺嘧啶核苷，繼續(xù)培養(yǎng)12小時后，培養(yǎng)板凍存于-20℃冰箱。
(5)用細(xì)胞收集儀(HARVESTER96，TOMTEC)收集細(xì)胞于玻璃纖維膜上，用液閃記數(shù)儀(MicroBeta Trilux，PerkinElmer)檢測[3H]-胸腺嘧啶核苷摻入量，反映細(xì)胞增殖情況。2、淋巴細(xì)胞因子誘導(dǎo)及檢測(1)脾細(xì)胞懸液的制備如上，將細(xì)胞濃度調(diào)為2×106/毫升，加入24孔板，每孔1mL。
(2)白藜蘆醇及ConA(終濃度5μg/mL，IL-2誘導(dǎo))或Sac(終濃度0.01％，II-12，IFN-γ，IL-10誘導(dǎo))加入24孔板，終體積2mL。
(3)在含5％二氧化碳，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24或48小時后，收集無菌培養(yǎng)上清凍存于-20℃冰箱，待測細(xì)胞因子。
(4)常規(guī)ELISA法檢測細(xì)胞因子的產(chǎn)生，用TMB作為酶反應(yīng)底物，OD450nm檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所做標(biāo)準(zhǔn)曲線換算細(xì)胞因子生成量。
如下表1所示，白藜蘆醇能明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，同時促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子(2，IFN-γ，IL-12)的產(chǎn)生，抑制Th2型細(xì)胞因子(II-10)的產(chǎn)生；表明白藜蘆醇有增強機體產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的作用。
表1 白藜蘆醇對正常小鼠免疫細(xì)胞功能的影響(X±S)分組劑量 T淋巴細(xì)胞增殖 細(xì)胞因子產(chǎn)生(24小時)(μM) (CPM×10-3) (pg/mL)無刺激 CONA IL-2 IFN-γ IL-12 IL-10對照組 - 2.08±0.35 18.96±0.374020±14 3153±621145±159534±448RES 0.752.52±0.39 23.75±0.29c 4102±4 3327±124 1416±747750±1611.5 2.39±0.46 30.78±0.89c4216±1b3462±36b1654±8c7313±510b3 2.12±0.52 31.45±0.43c4841±5c3600±15b1723±32c6478±188b6 1.99±0.56 32.74±0.21c5074±11c3752±14b1903±37c4371±644b與對照組比較bP＜0.05，cP＜0.01實施例2白藜蘆醇在小鼠DTH反應(yīng)中對乙醇誘導(dǎo)的免疫抑制作用的影響1、DTH反應(yīng)動物模型用2，4-二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DHT反應(yīng)，具體為雌性Balb/c小鼠隨機分組，每組8只用以丙酮-橄欖油(4∶1)配制的0.5％的2，4-二硝基氟苯20μL涂于小鼠兩后足致敏，第二天以同樣劑量加強致敏。
白藜蘆醇(4，16mg/kg)用0.5％CMC制成懸濁液后從致敏第一天開始給小鼠灌胃，直至實驗結(jié)束。同時，乙醇(16％w/v)加于小鼠飲用水瓶中，讓小鼠自由飲用。陰性對照，模型對照及乙醇對照組每天以0.5％CMC灌胃。第一次致敏5天后，用10μL 0.2％2，4-二硝基氟苯-丙酮-橄欖油(4∶1)涂于小鼠左耳片兩側(cè)攻擊；右耳片則涂以丙酮-橄欖油(4∶1)溶劑作為自身對照。24小時后，脫頸臼處死小鼠，用特制的8mm打孔器沿耳片外沿相同部位打下耳片，稱重，以左右耳片重量差作為小鼠DTH反應(yīng)的指標(biāo)。2、淋巴細(xì)胞亞群的改變及抗原提呈功能分子表達(dá)檢測(1)小鼠脾淋巴細(xì)胞1.0×106用冰冷的染色緩沖液(staining buffer)(PBS，含0.1％NaN3，1％FBS，pH7.2)洗后，重懸于staining buffer中。
(2)2.4G2單抗封閉Fc受體后，加入適宜濃度熒光標(biāo)記的抗體并于4℃冰箱中孵育30分鐘。
(3)細(xì)胞用2.0mL染色緩沖液洗兩次后，重懸于0.5mLPBS(pH7.2)中，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析，數(shù)據(jù)用CellQuestTM軟件(Becton Dickinson，San Jose，CA)進(jìn)行分析。
(4)進(jìn)行Mac-1+細(xì)胞抗原提呈功能分子分析采用FITC-Mac-1與PE-H-2KdPE-I-Ad/I-EdPE-CD80，PE-anti-mouse-CD86雙染，其余操作同上。
如下表2所示白藜蘆醇單獨使用能促進(jìn)小鼠DTH免疫反應(yīng)；乙醇能導(dǎo)致小鼠DTH反應(yīng)的顯著抑制，白藜蘆醇能顯著地對抗乙醇的抑制作用。白藜蘆醇對小鼠淋巴細(xì)胞亞群無明顯的影響作用，但它能明顯地促進(jìn)脾臟巨噬細(xì)胞的抗原提呈重要功能分子MHC-II的表達(dá)，并且明顯對抗乙醇引起的MHC-II表達(dá)的抑制。
