專利名稱：皮膚外用制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黑色素生成抑制劑以及含有該抑制劑的皮膚外用制劑。詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明涉及黑色素生成抑制效果優(yōu)異，且穩(wěn)定性、安全性高的黑色素生成抑制劑，和含有該抑制劑作為有效成分的化妝品和/或保健品的皮膚外用制劑。
背景技術(shù)：
皮膚上的色素沉積是由皮膚內(nèi)存在的色素生成細(xì)胞(黑素細(xì)胞)地活化而導(dǎo)致的黑色素生成顯著亢進(jìn)的結(jié)果產(chǎn)生的，這已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的肌膚病痛。特別是近年來(lái)，開(kāi)發(fā)可改善和/或抑制這類(lèi)色素沉積并對(duì)肌膚保持美白有用的、即具有肌膚美白作用的物質(zhì)已顯得更為迫切。
作為抑制黑色素生成的物質(zhì)，例如已知抗壞血酸和其衍生物、谷胱甘肽或半胱氨酸等含硫氨基酸類(lèi)化合物、曲酸和其衍生物、壬二酸和其衍生物、凝血酸和其衍生物、氫醌和其衍生物(特公昭60-16906號(hào)公報(bào)，特公昭60-56912號(hào)公報(bào))、烷基間苯二酚衍生物(特開(kāi)2000-38334號(hào)公報(bào))、泛醌衍生物(特開(kāi)昭61-289029號(hào)公報(bào)，特表平9-510725號(hào)公報(bào))等，進(jìn)而可將這些物質(zhì)作為有效成分用于乳膏、軟膏、乳液等，并涂抹、貼附于色素沉積的部位。但是，抗壞血酸和其衍生物，不但在穩(wěn)定性方面存在問(wèn)題，而且在含水體系中易于變色或變臭。谷胱甘肽或半胱氨酸等不僅異臭強(qiáng)烈，而且存在易氧化的問(wèn)題，因此難以組合到外用制劑中。而且這些化合物的作用起效緩慢，所以很難得到充分的效果。壬二酸和其衍生物、凝血酸和其衍生物為無(wú)臭的白色粉末，與皮膚外用制劑中所采用的各種基材的相容性也較好，但是兩者黑色素抑制作用的起效緩慢。
另外，氫醌和其衍生物、烷基間苯二酚衍生物，由于有皮膚刺激性和/或致敏性，因此作為副作用有可能引起變應(yīng)性接觸皮炎等，作為皮膚外用制劑使用時(shí)存在一些問(wèn)題。
另一方面，泛醌衍生物、特別是泛醌-10(C59H90O4Mw862)存在于生物體內(nèi)的細(xì)胞膜和線粒體中，在電子傳遞體系中用作輔酶，并且作為調(diào)控黑素細(xì)胞中酪氨酸激酶活性的物質(zhì)起著重要的作用。但是，由于分子量高，經(jīng)皮膚吸收性極低，且與皮膚外用制劑中所采用的各種基材的相容性差，很難在皮膚外用制劑的基材中穩(wěn)定地共存。
發(fā)明的公開(kāi)
本發(fā)明的目的在于，提供黑色素生成抑制作用、即皮膚美白作用優(yōu)異，且安全性、穩(wěn)定性高的藥劑以及含有該藥劑作為有效成分的皮膚外用制劑。
本發(fā)明者們?yōu)榻鉀Q上述課題進(jìn)行了悉心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，4-苯二酚衍生物和1，4-苯醌衍生物的皮膚美白作用極為優(yōu)異，且穩(wěn)定性、安全性高，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以通式(I)所示的苯二酚衍生物或通式(II)所示的苯醌衍生物為有效成分的黑色素生成抑制劑。
在本發(fā)明的苯二酚衍生物、苯醌衍生物中，如果x+y的值不足規(guī)定數(shù)，對(duì)細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，x+y的值如果比規(guī)定的數(shù)大，則黑色素生成抑制效果將顯著降低，得不到所期望的黑色素生成抑制作用。另外，苯二酚衍生物幾乎無(wú)色，用于皮膚外用劑時(shí)具有外觀好的優(yōu)點(diǎn)。
本說(shuō)明書(shū)中，通式(I)所示的1，4-苯二酚衍生物可以由以下簡(jiǎn)略式表示。
BD-A-yH
[式中，BD＝苯二酚，A＝x+y]
因此，本發(fā)明中通式(I)所示的1，4-苯二酚衍生物為BD-4-0H、BD-4-1H、BD-4-2H、BD-4-3H、BD-4-4H、BD-5-0H、BD-5-1H、BD-5-2H、BD-5-3H、BD-5-4H、BD-5-5H、BD-6-0H、BD-6-1H、BD-6-2H、BD-6-3H、BD-6-4H、BD-6-5H和BD-6-6H。從其效果和1，4-苯二酚衍生物合成的容易程度以及成本來(lái)考慮，優(yōu)選下列1，4-苯二酚衍生物。
BD-4-0H (x+y＝4，y＝0)，即
2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2，6，10，14-十六烷四烯基)-1，4-苯二酚；
BD-4-3H (x+y＝4，y＝3)，即
2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2-十六烷單烯基)-1，4-苯二酚；
BD-4-4H (x+y＝4，y＝4)，即
2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2-十六烷基)-1，4-苯二酚；
BD-5-0H (x+y＝5，y＝0)，即
