專利名稱：重組全長人肝再生增強因子的生產(chǎn)方法及其治療嚴(yán)重肝病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域，尤其重組全長人肝再生增強因子的生產(chǎn)方法及其治療嚴(yán)重肝病的用途。
背景技術(shù)：
肝臟是人體內(nèi)再生能力最為強大的器官之一，肝臟的再生在多種肝臟疾病如急性/慢性病毒性肝炎、重型肝炎的發(fā)病與治療中具有重要的意義，因此多年來人們對于肝臟再生的機理、調(diào)節(jié)機制進(jìn)行了持續(xù)的研究，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)作用的因子多達(dá)數(shù)十種，如肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)等。由于多數(shù)因子的作用缺乏肝特異性，因此不可能是肝臟再生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。1975年，Labrecque等首次報道在剛剛斷乳的大鼠肝和肝部分切除大鼠的再生肝中存在一種熱穩(wěn)定的特異性刺激肝細(xì)胞增殖的物質(zhì)，稱為肝刺激物質(zhì)(HSS)。之后的研究發(fā)現(xiàn)，在狗、小鼠等其它動物中也存在相同性質(zhì)的物質(zhì)。1994年，Hagiya等從成年大鼠部分肝切除后的再生肝中提取肝刺激物質(zhì)，經(jīng)過復(fù)雜的步驟后獲得了一個全長1.2kb的cDNA，包含375bp的開發(fā)讀框，編碼125個氨基酸的小分子蛋白，將其命名為肝再生增強因子(ALR)。在大鼠ALR分子克隆的基礎(chǔ)上，1999年我們利用同源引物PCR技術(shù)獲得了人ALR的基因組序列(Genbank號為AF146394)，根據(jù)預(yù)測的375bp的開放讀框，可以編碼125個氨基酸的小分子蛋白。之后Lisowsky發(fā)現(xiàn)此基因有3種不同的剪切形式，125個氨基酸為不成熟形式，而204個氨基酸的形式為成熟形式，在組織中所占的比率最高，并且具有最強的生物學(xué)活性。全長hALR的分子量為23kDa，主要分布于肝臟、腎臟。hALR的主要生物學(xué)活性為促進(jìn)肝再生。在肝部分切除大鼠模型中進(jìn)行的實驗表明，肝再生增強因子能促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，使3H-TdR摻入量提高2.5倍。對肝部分切除后肝再生增強因子mRNA的動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后12hmRNA即顯著增加，并于術(shù)后24h達(dá)到峰值。在門腔靜脈吻合模型中，重組肝再生增強因子能夠使肝體積保持正常，防止肝細(xì)胞萎縮，而對照組肝組織出現(xiàn)肝萎縮，肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體減少，線粒體變大且嵴破裂。肝再生增強因子對于肝細(xì)胞損傷具有保護作用。在CCl4模擬體內(nèi)重肝損傷模型中，肝再生增強因子能夠明顯抑制CCl4誘導(dǎo)損傷肝細(xì)胞的LDH釋放，在體內(nèi)實驗中重組肝再生增強因子能夠使治療組的存活率提高20％，血清LDH水平降低34％，ALT水平降低38.3％。此外，肝再生增強因子還能夠提高糖尿病大鼠進(jìn)行胎鼠胰腺移植的成功率，并且在精子生成中發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過原核表達(dá)、純化獲取具有生物活性的重組全長人肝再生增強因子并用于治療嚴(yán)重肝病。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是在獲取全長人肝再生增強因子基因并構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體分離裂解、蛋白質(zhì)復(fù)性純化的工藝，以獲重組全長人肝再生增強因子純品，并對重組全長人肝再生增強因子的生物學(xué)活性進(jìn)行了描述，表明重組全長人肝再生增強因子具有治療嚴(yán)重肝病的用途。
關(guān)于全長人肝再生增強因子基因的獲取及其高效表達(dá)載體的構(gòu)建可以參閱成軍，鐘彥偉，劉妍，董菁，楊繼珍，陳菊梅，人肝再生增強因子基因組DNA的克隆化與序列分析。中華肝臟病雜志，2000；8(1)12-14；以及夏小兵，成軍，王剛，楊繼珍，劉妍，董菁，王琳，李克，人肝再生增強因子在畢赤酵母中的表達(dá)。世界華人消化雜志，2001；9(7)743-746。全長人肝再生增強因子基因及表達(dá)蛋白見序列表中序列1和序列2。
