專利名稱：具有抑制病毒感染作用的反義核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抑制病毒，尤其CVA24感染作用的反義核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
出血性結(jié)膜炎(Epidemic Haemorrhagic Conjunctivitis)是一種傳染性很強(qiáng)的疾病，它可在公眾場(chǎng)合造成大范圍的感染流行。其癥狀為眼瞼腫脹，顯著濾泡增生。半數(shù)病例于病后2-3天病情達(dá)到高峰時(shí)，可有球結(jié)膜出血呈點(diǎn)狀或片狀和角膜上皮損害，出血嚴(yán)重者可遍及整個(gè)球結(jié)膜，有些病例常發(fā)生角膜上皮反復(fù)剝脫，持續(xù)數(shù)年之久甚為頑固。該病特點(diǎn)是潛伏期短，傳染性強(qiáng)。該病的傳染源主要為柯薩奇A組病毒和腸道病毒70型，特別是CVA24常引起暴發(fā)流行，造成大量人群的出血性結(jié)膜炎。根據(jù)報(bào)道，70年代以來(lái)，CVA24分別在亞洲、非洲、美洲的一些國(guó)家引起出血性結(jié)膜炎的暴發(fā)流行。其中，1985～1989年在臺(tái)灣發(fā)生了4次CVA24引起的出血性結(jié)膜炎的暴發(fā)流行。1985年7～11月在日本沖繩CVA24引起的出血性結(jié)膜炎的暴發(fā)流行，僅三個(gè)月眼科診所就接收病人9952例。
柯薩奇A24病毒(CVA24)為小RNA病毒科，腸道病毒屬。基因組含一個(gè)單、正鏈RNA，即具有mRNA活性的核苷酸序列。全長(zhǎng)7402個(gè)核苷酸，這里不包括3’端的多聚腺苷酸尾。在CVA基因組各功能區(qū)的排列順序依次為5’端非編碼區(qū)(NTR)，P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)和一段3’端非編碼區(qū)。5’端是病毒基因組的非編碼區(qū)，含741個(gè)核苷酸。是病毒增殖周期中起著非常重要作用的功能區(qū)，它包括與病毒毒力有關(guān)的區(qū)域、與病毒復(fù)制有關(guān)的起始信號(hào)區(qū)等。根據(jù)本專利作者前期對(duì)柯薩奇病毒基因組的研究發(fā)現(xiàn)在5’端非編碼區(qū)362-569的區(qū)域內(nèi)存在病毒蛋白翻譯的起始信號(hào)區(qū)，宿主細(xì)胞的核糖體(18SRNA)就結(jié)合到病毒基因組的這段區(qū)域，開(kāi)始向基因組的3’端滑行，在AUG位點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯(該論文發(fā)表在國(guó)際刊物Virology，99年265卷12期206-17頁(yè))。在經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是與宿主細(xì)胞內(nèi)18sRNA互補(bǔ)的，這一能與使真核細(xì)胞的核糖體直接結(jié)合的位點(diǎn)稱作IRES(Internal RibosomeEntry Site)。
柯薩奇病毒RNA含有一個(gè)單一、較長(zhǎng)的開(kāi)放讀碼框架，編碼一個(gè)較長(zhǎng)的多聚蛋白鏈，這個(gè)多聚蛋白通常在形成過(guò)程中就開(kāi)始解鏈。P1區(qū)是結(jié)構(gòu)蛋白基因編碼區(qū)，P2、P3區(qū)是病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的基因編碼區(qū)。它的解鏈主要依靠病毒編碼的蛋白酶來(lái)完成，最終產(chǎn)生11個(gè)終末產(chǎn)物(如

圖1所示)。
多年來(lái)對(duì)病毒感染所造成的疾病缺乏有效的預(yù)防和治療手段，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療病毒感染存在著特異性差、療效不佳的缺陷。因此，研究有效的特異性抗病毒新型藥物具有重要的意義。反義核酸技術(shù)應(yīng)用在醫(yī)學(xué)疾病的基因治療中，是利用具有專一順序的寡聚脫氧核苷酸(ODNs)特異封閉對(duì)于人體有害基因，是一種全新的治療方法。反義核酸進(jìn)行抗病毒治療旨在破壞病毒的基因組，又能以堿基配對(duì)的方式?jīng)Q定這一抗病毒基因治療的高度特異性。作用原理主要為阻斷病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，阻斷RNA的轉(zhuǎn)錄和加工，阻斷翻譯復(fù)合體的形成和翻譯過(guò)程。反義核酸與靶RNA結(jié)合成雜種分子激活內(nèi)源性的Rnase H等，將其分解，而破壞病毒的基因組結(jié)構(gòu)。所以，從核苷酸水平上尋找抗病毒治療的方法也是抗病毒治療的最佳途徑。