2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基-2，6，10，14，18-二十烷五烯基)-1，4-苯二酚；
BD-5-5H (x+y＝5，y＝5)，即
2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基-二十烷基)-1，4-苯二酚；
BD-6-0H(x+y＝6，y＝0)，即
2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四烷六烯基)-1，4-苯二酚；和
BD-6-6H(x+y＝6，y＝6)，即
2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19，23-六甲基-二十四烷基)-1，4-苯二酚。
另外，通式(II)所示的1，4-苯醌衍生物可以通過(guò)下列簡(jiǎn)略式表示
BQ-A-yH
[式中，BQ＝苯醌，A＝x+y]
因此，本發(fā)明中通式(II)所示的1，4-苯醌為BQ-4-0H，BQ-4-1H，BQ-4-2H，BQ-4-3H，BQ-4-4H，BQ-5-0H，BQ-5-1H，BQ-5-2H，BQ-5-3H，BQ-5-4H和BQ-5-5H。從其效果和1，4-苯醌衍生物合成的容易程度以及成本來(lái)考慮，優(yōu)選下列1，4-苯醌衍生物。
BQ-4-0H(x+y＝4，y＝0)，即2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2，6，10，14-十六烷四烯基)-1，4-苯醌；
BQ-4-3H(x+y＝4，y＝3)，即2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2-十六烷單烯基)-1，4-苯醌；和
BQ-5-0H(x+y＝5，y＝0)，即2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基-2，6，10，14，18-二十烷五烯基)-1，4-苯醌。
上述1，4-苯二酚衍生物和1，4-苯醌衍生物與黑色素生成細(xì)胞(B16黑色素瘤，HM3KO黑色素瘤)直接接觸時(shí)，3ppm、優(yōu)選10ppm的低濃度就可顯示顯著的黑色素生成抑制作用，并對(duì)皮膚具有極為顯著的美白作用。
因此，本發(fā)明提供皮膚美白作用優(yōu)異的皮膚外用制劑，其特征在于，含有1種以上由上述1，4-苯二酚衍生物和/或1，4-苯醌衍生物構(gòu)成的黑色素生成抑制劑。皮膚外用制劑中的1種以上的上述黑色素生成抑制劑的含量為0.0001重量％以上。上述的本發(fā)明黑色素生成抑制劑，由于在極低的濃度下就具有顯著的效果，因此0.0001重量％以上即可。另外，本發(fā)明的黑色素生成抑制劑含量超過(guò)某種濃度以上時(shí)所具有的效果也不會(huì)增加，因此其含量沒(méi)有必要在5重量％以上。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，皮膚美白用的皮膚外用制劑含有0.0001～5重量％、優(yōu)選0.01～1重量％的1種以上由本發(fā)明1，4-苯二酚衍生物和/或1，4-苯醌衍生物構(gòu)成的黑色素生成抑制劑。
另外，本發(fā)明的皮膚美白用的皮膚外用制劑的給藥量，取決于年齡、個(gè)體差異、人種差異、色素沉積狀況等，但是，通常將本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物和/或1，4-苯醌衍生物以0.01～5mg/cm2、優(yōu)選0.1～1mg/cm2的量每天1～3次直接涂抹于皮膚的患病部位上。
另外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，皮膚外用制劑還可以與制劑上允許的其它藥劑、添加劑和/或基劑混合。添加劑可選自抗氧化劑，防紫外線劑，角質(zhì)脫落劑，表面活性劑，香料，色素，防腐劑，pH調(diào)節(jié)劑，螯合劑，但為了進(jìn)一步提高本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物和1，4-苯醌衍生物的穩(wěn)定性，優(yōu)選混合抗氧化劑和/或防紫外線劑。另外，優(yōu)選組合提高皮膚外用制劑的有效性的角質(zhì)脫落劑，提高經(jīng)皮吸收性的天然表面活性劑。
本發(fā)明中使用的抗氧化劑沒(méi)有特別的限制，只要是制劑上允許的就可，例如生育酚或其衍生物。作為水溶性抗氧化劑，例如低濃度抗壞血酸或其衍生物、硫代?；撬帷⒐入赘孰牡群虬被?，迷迭香提取物、鼠尾草提取物等抗氧化草藥提取物，丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等合成抗氧化劑，可以適宜配合這些物質(zhì)的1種或2種以上組合。
本發(fā)明的防紫外線劑中，包括紫外線吸收劑和紫外線反射劑。作為紫外線吸收劑，例如肉桂酸辛酯、2-乙基己?；?二對(duì)甲氧基肉桂酸甘油單酯等肉桂酸酯衍生物，對(duì)氨基安息香酸辛酯、N，N-二甲基-安息香酸辛酯等安息香酸酯衍生物，2，4-二羥基二苯甲酮、2，2’-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸鹽等二苯甲酮。作為其它的紫外線吸收劑，例如3-(4’-甲基亞芐基)-d，1-莰烷、3-亞芐基-d，1-莰烷、尿刊酸、尿刊酸乙酯、4-甲氧基-4’-叔丁基-二苯甲?；淄榈?。作為紫外線反射劑，例如氧化鈦、氧化鋅、云母鈦等。