表2 白藜蘆醇對正常及乙醇抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)功能的影響(X±S)分組淋巴細(xì)胞亞群(％) 抗原提呈分子表達(dá)DTH耳腫乙醇 白藜蘆醇Mac-1+-I-Ad/I-Ed脹(mg) CD4+CD8+B Mac-1+(16w/v) (mg/kg) (MHC-II)-- 14.3±0.824.5 14.0 46.8 12.6 2185-4 15.4±1.524.7 13.4 49.0 11.1 269016 16.5±1.3b23.3 12.8 48.1 13.1+- 11.9±1.1b25.0 15.1 49.4 9.11841+4 15.2±2.3e24.7 14.2 49.6 10.6 2558+16 18.9±5.1e23.8 14.8 44.6 10.0與對照組比較，bP＜0.05，與乙醇對照組比較，eP＜0.05實施例3白藜蘆醇對晚期荷瘤小鼠免疫細(xì)胞功能的影響1、CAS1M免疫抑制型荷瘤小鼠模型CAS1M纖維肉瘤細(xì)胞最初是在一雄性Balb/c小鼠上用Schmidt-Ruppin品系的魯斯氏肉瘤病毒誘導(dǎo)而來。取傳代第三天的生長良好的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/毫升。于雄性Balb/c小鼠背部皮內(nèi)注射，每鼠0.1mL(3×105)。取同批接種五周且瘤徑相當(dāng)?shù)膭游镫S機分組，每組8-10只。白藜蘆醇給藥劑量參照前期在DTH模型中的結(jié)果采用4mg/kg劑量，對照組則以0.5％CMC代替；每天灌胃給藥，持續(xù)2-3周，到第8周左右進(jìn)行實驗，作為晚期荷瘤組。正常對照組采用與晚期組同批次但未接種腫瘤的小鼠。2、實驗時取各組小鼠(＞3只)脾細(xì)胞混合懸液，分別調(diào)至適宜細(xì)胞濃度，進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗，或培養(yǎng)48小時取上清液，用ELISA法檢測細(xì)胞因子，或用流式細(xì)胞儀檢測脾臟巨噬細(xì)胞抗原提呈功能分子(MHC-II，CD80)的表達(dá)。
如下表3所示白藜蘆醇口服給藥兩周后，能顯著提高晚期荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)功能，解除功能抑制的現(xiàn)象。明顯提高晚期腫瘤鼠淋巴細(xì)胞IL-2，IFN-γ，IL-12的產(chǎn)生，同時降低免疫抑制型淋巴因子IL-10的產(chǎn)生。白藜蘆醇明顯改善晚期腫瘤所表現(xiàn)的機體免疫功能低下。
表3白藜蘆醇對荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖，細(xì)胞因子產(chǎn)生及抗原提呈功能分子表達(dá)的影響(X±S)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 抗原提呈功能分子表分組 細(xì)胞因子產(chǎn)生(mg/ml)(CPMx10-3) 達(dá)(平均熒光強度)T淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞 IL-2IFN-γ IL-12 IL-10 MHC-II CD80正常組38.74±4.1932.29±1.80 2.60±0.06 29.04±0.65 3.48±0.05 29.18±1.26 1116554晚期腫瘤1.44±0.25c0.04±0.01c2.41±0.01a7.67±0.02b2.13±0.03b23.71±1.32b541 509組白藜蘆醇42.67±3.90af14.95±3.01c，a3.39±0.07c，e14.92±0.86b，e3.82±0.15a，e23.49±0.54a，d870 660治療組與正常對照組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與晚期腫瘤組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01有益效果本發(fā)明發(fā)掘了已知化合物白藜蘆醇在增強機體免疫功能中的新用途，開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種具有如下結(jié)構(gòu) 具有抗炎、抗腫瘤和心血管保護(hù)作用的白藜蘆醇其特征在于在增強抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞免疫反應(yīng)功能，促進(jìn)機體產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)中的作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作用，其特征在于增強機體產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，提高機體抗病能力和免疫反應(yīng)機能，在藥物治療或預(yù)防腫瘤、艾滋病、免疫缺陷癥、衰老等所致的免疫系統(tǒng)功能降低和衰退中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及白藜蘆醇的新用途。該化合物具有增強抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫反應(yīng)功能，促進(jìn)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的作用，對免疫反應(yīng)異常低下或抑制的機體作用尤為顯著。
文檔編號A61K31/045GK1459280SQ02111769
公開日2003年12月3日 申請日期2002年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月21日
發(fā)明者左建平, 馮泉紅, 李曉玉, 趙維民 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所