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種采用了反義核酸互補(bǔ)和結(jié)合到基因組中的相對(duì)區(qū)域的原理，合成病毒基因組特定部位的反義核酸，以此結(jié)合到病毒基因組的特定區(qū)域阻斷病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及翻譯。故具有高度特異性。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為1、針對(duì)柯薩奇A24病毒基因組5’端非編碼區(qū)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(病毒蛋白翻譯起始信號(hào)區(qū))所設(shè)計(jì)的一組反義寡核苷酸序列，在病毒感染細(xì)胞中，與病毒mRNA的堿基互補(bǔ)，特異性阻斷病毒遺傳信息流動(dòng)，抑制該病毒顆粒攻擊細(xì)胞，達(dá)到治療和預(yù)防該病毒感染的目的。
2、根據(jù)以上1項(xiàng)所述的反義寡核苷酸序列，其中所述柯薩奇A24病毒基因組核糖體結(jié)合位點(diǎn)的基因區(qū)序列是tattgagcta cttaagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac
catggagcag gtagttgcaa tccagcagcc agcctgtcgt aacgcgcaagtccgtggcgg aaccgactac tttgggtaac cgtgtttcct tttattctttgtatggctgc ttatggtgac aatcattgat tgttatcata gagcgacttggattggcc3、根據(jù)以上1項(xiàng)所述的一組反義寡聚核苷酸序列，其特征在于，針對(duì)不同的區(qū)域設(shè)計(jì)的序列為SCA5475’ACACGGTTACCCAAAGTAGT 3’SCA5515’GGAAACACGGTTACCCAAAG 3’SCA5545’AAAGGAAACACGGTTACCCA 3’SCA5585’AATAAAAGGAAACACGGTTA 3’SCA5685’CCATACAAAGAATAAAAGGA 3’4、根據(jù)以上1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列的修飾型。
5、根據(jù)以上1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列，特征在于它與病毒mRNA的堿基互補(bǔ)，有效地阻斷病毒遺傳信息流動(dòng)。
6、根據(jù)以上1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列作為治療和/或預(yù)防病毒性疾病的基因藥物的應(yīng)用。
7、根據(jù)以上1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
8、根據(jù)4項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列的修飾型作為治療和/或預(yù)防病毒性疾病的基因藥物的應(yīng)用。
經(jīng)過(guò)不同基團(tuán)修飾后的反義核酸具有穩(wěn)定性強(qiáng)和細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)。國(guó)外也在探討抗病毒的基因治療，實(shí)驗(yàn)研究主要集中在艾滋病病毒感染上，本研究在國(guó)內(nèi)外首先進(jìn)行和報(bào)道了針對(duì)柯薩奇病毒感染進(jìn)行反義核酸的基因治療。故本實(shí)驗(yàn)具有源頭創(chuàng)新和自我知識(shí)產(chǎn)權(quán)。創(chuàng)新之二是在實(shí)驗(yàn)中我們采取的柯薩奇A24病毒是國(guó)內(nèi)出血性結(jié)膜炎流行期間從病人分離出的流行株，具有流行病學(xué)意義。所以針對(duì)該病毒所設(shè)計(jì)的反義核酸及抗病毒研究的實(shí)驗(yàn)資料有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值(局部用藥)。
本研究的關(guān)鍵是1、掌握柯薩奇病毒生物學(xué)特性，詳細(xì)地分析病毒感染周期中基因組重要功能區(qū)結(jié)構(gòu)及特性，使其反義寡聚核苷酸作用準(zhǔn)確、特異。利用穩(wěn)定的細(xì)胞感染模型使反義核酸抗病毒感染的實(shí)驗(yàn)得到穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2、對(duì)于細(xì)胞自然攝取寡聚核苷酸能力較低的不足，采取天然脂類化合物能懸浮在水中形成雙層磷脂膜的囊泡，反義核酸包裹其內(nèi)，既能加速進(jìn)入細(xì)胞又能降低使用藥物濃度，充分發(fā)揮作用。