專利名稱：生物誘導(dǎo)型活性人工角膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工角膜技術(shù)，特別涉及一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
角膜病是目前眼致盲的主要因素，全球患者約有1000萬人，我國也有約300萬角膜盲患者。但由于供體來源的匱乏，我國每年能進(jìn)行的同種異體角膜移植術(shù)僅約為1000例，大量的患者因人體角膜的短缺得不到醫(yī)治，這是一個(gè)全球性長期未能解決的問題。由于眼免疫赦免現(xiàn)象和角膜的無血管特性，角膜移植術(shù)是全身組織器官移植中成功率最高的手術(shù)，因此，人工角膜及其移植優(yōu)于其他組織工程器官和組織的移植。目前已有的人工角膜有非活性人工角膜及無生物誘導(dǎo)性的組織工程人工角膜兩種，非活性人工角膜利用合成材料如甲基丙烯酸甲酯(MMA)等制作的人工角膜，在進(jìn)行人體移植時(shí)，雖可使人視力有所恢復(fù)，但視野范圍極小，人工合成材料難以和眼周圍組織相融合，植入后有異物感，容易出現(xiàn)角膜溶解、房水滲漏、人工角膜脫出以及眼內(nèi)炎等并發(fā)癥，給患者帶來很大的痛苦。而通常概念上的組織工程人工角膜是在體外強(qiáng)化的條件下，進(jìn)行角膜細(xì)胞培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞在支架材料上生長后，才使之具有生物活性；這種方法制作出的人工角膜雖然在與眼周圍組織相容性方面可能會(huì)有所改善，但由于它需要體外培養(yǎng)多種角膜細(xì)胞，而目前角膜細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)的途徑和方法比較困難和不成熟，角膜細(xì)胞培養(yǎng)后的保存和傳代繁殖也存在問題，整個(gè)過程較復(fù)雜、費(fèi)用高，異體角膜細(xì)胞在移植過程中的免疫排斥作用亦是面臨的一大難題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種與人眼組織具有良好的生物相容性、使用方便、性能良好并可長期保存和長途輸運(yùn)，便于進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備上述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的方法。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜包括如下組分——?dú)ぞ厶? 0.5％～3％膠原0.5％～3％透明質(zhì)酸0.1％～0.5％水 93.5％～96.0％以上比例為重量百分比。
除上述組份外，為助于刺激自體生長因子富集的速度，本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜還可整合有角膜細(xì)胞生長因子如成纖細(xì)生長因子(FGF)，表皮細(xì)胞生長因子(EGF)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)，用量為3～100ng/ml，以0.01％～0.2％的碳二亞胺(EDC)交聯(lián)劑交聯(lián)，形成帶生長因子的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
制備上述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的方法包括如下步驟(1)將殼聚糖溶于酸溶液，膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)混合各組分；(3)將混合液注入模具中并烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后所得制品并使其達(dá)吸水平衡。
在步驟2的各組分混合均勻后可加入角膜細(xì)胞生長因子。
所述酸溶液為鹽酸溶液或醋酸溶液。
所述混合過程為在室溫下攪拌1～2hr，使各組份充分混合均勻。
本發(fā)明的作用原理是人角膜組織主要由上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和膠原纖維及粘多糖構(gòu)成，膠原蛋白占角膜干重的75％，可從動(dòng)物中大量提取，來源豐富且價(jià)格不貴，因此采用膠原作為本人工角膜支架的基質(zhì)材料。
從動(dòng)物中提取的膠原，雖然在組成上與人體膠原相似，但在提取過程中其整體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，提純后的膠原失去了強(qiáng)度，作為支架基質(zhì)材料，在體內(nèi)受膠原酶的作用，極易降解；為了彌補(bǔ)膠原的這些弱點(diǎn)，增強(qiáng)膠原的強(qiáng)度和控制其在體內(nèi)的降解率，采取加入殼聚糖的方法；殼聚糖是一種天然的生物氨基多糖，與角膜細(xì)胞間質(zhì)中的粘多糖有相似的結(jié)構(gòu)，成膜性好、強(qiáng)度高、外觀透明，在機(jī)體內(nèi)不被膠原酶降解，可緩慢地被溶菌酶降解，從而可以調(diào)節(jié)支架基質(zhì)材料的降解率，同時(shí)也可使用交聯(lián)劑對(duì)材料進(jìn)行交聯(lián)，控制降解率。
透明質(zhì)酸屬粘多糖，它是構(gòu)成角膜細(xì)胞外和細(xì)胞間基質(zhì)的主要成分，具有粘彈性和大分子水合性，可促進(jìn)和引導(dǎo)角膜細(xì)胞的生長繁殖，與膠原相結(jié)合形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對(duì)角膜形態(tài)和正常生理狀態(tài)的維持具有重要作用，通過與角膜內(nèi)皮的結(jié)合，形成角膜組織表面的保護(hù)膜，控制體內(nèi)自由基對(duì)角膜細(xì)胞造成的損傷，透明質(zhì)酸分子中大量帶負(fù)電荷的羧基與眼表面的粘多糖成份中含有的羥基通過氫鍵結(jié)合，易于與眼表面親合。
生長因子對(duì)角膜細(xì)胞的培養(yǎng)、生長繁殖及與細(xì)胞外和細(xì)胞間基質(zhì)的結(jié)合有極大的影響，不同角膜細(xì)胞生長因子之間的協(xié)同效應(yīng)和用量對(duì)角膜細(xì)胞的生長繁殖可進(jìn)行調(diào)控，其中成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)，和表皮生長因子(EGF)對(duì)角膜細(xì)胞的生長繁殖、細(xì)胞間的正常融合及與基質(zhì)的結(jié)合均有促進(jìn)作用。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明生物誘導(dǎo)型活性人工角膜與眼組織具有優(yōu)良的相容性，與眼角膜細(xì)胞相融合，誘導(dǎo)多種角膜細(xì)胞生長因子富集，刺激角膜細(xì)胞在其上生長繁殖；在角膜移植和修復(fù)前，不需進(jìn)行體外角膜細(xì)胞的培養(yǎng)，因而免除了體外培養(yǎng)角膜細(xì)胞的復(fù)雜過程和由異體角膜細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)，以及由此而產(chǎn)生的各種并發(fā)癥，所以使用不但簡單方便，而且非常安全可靠，作用效果較好；(2)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜具有與人眼角膜相似的光學(xué)與力學(xué)特性，可根據(jù)有關(guān)要求進(jìn)行各種加工成型；已制作的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的光學(xué)力學(xué)指標(biāo)與人角膜相似，如下所示材料透光率90～96％；材料折射率1.368～1.382(人眼角膜為1.377)；材料機(jī)械強(qiáng)度與人眼角膜相仿，其中濕態(tài)抗張強(qiáng)度4Mpa～8.6MPa；含水率55～75％；扯斷伸長率300％～350％；(3)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜比較適合成型加工，制作過程簡單、加工容易方便，所以可以大批量地制備及使用；(4)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜易于長期保存和長途輸運(yùn)，便于進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；(5)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的發(fā)明，不但對(duì)于人民健康有重要促進(jìn)作用，可產(chǎn)生重要社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益，而且還為其它生物誘導(dǎo)型活性人工組織的研究開辟了道路，因而具有重要的科學(xué)意義。
