專利名稱：中國漢族人基質金屬蛋白酶－9基因重構、表達、純化及其醫(yī)學應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域中人體基因的重構后表達、純化方法，特別是人基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因的重組、表達和純化；以及MMP-9蛋白本身、類似物、衍生物在肝癌醫(yī)學診斷、治療方面的應用。
背景技術：
惡性腫瘤轉移是一個連續(xù)、復雜、多因素參與的多階段過程。其中細胞外基質(ECM)是腫瘤細胞在轉移過程中面臨的第一道屏障。腫瘤細胞可產生大量的蛋白酶水解基質，使腫瘤細胞易于轉移。ECM降解酶系統(tǒng)至少包括六大類，其中基質金屬蛋白酶(MMPs)最為重要，它幾乎能降解多糖以外的全部ECM成分。腫瘤的侵襲轉移過程中，MMPs過度表達。
MMP-9的臨床應用本專利發(fā)明人檢測了170例肝癌(原發(fā)性肝癌115例和繼發(fā)性肝癌55例)患者外周血及40例肝臟良性疾病(肝臟良性腫瘤11例和肝硬化29例)患者外周血，30例健康人外周血MMP-9。結果顯示血清MMP-9含量在肝癌組(523.25±410.96ng/ml)和肝臟良性疾病組(200.06±163.59ng/ml)、健康人(123.39±58.51ng/ml)組之間具有顯著性差異(p＝0.0001，p＝0.0001值)(表一)；肝癌、良性肝病和正常人的陽性率分別為73.5％、35％和3.3％(cut-off值240.41ng/ml)，判斷肝癌敏感度73.5％，特異度96.7％(表二)。表明定量檢測肝癌患者外周血中MMP-9濃度是協(xié)助診斷肝癌的參考指標。
表一 MMP-9在肝臟疾病中表達病例分組 NMean(ng/ml)Std DeviationStd ErrorMinimMaxim p肝癌170 523.25 410.9631.52 26.202160.0原發(fā)性肝癌 115 490.39 397.5037.07 26.202160.0繼發(fā)性肝癌 55 591.97 433.4558.45 93.001812.00.080肝臟良性疾病40 200.06 163.5925.87 22.30677.400.0001肝良性腫瘤 11 270.40 228.7068.96 26.50677.40肝硬化 29 173.38 126.1523.42 22.30564.200.094正常人 30 123.39 58.51 10.68 21.30257.600.0001表二 MMP-9表達的陽性率病例分組N MMP-9表達 P(2-sided)陰性 陽性肝癌 170 45(26.5％)125(73.5％)肝臟良性疾病 40 26(65.0％)14(35.0％) ＜0.01正常人 30 29(96.7％)1(3.3％) ＜0.01本發(fā)明人通過研究還證實了血清MMP-9水平與肝癌的復發(fā)、轉移密切相關(表三)。因此外周血MMP-9高水平的原發(fā)性肝癌患者可考慮在介入或手術等局部治療前后給予系統(tǒng)化治療，預防其轉移的發(fā)生，以期提高治愈率。
表三 肝癌MMP-9水平與是否轉移是否轉移NMMP-9(ng/ml)MeanStd DeviationStd Errorp無轉移 45391.23 286.96 33.36有轉移 28530.86 363.27 63.550.044

發(fā)明內容
為了穩(wěn)定地獲得足量的MMP-9蛋白，同時為制備用于研究MMP-9蛋白的高效的抗MMP-9抗體，本發(fā)明的發(fā)明人通過基因重組的方法，獲得了重組中國漢族人MMP-9 cDNA，為了加強其抗原性，發(fā)明人又進一步構建了一種PMMP-9基因，同時穩(wěn)定、高效的表達了人重組MMP-9蛋白。
本發(fā)明的目的是提供上述中國漢族人MMP-9基因重組、表達和MMP-9蛋白純化的方法。同時揭示MMP-9的血漿含量和組織含量與肝癌復發(fā)轉移、早期預測的內在關系。
本發(fā)明的技術方案為克隆、重組、表達純化人MMP-9和PMMP-9蛋白的方法，包括以下步驟(1)、克隆中國漢族人MMP-9的基因，用反轉錄PCR法擴增MMP-9的基因；(2)、將上述擴增的MMP-9基因與克隆載體連接，構建人MMP-9克隆質粒；(3)、將上述人MMP-9克隆質粒亞克隆進表達載體，再將連接后的質粒DNA轉染大腸桿菌；(4)、表達人MMP-9a、將上述帶有中國漢族人MMP-9基因的表達載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)；b、從板上選一個菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶內，在30℃搖箱內培養(yǎng)，測菌液A650 OD值為1.0時停止培養(yǎng)；
