專利名稱：預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物，具體地說以中草藥為原料制備的中成藥。
現(xiàn)臨床用藥有雙磷酸鹽、特異雌激素受體調(diào)節(jié)劑、抑鈣素及雌激素，上述藥物都是作用在抑制破骨細(xì)胞上，而作用在造骨細(xì)胞上的只有副甲狀腺素，這些藥都有其副作用，且長期使用的安全性還不清楚，不幸的是骨質(zhì)疏松癥的病人都需長期服用，其中抑鈣素和副甲狀腺素是屬于蛋白質(zhì)藥物，必須以注射或噴鼻方式投藥，十分不便。
而在目前提倡自然療法的時代，一般強(qiáng)調(diào)治療或是保健骨質(zhì)疏松癥，不外運(yùn)用多攝食含鈣量高的食物，如多喝牛奶或是乳制品，小魚干、豆類食品及深色蔬菜等。當(dāng)然適當(dāng)?shù)呢?fù)重運(yùn)動能抑制骨質(zhì)流失速度，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。若運(yùn)動量不足，骨質(zhì)流失較快。
雖然在某些文獻(xiàn)或是專利中論及運(yùn)用天然食品或是中草藥，可實(shí)現(xiàn)預(yù)防或是治療骨質(zhì)疏松癥的效果。例如Diane Feskanich等人于1999年Am.J.Clin.Nutr.第69卷第674-679頁報(bào)導(dǎo)，38-63歲婦女由萵苣(非本發(fā)明之萵苣子)攝取維生素K，有益于骨骼健康與血液凝結(jié)。LCui.Y.F.Ma.等人于1999年J.of Bone and Mineral Research第14卷第Suppl.1期S283頁報(bào)導(dǎo)，摘除卵巢的老鼠日喂食1.0g/kg經(jīng)熱水萃取的淫羊藿、黃耆與白術(shù)混合粉末，可抑制骨吸收。胡學(xué)攀于1995年中國專利號為94105130.7的專利公開了，以石膏、桂枝、陳皮、麻黃、白芍、枳殼、川芎、茯苓、牡丹皮、半夏、白術(shù)、厚樸、黃苓、青皮、蘇子、西黨參、當(dāng)歸、柴胡、附子、桃仁的散劑處方，有消炎健骨、治療骨髓炎、骨質(zhì)增生作用。柳海峰于1993年中國專利號為93104876.1號專利，公開了以沉香、西紅花、木香、川芎、桂枝、白芷、三七、川續(xù)斷、土鱉蟲、骨碎補(bǔ)、制馬錢子、牛膝、黃瓜子、雞骨、大黃、自然銅、冰片、血竭的散劑處方，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨，治療成骨不全、軟骨發(fā)育不良的作用。船田正等人于1992年日本第4-266820號公開專利，由米糠油分離出來含有碳數(shù)22至38的直鏈飽和醇類，可預(yù)防骨質(zhì)流失且增加骨質(zhì)增生。
本發(fā)明的解決方案是基于祖國醫(yī)學(xué)對骨折及骨質(zhì)疏松癥的認(rèn)識及治療原則，參考現(xiàn)代藥理研究成就，從祖國醫(yī)藥寶庫中，篩選出天然食用植物藥，按中醫(yī)理論組方，提取精華，使其發(fā)揮刺激骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2及成骨細(xì)胞分裂作用，提高骨折后的愈合速度，降低骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的速度，并可對骨質(zhì)疏松癥有治療作用。
本發(fā)明藥物包括下列原料沉香、稻米、乳香、萵苣子、白術(shù)、菟絲子。
本發(fā)明藥物的各組分的配比為(用量為重量份)沉香2～20 稻米 1～5乳香0.1～1萵苣子0.1～1白術(shù)0.1～1菟絲子0.1～1本發(fā)明藥物的優(yōu)選配比為(用量為重量份)沉香3～7稻米 1～3乳香0.3～0.7萵苣子0.3～0.7白術(shù)0.2～0.4菟絲子0.3～0.7本發(fā)明藥物的最佳配比為(用量為重量份)沉香5 稻米 2乳香0.5 萵苣子0.5白術(shù)0.25菟絲子0.5
上述六種藥材中，萵苣子是菊科植物萵苣的干燥種子；沉香是瑞香科植物沉香的含樹脂木材；稻米是禾本科植物稻的果實(shí)；乳香是橄欖科植物卡氏乳香樹或同屬植物的樹干皮部所得的膠狀樹脂；白術(shù)是菊科植物白術(shù)的干燥根莖；菟絲子是旋花科植物菟絲子、南方菟絲子或日本菟絲子的干燥種子。
本發(fā)明藥物按常規(guī)的方法可制成錠劑、軟膠囊、顆粒、粉劑、液劑、膠囊或丸劑、注射劑、軟膏劑。
本發(fā)明藥物的粉劑中可添加佐料，如乳糖、淀粉、微晶纖維素、帝摩杰(PRIMOJELTM)普杰(PREJELTM)枯羅素摩羅鈉(sodiumcrosscarmellose)、羥甲基纖維素、波維棟(povidone)及硬脂酸鎂或其它常用的賦形劑，制成所需要的劑型。
本發(fā)明可依照傳統(tǒng)或是現(xiàn)代的中藥方劑的制備方法制成傳統(tǒng)的或是現(xiàn)代的中藥方劑，也可依照一般西藥劑型的制備方法制成常用的西藥劑型。
圖2為家兔橈骨在手術(shù)后23天給藥組，骨折斷端的組織照片。
圖3為家兔橈骨在手術(shù)后30天對照組，骨折斷端的組織照片。
圖4為家兔橈骨在手術(shù)后30天給藥組，骨折斷端的組織照片。
圖5為老鼠假手術(shù)對照組，股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)照片。
圖6為老鼠去勢30天的去勢組，股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)照片。
圖7為老鼠去勢70天的去勢組，般骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)照片。
圖8為老鼠去勢30天后再給藥處理40天組，股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)照片。
圖9為老鼠假手術(shù)組，股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)照片。