(四)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 2％膠原 2.5％透明質(zhì)酸 0.3％水 95.1％以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于鹽酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖鹽酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌1.5小時(shí)，使各組份充分混合均勻；(3)在混合均勻的混合液中加入0.1％的碳二亞胺交聯(lián)劑，90ng/ml成纖細(xì)生長因子，35ng/ml表皮細(xì)胞生長因子和60ng/ml細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子，再充分混合半小時(shí)；(4)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(5)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時(shí)以達(dá)到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
實(shí)施例2本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 1％膠原 3％透明質(zhì)酸 0.2％水 95.65％以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于醋酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，使各組份充分混合均勻；(3)在混合均勻的混合液中加入0.15％的碳二亞胺交聯(lián)劑，5ng/ml成纖細(xì)生長因子，20ng/ml表皮細(xì)胞生長因子和10ng/ml細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子，再充分混合半小時(shí)；(4)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(5)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時(shí)以達(dá)到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
實(shí)施例3本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖0.5％膠原 1.5％透明質(zhì)酸 0.3％水97.7％以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于醋酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，使各組份充分混合均勻；(3)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(4)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時(shí)以達(dá)到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
實(shí)施例4本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 1.5％膠原2％透明質(zhì)酸0.1％水 96.4％以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于醋酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，使各組份充分混合均勻；(3)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(4)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時(shí)以達(dá)到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
測(cè)量上述各實(shí)施例制得的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的光學(xué)力學(xué)指標(biāo)與人眼角膜的參數(shù)比較如表一所示表一

由上表比較結(jié)果可知，本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜在性能參數(shù)與人眼角膜值非常接近，由此可見，本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜與人眼角膜較為相似。
將上述制得的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜分別進(jìn)行動(dòng)物埋植實(shí)驗(yàn)、人工角膜板層移植實(shí)驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可觀察到植入后本人工角膜可一直保持透明，60天后取出染色后作病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見角膜結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞，上皮無增厚及變薄，實(shí)質(zhì)層無水腫，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)正常；植入的生物誘導(dǎo)型人工角膜材料能與角膜相容，角膜與材料之間相粘結(jié)，在與角膜相粘連的材料處可見角膜細(xì)胞生長并具有向材料內(nèi)部生長的趨勢(shì)；材料兩個(gè)月在體內(nèi)的降解率約為30％。
權(quán)利要求
1.一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜，包括如下組分殼聚糖 0.5％～3％膠原 0.5％～3％透明質(zhì)酸 0.1％～0.5％水 93.5％～96.0％以上比例為重量百分比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜，其特征在于整合有角膜細(xì)胞生長因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜，其特征在于所述角膜細(xì)胞生長因子為成纖細(xì)生長因子，表皮細(xì)胞生長因子和細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子，用量分別為3～100ng/ml，以0.01％～0.2％的碳二亞胺交聯(lián)劑交聯(lián)。
4.一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將殼聚糖溶于酸溶液，膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)混合各組分；(3)將混合液注入模具中并烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后所得制品并使其達(dá)吸水平衡。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的制備方法，其特征在于在各組分混合均勻后，加入角膜細(xì)胞生長因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的制備方法，其特征在于所述酸溶液為鹽酸溶液或醋酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜,包括如下組分:殼聚糖0.5%～3%、膠原0.5～3%、透明質(zhì)酸0.1%～0.5%、水93.5%～96.0%,以上比例為重量百分比;為助于刺激自體生長因子富集速度,也可先在材料上整合角膜生長因子;一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的制備方法,包括如下步驟:將殼聚糖溶于酸溶液,膠原和透明質(zhì)酸溶于水;混合各組分;將混合液注入模具中并烘干;用水浸泡清洗烘干后所得制品并使其達(dá)吸水平衡。本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜具有與人眼角膜相似的特性,與眼組織的相容性好,適合成型加工,制作過程簡單,并易于長期保存和長途運(yùn)輸,社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益較好,并具有重要的科學(xué)意義。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1382425SQ0211521
公開日2002年12月4日 申請(qǐng)日期2002年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者黃耀熊, 李沁華 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)