3、保持反義寡聚核苷酸在實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定，不宜被降解而失去其抑制效能，采用硫代形式的修飾型反義寡聚核苷酸，以增加其穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明，提供了針對(duì)柯薩奇A24病毒基因組5’端非編碼區(qū)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(病毒蛋白翻譯起始信號(hào)區(qū))(Seq ID No.9)所設(shè)計(jì)的一組反義寡核苷酸序列，在病毒感染細(xì)胞中，所述反義寡核苷酸序列與病毒mRNA的堿基互補(bǔ)，特異性阻斷病毒遺傳信息流動(dòng)，抑制該病毒顆粒攻擊細(xì)胞，達(dá)到治療和預(yù)防該病毒感染的目的。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了上述反義核苷酸序列的應(yīng)用，尤其作為病毒預(yù)防和治療藥物的應(yīng)用。在以下的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人設(shè)計(jì)了SeqID No.1-5的本發(fā)明反義核苷酸序列，其中Seq ID No.6-8作為對(duì)比反義核苷酸提供。結(jié)果表明，本發(fā)明的反義核苷酸顯示了較強(qiáng)的病毒抑制作用。
圖2是不同反義核酸在5μM濃度下對(duì)病毒空斑形成的影響。其中全黑欄(Virus)為不加反義核酸的對(duì)照，圖中顯示，在10-1、10-3和10-5病毒滴度下，本發(fā)明的反義核苷酸均顯示了較顯著的對(duì)病毒空斑形成的抑制作用。
圖3是SCA547抑制病毒感染的量效曲線圖，圖中顯示在0.3-0.6μm/ml濃度之間，濃度上升與病毒抑制率呈直線上升，0.6μm/ml以上成平穩(wěn)上升狀態(tài)。
圖4是SCA568抑制病毒感染的量效關(guān)系曲線圖，圖中顯示，在0.3-5μm/ml濃度之間，均呈現(xiàn)了較高的病毒抑制率。
圖5是SCA554抑制病毒感染的量效關(guān)系曲線圖，圖中顯示，在0.3-1.25μm/ml濃度之間，濃度上升與病毒抑制率呈直線上升，1.25μm/ml以上呈平穩(wěn)狀態(tài)。
圖6是SCA551抑制病毒感染的量效關(guān)系曲線圖，圖中顯示，在0.3-0.6μm/ml濃度之間，SCA551濃度與病毒抑制率呈直線上升，0.6μm/ml以上呈平穩(wěn)上升。
圖7是SCA558抑制病毒感染的量效關(guān)系曲線，圖中顯示，在0.3-2.5μm/ml之間，SCA558濃度與病毒抑制率呈較陡的峰上升，2.5-5μm/ml之間趨于平穩(wěn)。
2、細(xì)胞及病毒實(shí)驗(yàn)所用Hela細(xì)胞株由本研究所生化免疫室提供。細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM(Minimum Essetial Medium)，含5～10％新生牛血清、100u/ml青霉素、鏈霉素0.1mg/ml、L-谷氨酰胺0.297mg/ml。實(shí)驗(yàn)所用病毒株為本室從病人標(biāo)本中分離，在Hela細(xì)胞中傳代后，其病毒滴度為4×107pfu/ml，-80℃低溫冰箱保存。使用時(shí)，用無(wú)血清MEM(青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺含量同前)稀釋病毒。
3、病毒空斑形成實(shí)驗(yàn)為了估計(jì)反義核酸抑制CVA24的能力，我們先用病毒空斑形成實(shí)驗(yàn)來(lái)確定感染量。將Hela細(xì)胞以每孔5×105密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃，5％CO2孵育18-24小時(shí)。用不含血清MEM稀釋CVA24病毒為10-1至10-5，分別加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為2×106，病毒量200μl/孔，含一對(duì)照孔，37℃，5％CO2孵育1小時(shí)，每10分鐘振蕩一次。用PBS(無(wú)Ca++、Mg++)洗細(xì)胞3次，去掉未結(jié)合病毒。加入0.7％瓊脂(1ml/孔)，再孵育48小時(shí)。1％結(jié)晶紫染色，觀察結(jié)果。
4、病毒空斑阻斷實(shí)驗(yàn)用病毒空斑阻斷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)反義核酸抑制CVA24的能力。將Hela細(xì)胞以每孔5×105密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃，5％CO2孵育18-24小時(shí)。其后，用濃度為5μmol/L的SCA373、SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568、SCA723和SCA746分別加入Hela細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每孔加入1ml MEM培養(yǎng)基，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，細(xì)胞對(duì)照孔只加入1ml MEM培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵育18小時(shí)。