圖10為老鼠去勢100天的去勢組，股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)照片。
圖11為老鼠去勢30天后再給藥處理70天組，股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明藥物的生物活性試驗(yàn)包括(1)刺激骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2作用試驗(yàn)；(2)對成骨細(xì)胞分裂刺激作用的試驗(yàn)；(3)促進(jìn)家兔骨折模型愈合的體內(nèi)試驗(yàn)；(4)防治去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥體內(nèi)試驗(yàn)；(5)小鼠醋酸扭體體內(nèi)試驗(yàn)；(6)小鼠游泳能力(負(fù)重)體內(nèi)試驗(yàn)；(7)大鼠口服急性毒性體內(nèi)試驗(yàn)；(8)大鼠口服長期毒性體內(nèi)試驗(yàn)；上述的(1)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物散劑A、散劑B；上述的(2)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物散劑C；上述的(3)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物蜜丸；上述的(4)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物散劑C；上述的(5)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物散劑B；上述的(6)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物散劑B；上述的(7)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物散劑C；上述的(8)試驗(yàn)用本發(fā)明藥物散劑B；散劑A劑型的制備方法如下將2000克沉香、800克稻米、200克乳香、200克萵苣子、100克白術(shù)及200克菟絲子，分別粉碎成粉末并混合均勻，過100目篩網(wǎng)制成。
散劑B劑型的制備方法如下將400克沉香、267克稻米分別研磨成粉，并經(jīng)60目篩網(wǎng)過篩；另取533克稻米、200克乳香、1600克沉香、200克萵苣子、100克白術(shù)及200克菟絲子置于萃取鍋內(nèi)，以去離子水加以浸泡，并加熱至100℃持續(xù)2.5小時。收取萃取液，經(jīng)100目篩網(wǎng)過篩后，減壓加熱濃縮。
將濃縮液與已經(jīng)過篩的267克稻米粉末及400克沉香粉末混合，制成顆粒，將顆粒置于烘箱，以60℃干燥4小時至水分為9％以下，再經(jīng)200目篩網(wǎng)過篩制成。
散劑C劑型的制備方法如下將2000克沉香、800克稻米、200克乳香、200克萵苣子、100克白術(shù)及200克菟絲子置于萃取鍋內(nèi)，以去離子水加以浸泡，并加熱至100℃持續(xù)2.5小時，收取萃取液，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，此萃取液再以噴霧干燥機(jī)噴霧干燥成粉末。
密丸劑型的制備方法如下；取散劑A劑型的粉末，另取蜂蜜煮至滴水成珠，以1∶1的比例混合制成蜜丸。
膠囊劑型的制備方法如下取散劑B劑型或散劑C劑型的粉末，添加藥學(xué)上常用的賦形劑、載體、或稀釋劑混合，過篩后，裝填入膠囊。
錠劑劑型制備方法如下取散劑B劑型或散劑C劑型的粉末，添加藥學(xué)上常用的賦形劑、載體、或稀釋劑混合，過篩后，直接打成錠劑；也可經(jīng)已知藥學(xué)上常用的造粒技術(shù)制成顆粒后，打成錠劑。
口服液劑型制備方法如下取散劑B劑型或散劑C劑型的粉末，添加藥學(xué)上常用的懸浮劑及去離子水制成口服液劑型。
生物活性試驗(yàn)一、體外試驗(yàn)本發(fā)明藥物對骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2啟動子活性的作用。
參考刊登于1999年Science第286卷第1946～1949頁Stimulation ofBone Formation in Vitro and in Rodents by Statins，刊登于2000年BiochemBiophys Res.Commun.第271卷第3期第688～92頁Compactin andsimvastatin，but not pravastatin，induce bone morphogenetic proteim-2 inhuman osteosarcoma cells，以及刊登于2001年J.Bone Joint Surg.Am.第83-Asuppl.1(Pt 2)卷第S99～104頁In vitro and in vivo studies of bonemorphogenetic protein-2 expressing adenoviral vector等方法。
將骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2基因5′啟動子(promotor)片斷連接構(gòu)建到螢光素酶(luciferase)報(bào)導(dǎo)基因載體(reporter vector)上，而轉(zhuǎn)染到成骨細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)由測定螢光素酶活性，可以得知骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2基因的表現(xiàn)程度。
所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均為脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞為成骨細(xì)胞，螢光素酶活性測試儀及試劑均為美國TR0PLEX產(chǎn)生，儀器名稱為TR717Microplate Luminometer，實(shí)驗(yàn)用本發(fā)明的散劑A、散劑B。
表一 本發(fā)明藥物對骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2啟動子活性影響

