專利名稱：一種治療苯酮尿癥的藥物及其制造方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物及其制造方法與應(yīng)用，特別是涉及一種治療苯酮尿癥的藥物及其制造方法與應(yīng)用。
苯酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是一種常見的常染色體隱性遺傳性氨基酸代謝病。由于苯丙氨酸羥化酶基因突變，造成肝臟PAH酶活降低或缺如，不能將苯丙氨酸羥化為酪氨酸，致使苯丙氨酸及其不正常代謝物蓄存體內(nèi)。這些不正常的產(chǎn)物主要是苯丙氨酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖?，后者?jīng)氧化作用形成正羥苯乙酸、苯乙酸、苯乳酸。這些不正常的代謝產(chǎn)物蓄積在血、腦脊液和各種組織中，給腦組織細胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，并從尿中大量排出，患者尿液有特殊臭味，即苯丙酮酸尿。PKU臨床上的主要表現(xiàn)是智力低下，癲癇發(fā)作和色素減少。
目前，世界各國均主要采用飲食療法治療PKU，即常年堅持給予患者低苯丙氨酸特制奶粉，嚴格限制其飲食直至其智力發(fā)育基本成熟，即十七、八歲。但由于苯丙氨酸是必須氨基酸，不能從飲食中完全除去，需要根據(jù)年齡、個體進行調(diào)節(jié)，成本非常高，不僅增加了病人家庭的負擔，而且病人由于常年不能吃正常的飲食而非常痛苦；也極少有堅持此飲食療法長達十幾年者。
苯丙氨酸脫氨酶是植物及酵母中特有的酶，能夠?qū)⒈奖彼崦摪鄙扇夤鹚?，因此曾有報道將其用于苯酮尿癥治療的研究。但是從植物中提取苯丙氨酸脫氨酶成本非常高，而且該酶不穩(wěn)定，給應(yīng)用造成了很多不可逾越的障礙。
一種治療苯酮尿癥的藥物，它的活性成份是能夠表達活性苯丙氨酸脫氨酶的人腸道正常菌。
所述人腸道正常菌為乳酸桿菌，雙歧桿菌或乳球菌。
所述苯丙氨酸脫氨酶基因來自于傘形花科植物、禾本科植物或紅酵母，其中優(yōu)選的品種為歐芹、水稻或紅酵母。
所述能表達活性苯丙氨酸脫氨酶的人腸道正常菌可以采用以下方法獲得1)人工合成具有限制性內(nèi)切酶粘性末端的編碼苯丙氨酸脫氨酶的DNA片段；2)將上述DNA片段與表達載體相連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克隆。
也可以采用以下方法獲得1)從植物或紅酵母的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到苯丙氨酸脫氨酶的cDNA；2)將苯丙氨酸脫氨酶的cDNA與表達載體連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克隆。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種生產(chǎn)上述治療苯酮尿癥的藥物的方法。
在本發(fā)明中，生產(chǎn)治療苯酮尿癥的藥物的方法有兩種，其中，第一種方法包括以下步驟1)人工合成具有限制性內(nèi)切酶粘性末端的編碼苯丙氨酸脫氨酶的DNA片段；2)將上述DNA片段與表達載體相連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克?。?)將陽性克隆大量繁殖，純化；6)加入醫(yī)學上可接受的藥用載體，得到治療苯酮尿癥的藥物。
第二種方法包括以下步驟1)從植物或紅酵母的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到苯丙氨酸脫氨酶的cDNA；2)將苯丙氨酸脫氨酶的cDNA與表達載體連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克??；5)將陽性克隆大量繁殖，純化；6)加入醫(yī)學上可接受的藥用載體，得到治療苯酮尿癥的藥物。
為了應(yīng)用方便，本發(fā)明的藥物中還可以加有醫(yī)學上可接受的載體和輔劑。本發(fā)明藥物的劑型為口服制劑，可以根據(jù)不同的需要，制成腸溶膠囊、片劑、粉劑或液體劑型。
本發(fā)明藥物的用量根據(jù)患者的體重進行調(diào)整，一般每次為0.5-5活性單位，從新生兒篩查確定為PKU起服用，最好堅持每天飯前后立即服用直到十七歲，PKU孕婦亦應(yīng)服用。
本發(fā)明巧妙地利用了植物和微生物中苯丙氨酸脫氨酶能夠?qū)⒈奖彼崦摪鄙扇夤鹚岬奶匦?，?chuàng)造性地將編碼苯丙氨酸脫氨酶的基因?qū)氲饺四c道本身固有的有益菌中，使其在病人的小腸中進行表達，等于在病人的小腸內(nèi)設(shè)了一個“小藥廠”，就地生產(chǎn)苯丙氨酸脫氨酶，就地利用它來將食物消化液中尚沒有被吸收的苯丙氨酸脫氨，變成肉桂酸，從而可以有效降低苯丙氨酸的水平，達到治療PKU之目的。
患者在服用本發(fā)明藥物的同時，可以與常人一樣吃正常的飲食，一方面能夠保證患者營養(yǎng)的全面性，另一方面也避免了“飲食療法”給患者帶來的精神上和生活上的壓力和痛苦，提高其生活質(zhì)量本發(fā)明的藥物生產(chǎn)工藝簡單、成本低，能夠為廣大患者接受。同時，本發(fā)明的藥物在安全性方面具有切實有效的保障，首先，外源基因只是在有益腸道菌中表達，不進入人體組織細胞，不會對人本身的基因組產(chǎn)生影響，也不會誘發(fā)和激活癌基因；同時，為了確保萬無一失，本發(fā)明導入到載體上的苯丙氨酸脫氨酶基因不采用抗抗生素的基因片段作為標記，保證服用者不會因為服用了本發(fā)明的藥物而對抗生素產(chǎn)生抗藥性。本發(fā)明的藥物除了可用來治療苯酮尿癥以外，還可以作為催化劑，利用肉桂酸和氨為原料生產(chǎn)苯丙氨酸。
6、培養(yǎng)得到的乳酸桿菌純化后用pH8.0的0.1mol/L磷酸緩沖液培養(yǎng)基制成液體口服制劑。
