專利名稱：一組合成抗菌肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組合成抗菌肽、其制備方法及在制備治療細菌、真菌感染的藥物中的應(yīng)用，該抗菌肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有顯著的殺菌活性。
隨著對抗菌肽一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，已有許多研究者對這些抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能進行研究，發(fā)現(xiàn)在模擬膜的疏水環(huán)境下，分子中的α-螺旋度與其殺菌活性密切相關(guān)。另外研究結(jié)果表明抗菌肽是通過破壞膜的完整性使得細菌細胞膜滲漏而殺死細菌(Nakajima Y.etal.，J.Biol.Chem，2621665-1669；Zasloff M.Nature，2002，415389-395)。因此有人試圖通過增加分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)或提高多肽中含正電荷氨基酸的比例來尋找更強抗菌活性的多肽(Broth W.B.etal.，AntimicrobialAgentsChemotherapy，2001，451894-1895；HongS.Y.etal.，Peptides，2001，221669-1674)。
Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(Al′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ilc Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3 ′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lus Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)序列為抗菌肽序列的核心結(jié)構(gòu)。其中A1、A1′、A1″為Lys或Arg中的一種，A2、A2′、A2″為Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一種，A3、A3′、A3″為Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一種，A4、A4′、A4″為Lys或Arg中的一種。(A1-A2-A3-A4)的氨基端連接有11個氨基酸，11個氨基酸中第1，3，6，7位氨基酸為賴氨酸或精氨酸中的一種，11個氨基酸中第2位氨基酸為色氨酸或苯丙氨酸中的一種，11個氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸為亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸或甘氨酸中的一種。
本發(fā)明一組合成抗菌肽還包括以上所述多肽中個別氨基酸的取代、環(huán)化、L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。
本發(fā)明提供的一組合成抗菌肽，其制備方法可以是固相化學法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到載體上，然后在宿主細胞中表達后獲得。其中表達載體可以是質(zhì)?；虿《局械囊环N，宿主細胞可以是原核細胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細胞也可以是真核細胞、包括酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。制備的抗菌肽可通過質(zhì)譜鑒定。
為了深入研究本發(fā)明這類生物學活性抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，利用美國應(yīng)用系統(tǒng)生物公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀制備一組多肽，以進行研究。下面以制備的具有下列氨基酸序列的GK-1，GK-2和GK-3抗菌肽作為舉例來進行敘述
GK-1Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu ArgLys Leu Leu LysGK-2Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu ArgArg Leu Leu ArgGK-3Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg利用96孔板法檢測多肽的殺菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以預(yù)先合成的天然抗菌肽buforin II，cecropin A1為對照，進行殺菌活性檢測。結(jié)果表明本發(fā)明合成抗菌肽的殺菌活性強于所述兩種天然抗菌肽的殺菌活性。
同樣對多肽中氨基酸缺失、環(huán)化衍生物的抗菌肽功能等同物也進行了制備與生物活性測定，測定結(jié)果顯示這些多肽的殺菌活性也基本上強于上述的天然抗菌肽的殺菌活性。
抗菌肽在高效殺菌的同時也有可能作用于高等有機體包括人體細胞，因為抗菌肽的作用方式都是在細胞膜上穿孔使得細胞發(fā)生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細胞發(fā)生滲漏作為其是否有毒性的一個標準，如果抗菌肽能使紅細胞中的血紅蛋白發(fā)生滲漏，就可以通過檢測OD490值確定毒性的大小。因此本發(fā)明還檢測了合成抗菌肽對人體紅細胞的溶血活性，實驗表明，抗菌肽溶血率值很低，證實本發(fā)明合成抗菌肽的溶血毒性極小。
此外，又對本發(fā)明合成抗菌肽進行動物體內(nèi)急性毒性試驗，證明合成抗菌肽無毒性作用。又進行合成抗菌肽對小白鼠急性感染金黃色葡萄球菌的抑制作用的試驗，表明合成抗菌肽對金黃色葡萄球菌感染有顯著的抑制作用。