c、向菌液內加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；d、收獲細菌；(5)、純化人MMP-9a、將上述細菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、裂解細菌，離心取上清液；c、初步純化人MMP-9；d、用離子交換和凝膠過濾層析進行純化。(6)、重組中國漢族人PMMP-9基因的構建a、以MMP-9質粒DNA為模板以新引物作PCR擴增得到MMP-9的衍生物PMMP-9；b、將PCR產物PMMP-9克隆到克隆載體質粒上；c、經(jīng)酶切將PMMP-9基因亞克隆到表達載體；(7)、重組中國漢族人PMMP-9蛋白的表達和純化a、將上述帶有重組人PMMP-9基因的表達載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)；b、從板上選一個菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶內，在30℃搖箱內培養(yǎng)，測菌液A650 OD值為1.0時停止培養(yǎng)；c、向菌液內加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；d、收獲細菌；e、將上述細菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；
f、裂解細菌，離心取上清液；g、初步純化重組人PMMP-9；h、用離子交換和凝膠過濾層析進行純化。本發(fā)明專用引物的基因序列為引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA


下面結合附圖對本發(fā)明的實施例作進一步說明。
圖1為純化的中國漢族人MMP-9的電泳2為純化的重組中國漢族人PMMP-9的電泳圖具體實施方式
實施例1一、中國漢族人MMP-9基因cDNA的獲得1、取肝細胞，采用美國Trizol RNA抽提試劑盒推薦方法提取總RNA，將總RNA走變性膠，確認總RNA的質量可靠；2、設計引物如下引物1 5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT 3′引物2 5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG 3′3、以上述總RNA為模版，反轉錄合成人MMP-9的cDNA，PCR擴增，PCR反應體系參照文獻(Scarf S.J.，In PCR ProtocolA Guide toMethod and Application，and ed.New York，Academic Press，USA 1990)進行，反應條件為
94℃變性50秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒，共35個循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘4、PCR產物經(jīng)1％瓊脂糖電泳初步確證后，酚/氯仿抽提回收；二、構建中國漢族人MMP-9克隆質粒1、按照Klenow多聚酶推薦方法，將PCR產物用Klenow多聚酶補平。
2、將補平的PCR產物與EcoRV酶切的pBluscript KS載體(任何的克隆載體均可以，如T-easy，pGEX等)平端連接，連接反應體系如下pBluscript KS(EcoRV酶切)1ul5x連接緩沖液(什么緩沖液)2ulT4 DNA連接酶1ulEcoRV(1u/1ul) 0.5ulPCR產物 4ulH2O 1.5ul以上混合物16℃連接12小時；3、將連接產物轉化E.Coli JM109感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素LB板，挑取陽性克隆，用堿裂解法制備質粒DNA，將質粒DNA用HindIII和EcoRI雙酶切鑒定出重組質粒pBLU-HMMP-9；三、表達質粒pET-MMP-9的構建
1、將上述pBLU-MMP-9克隆載體中人MMP-9(HMMP-9)的基因片段用NdeI和XhoI雙酶切下，經(jīng)1％瓊脂糖電泳，回收約2Kb的CMMP-9的基因片段；2、將上述該片段與相同酶切的pET表達載體(表達載體是多樣的，如pBluescriptKS、pPUC、pGEM等)連接，連接反應體系如下pET(NdeI，XhoI酶切) 1ul5x連接緩沖液2ulT4 DNA連接酶1ulHMMP-9 5ulH2O 1ul以上混合物16℃連接12小時3、將連接產物轉化E.coli BL21感受態(tài)細胞，涂布卡那霉素LB板，挑取陽性克隆；4、用堿裂解法制備質粒DNA，將質粒DNA用NdeI和XhoI雙酶切鑒定出重組質粒pET-HMMP-9；四、MMP-9在大腸桿菌中的表達1、將篩選出的在E.coliJM109中的重組質粒pET-HMMP-9克隆接種10ml LB試管，16℃300r/min搖床培養(yǎng)，測菌液A650OD值為1.0時停止培養(yǎng)；2、收集細菌，離心5000r/min20分鐘，去上清液，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)溶沉淀，超聲破碎菌體，離心10000r/min20分鐘，干燥沉淀。