本發(fā)明在獲取全長人肝再生增強因子基因并構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體分離裂解、蛋白質(zhì)復(fù)性純化的工藝，其特征為1)工程菌低密度發(fā)酵，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間為OD600＝0.3-0.4；2)包涵體的變性采用8mol/L尿素溶液；3)包涵體的復(fù)性采用2mol/L尿素，0.2mmol/L氧化性谷胱甘肽、1mmol/L還原性谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0；4)蛋白純化采用陽離子交換層析，采用SP-FF柱，上樣后首先利用乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相，然后利用300mmol/L NaCl進(jìn)行階段洗脫，重組全長人肝再生增強因子位于第一峰；5)獲得的重組全長人肝再生增強因子純度可達(dá)99％以上，能夠在體外促進(jìn)肝細(xì)胞系HepG2的增殖，在體內(nèi)促進(jìn)肝部分切除術(shù)后大鼠肝臟的再生，促進(jìn)CCl4中毒后大鼠肝細(xì)胞DNA合成，提高CCl4中毒后大鼠存活率。
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了1、一種重組全長人肝再生增強因子的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟
A、工程菌種的活化；B、發(fā)酵；C、裂菌；D、包涵體洗滌；E、包涵體裂解；F、包涵體復(fù)性；和G、純化。
2、以上項1的方法，其中發(fā)酵為低密度發(fā)酵，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間為OD600＝0.3-0.4。
3、以上項1的方法，包涵體的裂解采用尿素進(jìn)行。
4、以上項1的方法，包涵體的復(fù)性采用尿素，氧化性谷胱甘肽，還原性谷胱甘肽和Tris-HCl進(jìn)行，其中pH為7.5-8.5，優(yōu)選8.0。
5、以上項1的方法，其中純化采用陽離子交換層析和凝膠層析進(jìn)行。
6、以上項1-5中任一項的方法獲得的重組全長人肝再生增強因子。
7、以上項6的重組全長人肝再生增強因子在制備治療嚴(yán)重肝病的藥物中的用途。
有益效果通過我們的技術(shù)方案可以獲得純化的重組全長人肝再生增強因子。人肝再生增強因子在肝臟再生中的作用在很早以前就引起人們的注意，但以前對它的了解大多限于125氨基酸形式，對于人肝再生增強因子其它剪切產(chǎn)物以及它們功能上的差異則是剛剛了解。目前的認(rèn)識是204氨基酸形式才是它的全長形式，在組織中所占的比率最高，并且具有最強的生物學(xué)活性，因此有望在治療嚴(yán)重肝病中取得實際的應(yīng)用。
附圖簡述

圖1為生產(chǎn)工藝流程圖；實施例實施例一重組全長人肝再生增強因子的生產(chǎn)方法一、本實施例的技術(shù)要點1、細(xì)菌為低密度發(fā)酵；2、包涵體變性劑為尿素；3、包涵體復(fù)性后利用陽離子交換層析進(jìn)行純化；二、操作步驟；1、工程菌種的活化重組pBV220-hALRL/JM109為本室構(gòu)建。從4℃保存的細(xì)菌平皿中挑取分離良好的單菌落，接種于5mlLB/Amp(100ug/ml)培養(yǎng)基中，30℃200rpm振蕩培養(yǎng)12h；5％接種于搖瓶中，培養(yǎng)基同前，30℃200rpm振蕩培養(yǎng)12h作為種子液。
2、發(fā)酵種子液按照2.5％接種于500ml LB/Amp(100ug/ml)培養(yǎng)基中，30℃200rpm振蕩培養(yǎng)3-4h，待其OD600＝0.3-0.4時升高培養(yǎng)溫度至42℃，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5h。10000rpm離心，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，約為4g/L。利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行小試，發(fā)酵參數(shù)為通氣量2L/min，溶氧量50％，攪拌速度300-600rpm。每次投料4L，按照2.5％接種種子液，30℃生長至OD600＝0.3-0.4時升高培養(yǎng)溫度至42℃誘導(dǎo)表達(dá)5h。10000rpm離心，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，約為4g/L。
3、裂菌4℃3000rpm離心30min，棄上清。稱量細(xì)菌濕重，按照100ml/10g菌體的比例加入細(xì)菌裂解液(50mmol/LTris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，1mg/ml溶菌酶)，0℃作用30min，冰浴超聲破碎30-45s，間歇2min，共超聲3次，之后4℃8000rpm離心30min，棄上清，收集包涵體，以100mmol/LTris-HCl，pH8.0洗滌一次。
4、包涵體洗滌以0.5％Triton X-100(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)按照100ml/20g包涵體的比例重懸包涵體，室溫攪拌40min。10000rpm離心30min，棄上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl，pH8.0洗滌一次，稱重。以2mol/L NaCl(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)按照100ml/20g包涵體的比例重懸包涵體，室溫攪拌120min。10000rpm離心30min，棄上清。沉淀用100mmol/LTris-HCl，pH8.0洗滌一次，稱重。以4mol/L尿素(100mmol/LTris-HCl，pH8.0)按照100ml/20g包涵體的比例重懸包涵體，室溫攪拌40min。10000rpm離心30min，棄上清。沉淀用100mmol/LTris-HCl，pH8.0洗滌一次，稱重。