表一以下列公式計(jì)算活性值增加率；活性值增加率(d項(xiàng)-b項(xiàng))/b項(xiàng)×100＝(160-94)/94×100＝70.2％活性值增加率(e項(xiàng)-b項(xiàng))/b項(xiàng)×100＝(212-94)/94×100＝125.5％培養(yǎng)液是指達(dá)柏膠培養(yǎng)基(DMEM，Dulbecco’sModified EagleMedium)，螢光素酶底物是指螢光素(Luciferrin)PGL3載體是指BasicLuciferse reporter plasmid，藥物濃度(％)是以W/V％表示。試驗(yàn)結(jié)果表二 本發(fā)明藥物中發(fā)光物質(zhì)及螢光素酶活性測定

如表二所示，本發(fā)明藥物本身并不含螢光素酶活性。如表一所示，加上0.3％濃度的本發(fā)明藥物散劑A，可以使骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2的活性增加70.2％；加上0.3％濃度的本發(fā)明藥物散劑B，可以使骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)-2的活性增加125.5％。二、體外試驗(yàn)本發(fā)明藥物對成骨細(xì)胞分裂的刺激作用參考刊登于1999年5月中國骨質(zhì)疏松雜志第5卷第2期第58～62頁的骨質(zhì)疏松癥防治藥物的體外細(xì)胞藥效評價，1999年5月中國骨質(zhì)疏松雜志第5卷第2期第70頁的淫羊藿對成骨細(xì)胞增殖分化的影響，以及1997年CMLS，Cell.mal.life sci.第53卷第967～976頁Menadione-induced cytotoxicity to rat osteoblasts等方法。
Wistar新生鼠顱頂骨(calvaria)以連續(xù)二次，各30分鐘，37℃的膠原酶(collagenase)消化方式取得(丟棄第一消化所釋出的細(xì)胞)，然后在含100U/ml盤尼西林G，10％胎血清的柏膠培養(yǎng)基，100μg/ml鏈霉素，含5％二氧化碳空氣，在37℃下培養(yǎng)。將1×104細(xì)胞/cm2成骨細(xì)胞培養(yǎng)于96槽(well)培養(yǎng)皿中，48小時后，加上0.1、1、10、100、1000μg/ml等不同濃度溶解于二甲基亞砜的本發(fā)明藥物，分別于第一組繼續(xù)培養(yǎng)1天，第二組繼續(xù)培養(yǎng)3天。
各組在培養(yǎng)后，取1mg/ml濃度的賈諾秀(MTT，[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]100μl處理細(xì)胞4小時，將上清液除去，加上100μl含有0.04N鹽酸的異丙醇溶解，然后以波長570nm的倚萊紗分析器(ELISA)來讀數(shù)。
以下列公式計(jì)算表現(xiàn)促進(jìn)率的百分率促進(jìn)率＝[(加藥物的平均吸收值-無藥物的平均吸收值)/無藥物的平均吸收值]×100，平均吸收值(AOD，average optical density)，標(biāo)準(zhǔn)差(SD，Standard Deviation)。試驗(yàn)結(jié)果表三 本發(fā)明藥物對成骨細(xì)胞分裂的刺激作用