本發(fā)明提供一組新的人工設(shè)計合成的抗菌肽?？煞奖愕夭捎霉滔嗷瘜W法制備或?qū)⒕幋a抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得。該合成抗菌肽對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌具有廣譜殺傷活性，并較天然抗菌肽有更強的殺菌活性，但對動、植物細胞無任何毒害作用。并通過抗菌肽對金黃色葡萄球菌急性感染殺菌活性的小鼠試驗顯示合成抗菌肽給予0.25mg/kg劑量，就能達到100％殺菌抑制率，而作為殺滅金黃色葡萄球菌特效藥的萬古霉素要給予4.0mg/kg劑量才能達到100％的殺菌抑制率，表明本發(fā)明合成抗菌肽對金黃色葡萄球菌急性感染有很顯著的殺菌效果，因此本發(fā)明合成抗菌肽可應(yīng)用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染引起的疾病的藥物。


圖1是抗菌肽GK-2的質(zhì)譜圖。
cecropin A1的序列(參見Morishima，I.，etc，Comp.Biochem.Physiol.，1990，B 95(3)，551-554)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp GlyLeu Ile Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Gln Ala Lys Ser Leubuforln II的序列(參見Park，C.B.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，218(1)，408-413)Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg LeuLeu Arg Lys本實施例采用固相化學法合成，所用儀器為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀。合成的多肽經(jīng)過高濃度的TFA剪切后，用反向柱純化，純化后的多肽通過質(zhì)譜鑒定。具體試驗步驟如下1、抗菌肽的制備(以制備0.1mmol量的GK-2為例)以下所有制備抗菌肽的試劑均購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
制備的GK-2多肽序列為N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu LeuArg Arg Leu Leu Arg-C制備從C端到N端逐個進行，由合成儀自動控制。首先稱量0.1mmol的結(jié)合了第一個氨基酸即Arg的樹脂(購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，裝柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脫保護，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護的游離氨基酸溶解于碳二亞胺(DCC)，羥基苯并三唑(HOBt)/二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環(huán)偶合反應(yīng)30分鐘，二甲基甲酰胺清洗重復(fù)以上脫保護到偶合反應(yīng)步驟直到制備結(jié)束(具體操作步驟見pioneer多肽合成儀操作指南)。
制備后的多肽經(jīng)如下步驟剪切取下反應(yīng)后的樹脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三異丙基硅烷)，室溫反應(yīng)2小時，過濾，濾出液中加入10倍體積的預(yù)冷無水乙醚，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集沉淀并室溫干燥。
2、抗菌肽純化稱量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，樣品處理后經(jīng)反向柱分離(洗脫液為含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脫峰。
3、抗菌肽的鑒定如圖1所示，制備的抗菌肽GK-2經(jīng)過質(zhì)譜分析，GK-2在質(zhì)譜圖中顯示的分子量計算如下(1)734.8×4＝2939.2，2939.2-4＝2935.2(2)979.1×3＝2937.3，2937.3-3＝2934.3(3)1468×2＝2936，2936-2＝2934計算出GK-2的分子量為2934。由多肽序列計算出的理論值為2932.74。證明制備的多肽即為設(shè)計的GK-2抗菌肽。鑒定合格的抗菌肽產(chǎn)物備用。
抗菌肽GK-1和GK-3，天然抗菌肽cecropin A1和buforin II可以采用類似于GK-2抗菌肽的制備方法制備。
實施例2 抗菌肽GK-1基因在大腸桿菌中的表達首先設(shè)計合成編碼抗菌肽的GK-1基因，將其克隆到pGEX-4T1載體上(購自AmershamPharmcia Biotech公司)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)IPTG誘導表達GST-GK-1融合蛋白，再經(jīng)凝血酶切割后，得抗菌肽GK-1。
實施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶，Klenow酶、限制性內(nèi)切酶除特別指明外均為BIOLAB公司產(chǎn)品，割膠回收試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品，寡聚核苷酸為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。凝血酶剪切試劑盒購于SIGMA公司。
有關(guān)DNA的分離、純化、PCR擴增、酶解、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》進行。大腸桿菌JM109培養(yǎng)在液體或固體的LB培養(yǎng)基中。
采用大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計編碼優(yōu)選抗菌肽GK-1基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位點BamHI(GGATCC)，在3’端加上終止密碼子(TAG)，所得構(gòu)建基因的長度為78bp。
