專利名稱：用靜電吸引層層自組裝改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，具體說是用多元胺胺解并在此基礎(chǔ)上靜電吸引層層自組裝具生物活性的聚電解質(zhì)，以制備表面具有細(xì)胞相容性的聚酯類生物材料的方法。
背景技術(shù)：
聚合物生物材料因具有優(yōu)良的物理和化學(xué)性能，在組織工程中的應(yīng)用越來越廣泛。但由于這類材料特殊的應(yīng)用環(huán)境——需要直接與人體的體液、器官、組織等接觸，因此制備一種表面具有良好生物相容性的聚合物生物材料成為組織工程發(fā)展中非常關(guān)鍵的途徑之一。
聚酯類生物材料不僅具有良好的物理機(jī)械性能、無毒性、易加工成型性，而且還具有組織工程材料所特有的可生物降解性，因此越來越受到人們的關(guān)注。以乳酸或乙醇酸為骨架單元的聚酯類聚合物，由于符合臨床使用要求而被許可用作生物組織培養(yǎng)的聚合物，已發(fā)展到最為廣泛的應(yīng)用。但未經(jīng)過改性的聚酯類聚合物由于其本身的疏水性和表面惰性，導(dǎo)致不能提供一個(gè)友好的界面以有效促進(jìn)組織和器官的生長；降解后形成的局部酸性也會(huì)導(dǎo)致周圍器官和組織產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。目前雖然存在多種改善其表面性能的表面修飾方法，但均存在操作工藝復(fù)雜，修飾表面穩(wěn)定性差，尤其不適應(yīng)于多孔的體型復(fù)雜的支架材料和制品等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，用靜電吸引層層自組裝改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法。
本發(fā)明的方法包括以下步驟1)在有機(jī)溶劑中溶解多元胺制備濃度為0.001～1g/ml的多元胺溶液；2)將聚酯類聚合物材料浸入多元胺溶液中，在0～100℃溫度下，反應(yīng)0.1～10小時(shí)；3)將聚酯類聚合物材料取出多元胺溶液，用去離子水或無水乙醇浸泡清洗，真空干燥至恒重；4)用指示劑茚三酮檢測聚酯類聚合物材料表面的胺基；
5)將表面帶自由胺基的聚合物材料浸入濃度為0.0024～0.12mol/L的酸溶液中，在室溫下進(jìn)行酸化反應(yīng)1～60分鐘，反應(yīng)結(jié)束，取出并用水沖洗干凈；6)將步驟5)所得表面帶正電的聚酯類聚合物首先浸入濃度為0.001～1000mg/ml的生物活性聚陰離子水溶液中，吸附一層陰離子，表面帶上負(fù)電荷；用三蒸水洗去游離的陰離子后再浸入濃度為0.001～1000mg/ml的生物活性聚陽離子酸溶液中，吸附一層陽離子后先用酸沖洗，再用三蒸水洗去游離的陽離子，這時(shí)表面又帶上了正電荷，重復(fù)上述步驟，使生物活性陰陽離子交替組裝在聚酯類聚合物材料上。
7)反應(yīng)結(jié)束后，取出并用酸或水沖洗干凈，室溫下真空干燥至恒重。
本發(fā)明中，多元胺可以是小分子多元胺和聚多胺，小分子多元胺包括乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、二正辛胺、二正壬胺、二正癸胺的一種或其混合物，聚多胺包括聚乙烯基亞胺、聚烯丙基胺中的一種或其混合物。
本發(fā)明中，用于溶解多元胺的有機(jī)溶劑包括，但不限于乙醇、乙醇胺、正丙醇、異丙醇、乙二醇二甲醚、二甲基亞砜中的一種或其混合物。
所述的聚合物材料，通常是聚酯類聚合物膜和多孔支架。聚酯類聚合物優(yōu)選聚己內(nèi)酯、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、無定型聚(D，L-乳酸)(PDLLA)、聚酯型聚氨酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚乙醇酸、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)中的一種及這些聚合物的共聚物。
所使用的聚酯類聚合物的分子量可以不必考慮，但優(yōu)選使用分子量范圍為10000～1000000的聚酯類聚合物。
多孔支架是指通過致孔劑法、相分離法、編織法、乳液凍結(jié)干燥法、徑跡刻蝕法、快速成型法或無紡法等方法制備的內(nèi)部孔洞相互連通的支架。
本發(fā)明中，生物活性聚陰離子可選用苯乙烯磺酸鈉(PSS)、硫酸葡聚糖(DS)、硫酸軟骨素(CSAS)、海藻酸鈉(NaAlg)、聚丙烯酸鈉(PAA)、聚甲基丙烯酸、肝素、硫酸肝素中的一種或其混合物；聚陽離子可選用膠原(Collagen)、殼聚糖(Chitosan)、多聚賴氨酸、聚乙烯基亞胺鹽酸鹽(PEI)、聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)中的一種或其混合物。上述聚陰離子或聚陽離子還可選用具有兩性電荷性質(zhì)的各種蛋白、生長因子和分化誘導(dǎo)因子，這些蛋白、生長因子和分化誘導(dǎo)因子可通過調(diào)節(jié)pH值來得到不同的帶電性質(zhì)等電點(diǎn)下帶正電，等電點(diǎn)上帶負(fù)電。