由表三的結(jié)果所示，本發(fā)明藥物在24小時內(nèi)可以刺激成骨細(xì)胞增生，隨著藥物濃度的提高，其促進(jìn)率也提高；而在72小時后，仍可以刺激成骨細(xì)胞增生，藥物濃度愈高，其促進(jìn)率也愈高。在1mg/ml本發(fā)明藥物的高濃度下，三天內(nèi)沒有細(xì)胞毒性產(chǎn)生。
三、本發(fā)明藥物促進(jìn)家兔骨折模型愈合的體內(nèi)試驗(yàn)參考刊登于1981年Clinical Orthopaedics & Related Research第154卷第286～92頁的Experimental femoral fracture immobilized by rigid andflexible rods(a rabbit model)，刊登于1992年Hsueh Tsa Chih ChineseJurnal of Stomatology第27卷第4期第215～216頁的An experimentalstudy of dan sheng improving the mandibular bone fracthuehealing.Cheeng-Hua Kou Chiang，刊登于1998年Clinical Orthopaedics &Related Research第353卷第231～237頁的Effect of nicotine on the rateand strength of long bone fracture healing.
體重在1.5-2公斤，家兔40只，雌雄各半，在觀察一周無異狀后，經(jīng)麻醉以無菌手術(shù)切開前臂，在橈骨上段1/3處，利用電據(jù)制成2mm的標(biāo)準(zhǔn)橫斷骨折，縫合傷口。40只家兔依照預(yù)定日期分為5，12，17，23，30天組等5組，每組8只，每組內(nèi)實(shí)驗(yàn)組5只，對照組3只，對照組喂以標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合飼料，而實(shí)驗(yàn)組喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料外，各組在預(yù)定日期內(nèi)每日早晚給藥，實(shí)驗(yàn)用藥蜜丸劑型，該藥丸含生藥3克，每組在預(yù)定日期處死，進(jìn)行X光片與病理學(xué)觀察。
預(yù)定日期處死的分組方式，是與骨折模型各個愈合時期配合，通常愈合初期為傷口產(chǎn)生到愈合5～12天，愈合中期為17～23天，愈合后期為23～30天。
試驗(yàn)結(jié)果如下(1)體能觀察實(shí)驗(yàn)組較對照組恢復(fù)得快，實(shí)驗(yàn)組的前肢較對照組早些能支持體重。(2)X光片檢查實(shí)驗(yàn)組骨折愈合情況，在各個時間點(diǎn)都比對照組好。(3)病理組織學(xué)觀察a.手術(shù)后5天；對照組骨折斷端可見血腫及壞死組織，皮質(zhì)骨、內(nèi)骨沒有明顯改變；本發(fā)明藥物組骨折斷端有血腫及組織壞死，傷患處有血管長入，皮質(zhì)骨有造骨細(xì)胞增生，骨內(nèi)有微血管增生。
b.手術(shù)后12天對照組還有一些血腫及壞死組織，纖維性骨痂形成，皮質(zhì)骨有些生物活性發(fā)生，少量區(qū)域有軟骨性骨痂；本發(fā)明藥物組在骨折斷端形成纖維性骨痂，骨折近端皮質(zhì)骨生骨明顯，有骨性骨痂。
c.手術(shù)后17天對照組骨折斷端有大量軟骨性骨痂，骨髓腔尚未被骨痂封閉；本發(fā)明藥物組在骨折斷端生骨明顯，骨痂有礦化現(xiàn)象發(fā)生，骨髓腔已被骨痂封閉，并可看見血管。
d.手術(shù)后23天對照組骨折斷端已多為骨性骨痂，但骨痂尚未安全骨性連接，斷端中端仍有軟骨性骨痂存在，如圖1所示；本發(fā)明藥物組骨折端已完全骨性愈合，外骨痂已出現(xiàn)明顯的塑型，骨小梁內(nèi)血運(yùn)豐富，如圖2所示；而在高倍鏡下，內(nèi)骨痂封閉的骨髓腔端，出現(xiàn)明顯的破骨及造骨細(xì)胞的骨吸收，骨改建過程，骨髓腔再通。
e.手術(shù)后30天對照組骨折斷端骨痂成熟度差，仍有軟骨鈣化影像，皮質(zhì)骨改建塑型不明顯，斷端及骨痂連接不良，四環(huán)素標(biāo)記多為單標(biāo)，如圖3所示；本發(fā)明藥物組骨折斷端骨痂成熟，骨痂與斷端骨皮質(zhì)連接良好，原斷端皮質(zhì)骨也出現(xiàn)骨改建，四環(huán)素雙標(biāo)記明顯，已達(dá)臨床愈合標(biāo)準(zhǔn)，如圖4所示。
根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明藥物在家兔骨折模型各個愈合時期中，都表現(xiàn)出明顯的愈合促進(jìn)作用，愈合初期時，本發(fā)明藥物可促進(jìn)骨折斷端間血腫機(jī)化，刺激成骨細(xì)胞增生分化，骨小梁形成；在愈合中期，本發(fā)明藥物有利于骨小梁成熟及礦化，促進(jìn)骨痂形成；在愈合后期，本發(fā)明藥物可促進(jìn)骨塑型改建，加速骨髓腔再通。
四、本發(fā)明藥物防治去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥體內(nèi)試驗(yàn)參考刊登于1999年5月中國骨質(zhì)疏松雜志第5卷第2期第67頁的骨康防治去勢大鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究，刊登于1998年ClinBiomech(Bristol，Avon)第13卷第7期第480～484頁的Effect ofovariectomy and calcium deficiency on the ultrasound velocity，mineraldensity and strength in the rat femur.，刊登于2001年Biomed Sci.Instrum.第37卷第281～286頁的The use of estrogen，DHEA，and diosgenin in asustained delivery setting as a novel treatment approach for osteoporosis inthe ovariectomized adult rat model.，以及刊登于1999年Zhonghua FuChan Ke Za.Zhi.第34卷第2期第86～89頁的Study of nylestriol effect onbone histomorphometric parameters in ovariectomized rats.。
52只體重200克的SD(Spraque-Dawley)雌鼠分成四組(1)假手術(shù)對照組；(2)去勢(摘除卵巢)組；(3)去勢30天后再給本發(fā)明藥物40天組；(4)去勢30天后再給本發(fā)明藥物70天組。
(一)去勢手術(shù)老鼠麻醉后，在無菌狀態(tài)下施行假手術(shù)或去勢手術(shù)，一個月后，處死假手術(shù)對照組與去勢組各5只，觀察是否已發(fā)生骨質(zhì)疏松。
試驗(yàn)結(jié)果如下假手術(shù)對照組老鼠股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)成熟，排列連接緊密，平均骨小梁壁的厚度較為一致，如圖5所示；去勢30天后老鼠股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)極不成熟，骨小梁間連接很差，出現(xiàn)大量骨小梁盲端，骨小梁表面出現(xiàn)大量類骨質(zhì)，表明骨再建增加，呈現(xiàn)典型的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型，如圖6所示；去勢老鼠在30天后的骨小梁結(jié)構(gòu)，與假手術(shù)對照組有極明顯的差異。
(二)去勢手術(shù)后再給藥去勢一個月后，給藥組每日口服給予0.12克(相當(dāng)于生藥量1克)散劑C。40天后，四組各處死4只老鼠，測試骨密度及病理組織學(xué)觀察。第四組再繼續(xù)給藥處理30天后，各組剩下的老鼠全部處死，進(jìn)行骨密度、病理組織學(xué)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察。
骨密度測試?yán)鲜笥夜晒且訦ologic QDR-4500W(S/N 47192)來測試骨密度。
骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察各組切片均選擇骨骺板下1毫米內(nèi)骨小梁，區(qū)分為內(nèi)、中、外三點(diǎn)選取3個圖像，錄入電腦，每個樣品采用三種觀察方法澤米(Gemisa)染色做組織學(xué)觀察，翁軻沙(Von Kossa)染色做類骨質(zhì)觀察，螢光顯微鏡做四環(huán)素標(biāo)記觀察，進(jìn)行以下項(xiàng)目骨組織形態(tài)計(jì)量分析平均骨體積(TBV)、四環(huán)素單標(biāo)記表面(STS)、四環(huán)素雙標(biāo)記表面(DTS)、四環(huán)素單、雙標(biāo)記表面比(STS/DTS)、類骨質(zhì)表面(TOS)，平均類骨質(zhì)寬度(MOSW)、礦化時間、骨重建時間、骨表面、骨吸收表面、骨礦化沉積率(MAR)、糾正骨礦化沉積率(iMAR)。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分述如下a.去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物40天組組織病理學(xué)觀察去勢組(去勢70天)股骨下端骨骺板下，骨小梁結(jié)構(gòu)比去勢30天時排列更稀疏，分散而薄，骨小梁表面類骨質(zhì)清晰可見，骨的生成與改建十分活躍，出現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型的典型表現(xiàn)，如圖7所示。如圖8所示，再給本發(fā)明藥物處理40天后，該組雖然未達(dá)到與假手術(shù)對照組相近似的程度，但與去勢組比較，骨小梁結(jié)構(gòu)明顯增加，也變得致密，小梁間連接也明顯改善。
表四 老鼠右股骨骨密度(給藥40天)

