專(zhuān)利名稱(chēng)：輪狀病毒基因重配株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組輪狀病毒基因重配株，用于生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗，預(yù)防小兒輪狀病毒腹瀉，對(duì)控制人類(lèi)輪狀病毒感染和腹瀉流行有重大意義。
我國(guó)每年嬰幼兒腹瀉病例約為3.5億人次，在3歲以下因急性腹瀉住院的病兒中，年平均33％為輪狀病毒感染性腹瀉，秋冬季流行季節(jié)時(shí)可達(dá)50％以上。
采用對(duì)腸道傳染病的一般預(yù)防措施，如社會(huì)公共衛(wèi)生和個(gè)人衛(wèi)生條件的改善，水源改善和糞便管理等，對(duì)輪狀病毒腹瀉未能取得明顯預(yù)防和控制的效果。臨床對(duì)輪狀病毒腹瀉至今尚無(wú)特效的藥物和療法。以前曾推廣的口服補(bǔ)液療法(ORS)也未取得明顯效果。
因此，研究開(kāi)發(fā)理想的安全有效的輪狀病毒疫苗來(lái)預(yù)防嬰幼兒的嚴(yán)重的輪狀病毒性腹瀉已是一項(xiàng)全球性迫切任務(wù)。
數(shù)十年來(lái)，許多病毒疫苗對(duì)預(yù)防和控制病毒性傳染病取得了十分顯著的效果，如天花，脊髓灰質(zhì)炎，麻疹，流行性腮腺炎，乙型肝炎等。特別是1979年10月26日世界衛(wèi)生組織宣布，天花已從地球上被消滅，這是人類(lèi)歷史上第一個(gè)使用疫苗消滅的傳染病，十分明顯地證實(shí)了疫苗對(duì)人類(lèi)做出的貢獻(xiàn)。
像其他病毒疫苗研發(fā)過(guò)程一樣，人用輪狀病毒疫苗研發(fā)途徑有活疫苗(動(dòng)物株輪狀病毒活疫苗，人—?jiǎng)游锘蛑嘏渲昊钜呙纾律鷥狠啝畈《救醵局昊钜呙?，人輪狀病毒冷適應(yīng)株減毒活疫苗)，滅活疫苗(輪狀病毒滅活疫苗)，病毒樣顆粒疫苗等。
輪狀病毒活疫苗研究和開(kāi)發(fā)從1983年開(kāi)始，主要策略是采用琴納氏種痘法原理，即“種牛痘預(yù)防人類(lèi)天花”。輪狀病毒可感染人和許多幼小動(dòng)物，有嚴(yán)格的宿主特異性，非人宿主的輪狀病毒對(duì)人為無(wú)毒或弱毒。因此，接種動(dòng)物輪狀病毒對(duì)人是安全的，并可獲得有效的免疫，如牛輪狀病毒RIT4237株(1983)，WC3株(1988)，猴輪狀病毒MMU 18006株(1985)，羊輪狀病毒LLR株(1988)，都是用動(dòng)物輪狀病毒原株研發(fā)人用的口服輪狀病毒活疫苗。
隨后，國(guó)際上又致力于輪狀病毒基因重配株口服輪狀病毒活疫苗的研發(fā)，即在動(dòng)物輪狀病毒基因組弱毒性狀的基礎(chǔ)上，利用基因重配技術(shù)換入人輪狀病毒G1型，G2型，G3型和G4型的編碼VP7和VP4抗原蛋白的基因片段，以此加強(qiáng)疫苗的免疫效果。如猴—人輪狀病毒基因重配株四價(jià)口服活疫苗(RRV-TV)，以及正在開(kāi)發(fā)的牛UK株和WC3株—人輪狀病毒基因重配株四價(jià)活疫苗。
美國(guó)的猴—人輪狀病毒基因重配株四價(jià)活疫苗(RRV-TV)在1998年已經(jīng)由美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)注冊(cè)，此疫苗包括D-RRV(G1)，DS-1-RRV(G2)，RRV(G3)和ST3-RRV共四個(gè)基因重配株，臨床觀(guān)察結(jié)果表明，小兒口服此疫苗后對(duì)輪狀病毒腹瀉的保護(hù)率為49-68％，對(duì)輪狀病毒重型腹瀉的保護(hù)效果為65-100％。
人—?；蛑嘏渲晁膬r(jià)口服活疫苗(WC3-QV)，此疫苗包括WI79-9(G1)，SC2-9(G2)，WI78-8(G3)，和WI79-4(VP4基因片段)共四個(gè)基因重配株。II期臨床觀(guān)察結(jié)果，小兒經(jīng)口服接種后，發(fā)熱反應(yīng)明顯減少，對(duì)重型和中型輪狀病毒腹瀉的保護(hù)效果可達(dá)70％。
人—?；蛑嘏渲晁膬r(jià)口服活疫苗(UK-QV)，此疫苗包括D-UK(G1)，DS-1-UK(G2)，P-UK(G3)和ST3-UK(G4)共四個(gè)基因重配株，II期臨床觀(guān)察結(jié)果，小兒經(jīng)口服接種后，副反應(yīng)輕微，免疫效果良好。