通過DNA合成儀直接合成該核苷酸片斷。首先用PCR方法對基因進行擴增。設(shè)計一對引物5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反應(yīng)條件如下94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反應(yīng)30個循環(huán)。PCR反應(yīng)后將該片斷經(jīng)過Klenow酶補平后用BamHI酶切，酶切片斷經(jīng)過割膠回收后(割膠回收操作參照試劑盒操作說明)與pGEX-4T1載體的BamHI和SmaI的雙酶切片斷連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化子通過SmaI酶切鑒定、篩選。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過IPTG誘導表達GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST親合柱純化后經(jīng)凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具體操作參照試劑盒操作說明。
GK-1蛋白序列Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu ArgLys Leu Leu Lys編碼GK-1的核苷酸序列GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAAACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAATAG實施例3 抗菌肽GK-1基因在酵母細胞中的表達本實施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶，Klenow酶、限制性內(nèi)切酶除特別指明外均為BIOLAB公司產(chǎn)品，割膠回收試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品，寡聚核苷酸為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。凝血酶剪切試劑盒購于SIGMA公司。
設(shè)計合成編碼抗菌肽的GK-1基因，經(jīng)過BamHI酶切與編碼GST的DNA序列連接，后將其連接到質(zhì)粒pBluescriptSKII(購自美國Stratagene公司)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購自武漢大學菌種保藏中心)，提取質(zhì)粒經(jīng)過測序證明序列正確后，質(zhì)粒經(jīng)過EcoRI，XhoI酶切后連接到pPIC9載體(購自美國Invitrogen公司)中，后轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌株KM71(購自美國Invitrogen公司)，甲醇誘導表達融合蛋白GST-GK-1。
有關(guān)DNA的分離、純化、PCR擴增、酶解、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》進行。畢氏酵母菌株KM71培養(yǎng)在液體或固體的BMGY培養(yǎng)基中，甲醇誘導表達融合蛋白GST-GK-1時酵母菌株培養(yǎng)在BMMY培養(yǎng)基中，每隔24小時補加甲醇至終濃度為1％。
采用酵母菌偏愛的密碼子設(shè)計編碼優(yōu)選抗菌肽GK-1及GST的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位點BamHI(GGATCC)，在3’端加上終止密碼子(TAG)及EcoRI酶切位點(GAATCC)，所得構(gòu)建基因的長度為84bp，同時在GK-1基因前段接編碼GST的DNA序列，同時在GST的DNA序列的5’端加了一個XhoI酶切位點。
GK-1核苷酸片斷的制備通過DNA合成儀直接合成編碼GK-1核苷酸片斷。然后用PCR方法對基因進行擴增。設(shè)計一對引物5’CCTAGGTTTACCT3’和5’AAGTCGTCCGCC3’。PCR反應(yīng)條件如下94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反應(yīng)35個循環(huán)。
編碼GST的DNA序列的的制備設(shè)計一對引物5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’用以上引物擴增pGEX-4T1載體。PCR反應(yīng)條件如下94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，60秒；反應(yīng)30個循環(huán)。
擴增片段與質(zhì)粒的連接將GK-1的PCR擴增片斷經(jīng)過Klenow酶補平后用BamHI和EcoRI酶切，酶切片斷經(jīng)過割膠回收后(割膠回收操作參照試劑盒操作說明)與編碼GST的DNA擴增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段以及pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI酶切回收片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過抗性、藍白斑、酶切鑒定后，進一步經(jīng)過測序確定表達序列正確。提取質(zhì)粒經(jīng)XhoI和EcoRI酶切回收小片段，與pPIC9的XhoI和EcoRI酶切連接構(gòu)建成表達質(zhì)粒pPIC9-gst-gk1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。按文獻報道的方法(Clare JJ，etc.，Gene，1991，105205-212)制備畢氏酵母KM71的感受態(tài)細胞，并將SacI單酶切的線性化重組質(zhì)粒pPIC9-gst-gk1經(jīng)電轉(zhuǎn)化導入感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)化的條件為1.5KV，22.5uF。將電轉(zhuǎn)化的酵母細胞涂板于YPD平板，30℃培養(yǎng)兩天后，篩選表達融合蛋白的陽性克隆。
轉(zhuǎn)化子經(jīng)過甲醇誘導表達GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST親合柱純化后經(jīng)凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具體操作參照試劑盒操作說明。