本發(fā)明方法步驟6)中，生物活性聚陰離子水溶液和生物活性聚陽離子酸溶液的濃度優(yōu)選0.1～50mg/ml。
本發(fā)明采用多元胺胺解聚酯類聚合物表面首先得到表面帶自由胺基的聚合物，再以酸酸化使聚合物表面帶正電，然后將它交替浸入聚陰離子和聚陽離子的溶液中，通過聚陰離子和聚陽離子的靜電引力作用利用靜電吸引層層自組裝的方法，在其表面交替組裝單層或多層具有生物活性的不同聚陰離子和聚陽離子，這些生物活性聚電解質(zhì)經(jīng)層層組裝后仍然保持其原有的生物活性，得到表面具有細(xì)胞相容性的平面膜和三維多孔的支架材料及其制品。這些自由胺基不僅有效提供了進(jìn)一步與生物活性聚電解質(zhì)反應(yīng)的活性位點(diǎn)，而且其降解后的胺基能適度中和聚合物在生物降解過程中產(chǎn)生的局部酸性，有望減輕因局部酸性而引起的器官和組織周圍的炎癥。靜電吸引自組裝生物活性聚電解質(zhì)后，更可進(jìn)一步提高材料的細(xì)胞相容性和其它具有特殊功能的生物活性。本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易操作，重現(xiàn)性好，適用范圍廣，環(huán)境友好。適用于多種復(fù)雜體型的材料表面、多孔支架材料及其宏觀制品的表面修飾。在多種具有復(fù)雜體型結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)用裝置和多孔組織工程支架材料的表面修飾中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是胺解聚(L-乳酸)膜上PSS/殼聚糖多層自組裝后水動(dòng)態(tài)接觸角(前進(jìn)角)隨組裝層數(shù)的變化情況。其中未改性聚(L-乳酸)的前進(jìn)角為85.3度。
圖2是聚(L-乳酸)膜表面改性前后人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞在其上分別生長12小時(shí)和4天后的粘附率、活性和增殖率，其中a為組織培養(yǎng)聚苯乙烯(TCPS)，b為未改性聚(L-乳酸)膜，c為組裝一層PSS的聚(L-乳酸)，d為組裝一雙層PSS/殼聚糖(外層為殼聚糖)的聚(L-乳酸)膜，e為組裝三雙層PSS/殼聚糖(外層為殼聚糖)的聚(L-乳酸)，f為組裝五雙層PSS/殼聚糖(外層為殼聚糖)的聚(L-乳酸)膜。
圖3是聚(L-乳酸)膜表面組裝單層PSS后，人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞生長4天后的電鏡照片，其中圖3a放大倍數(shù)為1000倍，可清晰看到內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長的形貌；圖3b放大倍數(shù)為180倍。
圖4是聚(L-乳酸)膜表面組裝三雙層殼聚糖(外層為殼聚糖)后，人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞生長4天后的電鏡照片，其中圖4a放大倍數(shù)為472倍，可清晰看到內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長及胞間聯(lián)系的情形；圖4b放大倍數(shù)為180倍。
圖5是聚酯型聚氨酯膜表面組裝不同聚陰離子和膠原后，水動(dòng)態(tài)接觸角的變化情況?？瞻拙埘バ途郯滨ツさ那斑M(jìn)角為80度。
圖6是聚酯型聚氨酯膜表面組裝不同聚陰離子和膠原(一雙層，外層為膠原)后人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞在其上分別生長12小時(shí)的粘附率，圖中a為肝素，b為CSAS，c為PAA，d為DS，e為NaAlg，f為PSS。
圖7是聚酯型聚氨酯膜表面組裝不同聚陰離子和膠原(一雙層，外層為膠原)后人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞在其上分別生長4天后的增殖率，圖中a為肝素，b為CSAS，c為PAA，d為DS，e為NaAlg，f為PSS。