本發(fā)明的目的是利用基因重配技術(shù)，將我國(guó)分離的羔羊輪狀病毒(NT株)同人輪狀病毒毒株進(jìn)行基因重配，提供一組基因重配株，即攜帶人輪狀病毒特異性有效抗原VP7(和/或VP4)編碼基因片段的動(dòng)物輪狀病毒，構(gòu)建成一組安全，高效的輪狀病毒活疫苗的理想疫苗株，具有良好的生物學(xué)性狀，可用于生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗，輪狀病毒診斷試劑及輪狀病毒抗原和抗體，用于小兒輪狀病毒腹瀉的預(yù)防和診斷。
基因重配原理和技術(shù)方法已在分子病毒學(xué)研究和病毒疫苗研制中廣泛應(yīng)用，如病毒基因與編碼蛋白，基因型(電泳型)的多型性、流感病毒冷適應(yīng)株基因重配株疫苗、輪狀病毒基因重配株活疫苗等。
輪狀病毒基因組由11個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA組成，每一個(gè)基因節(jié)段編碼一個(gè)蛋白質(zhì)，第1，2，3基因分別編碼VP1，VP2，和VP3蛋白，是組成病毒核心的結(jié)構(gòu)蛋白；第6基因編碼VP6，是決定病毒組和亞組特異性的抗原蛋白；第4基因編碼VP4蛋白，第7，8，或9基因編碼VP7蛋白(視不同毒株而定)，VP4和VP7是兩個(gè)主要的誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的外殼結(jié)構(gòu)蛋白(表面抗原)，是決定血清型的抗原蛋白，在輪狀病毒感染免疫和疫苗免疫中起著十分重要的作用；第5，7，8，10，和11基因分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1-NSP5。
輪狀病毒的血清型分為G型和P型，VP7血清型為G型，目前已知有14個(gè)G血清型，其中10個(gè)已在人類(lèi)腹瀉糞便標(biāo)本中檢出(1，2，3，4，5，6，8，9，10，12型)，臨床和流行病學(xué)調(diào)查研究表明G1，2，3，和4型最常見(jiàn)，可占嬰幼兒輪狀病毒腹瀉的90％以上，G1型更是主要流行型別。VP4血清型為P型，目前已知有19個(gè)P血清型。人類(lèi)輪狀病毒有5個(gè)血清型，其中P1A為G1，3，和4型毒株所共有，P1B為G2型毒株所有。
一般認(rèn)為，VP7是輪狀病毒主要中和抗原，VP4是輪狀病毒次要中和抗原。嬰幼兒感染輪狀病毒腹瀉后，可產(chǎn)生抗VP7和抗VP4的中和抗體，抵抗輪狀病毒的再感染或減輕輪狀病毒再感染的癥狀。
因此，為了開(kāi)發(fā)更為安全有效的理想的輪狀病毒活疫苗，對(duì)原有的動(dòng)物輪狀病毒株活疫苗進(jìn)行了改造，即通過(guò)基因重配理論和技術(shù)，將人輪狀病毒的中和抗原VP7(和/或)VP4的編碼基因片段交換到動(dòng)物輪狀病毒基因組上，構(gòu)建出新的輪狀病毒基因重配株，開(kāi)發(fā)了或正在開(kāi)發(fā)輪狀病毒基因重配株口服活疫苗，臨床觀(guān)察已見(jiàn)成功。
狀病毒NT株RNA基因組中的8個(gè)基因片段以上；2)各基因重配株基因組中攜帶人輪狀病毒G1型，G2型，G3型，或G4型VP7血清型抗原編碼基因片段。
本發(fā)明上述各基因重配株在新生小牛腎原代細(xì)胞和Vero傳代細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)良好，各基因重配株培養(yǎng)物經(jīng)MA-104細(xì)胞檢定結(jié)果，病毒滴度可達(dá)4.5-5.5log10 TCIDEA50/ml。
本發(fā)明為輪狀病毒培養(yǎng)物病毒滴定提供一種新方法，即TCIDEA50法。
本發(fā)明上述各基因重配株經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)50代結(jié)果證實(shí)，遺傳性狀穩(wěn)定，RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜未見(jiàn)改變。
本發(fā)明上述各基因重配株病毒活性穩(wěn)定性良好，37℃耐熱性試驗(yàn)合格。