3、將上述10ml菌液放入裝有1000mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃搖箱內培養(yǎng)300r/min，測菌液A650 OD值，當OD值為1.0時，向菌液內加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；4、收集細菌，以3000轉/分，4℃，離心20分鐘，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸鹽緩沖液混溶沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至1mM，放于-20℃凍存；五、MMP-9的分離純化1、將細菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心5000轉/分，4℃，5分鐘，去上清液，再用磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；2、用超聲破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使細菌裂解，4℃條件下12,000r/min離心10min，沉淀重懸于30ml基礎緩沖液(8M尿素，10mM Tris，pH7.5)。12,000r/min離心10min，取上清液；3、上清液經(jīng)DEAE離子交換層析分別以基礎液加100mM、200mM、400mM NaCl進行洗脫。各組分經(jīng)12.5％SDS-PAGE分析。含所需蛋白的組分進行Ni-NTG-His柱親和層析，分別以基礎液加15mM、30mM、60mM、120mM、220mM咪唑洗脫。各組分行12.5％SDS-PAGE分析。
如圖1所示，所得MMP-9溶液SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)一條帶。在上述實施例中，表達質粒的構建還可以用一對上游和下游的5′端各帶有和表達載體相對應的二個限制性內切酶位點的引物，以人MMP-9克隆質粒DNA為模板，做PCR擴增；將PCR產物用常規(guī)方法進行純化；用二個相應的限制性內切酶對PCR產物和表達載體進行酶切，用常規(guī)方法純化酶切后的PCR產物和表達載體；用T4連接酶將純化的PCR產物和表達載體連接。
實施例2一、重組中國漢族人PMMP-9基因的獲得1、設計引物如下引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC 3′引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA 3′2、選擇上述中國漢族人MMP-9 cDNA為模板；獲得重組中國漢族人PMMP-9的基因，PCR擴增，PCR反應體系參照文獻(Scarf S.J.，In PCR ProtocolA Guide to Method and Application，and ed.New York，Academic Press，USA 1990)進行，反應條件為94℃變性50秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒，共35個循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘3、PCR產物經(jīng)1％瓊脂糖電泳初步確證后，酚/氯仿抽提回收；二、構建重組中國漢族人PMMP-9克隆質粒1、按照Klenow多聚酶推薦方法，將PCR產物用Klenow多聚酶補平。
2、將補平的PCR產物與EcoRV酶切的pBluscript KS載體(任何的克隆載體均可以)平端連接，連接反應體系如下pBluscript KS(EcoRV酶切) 1ul5x連接緩沖液(什么緩沖液) 2ulT4 DNA連接酶 1ulEcoRV(1u/1ul) 0.5ulPCR產物 4ulH2O 1.5ul以上混合物16℃連接12小時；3、將連接產物轉化E.Coli JM109感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素LB板，挑取陽性克隆，用堿裂解法制備質粒DNA，將質粒DNA用HindIII和EcoRI雙酶切鑒定出重組質粒pBLU-HPMMP-9；三、表達質粒pET-PMMP-9的構建1、將上述pBLU-PMMP-9克隆載體中重組人PMMP-9的基因片段用NdeI和XhoI雙酶切下，經(jīng)1％瓊脂糖電泳，回收約450bp的PMMP-9的基因片段；2、將上述該片段與相同酶切的pET表達載體(表達載體是多樣的，如pBluescriptKS、pPUC、pGEM等)連接，連接反應體系如下pET(NdeI，XhoI酶切) 1ul5x連接緩沖液 2ulT4 DNA連接酶 1ulHPMMP-9 5ul