PBS(無(wú)Ca++、Mg++)洗細(xì)胞3次。用不含血清的MEM稀釋CVA24病毒至10-2，每孔加入0.2ml。細(xì)胞對(duì)照孔加入0.2mlMEM，不含反義核酸。于37℃、5％CO2中感染1小時(shí)，每10分鐘振蕩一次。用PBS洗細(xì)胞3次，去掉未結(jié)合病毒。每孔加入2ml含0.7％Ager的MEM固體培養(yǎng)基，37℃、5％CO2中孵育48小時(shí)。固定細(xì)胞，1％結(jié)晶紫染色后，觀察結(jié)果。
5、病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)將Hela細(xì)胞以每孔5×105密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞溶于2ml MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小時(shí)。稀釋病毒使最后細(xì)胞的感染量為10、1、0.1、0.01MOI四種病毒稀釋滴度，分別加入細(xì)胞孔中，每孔200μl，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照孔，37℃、5％CO2孵育1小時(shí)，每10分鐘振蕩一次。用PBS洗細(xì)胞3次，去掉未結(jié)合病毒。每孔加入2L的MEM(含10％新生牛血清、100u/ml青霉素、鏈霉素0.1mg/mL、L-谷氨酰胺0.297mg/ml)。37℃、5％CO2孵育72小時(shí)。顯微鏡下觀察結(jié)果。
6、反義核酸抑制病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE實(shí)驗(yàn))
將Hela細(xì)胞以每孔5×105密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞溶于2ml MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小時(shí)。其后，用濃度為5μmol/L的SCA373、SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568、SCA723和SCA746分別加入Hela細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每孔加入1ml MEM培養(yǎng)基，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，細(xì)胞對(duì)照孔只加入1mL MEM培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵育18小時(shí)。PBS(無(wú)Ca++、Mg++)洗細(xì)胞3次。用不含血清的MEM稀釋CVA24病毒至10MOI，分別加入細(xì)胞孔中，每孔200μl。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照孔，細(xì)胞對(duì)照孔加入0.2mL MEM，不含反義核酸。于37℃、5％CO2中感染細(xì)胞1小時(shí)，于37℃、5％CO2中孵育1小時(shí)。用PBS細(xì)胞洗3次，去掉為結(jié)合病毒。每孔再加入上述反義核酸5μmol/L，2ml，37℃、5％CO2中孵育48小時(shí)。將合成的寡聚核苷酸稀釋至5μmol％，分別加入培養(yǎng)板的細(xì)胞孔中，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，每孔1ml，細(xì)胞對(duì)照孔只加入1ml MEM培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵育18小時(shí)。PBS(無(wú)Ca++、Mg++)洗細(xì)胞3次。用不含血清的MEM稀釋CVA24病毒至10MOI感染Hela細(xì)胞，37℃、5％CO2孵育1小時(shí)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照孔。其后，將合成的寡聚核苷酸SCA373、SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568、SCA723和SCA746分別稀釋至5μmol/L，再加入已感染不同滴度病毒的細(xì)胞孔，每孔加入2ml的MEM(含10％新生牛血清、100u/ml青霉素、鏈霉素0.1mg/ml、L-谷氨酰胺0.297mg/ml)。37℃、5％CO2孵育72小時(shí)，觀察結(jié)果。