骨密度結(jié)果如表四所示，顯示再給本發(fā)明藥物處理40天后，該組右股骨密度與去勢組比較，并無明顯差異，此二組的骨密度均比假手術(shù)對照組低。
b.去勢手術(shù)后再給藥處理70天組組織病理學(xué)觀察假手術(shù)組老鼠股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)成熟，排列連接緊密，有規(guī)則，骨小梁各壁的厚度較為一致，如圖9所示；去勢組在去勢100天后股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)排列稀疏，總量及密度明顯減少，小梁間連接性差，厚度不一，有許多骨小梁盲端，小梁表面類骨質(zhì)增多，表明骨再建增加，仍呈現(xiàn)典型高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，如圖10所示。
去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物處理70天，如圖11所示，該組大鼠股骨下端骨骺板下骨小梁結(jié)構(gòu)排列緊密，形態(tài)與假手術(shù)對照組相似，小梁間連接成網(wǎng)，排列有序，厚度較為均一，小梁表面類骨質(zhì)較少，與正常相似，表明骨重建較不活躍。
表五 老鼠右股骨骨密度(給藥70天)

*去勢組與假手術(shù)對照組比較，P＜0.01**給本發(fā)明藥物70天組與去勢組比較，P＜0.05***再給本發(fā)明藥物70天組與去勢組比較，P＜0.01骨密度結(jié)果如表五所示，去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物處理70天后，該組右股骨的骨密度與去勢組比較有明顯差異(P＜0.01)，且回復(fù)達(dá)假手術(shù)對照組的程度。
骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察
表六 假手術(shù)對照組、去勢組、去勢手術(shù)后再給藥處理組的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)(一)

*去勢組與假手術(shù)對照組比較，P＜0.01**去勢組與假手術(shù)對照組比較，P＜0.001# 去勢+本發(fā)明藥物組與去勢組比較，P＜0.01## 去勢+本發(fā)明藥物組與去勢組比較，P＜0.001表七 假手術(shù)對照組、去勢組、去勢手術(shù)后再給藥處理組的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)(二)