本發(fā)明為確保上述基因重配株培養(yǎng)物的耐熱穩(wěn)定性，提供一種性能良好的蔗糖果糖保護(hù)劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人確定下述優(yōu)選的技術(shù)方案1)基因重配株的動(dòng)物輪狀病毒親本株(親本株1)是對(duì)人弱毒性狀的動(dòng)物輪狀病毒，即羔羊輪狀病毒NT株，是用細(xì)胞培養(yǎng)從羔羊腹瀉糞便中分離的自然分離株，屬輪狀病毒A群，G10型，P12型，電泳圖譜為長(zhǎng)型；2)基因重配株的人輪狀病毒親本株(親本株2)是人輪狀病毒G1型Wa株，G2型DS-1株，人輪狀病毒G3型(本實(shí)驗(yàn)室采用同為G3型的猴輪狀病毒SA11株)，G4型Hochi株，均為實(shí)驗(yàn)室通用的標(biāo)準(zhǔn)參考株。親本株2提供G1型，G2型，G3型，或G4型VP7(和/或VP4)中和抗原編碼基因片段；3)進(jìn)行基因重配的宿主系統(tǒng)是適于輪狀病毒繁殖的MA-104傳代細(xì)胞(恒河猴胎腎傳代細(xì)胞)；4)利用混合感染法進(jìn)行基因重配，控制兩個(gè)親本株病毒的細(xì)胞感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)獲得輪狀病毒的混合培養(yǎng)物，包括親本株1和親本株2及基因片段不同組合的子代基因重配株；5)利用蝕斑分離法和終末稀釋分離法篩選目的基因重配株，即以羔羊輪狀病毒基因組為遺傳背景(不少于8個(gè)羊輪狀病毒基因片段，不含羊輪狀病毒第9基因片段，即編碼G10型VP7抗原的基因片段)，并重配了人輪狀病毒G1型，G2型，G3型，或G4型毒株VP7(和/或VP4)中和抗原編碼基因片段，即第7，第8，或第9基因片段(因不同毒株而異)；6)利用輪狀病毒RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳(混合交叉電泳)鑒定子代基因重配株，并確定基因重配株的11個(gè)基因片段，特別是VP7抗原編碼基因片段，來(lái)自哪個(gè)親本株；7)利用輪狀病毒VP7型抗原單克隆抗體ELISA法鑒定子代基因重配株的VP7型別；8)確定本發(fā)明的人--羔羊輪狀病毒基因重配株。
在如下實(shí)施例中，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例11.細(xì)胞培養(yǎng)選定適于輪狀病毒繁殖的細(xì)胞系，即MA-104傳代細(xì)胞(恒河猴胎腎傳代細(xì)胞，ECACC 85102918)。細(xì)胞生長(zhǎng)液為市售的MEM培養(yǎng)基(Eagle最低必需培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司生產(chǎn))，并加入10％(V/V)的胎牛血清或新生小牛血清(美國(guó)GIBCO公司生產(chǎn))，100ug/ml卡那霉素，培養(yǎng)容器為方瓶。培養(yǎng)面積為32cm2，培養(yǎng)溫度為37℃。
取已生長(zhǎng)成片的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用適量胰蛋白酶-Versene消化分散液(0.1％胰蛋白酶和0.02％Versene混合液，胰蛋白酶1∶250，美國(guó)Difco公司生產(chǎn))，將細(xì)胞分散成游離的單個(gè)或小團(tuán)細(xì)胞，按1∶3-1∶4擴(kuò)大比例加入培養(yǎng)液，吹打均勻，接種3-4個(gè)培養(yǎng)瓶，置37℃溫箱培養(yǎng)，2-4日可生長(zhǎng)成片。
按實(shí)驗(yàn)需要，細(xì)胞也接種于培養(yǎng)板中(6孔，24孔，96孔，美國(guó)Nunc公司生產(chǎn))，置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。2.輪狀病毒培養(yǎng)取輪狀病毒毒種原液，按最終濃度5.0-10ug/ml加入IX型胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn))，37℃作用1小時(shí)，病毒用MEM液稀釋10-1或10-2，接種生長(zhǎng)成片的MA-104細(xì)胞，每瓶細(xì)胞接種病毒液0.1ml，置37℃吸附1小時(shí)后，加入MEM液10ml，此培養(yǎng)液含0.5-1.0ug/ml IX型胰蛋白酶，置37℃培養(yǎng)。