7、反義核酸抗病毒量效關(guān)系曲線的測(cè)定將Hela細(xì)胞以每孔5×105密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小時(shí)。其后，將合成的5種有效抑制CVA24的寡聚核苷酸SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568均稀釋至0.3125、0.625、1.25、2.5、5μmol/L，5個(gè)濃度，分別加入Hela細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每孔加入1ml MEM培養(yǎng)基，其中加入0.2％BSA(牛血清白蛋白)，細(xì)胞對(duì)照孔只加入1mL MEM培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵育18小時(shí)。PBS(無(wú)Ca++、Mg++)洗細(xì)胞3次。用不含血清的MEM稀釋CVA24病毒至10-2，分別加入細(xì)胞孔中，每孔200μl。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照孔，細(xì)胞對(duì)照孔加入0.2ml MEM，不含反義核酸；及病毒感染對(duì)照孔，細(xì)胞只感染病毒，不加入反義核酸。于37℃、5％CO2中感染細(xì)胞1小時(shí)，37℃、5％CO2孵育1小時(shí)。用PBS洗細(xì)胞3次，去掉未結(jié)合病毒。每孔再分別加入上述濃度的5種反義核酸，每孔加入2ml的MEM(含10％新生牛血清、100u/ml青霉素、鏈霉素0.1mg/ml、L-谷氨酰胺0.297mg/mL)。37℃、5％CO2孵育48-72小時(shí)，觀察結(jié)果，至病毒對(duì)照孔出現(xiàn)50-70％細(xì)胞死亡時(shí)，回收各細(xì)胞對(duì)照孔上清，-20℃保存。
將Hela細(xì)胞以每孔5×105密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞溶于2mL MEM(含10％新生牛血清)，37℃、5％CO2孵育18-24小時(shí)。將上述回收上清液稀釋至10-3，分別加入細(xì)胞孔中，每孔200μl，含病毒對(duì)照孔，37℃、5％CO2孵育1小時(shí)，每10分鐘振蕩1次。用PBS洗細(xì)胞3次，去掉未結(jié)合病毒。每孔加入2mL含0.7％Ager的MEM固體培養(yǎng)基，37℃、5％CO2中孵育48小時(shí)。固定細(xì)胞，1％結(jié)晶紫染色后，觀察結(jié)果。
8、結(jié)果①在CPE抑制實(shí)驗(yàn)中，在針對(duì)CVA24的一組反義核酸序列中，5條序列在5μM和2.5μM的濃度下顯示出有抑制病毒感染細(xì)胞的作用(見(jiàn)下表)。根據(jù)下列公式計(jì)算出CPE的抑制率。
CPE抑制率＝(病毒對(duì)照細(xì)胞死亡率-反義核酸治療后細(xì)胞死亡率/病毒對(duì)照組細(xì)胞死亡率)×100％

②在病毒空斑形成抑制實(shí)驗(yàn)中，反義核酸均采用5μM，病毒采用三種不同的稀釋度。同樣發(fā)現(xiàn)上述5條反義核酸序列具有明顯的抗病毒效果。根據(jù)空斑形成的數(shù)量，利用下列公式計(jì)算得出病毒空斑形成抑制率。見(jiàn)圖2。
病毒空斑形成抑制率＝(病毒對(duì)照空斑數(shù)-反義核酸治療后空斑數(shù)/病毒對(duì)照空斑數(shù))×100％③病毒抗病毒量效關(guān)系根據(jù)藥效學(xué)研究，我們采用病毒空斑形成抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)每一個(gè)有抗病毒效果的反義核酸進(jìn)行了量效關(guān)系的研究，結(jié)果見(jiàn)圖3至圖7。
序列表Seq ID No.1(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA5475’ACACGGTTACCCAAAGTAGT 3’Seq ID No.2(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA5515’GGAAACACGGTTACCCAAAG 3’Seq ID No.3(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈
d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA5545’AAAGGAAACACGGTTACCCA 3’Seq ID No.4(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA5585’AATAAAAGGAAACACGGTTA 3’Seq ID No.5(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA5685’CCATACAAAGAATAAAAGGA 3’Seq ID No.6(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基