**去勢組與假手術(shù)對照組比較，P＜0.001# 去勢+本發(fā)明藥物組與去勢組比較，P＜0.0 1## 去勢+本發(fā)明藥物組與去勢組比較，P＜0.001
表八 假手術(shù)對照組、去勢組、去勢手術(shù)后再給藥處理組的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)(三)

*去勢組與假手術(shù)對照組比較，P＜0.01**去勢組與假手術(shù)對照組比較，P＜0.001# 去勢+本發(fā)明藥物組與去勢組比較，P＜0.01## 去勢+本發(fā)明藥物組與去勢組比較，P＜0.001綜合表六、七、八的結(jié)果，本發(fā)明藥物骨松癥骨組織形態(tài)學(xué)的作用如下平均骨體積去勢小鼠手術(shù)后再給本發(fā)明藥物處理70天后，平均骨體積恢復(fù)到假手術(shù)對照組程度。四環(huán)素單標(biāo)記表面小鼠去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物處理70天后，四環(huán)素單標(biāo)記表面恢復(fù)到假手術(shù)對照組程度。四環(huán)素雙標(biāo)記表面本發(fā)明藥物處理去勢小鼠70天后，四環(huán)素雙標(biāo)記表面恢復(fù)到假手術(shù)對照組程度。四環(huán)素單、雙標(biāo)記表面比比例在三組之間沒有明顯差異。類骨質(zhì)表面在去勢組類骨質(zhì)表面比假手術(shù)對照組高，再給本發(fā)明藥物處理70天后，該組的類骨質(zhì)表面則高于假手術(shù)對照組，而類似于去勢組。平均類骨質(zhì)寬度去勢組與去勢手術(shù)再給本發(fā)明藥物組的平均類骨質(zhì)寬度均明顯大于假手術(shù)對照組。礦化時間三組之間沒有明顯差異。骨重建時間假手術(shù)對照組及去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物組的骨重建時間明顯的較去勢組長。骨表面去勢組及去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物組的骨表面積明顯的大于假手術(shù)對照組。骨再吸收表面去勢組及去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物組的骨再吸收表面積明顯的大于假手術(shù)對照組，而去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物組的骨再吸收表面積又明顯的大于去勢組。骨礦化沉積率去勢組及去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物組的骨礦化沉積率比假手術(shù)對照組高，而去勢組的骨礦化沉積率又較去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物組高。糾正骨礦化沉積率去勢手術(shù)后再給本發(fā)明藥物組的糾正骨礦化沉積率較去勢組低，且已恢復(fù)到假手術(shù)對照組的速度。
很明顯可以看出本發(fā)明藥物影響骨形成及骨吸收的活性，本發(fā)明藥物會促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，類骨質(zhì)及礦物沉積于基質(zhì)中。去勢后再給本發(fā)明藥物處理70天組的平均骨體積、四環(huán)素單標(biāo)記表面、四環(huán)素雙標(biāo)記表面、骨重建時間、糾正骨礦化沉積率等骨代謝指標(biāo)，都恢復(fù)到假手術(shù)對照組的正常程度。
五、小鼠醋酸扭體(鎮(zhèn)痛作用)體內(nèi)試驗(yàn)參考刊登于2001年P(guān)ain第89卷第2-3期第221～227頁的Peripheral and preemptive opioid antinociception in a mouse visceral painmodel.，刊登于2000年J.Ethnopharmacol.第73卷第1-2期第307～311頁的Preliminary studies on the analgesic activity of latex of calotroprisprocera.，刊登于2000年J.Ethnopharmacol.第71卷第1-2期第153～160頁的Studies on the anti-inflammatory and related pharmacologicalproperties of the aqueous extract of Bridelia ferruginea stem bark.。
昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重18～22g，按體重隨機(jī)分為6組，禁食過夜，分別投予生理食鹽水，0.2g/kg阿司匹林與不同劑量本發(fā)明藥物。本發(fā)明藥物是散劑B劑型，各劑量分別代表相當(dāng)于含生藥0.5、1.0、2.0、4.0g/kg。
給藥1小時后，每只小鼠腹腔注射0.3％的醋酸溶液0.2ml，觀察20分鐘內(nèi)，以小鼠扭體次數(shù)，判定藥效。小鼠扭體次數(shù)愈少，表示具有鎮(zhèn)痛作用。試驗(yàn)結(jié)果表九 本發(fā)明藥物對小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)的影響(平均±SD，n＝12)