圖8是聚酯型聚氨酯膜表面組裝不同雙層PSS/PEI(外層為PEI)后人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞在其上分別生長12小時(shí)的粘附率和生長4天后的增殖率。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)例1將聚(L-乳酸)溶解于1，4-二氧六環(huán)中(聚乳酸重量百分比含量為3％)，并澆鑄于成膜模具中流延成膜。將聚(L-乳酸)膜浸入濃度為0.06g/mL的1，6-己二胺/正丙醇溶液中，50℃下反應(yīng)8分鐘，用去離子水浸泡清洗，真空下烘干。取小片膜于濃度為1.0mol/L的茚三酮溶液中，顯藍(lán)紫色檢測膜表面存在游離的胺基(-NH2)。
將上述表面帶游離胺基的聚(L-乳酸)膜浸入到濃度為0.012mol/L的鹽酸中酸化15分鐘，取出并用三蒸水漂洗后，浸入1.0mg/ml聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液中浸泡20分鐘，用三蒸水漂洗干凈并用氮?dú)獯蹈桑俳?.0mg/ml殼聚糖乙酸溶液中浸泡15分鐘，先用1％乙酸溶液沖洗，再用三蒸水漂洗干凈并用氮?dú)獯蹈?。重?fù)上述步驟可制備多層組裝的聚(L-乳酸)改性膜。聚(L-乳酸)膜經(jīng)PSS/殼聚糖層層靜電自組裝后，親水性明顯提高，且呈有規(guī)律的交替變化，結(jié)果見圖1。這同時(shí)也證明了層層靜電自組裝過程的發(fā)生。
用I型膠原酶將人體臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞消化分離，并種植于底部平鋪有聚合物膜的96孔組織培養(yǎng)級聚苯乙烯(TCPS)培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液為PRMI1640和小牛血清，每孔接種200μl，將培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液，測定細(xì)胞粘附率(12小時(shí))和培養(yǎng)4天后的增殖率。聚(L-乳酸)膜經(jīng)層層靜電自組裝改性后，對內(nèi)皮細(xì)胞的相容性明顯提高，結(jié)果見圖2，3，4。
實(shí)例2將聚酯型聚氨酯溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，使聚合物溶液濃度達(dá)到0.13g/mL，將此溶液澆鑄于成膜模具中流延成膜。將聚酯型聚氨酯膜浸入濃度為0.06g/ml的1，6-己二胺/正丙醇溶液中，37℃下反應(yīng)5分鐘，用三蒸水浸泡清洗，真空干燥至恒重。取2厘米長和1厘米寬的胺解聚酯型聚氨酯，在濃度為1.0mol/L的茚三酮/無水乙醇溶液中浸泡1分鐘取出，在80℃下加熱，膜表面呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)紫色，表明在該膜表面上存在自由的胺基(-NH2)。將上述表面帶自由胺基的聚酯型聚氨酯膜浸入到濃度為0.012mol/l的鹽酸中酸化15分鐘，取出并用三蒸水漂洗后分別在肝素(1.0mg/mL Heparin)，硫酸軟骨素(1.0mg/mL CSAS)，聚丙烯酸鈉(1.0mg/mL，PAA)，海藻酸鈉(1.0mg/mL，NaAlg)，硫酸葡聚糖(1.0mg/mL，DS)，聚苯乙烯磺酸鈉(1.0mg/mL，PSS)中浸泡20分鐘，用三蒸水漂洗干凈并用氮?dú)獯蹈桑俜謩e浸入濃度為0.1％的膠原乙酸溶液或濃度為1.0mg/ml的PEI乙酸溶液中20分鐘。先用1.0％的乙酸漂洗，再用三蒸水漂洗干凈并用氮?dú)獯蹈?，放入真空烘箱中烘干。用熒光?biāo)記和水動(dòng)態(tài)接觸角測試(結(jié)果見圖5)可證明上述靜電吸引自組裝過程的發(fā)生。
用I型膠原酶將人體臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞消化分離，并種植于底部平鋪有聚合物膜的96孔組織培養(yǎng)級聚苯乙烯(TCPS)培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液為PRMI1640和小牛血清，每孔接種200μl，將培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液，測定細(xì)胞粘附率(12h)和培養(yǎng)4天后的增殖率。聚酯型聚氨酯膜經(jīng)層層靜電自組裝改性后，對內(nèi)皮細(xì)胞的相容性明顯提高，結(jié)果見圖6，7，8。
權(quán)利要求
