專利名稱：組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，具體說涉及用于引導組織和器官再生的組織相容性三維多孔支架的制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程是一個涉及到醫(yī)學、化學、生物學、材料學等多學科、多領(lǐng)域的交叉研究課題，而三維支架的構(gòu)建是其中的關(guān)鍵之一。只有構(gòu)建出具有特定微觀結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的機械性能、適宜的降解性能以及良好的生物相容性的支架，才能有效地促進細胞的粘附和生長，進而引導組織和器官的再生。
膠原是哺乳動物結(jié)締組織中的主要成分，構(gòu)成人體約30％的蛋白質(zhì)，在皮膚中的干重達72％。膠原有19種類型，最常見的是I型、II型和III型。其中I型最豐富，且性能優(yōu)良，被廣泛用于生物材料。膠原材料雖然具有無可比擬的生物相容性，但以純膠原構(gòu)建的支架的機械強度較低，降解速率過快，不能滿足組織工程支架的要求，因此有必要添加其它組份以改善膠原支架的性能并通過適當?shù)姆椒ń宦?lián)以獲得與細胞外基質(zhì)相類似的支架結(jié)構(gòu)，并具有與組織再生相匹配的降解速率。
殼聚糖是一種帶有多氨基的多糖類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和一些性質(zhì)與細胞外基質(zhì)的主要成分氨基葡聚糖類似，具有良好的生物相容性和適當?shù)慕到庑阅?，無刺激性、無免疫原性、無熱源反應(yīng)，并具有促進創(chuàng)面愈合的功能，而且來源廣泛、成本低廉。目前殼聚糖已廣泛應(yīng)用于醫(yī)用縫合線、創(chuàng)面敷料以及組織工程三維支架中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法。
本發(fā)明是以膠原和殼聚糖為材料，通過冷凍-凍干法制備組織工程用多孔支架，并采用物理和化學的方法對多孔支架進行交聯(lián)改性。該制備方法包括以下步驟1)分別在酸性條件下配制濃度(按重量)為0.1％～5％，最好為0.3％～3％的膠原溶液和殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液滴入膠原溶液中，攪拌均勻得膠原/殼聚糖混合溶液，殼聚糖溶液的含量(按重量)為1～80％，最好為5～30％；2)將膠原/殼聚糖共混液注入模具中，采用冷凍—凍干法，在-10℃～-100℃，最好在-10℃～-50℃溫度下冷凍0.05～5小時后，于凍干機中凍干，得膠原/殼聚糖三維多孔支架；3)將步驟2)所得膠原/殼聚糖三維多孔支架用真空干熱物理方法交聯(lián)，交聯(lián)溫度為80～130℃，時間為1～48小時，然后在乙酸溶液浸泡1～3小時，再放入醛類化合物或碳化二亞胺類化合物中化學交聯(lián)1～48小時；4)清洗，再次冷凍、凍干。
本發(fā)明中，配制膠原溶液的膠原材料是牛腱膠原、豬皮膠原、鼠尾膠原。配制膠原溶液和殼聚糖溶液所用的酸為乙酸、甲酸、鹽酸中的一種或其混合物。所說的膠原/殼聚糖混合液的pH值為2～5。
本發(fā)明中，醛類化合物是甲醛或戊二醛。醛類化合物的濃度為0.01％～2.5％，優(yōu)選濃度為0.05～0.25％。
本發(fā)明中，碳化二亞胺類化合物是指1-乙基-3-3二甲基胺丙基-碳化二亞胺(EDAC)。碳化二亞胺類化合物的濃度為0.001～1M的水溶液，優(yōu)選濃度為0.01～0.3M。
本發(fā)明中對所說的殼聚糖材料的分子量沒有特別的要求，但優(yōu)選使用分子量范圍為1～200萬的殼聚糖。
本發(fā)明方法所采用的材料屬于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，而且材料來源廣泛，成本低廉。采用冷凍-凍干法可以通過調(diào)節(jié)冷凍溫度、共混液濃度或pH值、膠原與殼聚糖的共混比例等因素可控制多孔支架的微結(jié)構(gòu)，制備出具有適宜孔徑和孔隙率的三維多孔支架。采用殼聚糖為橋聯(lián)劑，經(jīng)過物理或化學的方法交聯(lián)以調(diào)節(jié)多孔支架的降解速率。通過本發(fā)明制備得多孔支架可以廣泛地應(yīng)用于皮膚、軟骨、骨、血管、神經(jīng)、肌腱、心臟瓣膜等多種組織或器官的重建或再生，以有效促進上述組織或器官的體外構(gòu)建或體內(nèi)再生。


圖1a殼聚糖濃度為10％時，支架的SEM照片；圖1b殼聚糖濃度為50％時，支架的SEM照片；圖2a冷凍溫度為-50℃條件下制備的支架的SEM照片；圖2b冷凍溫度為-20℃條件下制備的支架的SEM照片；圖3不同濃度的戊二醛交聯(lián)的殼聚糖濃度為10％的牛腱膠原/殼聚糖支架的降解性能；圖4 0.25％戊二醛交聯(lián)的殼聚糖濃度為10％的牛腱膠原/殼聚糖支架種植3T3細胞7天后的激光共聚焦顯微鏡照片；圖5a 0.25％戊二醛交聯(lián)的殼聚糖濃度為10％的牛腱膠原/殼聚糖支架植入兔耳背3天的組織切片圖；圖5b是0.25％戊二醛交聯(lián)的殼聚糖濃度為10％的牛腱膠原/殼聚糖支架植入兔耳背7天的組織切片圖；圖5c是0.25％戊二醛交聯(lián)的殼聚糖濃度為10％的牛腱膠原/殼聚糖支架植入兔耳背14天的組織切片圖；圖5d是0.25％戊二醛交聯(lián)的殼聚糖濃度為10％的牛腱膠原/殼聚糖支架植入兔耳背28天的組織切片圖；圖6是0.25％戊二醛交聯(lián)的殼聚糖濃度為10％的豬皮膠原/殼聚糖支架種植3T3細胞7天后的激光共聚焦顯微鏡照片；具體實施方式