*，**與生理食鹽水組比較P＜0.05，0.01如表九所示，本發(fā)明藥物具有明顯的抑制醋酸誘發(fā)小鼠扭體的作用，其中1.0、2.0、4.0g生藥/kg組與生理食鹽水組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，0.5g生藥/kg組的扭體數(shù)比較生理食鹽水組略微降低，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明本藥具有一定的鎮(zhèn)痛作用。
六、小鼠游泳能力(增強(qiáng)肌力)體內(nèi)試驗(yàn)參考刊登于1990年Calcif Tissue Int.第47卷第3期第173～177頁的The effect of swimming on bone modeling and composition in youngadult rats.，刊登于1997年Jpn.J.physiol.第47卷第1期第51～57頁的Effects of exposure to hypobaric-hypoxia on body weight，muscular andhematological characteristics，and work performance in rats.，刊登于1996年Biol.Pharm.Bull.第19卷第1期第62～66頁的Pharmacological study onAgkistrodon blomhoffii BOIE.V.anti-fatigue effect of the 50％ethanolextract in acute weight-loaded forced swimming-treated rats.
昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重18～22g，按體重隨機(jī)分為6組，禁食過夜，分別連續(xù)給藥3天投予生理食鹽水，骨疏康3g/kg，與不同劑量本發(fā)明藥物。本發(fā)明藥物是散劑B劑型，各劑量相當(dāng)于含生藥0.5、1.0、2.0、4.0g/kg。骨疏康為中國核準(zhǔn)上市治療骨疏松癥的復(fù)方中藥，其成分為淫羊藿、熟地黃、黃耆、丹參、骨碎補(bǔ)。
末次給藥1小時后，于小鼠尾部加掛質(zhì)重2g法碼后，投入25℃、15cm深的水池中，開始計(jì)時，小鼠體力耗竭標(biāo)準(zhǔn)為小鼠鼻孔沉入水面10秒鐘以上，停止計(jì)時。投予各種藥物組與生理食鹽水組比較，判定藥效。試驗(yàn)結(jié)果表十 本發(fā)明藥物對小鼠負(fù)重游泳時間的影響(平均±SD，n＝12)

*，**與生理食鹽水組比較P＜0.05，0.01如表十所示，本發(fā)明藥物具有明顯的延長小鼠負(fù)重游泳時間的效果，四個劑量組(0.5、1.0、2.0、4.0g生藥/kg)與生理食鹽水組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的復(fù)方中草藥具有一定的增強(qiáng)體力、抗疲勞作用。
七、本發(fā)明藥物的大鼠口服急性毒性體內(nèi)試驗(yàn)24只體重約在200克的Spraque-Dawley純種大鼠，雌雄各半，以LIMS系統(tǒng)隨機(jī)分成二組，一組為對照組，一組為本發(fā)明藥物處理組。所用的本發(fā)明藥物為散劑C劑型，以1％羧甲基纖維素配成濃稠懸液，濃度為250mg/ml。本發(fā)明藥物處理組以250mg/ml散劑C喂食10ml/kg，對照組以1％羧甲基纖維素喂食，一天二次，每次間隔2小時，進(jìn)行臨床觀察14天。試驗(yàn)結(jié)果表十一 本發(fā)明藥物的大鼠口服急性毒性測試-體重變化(平均±SD，N＝6)

如表十一顯示，不論喂食本發(fā)明藥物濃稠懸浮液或?qū)φ杖芤旱慕M別在14天觀察后，全部動物存活。在14天觀察期間、動物均無任何臨床毒性癥狀，且本發(fā)明藥物組中雄、雌鼠的體重成長速度與對照組相近。試驗(yàn)終結(jié)尸體解剖后，肉眼檢查器官，組織變化，二組均無肉眼可觀察到的任何病變。本發(fā)明藥物5000mg/kg為不造成任何影響的劑量，可歸類為實(shí)際無毒性的物質(zhì)。
八、本發(fā)明藥物的大鼠口服長期毒性體內(nèi)試驗(yàn)Wistar種(二級)大鼠，選取80-100克大鼠飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。鼠齡6-7周，雌雄各半，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。合格證號SCXR1100-0006。
試驗(yàn)方法藥物劑量、給藥方法與動物數(shù)試驗(yàn)設(shè)溶媒對照組和16g生藥/kg給藥組，藥液濃度每毫升1.333g生藥，給藥容積為1.2ml/100g體重，溶媒對照組給予等容量1％羧甲基纖維素懸浮液。每天一次，每周6次，連續(xù)3個月。
動物數(shù)選取上述大鼠，飼養(yǎng)1周后按性別、體重隨機(jī)分為2組，溶媒對照組和給藥組，均雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，體重和食料量每周稱量一次。
給藥3個月處死大鼠，取血進(jìn)行血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)測定，取臟器稱重，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。
試驗(yàn)結(jié)果a.一般觀察在給藥期，各組大鼠活動情況正常，外觀體征、糞便、食料量均正常。雄性大鼠體重變化；溶媒對照組由121±2.2克(第0周)增加至365±20.0克(第十二周)；本發(fā)明藥物組由123±2.7克增加至357.5±23.3克。雌性大鼠體重變化溶媒對照組由119±4.2克(第0周)增加至231±16.4克(第十二周)；本發(fā)明藥物組由117±2.7克增加至220±10.8克。表明給藥組體重與溶媒對照組比較，無明顯差異。食料量給藥組與對照組比較，無明顯差異。
b.血液學(xué)指標(biāo)
表十二 本發(fā)明藥物灌胃給藥3個月對大鼠血液學(xué)的影響(平均±SD)