H2O1ul以上混合物16℃連接12小時3、將連接產物轉化E.coli JM109感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素LB板，挑取陽性克?。?、用堿裂解法制備質粒DNA，將質粒DNA用NdeI和XhoI雙酶切鑒定出重組質粒pET-HPMMP-9；四、PMMP-9在大腸桿菌中的表達1、將篩選出的在E.coliJM109中的重組質粒pET-HPMMP-9克隆接種10ml LB試管，16℃300r/min搖床培養(yǎng)，測菌液A650OD值為1.0時停止培養(yǎng)；2、收集細菌，離心5000r/min20分鐘，去上清液，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)溶沉淀，超聲破碎菌體，離心10000r/min20分鐘，干燥沉淀。
3、將上述10ml菌液放入裝有1000mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃搖箱內培養(yǎng)16小時測菌液A650 OD值，當OD值為1.0時，向菌液內加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；4、收集細菌，以3000轉/分，4℃，離心20分鐘，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸鹽緩沖液混溶沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至1mM，放于-20℃凍存；五、PMMP-9的分離純化1、將細菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心5000轉/分，4℃，5分鐘，去上清液，再用磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；2、用超聲破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使細菌裂解，4℃條件下12000轉/分離心，30分鐘，取上清液；3、上清液經(jīng)DEAE離子交換層析和Ni-NTG-His柱親和層析分別以基礎液加100mM、200mM、400mM NaCl進行洗脫。各組分經(jīng)12.5％ SDS-PAGE分析。含所需蛋白的組分進行Ni-NTG-His柱親和層析，分別以基礎液加15mM、30mM、60mM、120mM、220mM咪唑洗脫。各組分行12.5％SDS-PAGE分析。
權利要求
1.一種表達純化中國漢族人MMP-9 cDNA基因和重組PMMP-9的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、克隆中國漢族人MMP-9的基因，用反轉錄PCR法擴增MMP-9的基因；(2)、將上述擴增的MMP-9基因與克隆載體連接，構建人MMP-9克隆質粒；(3)、將上述人MMP-9克隆質粒亞克隆進表達載體，再將連接后的質粒DNA轉染大腸桿菌；(4)、表達中國漢族人MMP-9a、將上述帶有中國漢族人MMP-9基因的表達載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)；b、從板上選一個菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶內，在30℃搖箱內培養(yǎng)，測菌液A650 OD值為1.0時停止培養(yǎng)；c、向菌液內加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；d、收獲細菌；(5)、純化人MMP-9a、將上述細菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、裂解細菌，離心取上清液；c、初步純化人MMP-9；d、用離子交換和凝膠過濾層析進行純化。(6)、重組中國漢族人PMMP-9基因的構建a、以MMP-9質粒DNA為模板以新引物作PCR擴增得到MMP-9的衍生物PMMP-9；b、將PCR產物PMMP-9克隆到克隆載體質粒上；c、經(jīng)酶切將PMMP-9基因亞克隆到表達載體；(7)、重組中國漢族人PMMP-9蛋白的表達和純化a、將上述帶有重組中國漢族人PMMP-9基因的表達載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)；b、從板上選一個菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶內，在30℃搖箱內培養(yǎng)，測菌液A650 OD值為1.0時停止培養(yǎng)；c、向菌液內加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時；d、收獲細菌；e、將上述細菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；f、裂解細菌，離心取上清液；g、初步純化重組人PMMP-9；h、用離子交換和Ni-NTG-His柱親和層析進行純化。