輪狀病毒引起的細(xì)胞病變?yōu)榧?xì)胞圓縮，胞內(nèi)顆粒增加。當(dāng)細(xì)胞病變75％以上時(shí)，將感染細(xì)胞置-25℃低溫冰箱中凍融2次后，收獲病毒液，編號(hào)后置-25℃低溫冰箱保存。
本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)毒株和目的基因重配株的原種置-65℃低溫冰箱保存。
實(shí)施例2輪狀病毒的鑒定1)群抗原鑒定ELISA快速法，輪狀病毒抗原診斷試劑盒為蘭州生物制品研究所生產(chǎn)。2)亞群抗原鑒定輪狀病毒核酸電泳法(酚抽提法提取輪狀病毒基因組RNA，聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染色法)。本發(fā)明所用人輪狀病毒毒株，電泳圖譜長(zhǎng)型為亞群II，電泳圖譜短型為亞群I。3)基因型(輪狀病毒RNA電泳圖譜)鑒定本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)毒株具有各自的獨(dú)特的電泳圖譜。4)血清型(G型)鑒定采用輪狀病毒VP7單克隆抗體ELISA法，試劑為日本Serotec Lab公司產(chǎn)品。本型OD值應(yīng)比異型OD值高2倍以上。
實(shí)施例3輪狀病毒基因重配1)親本株的選定親本株1輪狀病毒基因重配株的背景基因毒株是羔羊輪狀病毒NT株。親本株2輪狀病毒G1型，G2型，G3型，G4型毒株，是提供該型VP7(和/
或VP4)編碼基因片段的供體株。2)基因重配以輪狀病毒G4型基因重配株為例取親本株1羔羊病毒NT株和親本株2輪狀病毒Hochi株(G4型)混合感染MA-104細(xì)胞24孔培養(yǎng)板(病毒接種方法見(jiàn)實(shí)施例1)，每孔接種0.1ml，兩個(gè)毒株各0.05ml，感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)約為2.0 TCID50/細(xì)胞。置37℃吸附1小時(shí)后，用MEM液輕洗3次，每孔加入1ml MEM培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞病變達(dá)到75％以上時(shí)收獲。
以上病毒收獲液為混合體，有親本株1、親本株2、及親本株1、2基因重配所產(chǎn)生的不同的子代基因重配株。
實(shí)施例4輪狀病毒基因重配子代重配株的分離和篩選將以上實(shí)施例3基因重配所得的病毒混合液按以下方法進(jìn)行分離和篩選1)蝕斑法將病毒混合體用MEM液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后(10-2或10-5)，接種MA-104細(xì)胞6孔板進(jìn)行蝕斑分離。病毒接種方法見(jiàn)實(shí)施例1，在病毒吸附后加入瓊脂覆蓋層，即MEM培養(yǎng)液含0.8％瓊脂糖(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)，置37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-5日，加蓋中性紅(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)瓊脂，即MEM培養(yǎng)液含0.06％中性紅，置37℃或室溫下2-3日，觀(guān)察蝕斑。一個(gè)蝕斑理論上是一個(gè)病毒顆粒子代的繁殖體。
隨意挑取單個(gè)子代蝕斑并移種到MA-104細(xì)胞24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)，即1個(gè)蝕斑的瓊脂接種1孔。出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲病毒液，輪狀病毒ELISA檢測(cè)陽(yáng)性，編號(hào)后置-25℃低溫冰箱保存。
取上述分離后的病毒樣品，提取RNA進(jìn)行電泳圖譜分析，根據(jù)圖譜鑒定該病毒樣品是親本株，或是基因重配株。