作為角質(zhì)脫落劑，例如檸檬酸、乙醇酸等α-羥基-羧酸、乙二胺四羧酸單、二或三鈉鹽，以及三甲基甘氨酸、羥基脯氨酸等氨基酸等。
作為天然的表面活性劑，特別可以例舉單烷酰基磷脂酰膽堿等溶血卵磷脂、二烷酰基磷脂酰膽堿、二烷?；字Ｒ掖及返嚷蚜字?lèi)。
本發(fā)明的皮膚外用制劑中，通常可以配合化妝品中使用的成分(例如油性成分，保濕成分，增稠劑，乳化劑和各種添加劑)。例如，作為油性成分可以例舉烴類(lèi)、各種合成酯類(lèi)、蠟類(lèi)、油脂類(lèi)、高級(jí)脂肪酸類(lèi)、高級(jí)醇類(lèi)、聚硅氧烷類(lèi)等。
作為保濕成分，例如丙二醇、1，3-丁二醇、異戊二醇、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸鈉、軟骨素硫酸鈉、水解膠原肽、彈性蛋白肽、角蛋白肽、甾醇配糖物等。
作為增稠劑，例如水溶性合成高分子化合物羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素或其鹽等，水溶性天然高分子化合物榠櫨子提取物、愈瘡膠、黃原膠、藻酸鈉等。
可使用的乳化劑，例如作為非離子乳化劑的各種高級(jí)醇的聚氧乙烯加成物等，各種高級(jí)脂肪酸聚乙二醇單、二酯等，以及甘油脫水山梨糖醇單、二酯等，作為陰離子乳化劑的各種高級(jí)脂肪酸皂堿，以及作為陽(yáng)離子乳化劑的α-油?；视挺痢?磷脂酰膽堿(溶血卵磷脂)、大豆卵磷脂和蛋黃卵磷脂等。另外，作為添加劑，例如香料、色素、防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑、螯合劑等，這些物質(zhì)可以組合起來(lái)適宜使用。
另外，作為本發(fā)明方式中的皮膚外用制劑的劑型，可以選自W/O型洗劑、O/W型洗劑、W/O乳膏、O/W型乳膏、粘稠微乳化香精、或O/W型香精等。
以下，列舉本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物的合成實(shí)例。[合成例1] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基十六烷-2，6，10，14-四烯基)-苯-1，4-二酚(BD-4-0H)的合成
將2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-二羥基苯25g和鄰反-香葉基沉香醇25g添加到100ml異丙醚中，在40℃加熱溶解。在40℃左右、1小時(shí)內(nèi)向其中滴加12.2g三氟化硼合乙醚絡(luò)合物溶解在25ml異丙醚中的溶液。滴加后，在相同溫度攪拌，使反應(yīng)進(jìn)行完全(約1小時(shí))。將反應(yīng)液冷卻至室溫，加水10ml。將全部液體移入分液漏斗，除去下層。在異丙醚層中加入200ml含有少量連二亞硫酸鈉的5％氫氧化鈉水溶液，攪拌后靜置，除去下層(為未反應(yīng)的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-二羥基苯)。然后，在異丙醚層中加入100ml含有少量連二亞硫酸鈉的5％氫氧化鈉水溶液，攪拌后靜置，除去下層。用水、飽和食鹽水依次洗滌異丙醚層，減壓蒸餾除去溶劑。所得殘?jiān)ㄟ^(guò)柱色譜精制(載體硅膠，流動(dòng)相異丙醚-己烷)，得到12g油狀BD-4-0H(收率32％)[合成例2] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基十六烷-2-烯基)-苯-1，4-二酚(BD-4-3H)的合成
將25g的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-二羥基苯和25g葉綠醇添加到100ml異丙醚中，在40℃加熱溶解。然后進(jìn)行與合成例1同樣的處理，得到20g油狀的BD-4-3H(收率51％)[合成例3] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基十六烷基)-苯-1，4-二酚(BD-4-4H)的合成
將25g的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-二羥基苯和25g的3，4-二氫葉綠醇添加到100ml異丙醚中，在40℃加熱溶解。然后進(jìn)行與合成例1同樣的處理，得到8.5g油狀的BD-4-4H(收率22％)。[合成例4] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基-2，6，10，14，18-二十烷五烯基)-苯-1，4-二酚(BD-5-0H)的合成
將5.0g的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-二羥基苯和6.2g鄰反-香葉基法呢醇添加到50ml異丙醚中，在40℃加熱溶解。然后，進(jìn)行與合成例1相同的處理，得到12g油狀的BD-5-0H(收率30％)。[合成例5] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-十六烷基)-1，4-苯二酚(BD-4-4H)的合成
將5.0g輔酶Q4在20ml乙醇中加熱溶解。添加1.0g作為催化劑的5％鈀碳，在氫氣流下室溫?cái)嚢琛?小時(shí)后，約有5當(dāng)量的氫被吸收。將反應(yīng)液過(guò)濾后，除去催化劑，減壓蒸餾除去乙醇，得到4.9g油狀的BD-4-4H(收率98％)。[合成例6] 由輔酶Q4合成BD-4-0H