5、包涵體裂解將包涵體按照20-30g/100ml的濃度重懸于8mol/L尿素(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，1％巰基乙醇中，室溫攪拌過夜。10000rpm離心30min，取上清。
6、包涵體復(fù)性將100mmol/L Tris-HCl，pH8.0加入包涵體裂解液，將尿素由8mol/L稀釋到2mol/L，同時調(diào)節(jié)總蛋白量不超過500ug/ml。加入氧化性谷胱甘肽至終濃度為0.2mmol/L，加入還原型谷胱甘肽至終濃度為1mmol/L。4℃復(fù)性8-10h。用含有谷胱甘肽氧化還原體系的100mmol/L Tris-HCl，pH8.0反復(fù)透析以除去尿素。
7、陽離子交換層析采用Amersham SP-FF強陽離子交換層析膠裝填入26mm層析柱，以50mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH5.5進(jìn)行平衡。包涵體復(fù)性溶液在乙酸鈉緩沖液中充分透析后上樣，每次上樣10ml。以乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相，之后利用300mmol/L NaCl進(jìn)行階段洗脫，目的蛋白位于第一峰。收集第一峰。
8、凝膠層析采用Sephacryl S-100凝膠層析柱，以50mmol/LTris-HCl，pH8.0進(jìn)行平衡。將樣品用50mmol/L Tris-HCl，pH8.0充分透析后上樣，目的蛋白位于主峰。收集主峰。
實施例二重組全長人肝再生增強因子體外促進(jìn)肝細(xì)胞系HepG2的DNA合成一、本實施例的技術(shù)要點重組全長人肝再生增強因子體外促進(jìn)肝細(xì)胞系HepG2的DNA合成。
二、操作步驟1、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞生長于高糖DMEM+10％胎牛血清中，37℃5％CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至4×105/ml，在96孔培養(yǎng)板中每孔接種100ul，繼續(xù)培養(yǎng)6h。
2、加樣在96孔培養(yǎng)板中加入待測樣品，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。假如2.0×104Bq3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)3h。
3、檢測利用細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集到濾紙片上，上液閃計數(shù)器計數(shù)。
4、結(jié)果通過實驗證明重組全長人肝再生增強因子能夠在體外促進(jìn)肝細(xì)胞系HepG2的DNA合成。
實施例三重組全長人肝再生增強因子體內(nèi)促進(jìn)肝部分切除術(shù)后大鼠肝臟細(xì)胞DNA合成一、本實施例的技術(shù)要點重組全長人肝再生增強因子體內(nèi)促進(jìn)肝部分切除術(shù)后大鼠肝臟細(xì)胞DNA合成。
二、操作步驟1、大鼠肝部分切除術(shù)模型的建立大鼠單籠飼養(yǎng)1wk，實驗前禁食過夜，術(shù)前腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg·kg-1)麻醉，上腹部脫毛后以750mL·L-1酒精消毒皮膚，以上腹部正中切口，顯露肝臟，按Hoggin法充分游離左葉及中葉肝臟的韌帶后，于各肝葉的根部結(jié)扎牢固，迅速于結(jié)扎線的遠(yuǎn)端切除左肝葉及肝中葉，即相當(dāng)于2/3肝切除。保留余肝葉，縫合腹部切口。
2、加藥術(shù)后腹腔注射重組全長人肝再生增強因子1ml(0.1mg/ml)，同時設(shè)生理鹽水對照組。20h后按照100uCi/kg腹腔注射3H-TdR，2h后處死大鼠。
3、檢測開腹，取肝組織，用Promega試劑盒提取組織DNA，進(jìn)行3H-TdR計數(shù)。
4、結(jié)果通過實驗證明重組全長人肝再生增強因子能夠在體內(nèi)促進(jìn)肝部分切除術(shù)后大鼠肝臟細(xì)胞DNA合成。
實施例四重組全長人肝再生增強因子體外促進(jìn)CCl4損傷肝細(xì)胞的修復(fù)一、本實施例的技術(shù)要點重組全長人肝再生增強因子體外促進(jìn)CCl4損傷肝細(xì)胞的修復(fù)。
二、操作步驟1、體外CCl4損傷肝細(xì)胞模型的建立按照原位灌注法分離BalB/C小鼠肝細(xì)胞，將分離的細(xì)胞用含10％小牛血清，10-9mol/L胰島素的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮，按每孔3×104細(xì)胞/100ul的數(shù)量接種于96孔板，37℃5％CO2培養(yǎng)10h。換用含5mM CCl4，10％小牛血清及不同濃度重組全長人肝再生增強因子的RPMI1640培養(yǎng)液。
2、LDH釋放實驗于換液后不同時間收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用Cytox 96非放射性細(xì)胞毒檢測試劑盒測定細(xì)胞LDH釋放率。