結(jié)果證明蝕斑法可以挑選出單個(gè)的子代株，而且可以再通過(guò)蝕斑法將單個(gè)的子代株再克隆。2)終末稀釋法將病毒混合體用MEM液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后(10-2或10-5)，接種MA-104細(xì)胞96孔板進(jìn)行終末稀釋法分離，病毒接種方法見(jiàn)實(shí)施例1。每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔0.1ml，37℃培養(yǎng)4-5日，觀(guān)察細(xì)胞病變，判定陽(yáng)性或陰性。按Reed-Muench法判定TCID50的終點(diǎn)，將低于50％陽(yáng)性的稀釋度的陽(yáng)性孔，逐孔轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)擴(kuò)增，收獲病毒液。輪狀病毒ELISA檢測(cè)陽(yáng)性，編號(hào)后置-25℃低溫冰箱保存。
在終末稀釋的條件下，低于50％陽(yáng)性的稀釋度的陽(yáng)性孔，理論上可能是一個(gè)病毒顆粒子代的繁殖體。
取上述分離后的病毒樣品，提取RNA進(jìn)行電泳圖譜分析，根據(jù)圖譜鑒定該病毒樣品是親本株，或是基因重配株。
結(jié)果證明終末稀釋法法可以挑選出單個(gè)的子代株，而且可以再通過(guò)終末稀釋分離法將單個(gè)的子代株再克隆。
實(shí)施例5基因重配子代株的選擇法1)隨機(jī)法如以上實(shí)施例4所述，親本株1和親本株2按同樣接種量感染MA-104細(xì)胞，收獲病毒混合樣品，進(jìn)行分離和篩選，其中約80％為親本株1和親本株2的子代病毒，即非重配子代株，約20％子代為基因重配株。2)免疫血清壓迫選擇法體內(nèi)法在親本株1和親本株2混合感染培養(yǎng)過(guò)程中，加入超量的抗親本株1(羔羊輪狀病毒NT株)的免疫血清，中和殺滅親本株1子代病毒以及所有具有羔羊輪狀病毒VP7抗原的基因重配子代株，有利于親本株2目的基因重配株的篩選。
體外法或是在基因重配之后和收獲病毒混合樣品之后，用超量的抗親本株1(羔羊輪狀病毒NT株)的免疫血清，中和處理親本株1子代病毒以及所有具有羔羊輪狀病毒VP7抗原的基因重配子代株，然后再接種MA-104細(xì)胞培養(yǎng)，篩選子代株，有利于親本株2目的基因重配株的篩選。
免疫血清壓迫選擇法所獲得的基因重配混合病毒樣品中所含子代株比隨機(jī)法大約可少50％。
實(shí)施例6輪狀病毒基因重配株的鑒定以輪狀病毒G4型基因重配株為例。1)兩個(gè)親本株基因圖譜的差別提取親本株1(羔羊NT株)和親本株2(H株)的病毒核酸RNA樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，第一行為親本株1，第二行為親本株1和親本株2的等量混合樣品，第三行為親本株2。根據(jù)第二行的混合電泳圖譜可見(jiàn)22條帶，即親本株1的11條帶和親本株2的11條帶。結(jié)果表明親本株1和親本株2的11個(gè)基因片段是各不相同的。2)基因重配子代株病毒的鑒定將實(shí)施例4所分離挑選的基因重配子代株病毒樣品，提取RNA樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，同時(shí)將親本株1和親本株2的RNA樣品也進(jìn)行電泳作為對(duì)照。基因重配子代株病毒樣品電泳圖譜的11條帶，同親本株電泳圖基因重配子代株譜進(jìn)行對(duì)比，可以確定哪條片段來(lái)自哪個(gè)親本株。由此可以鑒定所挑選的子代株是親本株1，親本株2，或是重配株。廢棄親本株1和親本株2的子代株，保留具有混合片段的基因重配子代株。3)目的基因重配株的選擇根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜分析，選擇目的基因重配株，如G4型基因重配株具有親本株2(Hochi株G4型)的第9基因片段和親本株1(羔羊輪狀病毒NT株)的第1，2，3，4，5，6，7，8，10，11等10個(gè)基因片段。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在上述基因重配子代株病毒樣品中，獲得了目的基因重配株，即G4型基因重配子代株病毒樣品，命名為NT-4株。
同樣方法和實(shí)驗(yàn)過(guò)程，獲得了NT-2株(G2型基因重配株)，NT-3株(G3型基因重配株)，NT-1株(G1型基因重配株)。