將2.0g輔酶Q4在50ml乙醇中加熱溶解。加入0.2g硼氫化鈉，室溫?cái)嚢柚敝脸壬?。在反?yīng)液中添加100ml己烷后，再添加100ml水和1.5ml冰醋酸。攪拌后靜置并除去下層。然后用水洗滌己烷相并減壓蒸餾除去己烷，得到1.8g油狀的BD-4-0H(收率90％)。[合成例7] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四烷六烯基)-1，4-苯二酚(BD-6-0H)
將0.1g市售的輔酶Q6在5ml乙醇中加熱溶解。加入0.05g硼氫化鈉，室溫?cái)嚢柚敝脸壬?。在反?yīng)液中添加100ml己烷后，進(jìn)一步添加100ml水和0.1ml冰醋酸。攪拌后，靜置并除去下層。水洗己烷相后，減壓蒸餾除去己烷，得到0.1g油狀BD-6-0H(收率100％)。[合成例8] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基-2，6-二十烷二烯基)-苯-1，4-二酚(BD-5-3H)的合成
將5g的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-二羥基苯和5g的3，7，11，15，19-五甲基-2，6-二十烷二烯醇添加到100ml異丙醚中，在40℃加熱溶解。然后進(jìn)行與合成例1相同的處理，得到2.5g油狀BD-5-3H(收率32％)。[合成例9] 2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基二十烷基)-1，4-苯二酚(BD-5-5H)的合成
將0.5g合成例8得到的BD-5-3H在20ml乙醇中加熱溶解。加入0.1g作為催化劑的5％鈀碳，在氫氣流下室溫?cái)嚢琛?小時(shí)后，吸收約2當(dāng)量的氫。過(guò)濾反應(yīng)液并除去催化劑，減壓蒸餾除去乙醇，得到0.49g油狀BD-5-5H(98％)。
下面，結(jié)合下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但它們不對(duì)本發(fā)明有任何限制。
實(shí)施例
以下示出本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物的黑色素生成抑制試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)。[黑色素生成抑制試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)]
使用本發(fā)明的化合物BD-4-0H[合成例1]、BD-4-3H[合成例2]、BD-5-0H[合成例4]、BQ-4-0H、BQ-4-3H和BQ-5-0H，作為比較例的類(lèi)似化合物2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二烷三烯基)-1，4-苯二酚(BD-3-0H)[比較例1]。BD-3-0H用與合成例1同樣的方法從法呢醇制備。另外，用僅添加乙醇的溶液作對(duì)照。(1)黑色素生成抑制試驗(yàn)1)利用來(lái)自小鼠的B16黑素瘤(惡性黑色腫瘤細(xì)胞)培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)
將B16黑素瘤培養(yǎng)細(xì)胞在96孔微滴定板上每孔播種2000個(gè)細(xì)胞，在含有10％胎牛血清和茶堿(0.09mg/ml)的Eagle-MEM培養(yǎng)基中在37℃，5％CO2存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)1天后，將20μl各種濃度的試樣化合物BD-3-0H、BD-4-0H、BD-4-3H、BD-5-0H、BQ-4-0H、BQ-4-3H或BQ-5-0H添加到各孔中，使最終濃度為3、10、50、100或200μg/ml。培養(yǎng)72小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，在其間也添加試樣化合物。第二天收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞沉積物的色調(diào)，判斷對(duì)新生黑色素合成的抑制效果。
同時(shí)對(duì)于細(xì)胞毒性按照下述方法，即，將細(xì)胞用10％福爾馬林緩沖液固定后，用1％龍膽紫染色，用モノセレ-タ-測(cè)定相對(duì)于對(duì)照的細(xì)胞生長(zhǎng)率，以對(duì)照細(xì)胞數(shù)為100％進(jìn)行評(píng)價(jià)。
根據(jù)細(xì)胞沉積物的色調(diào)，按照下述步驟對(duì)黑色素生成進(jìn)行判定，即，用磷酸緩沖液(50mM，pH6.8)洗滌孔后，將細(xì)胞用微刮刀剝離，用磷酸緩沖液回收并離心分離，將沉淀的細(xì)胞沉積物的色調(diào)以下列標(biāo)準(zhǔn)分4級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
-與對(duì)照相同
+稍微變淺
++淺白色
+++白色
對(duì)于BD-4-0H[合成例1]、BQ-4-0H和BD-3-0H[比較例1]，得到的結(jié)果在下述表1中示出。表1