如表十二顯示，給藥期各組的血紅素(Hb)、紅血球數(shù)(RBC)、白血球數(shù)(WBC)、血小板數(shù)(PLT)、凝血時間(CT)結(jié)果顯示連續(xù)給藥三個月，給藥組各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)與對照組比較，均無明顯差異。c.血液生化學(xué)指標(biāo)表十三(A) 本發(fā)明藥物灌胃給藥3個月對雄性大鼠血液生化的影響(平均±SD)

表十三(B) 本發(fā)明藥物灌胃給藥3個月對雌性大鼠血液生化的影響(平均±SD)

如表十三(A、B)顯示，給藥后的血液生化學(xué)檢測結(jié)果。結(jié)果顯示連續(xù)給藥三個月，給藥組各項(xiàng)生化指標(biāo)與對照組比較，均無明顯差異。d.對大鼠臟器系數(shù)的影響各組大鼠均在給藥3個月結(jié)束后處死，取各主要臟器稱重即為濕重，將濕重再除以體重，即得每100g體重的濕重(g)視為臟器系數(shù)。表十四(A) 本發(fā)明藥物灌胃給藥3個月對雄性大鼠臟器系數(shù)的影響(g/100g體重，平均±SD)

表十四(B) 本發(fā)明藥物灌胃給藥3個月對雌性大鼠臟器系數(shù)的影響(g/100g體重，平均±SD)

結(jié)果如表十四(A、B)所示，給藥組的各臟器系數(shù)與對照組比較，均無明顯差異。
e.大鼠臟器的病理組織學(xué)檢查連續(xù)給藥3個月后，處死各組大鼠，分別取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、膀胱、肺臟、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、胰臟、子宮、卵巢、睪丸、副睪丸、前列腺、腦、垂體、甲狀腺、腎上腺、胸腺、淋巴結(jié)及骨髓等23種臟器，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示給藥組與對照組相比，均無明顯的病理學(xué)改變。試驗(yàn)結(jié)論給藥組試驗(yàn)中以每kg大鼠投予本發(fā)明藥物16g生藥，大鼠連續(xù)灌胃給藥3個月，進(jìn)行一般觀察、血液學(xué)、血液生化學(xué)、病理組織學(xué)等檢查。試驗(yàn)結(jié)果表明，各項(xiàng)指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)明顯異常，臟器病理組織學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)與藥物有關(guān)的病理學(xué)改變。
給藥組大鼠長期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠在106倍于人用劑量(9g生藥/天/人)的連續(xù)給藥3個月，未見明顯毒性反應(yīng)。
經(jīng)過以上生物活性測試結(jié)果，本發(fā)明藥物是一種沒有毒性，在體外能刺激骨形態(tài)產(chǎn)生蛋白質(zhì)-2表現(xiàn)及成骨細(xì)胞增生的復(fù)方，它在動物實(shí)驗(yàn)中顯示，具有鎮(zhèn)痛作用及增強(qiáng)肌力作用，可以促進(jìn)骨折愈合及治療骨質(zhì)疏松癥，所以本發(fā)明藥物可以預(yù)防及治療骨折及骨質(zhì)疏松癥。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物，其特征在于它是由下列原料制成的藥劑萵苣子、沉香、稻米、乳香、白術(shù)、菟絲子，其中各原料的重量份配比是沉香2～20 稻米 1～5乳香0.1～1萵苣子0.1～1白術(shù)0.1～1菟絲子0.1～1
2.按照權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物，其特征在于其中各原料的重量份配比是沉香3～7稻米 1～3乳香0.3～0.7萵苣子0.3～0.7白術(shù)0.2～0.4菟絲子0.3～0.7
3.按照權(quán)利要求2所述的一種預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物，其特征在于其中各原料的重量份配比是沉香5 稻米 2乳香0.5 萵苣子0.5白術(shù)0.25菟絲子0.5
4.按照權(quán)利要求1或2或3所述的一種預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物，其特征在于所說的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
5.按照權(quán)利要求4所述的一種預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物，其特征在于所說的劑型為錠劑或軟膠囊或顆粒劑或粉末劑或液劑或膠囊劑或丸劑，或注射劑或軟膏劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的藥物，它是以萵苣子、沉香、稻米、乳香、白術(shù)及菟絲子為原料，藥物的各組分配比為(用量為重量份)沉香2～20，稻米1～5，白術(shù)0.1～1，菟絲子0.1～1，乳香0.1～1，萵苣子0.1～1。以傳統(tǒng)的中醫(yī)方法及萃取方法制成的錠劑或軟膠囊或顆粒劑或液劑或膠囊劑或丸劑。本發(fā)明配方獨(dú)特，預(yù)防及治療骨折與骨質(zhì)疏松癥的效果顯著。
文檔編號A61K36/00GK1457822SQ0211918
公開日2003年11月26日 申請日期2002年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者劉素瑩, 蔡宜明 申請人:天騵生化科技股份有限公司