實施例1殼聚糖含量對牛腱膠原/殼聚糖多孔支架的微結(jié)構(gòu)的影響采用酶解與酸抽提相結(jié)合的方法從牛腱中提取得到牛腱膠原。用乙酸溶液分別配制濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，然后將殼聚糖溶液與膠原溶液均勻共混獲得殼聚糖含量分別為(按重量)10％、20％、30％、50％的膠原/殼聚糖混合溶液。于-20℃冷凍1小時，凍干后可制備出具有不同孔徑和形貌的多孔支架，見圖1a、圖1b。圖1a、圖1b分別是殼聚糖含量為10％，50％的膠原/殼聚糖支架的掃描電鏡(SEM)照片。
實施例2冷凍溫度對牛腱膠原/殼聚糖多孔支架的微結(jié)構(gòu)的影響采用酶解與酸抽提相結(jié)合的方法從牛腱中提取得到牛腱膠原。用0.5M的乙酸溶液分別配制濃度為0.5％的膠原溶液和0.5％殼聚糖溶液，然后將殼聚糖溶液與膠原溶液均勻共混獲得殼聚糖含量為(按重量)10％的膠原/殼聚糖混合溶液。然后分別于-50℃、-20℃冷凍1小時，凍干后可制備出孔徑大小不同的多孔支架，見圖2a、圖2b。圖2a、圖2b分別為在-50℃，-20℃溫度下冷凍制備的多孔支架的SEM照片。
實施例3牛腱膠原/殼聚糖多孔支架的交聯(lián)采用酶解與酸抽提相結(jié)合的方法從牛腱中提取得到牛腱膠原。用0.5M的乙酸溶液分別配制濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，然后將殼聚糖溶液與膠原溶液均勻共混獲得殼聚糖含量為(按重量)10％的膠原/殼聚糖混合溶液。采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍1小時，然后凍干機中24小時凍干。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯(lián)24小時，得到干熱交聯(lián)的牛腱膠原/殼聚糖多孔支架。經(jīng)真空干熱交聯(lián)獲得的牛腱膠原/殼聚糖多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小時后，于4℃下用0.05％～0.25％的戊二醛溶液交聯(lián)24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯(lián)度不同的膠原/殼聚糖多孔支架。交聯(lián)后牛腱膠原/殼聚糖多孔支架的耐降解性能得到顯著提高，見圖3。
實施例4牛腱膠原/殼聚糖多孔支架體外評價采用酶解與酸抽提相結(jié)合的方法從牛腱中提取得到牛腱膠原。用0.5M的乙酸溶液分別配制濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，然后將殼聚糖溶液與膠原溶液均勻共混獲得殼聚糖含量為(按重量)10％的膠原/殼聚糖混合溶液。采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍1小時，然后凍干機中24小時凍干。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯(lián)24小時。真空干熱交聯(lián)的多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小時后，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交聯(lián)24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯(lián)的膠原/殼聚糖多孔支架。該多孔支架中種植1ml的3T3細胞(500萬/ml)，37℃下5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，隔日換液。熒光素二醋酸酯(FDA)染色后激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察在支架表面下200μm內(nèi)可見大量3T3細胞，細胞生長狀態(tài)良好，見圖4。
實施例5牛腱膠原/殼聚糖多孔支架體內(nèi)評價采用酶解與酸抽提相結(jié)合的方法從牛腱中提取得到牛腱膠原。用0.5M的乙酸溶液分別配制濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，然后將殼聚糖溶液與膠原溶液均勻共混獲得殼聚糖含量為(按重量)10％的膠原/殼聚糖混合溶液。采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍1小時，然后凍干機中24小時凍干。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯(lián)24小時。真空干熱交聯(lián)的多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小時后，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交聯(lián)24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯(lián)的膠原/殼聚糖多孔支架。支架消毒后埋植于人工切除的兔全厚皮膚創(chuàng)面，分別于埋植后3天，7天，14天，28天后做組織切片觀察。埋植3天后有少量炎癥細胞存在。7天后可見成纖維細胞長入，支架結(jié)構(gòu)仍然保留，支架中未見明顯的炎癥細胞，14天后，支架中已經(jīng)有大量的成纖維細胞生長進入，并且支架已經(jīng)有一定程度的血管化。埋植28天后已于周圍組織融合完好，呈真皮組織樣，見圖5a、圖5b、圖5c、圖5d。圖5a、圖5b、圖5c、圖5d分別為膠原/殼聚糖支架植入體內(nèi)3天，7天，14天，28天的組織切片圖。