比較例1的BD-3-0H，雖然在3μg/ml顯示高的黑色素生成抑制效果，但同時(shí)對(duì)B16黑素瘤顯示濃度依賴性的高毒性，并且在高濃度(50μg/ml)時(shí)細(xì)胞全部死亡。由此可以認(rèn)為BD-3-0H的黑色素生成抑制效果是由于其細(xì)胞毒性引起的。另一方面，本發(fā)明的BD-4-0H和BQ-4-0H，在3μg/ml能夠觀察到黑色素生成抑制效果，在10μg/ml顯示顯著的效果，但細(xì)胞的生長(zhǎng)率與對(duì)照相同，未觀察到細(xì)胞毒性。另外，BD-4-3H、BD-5-0H、BQ-4-3H和BQ-5-0H在50μg/ml觀察到黑色素生成抑制效果，在100μg/ml顯示顯著的效果，但未觀察到細(xì)胞毒性。2)利用來(lái)自人的HM3KO黑素瘤培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)
將從神戶大學(xué)得到的人HM3KO黑素瘤培養(yǎng)細(xì)胞(Melanoma Res.6，p.25-30[1996])在Dulbecco公司制的Eagle培養(yǎng)基中，加入10％胎牛血清和適量的青霉素和鏈霉素等抗生素，室溫培養(yǎng)。將作為試驗(yàn)樣品的BD-3-0H[比較例1]、BD-4-3H[合成例2]、BD-5-0H[合成例4]、BD-6-0H[合成例7]以最終濃度為3、10、30、100、300μg/ml的量加入到上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天后，用胰蛋白酶和EDTA處理細(xì)胞，用Fuchs-Rosenthal Cytometer測(cè)定細(xì)胞數(shù)，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率。之后，首先目視判定細(xì)胞沉積物的色調(diào)，然后將106個(gè)細(xì)胞用1mol/L濃度的NaOH水溶液煮沸10分鐘溶解，用分光光度計(jì)測(cè)定400nm的吸光度，以定量生成的黑色素量。另外，將對(duì)照(未加樣品)的黑色素生成抑制率作為0％，細(xì)胞生長(zhǎng)率作為100％進(jìn)行相對(duì)定量化。
結(jié)果，比較例1的BD-3-0H在3μg/ml的黑色素生成抑制率為35％，在10μg/ml為60％，低濃度時(shí)抑制率高，但是細(xì)胞生長(zhǎng)率在3μg/ml為93％，10μg/ml時(shí)降為56％，與B16黑素瘤培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果相同，可以認(rèn)為黑色素生成抑制效果是由細(xì)胞毒性引起的。
另一方面，采用本發(fā)明的BD-4-0H在3μg/ml的黑色素生成抑制率為35％，10μg/ml為58％，細(xì)胞生長(zhǎng)率在3μg/ml為90％，在10μg/ml為100％，幾乎未觀察到細(xì)胞毒性。BD-4-3H的黑色素生成抑制率在30μg/ml為36％，100μg/ml為65％。BD-5-0H的黑色素生成抑制率在30μg/ml為42％，在100μg/ml為60％。
上述試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物和1，4-苯醌衍生物具有顯著的黑色素生成抑制效果，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性或毒性顯著地低，可以作為黑色素生成抑制劑使用。
對(duì)于毒理學(xué)特性，還對(duì)本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物進(jìn)行了試驗(yàn)。(2)一次給藥毒性試驗(yàn)
用Wister系大鼠和ICR-JCL系小鼠研究采用各種給藥途徑時(shí)的急性毒性。給藥是用超聲波將本物質(zhì)在生理鹽水中制成懸浮液，調(diào)節(jié)至所定的量來(lái)實(shí)施。給藥后，連續(xù)觀察中毒癥狀，求出到第7天為止的死亡率隨時(shí)間的變化，求出LD50值。對(duì)生存例、死亡例均解剖觀察。通過(guò)Litchfield-Wilcoxon的圖形計(jì)算法算出LD50。
將雌雄大鼠，雌雄小鼠以4000mg/kg口服，以4000mg/kg經(jīng)皮，以500mg/kg皮下，以500mg/kg肌肉注射，以1500mg/kg腹腔內(nèi)，或以250mg/kg靜脈注射形式給藥BD-4-0H，BD-4-3H，BD-5-0H，觀察各種情況下的急性毒性。
結(jié)果，雌雄大鼠和雌雄小鼠在體重、飼料的攝取量都沒(méi)有特別的變化，另外在解剖觀察中，各種臟器也未看到異常。從該結(jié)果可以確認(rèn)，本發(fā)明1，4-苯二酚衍生物的安全性高。(3)致敏性試驗(yàn)
通過(guò)Magnusson B.Kligman A.M創(chuàng)立的極大化測(cè)試法進(jìn)行致敏性試驗(yàn)。(i)致敏誘導(dǎo)
準(zhǔn)備20只豚鼠，10只用于致敏誘導(dǎo)，剩下的10只用作對(duì)照。豚鼠肩胛骨上4×6cm的面積去毛，對(duì)稱于正中線將下列a、b、c三組左右同時(shí)進(jìn)行皮下注射。作為試驗(yàn)樣品，用超聲波將BD-4-0H、BD-4-3H、BD-5-0H制成10％濃度的懸浮水溶液。
a.在左右兩邊分別皮下注射0.05ml(合計(jì)0.1ml)弗氏完全佐劑(FCA Difco公司制)。
b.在左右兩邊分別皮下注射0.05ml試驗(yàn)樣品(用超聲波制成的10％濃度的懸浮水溶液)。
c.在左右兩邊分別皮下注射0.05ml試驗(yàn)樣品(10％濃度的FCA乳化物)。