實(shí)施例7目的基因重配株的確定按上述方法獲得并確認(rèn)了以下的目的基因重配株(代表株)基因片段基因重配株 1 2 3 4 5 6 7 891011血清型NT-4株 羊羊羊羊羊羊羊 羊4羊羊G4NT-2株 羊羊羊羊羊羊22 2羊羊G2NT-3株 羊羊羊羊羊羊羊 羊3羊羊G3NT-1株 羊羊羊羊羊羊羊 羊1羊羊G1實(shí)施例8目的基因重配株的檢定以G4型基因重配株NT-4株為例1) 輪狀病毒A群，輪狀病毒ELISA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。2) 輪狀病毒RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果陽(yáng)性，11條基因片段，其中第9片段來(lái)自Hochi株(G4型)，而第1，2，3，4，5，6，7，8，10，11，基因片段則來(lái)自羔羊病毒NT株。3) 血清型G型VP7單克隆抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)為G4型。
實(shí)施例9基因重配株的遺傳穩(wěn)定性將確定的基因重配株在MA-104細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)傳代至第50代，結(jié)果表明基因重配株遺傳性狀穩(wěn)定，RNA電泳圖譜未見(jiàn)改變。
實(shí)施例10基因重配株的病毒滴度取基因重配株第5-10代病毒培養(yǎng)物，用MA-104細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒滴定。TCIDEA50法用MEM液將病毒樣品稀釋為10-1--10-5，接種96孔板，每孔0.1ml，根據(jù)細(xì)胞病變判斷各孔陽(yáng)性或陰性，再用輪狀病毒ELISA的方法判斷各孔陽(yáng)性或陰性，并以ELISA結(jié)果為準(zhǔn)，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，特稱(chēng)之為T(mén)CIDEA50。
基因重配株的病毒滴度為4.5-5.5log10 TCIDEA50/ml。
實(shí)施例11基因重配株的大量培養(yǎng)方法1取基因重配株NT-4株接種新生小牛腎原代細(xì)胞，采用大方瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)面積300cm2，加液量為150ml，病毒稀釋10-1--10-2，接種量為10ml.置37℃吸附1小時(shí)，培養(yǎng)4--5日，收獲病毒液的病毒滴度達(dá)4.5-5.5log10TCIDEA50/ml。
方法2取基因重配株NT-4株接種Vero細(xì)胞，采用大方瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)面積300cm2，加液量為150ml，病毒稀釋10-1--10-2，接種量為10ml。37℃吸附1小時(shí)，培養(yǎng)4--5日，收獲病毒液的病毒滴度達(dá)4.0-5.0log10 TCIDEA50/ml。羔羊輪狀病毒NT株的大量培養(yǎng)方法取羔羊輪狀病毒NT株接種Vero細(xì)胞，采用大方瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)面積300cm2，加液量為150ml，病毒稀釋10-1--10-2，接種量為10ml。37℃吸附1小時(shí)，培養(yǎng)4--5日，收獲病毒液的病毒滴度達(dá)4.0--5.0log10TCIDEA50/ml。
權(quán)利要求
1. 一組輪狀病毒基因重配株，其特征在于該組基因重配株以羔羊輪狀病毒dsRNA基因組為遺傳背景，攜帶有人輪狀病毒(G1，G2，G3或G4血清型)VP7中和抗原蛋白編碼基因片段(第7，8，或9基因片段)，和/或VP4中和抗原蛋白編碼基因片段(第4基因節(jié)段)，或兼有人輪狀病毒的另一個(gè)基因片段。
2. 權(quán)利要求1的一組輪狀病毒基因重配株，其特征在于以羔羊輪狀病毒NT株(G10型)dsRNA基因組為遺傳背景，即含有羔羊輪狀病毒dsRNA基因組中的8個(gè)以上基因片段，但編碼VP7中和抗原的第9基因片段除外。
3. 權(quán)利要求1的一組輪狀病毒基因重配株，其特征在于含有人輪狀病毒(G1，G2，G3或G4血清型)dsRNA基因組中的VP7中和抗原蛋白編碼基因片段(第7，8，或9基因片段)，和/或VP4中和抗原蛋白編碼基因片段(第4基因節(jié)段)，和/或兼有人輪狀病毒dsRNA基因組的另一個(gè)其它基因片段，即該組輪狀病毒基因重配株所含人輪狀病毒dsRNA基因組的基因片段不超過(guò)3個(gè)。