3、細(xì)胞存活率的測定使用MTT法評價肝細(xì)胞的存活率，用酶聯(lián)儀檢測OD490值。
4、結(jié)果通過實驗證明，重組全長人肝再生增強因子能夠明顯抑制CCl4損傷肝細(xì)胞LDH釋放，并顯著增加CCl4損傷后肝細(xì)胞的存活率。
實施例五重組全長人肝再生增強因子體內(nèi)促進(jìn)CCl4損傷肝細(xì)胞的修復(fù)一、本實施例的技術(shù)要點重組全長人肝再生增強因子體內(nèi)促進(jìn)CCl4損傷肝細(xì)胞的修復(fù)。
二、操作步驟1、體內(nèi)CCl4肝中毒模型的建立BalB/C小鼠腹腔注射CCl4(4ml/kg)，4h后隨機分組，治療組每12h腹腔注射重組全長人肝再生增強因子20ug，對照組注射生理鹽水。記錄動物死亡時間，存活超過96h即為存活。
2、體內(nèi)CCl4肝損傷模型的建立BalB/C小鼠腹腔注射CCl4(2ml/kg)，4h后隨機分組，治療組每12h靜脈注射重組全長人肝再生增強因子20ug，對照組注射生理鹽水。48h后測定DNA增值率，同時取外周血測定ALT、LDH水平。
3、DNA增殖測定在最后一次注射重組全長人肝再生增強因子厚12h，按照1ml/kg的量腹腔注射5-FU標(biāo)記液，2h后處死動物，開腹取肝組織，甲醛固定，石蠟包埋。常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，酒精脫水后PBS洗滌三次，抗5-FU單抗室溫孵育60min，PBS洗滌二次，切片以過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG室溫孵育30min，洗滌三次后顯色10min，脫水、透明、封片，顯微鏡下隨即挑選五個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞。
4、結(jié)果通過實驗證明，重組全長人肝再生增強因子在體內(nèi)能夠顯著提高CCl4肝中毒小鼠的存活率，顯著降低CCl4肝損傷小鼠的外周血ALT、LDH水平。光鏡下可見重組全長人肝再生增強因子能夠顯著減輕肝細(xì)胞變性壞死的比率，并能夠促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型小鼠肝細(xì)胞DNA合成。
序列表<110>中國人民解放軍傳染病研究所<120>重組全長人肝再生增強因子的生產(chǎn)方法及其治療嚴(yán)重肝病的用途<160>2<210>1<211>615<212>DNA<213>人<220><223>n＝a或g或c或t<400>1ATG GCG GCG CCC GGC GAG CGG GGC CGC TTC CAC GGC GGG AAC CTC TTC TTC 51Met Ala Ala Pro Gly Glu Arg Gly Arg Phe His Gly Gly Asn Leu Phe PheCTG CCG GGG GGC GCG CGC TCC GAG ATG ATG GAC GAC CTG GCG ACC GAC GCG 102Leu Pro Gly Gly Ala Arg Ser Glu Met Met Asp Asp Leu Ala Thr Asp AlaGGG CCG GGG CGC GGG GCG GAG AGA CGC GGC CGC CTC GGC CTC GAC GCC AGC 153Gly Pro Gly Arg Gly Ala Glu Arg Arg Gly Arg Leu Gly Leu Asp Ala SerCCA GGC GCC GAC CTC CGA TTC TCC TGT CGC CGA GGA CGC CTC CCG GAG GCG 204Pro Gly Ala Asp Leu Arg Phe Ser Cys Arg Arg Gly Arg Leu Pro Glu AlaGCG TGC CGG GCC TGC GTC GAC TTC AAG ACG TGG ATG CGG ACG CAG CAG AAG 255Ala Cys Arg Ala Cys Val Asp Phe Lys Thr Trp Met Arg Thr Gln Gln LysCGG GAC ACC AAG TTT AGG GAG GAC TGC CCG CCG GAT CGC GAG GAA CTG GGC 306Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu GlyCGC CAC AGC TGG GCT GTC CTT CAC ACC CTG GCC GCC TAC TAC CCC GAC CTG 357Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp LeuCCC ACC CCA GAA CAG CAG CAA GAC ATG GCC CAG TTC ATA CAT TTA TTT TCT 408Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe SerAAG TTT TAC CCC TGT GAG GAG TGT GCT GAA GAC CTA AGA AAA AGG TTG TGC 459Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu CysAGG AAC CAC CCA GAC ACC CGC ACC