7天后，在肩胛骨上再次去毛，并涂抹含有10％十二烷基硫酸鈉的凡士林，引起輕微的炎癥。通過(guò)該處理增強(qiáng)致敏誘導(dǎo)。隨后，在該部位涂抹試驗(yàn)樣品，封閉貼附。(ii)誘發(fā)
致敏誘導(dǎo)后第21天，將致敏處置組和對(duì)照組的豚鼠側(cè)腹部5×5cm處去毛后，將各試驗(yàn)樣品用80％乙醇水溶液稀釋，24小時(shí)封閉貼附。對(duì)照組也進(jìn)行同樣的操作。(iii)評(píng)價(jià)
觀察對(duì)致敏處置組和對(duì)照組是否有肉眼可見(jiàn)的異常，比較評(píng)價(jià)致敏處置組有無(wú)紅斑、浮腫及其程度(輕度，中度或高度)。(iv)結(jié)果
本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物對(duì)所有豚鼠均未引發(fā)致敏反應(yīng)。該結(jié)果顯示這類(lèi)化合物即使經(jīng)皮長(zhǎng)期給藥也是安全的。(4)藥理效果試驗(yàn)
使用5只經(jīng)8-甲氧基ソラ一レン處理的光毒性色素沉積WeiserMaple豚鼠，在去毛后的背部用50μl的試驗(yàn)樣品每日1次在4cm2的范圍內(nèi)涂抹8周，根據(jù)下列評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)脫色效果和副作用表現(xiàn)形式的色素沉積程度。
對(duì)色素沉積的抑制效果
評(píng)價(jià)點(diǎn) 判定標(biāo)準(zhǔn)
3 變白(脫色)
2 基本變白
1 稍微變白
0 沒(méi)有變化
-1 稍微變黑
-2 基本變黑
-3 變黑(色素沉積)
試驗(yàn)樣品使用本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物BD-4-0H、BD-4-3H、和BD-5-0H，以及作為比較例2使用氫醌。使各試驗(yàn)樣品以1重量％的濃度溶解在一縮二丙二醇中，將該溶液按照上述方法涂抹到豚鼠上。另外，作為評(píng)價(jià)點(diǎn)，5只Weiser Maple豚鼠的平均評(píng)價(jià)點(diǎn)如下列表2所示。
表2
本發(fā)明的1，4-苯二酚衍生物(BD-4-0H，BD-4-3H，BD-5-0H)均可以隨著時(shí)間增加脫色效果。與之相對(duì)，比較例2的氫醌在第3周時(shí)脫色效果達(dá)到最大，其后由于刺激引起色素沉積，第7、8周相反觀察到黑色化的傾向。
下面，示出本發(fā)明中的皮膚外用制劑的制備例。另外，下述混合量全部為重量％。[實(shí)施例1]W/O潤(rùn)膚洗劑
微晶蠟1.0
蜂蠟 2.0
澳洲堅(jiān)果油2.0
角鯊?fù)?0.0
液體石蠟 19.0
BD-4-0H(合成例1) 1.0
1，3-丁二醇 4.0
甘油 3.0
脫水山梨糖醇倍半油酸酯3.0
溶血卵磷脂1.0
聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨糖醇單油酸酯 1.0
α-生育酚 0.02
防腐劑適量
離子交換水52.98
(制備方法) 在離子交換水中添加保濕劑1，3-丁二醇、甘油，并在70℃加熱。另外將微晶蠟、蜂蠟、澳洲堅(jiān)果油、角鯊?fù)楹鸵后w石蠟在70℃加熱溶解，然后在保持70℃的同時(shí)添加BD-4-0H、乳化劑脫水山梨糖醇倍半油酸酯、溶血卵磷脂和聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨糖醇單油酸酯、抗氧化劑α-生育酚、以及防腐劑。在攪拌的同時(shí)，將先配制的水相徐徐添加到油相中預(yù)乳化，用勻漿器將乳化顆粒均質(zhì)化后，脫氣、冷卻。[實(shí)施例2]W/O潤(rùn)膚洗劑
鯨蠟醇 1.0
蜂蠟0.5
凡士林 2.0
角鯊?fù)? 6.0
二甲基聚硅氧烷 2.0
乙醇5.0
BD-4-3H(合成例2)1.0
甘油4.0
1，3-丁二醇 4.0
聚氧乙烯(10摩爾)單油酸酯1.0
榠櫨子粘液(1％水溶液) 20.0
α-生育酚 0.02
防腐劑 適量
香料適量
離子交換水 52.48
(制備方法)在離子交換水中添加甘油、1，3-丁二醇和榠櫨子粘液，并在70℃加熱。另外將鯨蠟醇、蜂蠟、凡士林、角鯊?fù)楹投谆酃柩跬樵?0℃加熱溶解，然后保持70℃的同時(shí)，添加BD-4-3H、乳化劑聚氧乙烯(10摩爾)單油酸酯、抗氧化劑α-生育酚、以及防腐劑。在攪拌的同時(shí)，將先配制的水相徐徐添加到油相中預(yù)乳化，溫度降至35℃后添加乙醇，用勻漿器將乳化顆粒均質(zhì)化后，脫氣、冷卻。[實(shí)施例3]W/O潤(rùn)膚乳膏
液體石蠟30.0
微晶蠟 2.0
凡士林 5.0
BD-5-5H(合成例5)1.0
二油酸二甘油酯 5.0
α-生育酚 0.02
防腐劑 適量
香料適量
水相(1)
L-谷氨酸鈉1.2
L-絲氨酸 0.4
三甲基甘氨酸 0.4
離子交換水13.0
水相(2)
一縮二丙二醇 3.0
抗壞血酸-α-D-吡喃葡萄糖苷0.2
乙醇酸鈉 0.1
乙醇酸0.1
離子交換水38.58
(制備方法)將水相(1)在50℃加熱溶解，在攪拌的同時(shí)徐徐添加到同樣在50℃加熱的乳化劑部分二油酸二甘油酯中，配制成乳化組合物。將含有BD-5-5H和α-生育酚的油相(液體石蠟、微晶蠟和凡士林)在70℃加熱溶解后，在其中均勻分散上述乳化組合物。再將水相(2)在70℃加熱，在充分?jǐn)嚢柘绿砑拥缴鲜龇稚⒁褐?，用勻漿器均勻乳化后，脫氣、過(guò)濾并冷卻至30℃。[實(shí)施例4]O/W潤(rùn)膚乳膏