7、口服液中苯丙氨酸脫氨酶的鑒定將上述得到的液體口服制劑細胞破碎后聚丙烯凝膠電泳，得到一條約77KD的蛋白質(zhì)帶，經(jīng)測序證實N端的前15個氨基酸殘基正確，證實該蛋白確為苯丙氨酸脫氨酶。
實施例2、從水稻基因組DNA釣出苯丙氨酸脫氨酶基因的方法制備本基因工程藥物1、根據(jù)水稻苯丙氨酸脫氨酶編碼基因的核苷酸序列(Eiichi Minami，YoshiyukiTanaka，Nucleotide sequence of the gene for phenylalanine ammonia-lyase of rice and itsdeduced amino acid sequence，Biochem.et Biopgys.Acta 1171321--322 1993)，用實施例1的引物，以水稻基因組DNA為模板，用PCR技術(shù)合成苯丙氨酸脫氨酶基因；2、用EcoRV/Bgl II酶切得到的DNA片段，得到具有粘性末端的苯丙氨酸脫氨酶DNA；3、用EcoRV/Bgl II酶切載體質(zhì)粒pNZ8149并將苯丙氨酸脫氨酶DNA與其連接；4、用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的雙歧桿菌；5、篩選被轉(zhuǎn)化雙歧桿菌中的陽性克隆，并進行大規(guī)模培養(yǎng)；6、培養(yǎng)得到的雙歧桿菌冷凍干燥后制成腸溶膠囊。
7、口服腸溶膠囊中苯丙氨酸脫氨酶的鑒定在含苯丙氨酸溶液中加入上述制得的口服腸溶膠囊，用HPLC監(jiān)測反應(yīng)液的變化，結(jié)果表明，苯丙氨酸在本發(fā)明藥物的作用下，被脫氨變成了肉桂酸。
實施例3、本發(fā)明治療苯酮尿癥藥物的藥效學鑒定給誘導成功的苯酮尿癥模型大鼠飼喂本發(fā)明實施例1中得到的制劑，用量為20ml/公斤體重/只大鼠，觀查結(jié)果表明，服藥后大鼠血液及尿液中的苯丙酮酸水平較對照組下降，接近正常水平，兩組有顯著性差異(P≤0.01)。
權(quán)利要求
1.一種治療苯酮尿癥的藥物，它的活性成份是表達活性苯丙氨酸脫氨酶的人腸道正常菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療苯酮尿癥的藥物，其特征在于所述人腸道正常菌為乳酸桿菌，雙歧桿菌或乳球菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療苯酮尿癥的藥物，其特征在于所述苯丙氨酸脫氨酶基因來自于傘形花科植物、禾本科植物或紅酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療苯酮尿癥的藥物，其特征在于所述植物為歐芹、水稻或紅酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的治療苯酮尿癥的藥物，其特征在于所述表達活性苯丙氨酸脫氨酶的人腸道正常菌是采用以下方法獲得的1)合成具有限制性內(nèi)切酶粘性末端的編碼苯丙氨酸脫氨酶的DNA片段；2)將上述DNA片段與表達載體相連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克隆。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的治療苯酮尿癥的藥物，其特征在于所述表達活性苯丙氨酸脫氨酶的人腸道正常菌是采用以下方法獲得的1)從植物或紅酵母的總RNA反轉(zhuǎn)錄PCR得到苯丙氨酸脫氨酶的cDNA；2)將苯丙氨酸脫氨酶的cDNA與載體連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克隆。
7.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述治療苯酮尿癥藥物的方法，包括以下步驟1)合成具有限制性內(nèi)切酶粘性末端的編碼苯丙氨酸脫氨酶的DNA片段；2)將上述DNA片段與載體相連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克??；5)將陽性克隆大量繁殖，純化；6)加入醫(yī)學上可接受的藥用載體，得到治療苯酮尿癥的藥物。
8.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述治療苯酮尿癥藥物的方法，包括以下步驟1)從植物或紅酵母的總RNA反轉(zhuǎn)錄PCR得到苯丙氨酸脫氨酶的cDNA；2)將苯丙氨酸脫氨酶的cDNA與表達載體連接；3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的人腸道正常菌；4)篩選陽性克?。?)將陽性克隆大量繁殖，純化；6)加入醫(yī)學上可接受的藥用載體，得到治療苯酮尿癥的藥物。
9.權(quán)利要求1所述的藥物作為以肉桂酸和氨為原料生產(chǎn)苯丙氨酸的催化劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療苯酮尿癥的藥物及其制造方法與應(yīng)用，目的是提供一種治療苯酮尿癥的藥物，它的活性成份是表達活性苯丙氨酸脫氨酶的人腸道正常菌。所述人腸道正常菌為乳酸桿菌，雙歧桿菌或乳球菌。所述苯丙氨酸脫氨酶基因來自于傘形花科植物、禾本科植物或紅酵母，其中優(yōu)選的品種為歐芹、水稻或紅酵母。本發(fā)明的藥物生產(chǎn)工藝簡單、成本低，能夠為廣大患者接受。本發(fā)明的藥物除了可用來治療苯酮尿癥以外，還可以作為催化劑，利用肉桂酸和氨為原料生產(chǎn)苯丙氨酸。
文檔編號A61K38/43GK1451435SQ0211721
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月17日
發(fā)明者劉敬忠 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院