4. 如權(quán)利要求1，2，和3中所述的輪狀病毒基因重配株，其中的一個(gè)親本株，即對(duì)人弱毒的動(dòng)物輪狀病毒，是天然發(fā)生和分離的羔羊輪狀病毒(NT株)。
5. 如權(quán)利要求1，2，和3中所述的輪狀病毒基因重配株，其中另一個(gè)親本株，即人輪狀病毒G1，G2，G3或G4血清型VP7(和/或VP4)中和抗原蛋白的供體，選自人輪狀病毒VP7血清型G1，VP7血清型G2，VP7血清型G3，VP7血清型G4，均為已知的國(guó)際實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)參考株。
6. 權(quán)利要求1至3的一組輪狀病毒基因重配株中，含有特定的人輪狀病毒(G1，G2，G3或G4血清型)dsRNA基因組中的第7，或8，或9基因片段，即編碼VP7中和抗原蛋白基因片段。
7. 權(quán)利要求1至3的一組輪狀病毒基因重配株中，含有羔羊—人輪狀病毒G1型基因重配株，即NT1輪狀病毒基因重配株。
8. 權(quán)利要求1至3的一組輪狀病毒基因重配株中，含有羔羊—人輪狀病毒G2型基因重配株，即NT2輪狀病毒基因重配株。
9. 權(quán)利要求1至3的一組輪狀病毒基因重配株中，含有羔羊—人輪狀病毒G3型基因重配株，即NT3輪狀病毒基因重配株。
10.權(quán)利要求1至3的一組輪狀病毒基因重配株中，含有羔羊—人輪狀病毒G4型基因重配株，即NT4輪狀病毒基因重配株。
11.權(quán)利要求1至3和7至10中的任何一項(xiàng)輪狀病毒基因重配株用于制備輪狀病毒疫苗，預(yù)防輪狀病毒性腹瀉的用途。
12.權(quán)利要求1至3和7至10中的任何一項(xiàng)輪狀病毒基因重配株用于制備輪狀病毒抗原和抗體的用途。
13.權(quán)利要求1至3和7至10中的任何一項(xiàng)輪狀病毒基因重配株用于制備輪狀病毒診斷試劑的用途。
14.權(quán)利要求1至3和7至10中的任何一項(xiàng)輪狀病毒基因重配株用于同其他輪狀病毒進(jìn)行基因再重配的用途。
15.權(quán)利要求以羔羊輪狀病毒NT株dsRNA基因組為遺傳背景，選育和組建與任何其他人輪狀病毒G血清型毒株dsRNA基因組的基因重配株。
16.權(quán)利要求1至3和7至10中所述的基因重配株，在基因重配技術(shù)和方法中應(yīng)用特定的感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)。
17.權(quán)利要求1至3和7至10中所述的基因重配株，中試批量培養(yǎng)的宿主系統(tǒng)是新生小牛腎原代和二代細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1至3和7至10中所述的基因重配株，中試批量培養(yǎng)的宿主系統(tǒng)是Vero傳代細(xì)胞。
19.一種保護(hù)劑用于保護(hù)權(quán)利要求1至3和7至10中的任何一項(xiàng)輪狀病毒基因重配株病毒活性的穩(wěn)定性。
20.一種檢定輪狀病毒病毒活性的方法用于檢測(cè)輪狀病毒樣品的病毒滴度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組輪狀病毒基因重配株及其構(gòu)建方法，該組基因重配株是攜帶人輪狀病毒(G1型，G2型G3型G4型)特異性有效抗原VP7編碼基因片段的動(dòng)物輪狀病毒，構(gòu)建成一組安全，高效的輪狀病毒活疫苗的理想疫苗株，具有良好的生物學(xué)性狀，可用于生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗，輪狀病毒診斷試劑及輪狀病毒抗原和抗體，用于小兒輪狀病毒腹瀉的預(yù)防和診斷。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1396258SQ0211768
公開(kāi)日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者白植生, 朱偉文 申請(qǐng)人:北京諾泰科華生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司