鯨蠟醇 5.0
硬脂酸 3.0
凡士林 5.0
角鯊?fù)? 10.0
甘油三2-乙基己酸酯 7.0
BD-5-0H(合成例4)0.5
α-生育酚 0.02
1，3-丁二醇 5.0
甘油5.0
丙二醇單硬脂酸酯3.0
聚氧乙烯(20摩爾)鯨蠟醇醚3.0
三乙醇胺0.8
防腐劑 適量
香料 適量
離子交換水 52.68
(制備方法)在離子交換水中添加三乙醇胺、保濕劑1，3-丁二醇和甘油，在70℃加熱。將含有BD-5-0H和α-生育酚的油相(鯨蠟醇、硬脂酸、凡士林、角鯊?fù)楹透视腿?-乙基己酸酯)加熱溶解后，添加乳化劑丙二醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯(20摩爾)鯨蠟醇醚、防腐劑和香料，在70℃加熱。將其添加到先配制的水相中預(yù)乳化。然后用勻漿器將乳化顆粒均質(zhì)后，脫氣、過(guò)濾并冷卻至30℃。[實(shí)施例5]半透明微乳化化妝水
1，3-丁二醇6.0
甘油 5.0
聚乙二醇4000 3.0
澳洲堅(jiān)果油 0.5
BD-4-4H(合成例3) 0.3
α-生育酚 0.02
聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯 1.5
聚氧乙烯(5摩爾)油?；济? 0.3
乙醇 10.0
香料 適量
色素 適量
防腐劑 適量
pH調(diào)節(jié)劑 適量
螯合劑 適量
離子交換水 73.38
(制備方法)在離子交換水中添加保濕劑1，3-丁二醇、甘油和聚乙二醇4000、色素、pH調(diào)節(jié)劑、螯合劑，并在室溫溶解。另外將BD-4-4H、α-生育酚、澳洲堅(jiān)果油、乳化劑聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯(5摩爾)油?；济?、防腐劑和香料添加到乙醇中，并在室溫溶解。在先配制的水相中添加該醇相，用勻漿器配制成微乳化制劑。[實(shí)施例6]粘稠的微乳化香精
一縮二丙二醇5.0
聚乙二醇400 5.0
乙醇10.0
羧基乙烯基聚合物0.3
藻酸鈉 0.3
氫氧化鉀0.15
聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯 1.0
脫水山梨糖醇單油酸酯0.3
溶血卵磷脂 0.2
BD-4-0H(合成例1)0.2
BD-5-5H(合成例5)0.3
α-生育酚 0.02
α-生育酚乙酸酯 0.02
油醇0.5
香料適量
防腐劑 適量
離子交換水 73.38
(制備方法)將羧基乙烯基聚合物溶解在離子交換水中，再依次溶解一縮丙二醇和聚乙二醇400。另外將脫水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯(20摩爾)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、溶血卵磷脂、BD-4-0H、BD-5-5H、油醇、α-生育酚、α-生育酚乙酸酯、香料和防腐劑依次溶解在乙醇中。將其添加到先配制的水相中，用勻漿器微乳化。接著添加溶解在一部分離子交換水中的氫氧化鉀，攪拌、脫氣并過(guò)濾。含有防紫外線劑的O/W型香精
硬脂酸 3.0
乙醇 1.0
膽甾基-12-羥基硬脂酸酯 3.0
液體石蠟 5.0
棕櫚酸2-乙基己酯 3.0
BD-4-3H(合成例2) 0.3
BD-5-0H(合成例4) 0.3
α-生育酚 0.02
1，3-丁二醇5.0
聚氧乙烯(20摩爾)鯨蠟醇醚 2.0
甘油單硬脂酸酯 2.0
甘油單-2-乙基己?；?二對(duì)甲氧基肉桂酸酯 4.0
4-甲氧基-4’-叔丁基--二苯甲?；淄?.0
聚硅氧烷表面處理的氧化鋅顆粒 2.0
十甲基環(huán)二甲基硅酮 2.0
三乙醇胺 0.8
香料 適量
防腐劑 適量
離子交換水 61.88
(制備方法)將1，3-丁二醇、三乙醇胺加入到離子交換水中，在70℃加熱溶解。將硬脂酸、膽甾基-12-羥基硬脂酸酯、液體石蠟和棕櫚酸2-乙基己酯在70～80℃加熱溶解后，依次添加乳化劑(聚氧乙烯(20摩爾)鯨蠟醇醚和甘油單硬脂酸酯)、紫外線吸收劑(肉桂酸酯和4-甲氧基-4’-叔丁基-二苯甲?；淄?、BD-4-3H、BD-5-0H、α-生育酚、防腐劑和香料，并加熱至70℃。攪拌下將油相添加到先配制的水相中，進(jìn)行預(yù)乳化。之后，將溫度冷卻至40℃以下，在添加聚硅氧烷表面處理的氧化鋅微粒和十甲基環(huán)二甲基硅酮分散液的同時(shí)，用勻漿器將乳化顆粒均質(zhì)化，脫氣、冷卻。[實(shí)施例8]W/O型乳膏
液體石蠟 23.0
凡士林 6.0
純地蠟 3.0
蜂蠟 1.0
BQ-4-0H 0.5
BQ-5-5H 0.5
α-生育酚0.02
二甘油二油酸酯 4.0
L-谷氨酸鈉 2.0
吡咯烷酮羧酸鈉 3.0
1，3-丁二醇 5.0
甘油 2.0
防腐劑 適量
螯合抑制劑 適量
香料 適量
離子交換水 49.98
(制備方法)在離子交換水中添加保濕劑吡咯烷酮羧酸鈉、L-谷氨酸鈉、1，3-丁二醇、甘油和螯合抑制劑，并在70℃加熱均勻溶解。另外將純地蠟、蜂蠟、凡士林、液體石蠟和二甘油二油酸酯在80℃加熱溶解，添 BQ-4-0H、BQ-5-5H、α-生育酚、香料和防腐劑。攪拌的同時(shí)，將先配制的水相徐徐添加到該油相中進(jìn)行預(yù)乳化，用勻漿器將乳化顆粒均質(zhì)化后，脫氣、緩慢冷卻。[試驗(yàn)例]人的實(shí)用試驗(yàn)1)給藥試樣和試驗(yàn)方法