1.用靜電吸引層層自組裝改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，該方法包括下列步驟1)在有機(jī)溶劑中溶解多元胺制備濃度為0.001～1g/mL的多元胺溶液；2)將聚酯類聚合物材料浸入多元胺溶液中，在0～100℃溫度下，反應(yīng)0.1～10小時(shí)；3)將聚酯類聚合物材料取出多元胺溶液，用去離子水或無水乙醇浸泡清洗，真空干燥至恒重；4)用指示劑茚三酮檢測聚酯類聚合物材料表面的胺基；5)將表面帶自由胺基的聚合物材料浸入濃度為0.0024～0.12mol/L的酸溶液中，在室溫下進(jìn)行酸化反應(yīng)1～60分鐘，反應(yīng)結(jié)束，取出并用水沖洗干凈；6)將步驟5)所得表面帶正電的聚酯類聚合物首先浸入濃度為0.001～1000mg/mL的生物活性聚陰離子水溶液中，吸附一層陰離子，表面帶上負(fù)電荷；用三蒸水洗去游離的陰離子后再浸入濃度為0.001～1000mg/ml的生物活性聚陽離子酸溶液中，吸附一層陽離子后先用酸沖洗，再用三蒸水洗去游離的陽離子，這時(shí)表面又帶上了正電荷，重復(fù)上述步驟，使生物活性陰陽離子交替組裝在聚酯類聚合物材料上。7)反應(yīng)結(jié)束后，取出并用酸或水沖洗干凈，室溫下真空干燥至恒重。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是所說的多元胺是小分子多元胺和聚多胺，小分子多元胺包括乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、二正辛胺、二正壬胺、二正癸胺的一種或其混合物，聚多胺包括聚乙烯基亞胺、聚烯丙基胺中的一種或其混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是用于溶解多元胺的有機(jī)溶劑是乙醇、乙醇胺、正丙醇、異丙醇、乙二醇二甲醚、二甲基亞砜中的一種或其混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是所說的聚酯類聚合物材料是聚酯類聚合物膜和多孔支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是所說的聚酯類聚合物為聚己內(nèi)酯、聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、無定型聚(D，L-乳酸)、聚酯型聚氨酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚乙醇酸、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)中的一種或這些聚合物的共聚物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是所說的聚陰離子為聚苯乙烯磺酸鈉、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、海藻酸鈉、聚丙烯酸鈉、聚甲基丙烯酸、肝素、硫酸肝素中的一種或其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是所說的聚陽離子有膠原、殼聚糖、多聚賴氨酸、聚乙烯基亞胺鹽酸鹽、聚烯丙基胺鹽酸鹽中的一種或其混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是所說的聚陰離子和聚陽離子是具有兩性電荷性質(zhì)的蛋白、生長因子和分化誘導(dǎo)因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是所說的生物活性聚陰離子水溶液或聚陽離子酸溶液的濃度分別為0.1～50mg/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法，其特征是步驟5)中所說的酸溶液為鹽酸、硫酸、乙酸溶液中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用靜電吸引層層自組裝改性聚酯類材料為表面具有細(xì)胞相容性生物材料的方法。該方法用多元胺胺解聚酯類聚合物表面首先得到表面帶自由胺基的聚合物，再以酸酸化使聚合物表面帶正電，然后利用靜電吸引層層自組裝的方法，在其表面交替組裝單層或多層具有生物活性的不同聚陰離子和聚陽離子，這些生物活性聚電解質(zhì)經(jīng)層層自組裝后仍然保持其原有的生物活性，得到表面具有細(xì)胞相容性的平面膜和三維多孔的支架材料及其制品。本發(fā)明方法操作工藝簡單，重復(fù)性好。在多種具有復(fù)雜體型結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)用裝置和多孔組織工程支架材料的表面修飾中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/58GK1394901SQ02112499
公開日2003年2月5日 申請日期2002年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月10日
發(fā)明者高長有, 竺亞斌, 沈家驄 申請人:浙江大學(xué)