b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA3735’TCCCATTGTGATGGTGCTGT 3’Seq ID No.7(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA7235’TGCTGTCTTATCAGTAGTAC3’Seq ID No.8(i)序列特征a序列長(zhǎng)度20個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述SCA7465’CACCTGGGCTCCCATTGTGA 3’Seq ID No.9(i)序列特征a序列長(zhǎng)度208個(gè)堿基b類型核苷酸c鏈型單鏈d拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)序列描述tattgagcta cttaagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaaccatggagcag gtagttgcaa tccagcagcc agcctgtcgt aacgcgcaagtccgtggcgg aaccgactac tttgggtaac cgtgtttcct tttattctttgtatggctgc ttatggtgac aatcattgat tgttatcata gagcgacttggattggcc
權(quán)利要求
1.針對(duì)柯薩奇A24病毒基因組5’端非編碼區(qū)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(病毒蛋白翻譯起始信號(hào)區(qū))所設(shè)計(jì)的一組反義寡核苷酸序列，在病毒感染細(xì)胞中，與病毒mRNA的堿基互補(bǔ)，特異性阻斷病毒遺傳信息流動(dòng)，抑制該病毒顆粒攻擊細(xì)胞，達(dá)到治療和預(yù)防該病毒感染的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反義寡核苷酸序列，其中所述柯薩奇A24病毒基因組核糖體結(jié)合位點(diǎn)的基因區(qū)序列是tattgagcta cttaagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaaccatggagcag gtagttgcaa tccagcagcc agcctgtcgt aacgcgcaagtccgtggcgg aaccgactac tttgggtaac cgtgtttcct tttattctttgtatggctgc ttatggtgac aatcattgat tgttatcata gagcgacttggattggcc
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組反義寡聚核苷酸序列，其特征在于，針對(duì)不同的區(qū)域設(shè)計(jì)的序列為SCA5475’ACACGGTTACCCAAAGTAGT 3’SCA5515’GGAAACACGGTTACCCAAAG 3’SCA5545’AAAGGAAACACGGTTACCCA 3’SCA5585’AATAAAAGGAAACACGGTTA 3’SCA5685’CCATACAAAGAATAAAAGGA 3’
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列的修飾型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列，特征在于它與病毒mRNA的堿基互補(bǔ)，有效地阻斷病毒遺傳信息流動(dòng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列作為治療和/或預(yù)防病毒性疾病的基因藥物的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的反義寡聚核苷酸序列在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的反義寡聚核苷酸序列的修飾型作為治療和/或預(yù)防病毒性疾病的基因藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)柯薩奇A24病毒基因組5’端非編碼區(qū)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(病毒蛋白翻譯起始信號(hào)區(qū))所設(shè)計(jì)的一組反義寡核苷酸序列，在病毒感染細(xì)胞中，所述反義寡核苷酸序列與病毒mRNA的堿基互補(bǔ)，特異性阻斷病毒遺傳信息流動(dòng)，抑制該病毒顆粒攻擊細(xì)胞，達(dá)到治療和預(yù)防該病毒感染的目的。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1392154SQ0212418
公開(kāi)日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月16日
發(fā)明者劉哲偉, 孫紅妹, 張?chǎng)? 肖宗惠 申請(qǐng)人:首都兒科研究所