為了確定本發(fā)明的皮膚外用藥對(duì)人皮膚的實(shí)際效果，進(jìn)行下列試驗(yàn)。
將127名面部有色素沉積的患病部位(肝斑、雀斑、老年斑、炎癥后色素沉積和其它原因?qū)е碌纳爻练e)的被試驗(yàn)者作為受試對(duì)象。約一半的67名受試者涂抹本發(fā)明的皮膚外用藥，其它的60名每天早晚洗臉后在黑色素生成亢進(jìn)的患病部位直接涂抹安慰劑。連續(xù)使用2個(gè)月后，根據(jù)醫(yī)師的視覺(jué)判定來(lái)判定其效果，并且通過(guò)試驗(yàn)開(kāi)始前和2個(gè)月后的照片進(jìn)行比較研究。
作為試驗(yàn)樣品，使用實(shí)施例1配制的W/O型潤(rùn)膚洗劑，安慰劑是用等量離子交換水替換BD-4-0H后配制的W/O型潤(rùn)膚洗劑。
另外，涂抹皮膚外用藥時(shí)，按照1，4-苯二酚衍生物的給藥量為0.05～0.5mg/cm2，在患病的部位涂抹洗劑。所得試驗(yàn)結(jié)果如下表所示。
表32)試驗(yàn)結(jié)果
從上表說(shuō)明，采用本發(fā)明的皮膚外用藥W/O型潤(rùn)膚洗劑時(shí)，癥狀改善(改善+基本改善)的比率為88％。與此相對(duì)，采用安慰劑時(shí)有78％未見(jiàn)改善，并且觀察到6％的惡化。另外，采用安慰劑時(shí)雖然觀察到有22％的改善，但可以認(rèn)為是所謂的安慰劑效果。另外，本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)色素沉積的癥狀不同(肝斑、雀斑、老年斑、炎癥后色素沉積和其它原因?qū)е碌纳爻练e)時(shí)效果有較大的差異。
由以上結(jié)果可知，本發(fā)明中的皮膚外用制劑對(duì)改善人皮膚中的色素沉積確實(shí)具有明顯的效果。
發(fā)明的效果
本發(fā)明提供黑色素生成抑制效果優(yōu)異，且穩(wěn)定性、安全性高的黑色素生成抑制劑，以及含有該抑制劑作為有效成分的化妝品和/或保健品的皮膚外用制劑。由于本發(fā)明的黑色素生成抑制劑在0.0001重量％以上的極低濃度時(shí)具有顯著的黑色素生成抑制效果，且對(duì)皮膚或其細(xì)胞無(wú)毒或毒性極低，因此含有該黑色素生成抑制劑的皮膚外用制劑，不僅具有優(yōu)異的皮膚美白效果，而且其安全性高、能夠長(zhǎng)期連續(xù)使用。
權(quán)利要求
1.一種黑色素生成抑制劑，它以通式(I)所示的苯二酚衍生物或通式(II)所示的苯醌衍生物為有效成分，
式中，x、y為0～6的整數(shù)，且x+y＝4、5或6，
式中，x、y為0～5的整數(shù)，且x+y＝4或5。
2.權(quán)利要求1所述的黑色素生成抑制劑，其中，苯二酚衍生物是2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2，6，10，1 4-十六烷四烯基)-1，4-苯二酚，2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2-十六烷單烯基)-1，4-苯二酚，或2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基-2，6，10，14，18-二十烷五烯基)-1，4-苯二酚。
3.權(quán)利要求1所述的黑色素生成抑制劑，其中，苯醌衍生物是2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2，6，10，14-十六烷四烯基)-1，4-苯醌，2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15-四甲基-2-十六烷單烯基)-1，4-苯醌，或2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(3，7，11，15，19-五甲基-2，6，10，14，18-二十烷五烯基)-1，4-苯醌。
4.一種皮膚外用制劑，其特征在于，含有1種以上 1～3任一項(xiàng)所述的黑色素生成抑制劑。
5.權(quán)利要求4所述的皮膚外用制劑，其中，上述黑色素生成抑制劑的含量為0.0001～5重量％。
6.權(quán)利要求4或5所述的皮膚外用制劑，其中，含有選自抗氧化劑、防紫外線劑、角質(zhì)脫落劑、表面活性劑、香料、色素、防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑、螯合劑的添加劑。
7.權(quán)利要求4～6任一項(xiàng)所述的皮膚外用制劑，該皮膚外用制劑的劑型選自W/O型洗劑、O/W型洗劑、W/O型乳膏、O/W型乳膏、粘稠微乳化香精和O/W型香精。
全文摘要
本發(fā)明提供黑色素抑制作用、即皮膚美白作用優(yōu)異,且安全性、穩(wěn)定性高的藥劑以及含有該藥劑的皮膚外用制劑。將通式(I)所示的1,4－苯二酚衍生物和/或通式(II)所示的1,4－苯醌衍生物用作有效成分。
文檔編號(hào)A61K31/075GK1377640SQ0211831
公開(kāi)日2002年11月6日 申請(qǐng)日期2002年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月9日
發(fā)明者富田秀德, 吉村育生, 豐田仁, 山本順寬, 市橋正光, 船坂陽(yáng)子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社恩惠之水, 日清藥業(yè)股份有限公司