GST-GK-1融合蛋白序列Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu LeuGlu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn LysLys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The GlnSer Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg AlaGlu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser LysAsp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp ArgLeu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala LeuAsp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys ArgIle Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln GlyTrp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys TrpLys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu LysGST-GK-1核苷酸序列TTAGAAATGTCTCCTATTTTAGGTTATTGGAAAATTAAAGGTTTAGTTCAACCTACTCGTTTATTATTAGAATATTTAGAAGAAAAATATGAAGAACATTTATATGAACGTGATGAAGGTGATAAATGGCGTAATAAAAAATTTGAATTAGGTTTAGAATTTCCTAATTTACCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACTCAATCTATGGCTATTATTCGTTATATTGCTGATAAACATAATATGTTAGGTGGTTGTCCTAAAGAACGTGCTGAAATTTCTATGTTAGAAGGTGCTGTTTTAGATATTCGTTATGGTGTTTCTCGTATTGCTTATTCTAAAGATTTTGAAACTTTAAAAGTTGATTTTTTATCTAAATTACCTGAAATGTTAAAAATGTTTGAAGATCGTTTATGTCATAAAACTTATTTAAATGGTGATCATGTTACTCATCCTGATTTTATGTTATATGATGCTTTAGATGTTGTTTTATATATGGATCCTATGTGTTTAGATGCTTTTCCTAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATTCCTCAAATTGATAAATATTTAAAATCTTCTAAATATATTGCTTGGCCTTTACAAGGTTGGCAAGCTACTTTTGGTGGTGGTGATCATCCTCCTAAATCTGATTTAGTTCCTCGTGGTTCTAAATGGAAATTATTTAAAAAAATTGGTATTGGTCGTTTATTAAAACGTGGTTTACGTAAATTATTAAAATGAGAATTT實施例4 合成抗菌肽的殺菌活性檢測以下實施例中所使用的各種菌株購于中國生物制品檢定所。
采用96孔板法對合成抗菌肽的殺菌活性進行檢測，并用固相化學法合成的抗菌肽cecropin Al和buforin II作為對照，以評價本發(fā)明中作為舉例的三條抗菌肽GK-1，GK-2和GK-3的殺菌活性。
按以下步驟進行測定抗菌肽的殺菌活性菌種復(fù)蘇，接種斜面37℃培養(yǎng)過夜，挑菌于普通LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，稀釋菌液使菌濃度為104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接種于96孔板中，將多肽以一定比例稀釋后，每孔中加入10ul，將96孔板置于37℃培養(yǎng)過夜，酶標儀檢測0D620值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。檢測結(jié)果見表1。
含有抗菌肽的細菌的生長濃度(OD620)與不加抗菌肽的細菌的生長濃度的比值大于90％時的抗菌肽濃度即為最小抑菌濃度(最小抑菌濃度(MIC)定義為顯著抑制細菌生長的最低的濃度)。
表1 五種抗菌肽對不同細菌的抗菌活性最小抑菌濃度(MIC)的比較

上表中的的最小抑菌濃度值越小，則代表抗菌能力越強。
實施例5抗菌肽功能等同物——缺失、環(huán)化衍生物的殺菌活性檢測設(shè)計合成抗菌肽功能等同物缺失GK-19及環(huán)化GK-20衍生物，合成方法見美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)pioneer多肽合成儀操作指南。合成產(chǎn)物經(jīng)過分離純化(同實施例1)后，檢測了衍生物的最小抑菌濃度，殺菌活性檢測同實施例4，檢測結(jié)果見表2。缺失GK-19、環(huán)化GK-20衍生物的序列如下GK-19Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Pro Arg Leu Leu Arg Arg Gly Leu Arg Lys Val Leu Lys

表2 抗菌肽功能等同物GK-19和GK-20對不同細菌的最小抑菌濃度(MIC)

上表中的的最小抑菌濃度值越小，則代表抗菌能力越強。
實施例6體外溶血活性檢測本實施例用于檢測合成抗菌肽對人體紅細胞是否具有溶血活性，并用固相化學法合成的抗菌肽cecropin A1和buforinII作為對照。使用的的血樣取于正常人血。
合成抗菌肽溶血活性的檢測步驟是4％的新鮮紅細胞懸液在414nm下血紅蛋白的釋放來檢測的。人紅細胞經(jīng)PBS(PBS35mM磷酸緩沖液/0.15MNaCl，PH7.0)洗滌，取100ul的8％人紅細胞懸液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小時后，1500rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移100ul上清于新的96孔板中，通過酶標儀檢測414nm下的吸收。陰性對照用PBS，陽性對照用0.1％TritonX-100。檢測結(jié)果見表3