實施例6豬皮膠原/殼聚糖多孔支架構(gòu)建與體外評價采用酶解與酸抽提相結(jié)合的方法從新鮮豬皮中提取得到豬皮膠原。用0.5M的乙酸溶液分別配制濃度為0.5％的膠原溶液和濃度為0.5％的殼聚糖溶液，然后將殼聚糖溶液與膠原溶液均勻共混獲得殼聚糖含量為(按重量)10％的膠原/殼聚糖混合溶液。采用冷凍-凍干法，于-20℃冷凍1小時，然后凍干機中24小時凍干。凍干的膠原/殼聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干熱交聯(lián)24小時，真空干熱交聯(lián)的多孔支架于100ml 0.5M的乙酸溶液中浸泡1小時后，于4℃下用0.25％的戊二醛溶液交聯(lián)24小時，用三蒸水反復漂洗后，再次冷凍-凍干獲得交聯(lián)的膠原/殼聚糖多孔支架。該多孔支架中種植1ml的3T3細胞(500萬/ml)，37℃下5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，隔日換液。FDA染色后CLSM觀察可見在支架中的孔壁上貼附有大量3T3細胞，細胞呈圓顆粒狀，細胞間可見已有細胞間質(zhì)存在，見圖6。
權(quán)利要求
1.組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于它包括以下步驟1)分別在酸性條件下配制濃度(按重量)為0.1％～5％的膠原溶液和殼聚糖溶液，將殼聚糖溶液滴入膠原溶液中，攪拌均勻得膠原/殼聚糖混合溶液，殼聚糖溶液的含量(按重量)為1～80％；2)將膠原/殼聚糖共混液注入模具中，采用冷凍—凍干法，在-10℃～-100℃溫度下冷凍0.05～5小時后，于凍干機中凍干，得膠原/殼聚糖三維多孔支架；3)將步驟2)所得膠原/殼聚糖三維多孔支架用真空干熱物理方法交聯(lián)，交聯(lián)溫度為80～130℃，時間為1～48小時，然后在乙酸溶液浸泡1～3小時，再放入醛類化合物或碳化二亞胺類化合物中化學交聯(lián)1～48小時；4)清洗，再次冷凍、凍干。
2.按權(quán)利要求1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于配制膠原溶液的膠原材料是牛腱膠原、豬皮膠原、鼠尾膠原。
3.按權(quán)利要求1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于配制膠原溶液和殼聚糖溶液所用的酸為乙酸、甲酸、鹽酸中的一種或其混合物。
4.按權(quán)利要求1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于所說的膠原/殼聚糖混合液，其殼聚糖溶液的含量(按重量)為5～30％。
5.按權(quán)利要求書1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于所說的膠原/殼聚糖混合液的pH值為2～5。
6.按權(quán)利要求1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于所說的醛類化合物是甲醛或戊二醛。
7.按權(quán)利要求1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征是碳化二亞胺類化合物是指1-乙基-3-3二甲基胺丙基-碳化二亞胺。
8.按權(quán)利要求1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于步驟2)的冷凍溫度為-10℃～-50℃。
9.按權(quán)利要求1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于所說的醛類化合物的濃度為0.01％～2.5％，優(yōu)選濃度為0.05～0.25％。
10.按權(quán)利要求書1所述的組織工程用膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于碳化二亞胺類化合物的濃度為0.001～1M的水溶液，優(yōu)選濃度為0.01～0.3M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用天然生物材料膠原和殼聚糖為原料，通過冷凍－凍干，再進一步通過真空干熱法、醛類化合物或碳化二亞胺類化合物交聯(lián)，制備具有微結(jié)構(gòu)可控、適宜降解速率和良好生物相容性的多孔支架。本發(fā)明的膠原/殼聚糖支架的生物相容性好，降解速率可控，且材料來源廣泛，成本低，制備工藝簡單可行，重復性好，所構(gòu)建的支架可以廣泛地應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號A61L31/04GK1394655SQ02112498
公開日2003年2月5日 申請日期2002年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月10日
發(fā)明者高長有, 馬列, 王登勇, 毛崢偉, 沈家驄, 韓春茂 申請人:浙江大學