2.根據(jù)權利要求1所述的表達純化重組人MMP-9基因和PMMP-9的方法，其特征在于所述反轉錄PCR法擴增MMP-9的基因和PMMP-9所用的引物為CMMP-9引物1 5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT 3′CMMP-9 引物2 5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG 3′PCMMP-9引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC 3′PCMMP-9引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA 3′
3.根據(jù)權利要求1或2所述的表達純化重組人MMP-9和PMMP-9基因的方法，其特征在于所述將人MMP-9和PMMP-9克隆質粒亞克隆進表達載體的方法為表達載體為任一表達載體；用一對上游和下游的5′端各帶有和表達載體相對應的二個限制性內切酶位點的引物，以人MMP-9克隆質粒DNA為模板，做PCR擴增；將PCR產物用常規(guī)方法進行純化；用二個相應的限制性內切酶對PCR產物和表達載體進行酶切，用常規(guī)方法純化酶切后的PCR產物和表達載體；用T4連接酶將純化的PCR產物和表達載體連接。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的表達純化重組人MMP-9和PMMP-9基因的方法，其特征在于所述將人MMP-9和PMMP-9克隆質粒亞克隆進表達載體的方法為表達載體為任一表達載體；選用克隆載體和表達載體上相同的限制性內切酶位點。用二個限制性內切酶對克隆載體和表達載體酶切，切出克隆載體內的MMP-9和PMMP-9基因序列，切去表達載體內的多克隆位點序列；用常規(guī)方法純化MMP-9和PMMP-9基因序列和切去表達載體內多克隆位點序列的表達載體；用T4連接酶將純化的人MMP-9和PMMP-9基因序列和表達載體連接。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的表達純化重組人MMP-9基因的方法，其特征在于在所述表達全長人MMP-9和PMMP-9的過程中，LB培養(yǎng)基中加入的抗生素為氨芐青霉素；收獲細菌的方法為將培養(yǎng)物以3000轉/分離心20分鐘，去上清液，收集沉淀。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的表達純化重組人MMP-9和PMMP-9基因的方法，其特征在于在所述純化人MMP-9和PMMP-9的步驟中，用磷酸鹽緩沖液洗洗細菌沉淀后，離心的速度為5000轉/分，持續(xù)5分鐘；細菌裂解的方法為超聲破碎法或溶菌酶裂解法，細菌裂解后的離心為12000轉/分，持續(xù)30分鐘，取上清液；初步純化的方法為離子交換層析或分子篩法。
7.表達純化重組人MMP-9和PMMP-9基因中的專用引物，其基因序列為CMMP-9 引物1 5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT 3′CMMP-9 引物2 5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG 3′PCMMP-9引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC 3′PCMMP-9引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA 3′
8.MMP-9血漿和組織含量與肝癌早期診斷和復發(fā)轉移過程的相關性1).定量檢測肝癌患者外周血中MMP-9濃度是協(xié)助診斷肝癌的參考指標，其臨界值為＞300ng/ml2).治療前檢測周圍血中MMP-9的水平能夠作為預測肝癌復發(fā)轉移的較好的指標；其值為＞800ng/ml，超過此值預示肝癌復發(fā)和轉移。3).治療前外周血MMP-9高水平的肝癌患者可考慮在介入或手術等局部治療前后給予系統(tǒng)化治療，預防其轉移的發(fā)生，以期提高治愈率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中國漢族人MMP－9基因的克隆、重組、表達、純化方法與專用引物，以及MMP－9蛋白及其類似物、衍生物在肝癌臨床診斷和治療方面的應用。本方法將獲得的中國漢族人肝細胞cDNA，用PCR方法(引物1為5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT引物2為5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG)獲得人MMP－9基因，并將該基因重組后克隆到大腸桿菌表達載體中，誘導表達后提取MMP－9及其衍生物PMMP－9，進而應用離子交換柱層析和凝膠過濾純化出MMP－9及其衍生物PMMP－9，為臨床進一步觀察腫瘤病人體內MMP－9水平的變化，奠定了物質基礎。
文檔編號A61K38/48GK1459505SQ02117369
公開日2003年12月3日 申請日期2002年5月21日 優(yōu)先權日2002年5月21日
發(fā)明者胡敬群, 楊建國 申請人:趙平, 胡敬群, 蔡建強