CGG GCA TGC TTC ACA CAG TGG CTG TGC 510Arg Asn His Pro Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu CysCAC CTG CAC AAT GAA GTG AAC CGC AAG CTG GGC AAG CCT GAC TTC GAC TGC 561His Leu His Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp CysTCA AAA GTG GAT GAG CGC TGG CGC GAC GGC TGG AAG GAT GGC TCC TGT GAC 612Ser Lys Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys AspTAG615<210>2<211>204<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Ala Pro Gly Glu Arg Gly Arg Phe His Gly Gly Asn Leu Phe Phe5 10 15Leu Pro Gly Gly Ala Arg Ser Glu Met Met Asp Asp Leu Ala Thr Asp Ala20 25 30Gly Pro Gly Arg Gly Ala Glu Arg Arg Gly Arg Leu Gly Leu Asp Ala Ser35 40 45 50Pro Gly Ala Asp Leu Arg Phe Ser Cys Arg Arg Gly Arg Leu Pro Glu Ala55 60 65Ala Cys Arg Ala Cys Val Asp Phe Lys Thr Trp Met Arg Thr Gln Gln Lys70 75 80 85Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly90 95 100Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu105 110 115Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser120 125 130 135Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys
140 145 150Arg Asn His Pro Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys155 160 165 170His Leu His Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys175 180 185Ser Lys Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp190 195 200
權(quán)利要求
1.一種重組全長人肝再生增強因子的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟A、工程菌種的活化；B、發(fā)酵；C、裂菌；D、包涵體洗滌；E、包涵體裂解；F、包涵體復(fù)性；和G、純化。
2.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵為低密度發(fā)酵，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間為OD600＝0.3-0.4。
3.權(quán)利要求1的方法，其中包涵體的裂解采用尿素進(jìn)行。
4.權(quán)利要求1的方法，其中包涵體的復(fù)性采用尿素，氧化性谷胱甘肽，還原性谷胱甘肽和Tris-HCl進(jìn)行，其中pH為7.5-8.5，優(yōu)選8.0。
5.權(quán)利要求1的方法，其中純化采用陽離子交換層析和凝膠層析進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法獲得的重組全長人肝再生增強因子。
7.權(quán)利要求6的重組全長人肝再生增強因子在制備治療嚴(yán)重肝病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明為重組全長人肝再生增強因子的生產(chǎn)方法及其治療嚴(yán)重肝病的用途，屬于生物產(chǎn)品的生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域。在獲取全長人肝再生增強因子基因序列并成功構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了重組全長人肝再生增強因子原核表達(dá)、包涵體分離裂解、蛋白質(zhì)純化復(fù)性的工藝，最終獲得重組全長人肝再生增強因子純品。后者能夠在體外促進(jìn)肝細(xì)胞系HepG2的DNA合成，在體內(nèi)促進(jìn)肝部分切除術(shù)后大鼠肝臟的再生，促進(jìn)CCl
文檔編號A61K38/18GK1418964SQ02125768
公開日2003年5月21日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者成軍, 王剛, 夏小兵, 洪源, 劉妍, 鐘彥偉, 王琳, 董菁 申請人:中國人民解放軍傳染病研究所