表3 五種抗菌肽溶血活性檢測結(jié)果抗菌肽濃度 溶血率(％)(ug/ml) cecropinA1 buforinIIGK-1 GK-2 GK-312.5 0 0 00025 0 0 00050 0 0 0001001.20 0.5 0.2 0.62003 0.5 0.8 1.0 1.150010 1.7 1.5 21.9表3中抗菌肽的溶血率值越小，則代表抗菌肽的溶血毒性越小。
實施例7 動物體內(nèi)急性毒性試驗本實施例用以檢測合成抗菌肽對動物的毒性，并用固相化學法合成的抗菌肽cecropinA1和buforinII作為對照，測定本發(fā)明提供的抗菌肽GK-1、GK-2和GK-3的毒性。
采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，體重33.5±0.25g，抗菌肽按1mg/kg劑量，每日一次連續(xù)7天經(jīng)肌注小白鼠，觀察動物在最大劑量下毒性反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，動物經(jīng)肌注抗菌肽7天后，無異常反應(yīng)，活動正常。經(jīng)7天觀察，60只小白鼠全部存活。證明合成抗菌肽無毒性作用。
實施例8合成抗菌肽和萬古霉素對小鼠金黃色葡萄球菌感染模型抑制效果的比較使用昆明小白鼠的急性感染模型，實驗步驟如下將金黃色葡萄球菌CMCC26003置于含5％豬胃粘液素的小牛肉灌輸肉湯里，振蕩培養(yǎng)過夜。體重大約33.5±0.25g的小鼠腹腔內(nèi)注射10u-107存活細胞，每個處理組里有3個小鼠。靜脈注射抗菌肽GK-1(溶于0.1毫升5％右旋糖里供注射)，在10分鐘里注射。皮下注射萬古霉素(萬古霉素對小鼠皮下給藥是完全可生物利用的，不論皮下給予或靜脈給予有相似的活性)。
表4 抗菌肽GK-1和萬古霉素對金黃色葡萄球菌急性感染小白鼠模型的抑制作用

如表4所示，靜脈注射給予0.25mg/kg，合成抗菌肽能100％保護感染小鼠。萬古霉素在4.0毫克/kg劑量下才100％有效。所有的未處理小鼠在不到24小時里都死亡。
該實驗例顯示，合成抗菌肽對用高致命的細菌劑量的小鼠急性感染模型殺滅金黃色葡萄球菌是十分有效的。
序列表<110>上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司<120>一組合成抗菌肽<130>SPI028296<160>54<170>PatentIn Version2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>1Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>2<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>2Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>3<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>3Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa 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Xaa<210>24<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>24Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>25<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>25Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>26<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>26Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>27<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>27Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>28<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>28Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>29<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>29Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>30<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>30Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>31<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>31Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>32<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>32Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>33<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>33Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>34<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>34Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>35<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>35Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>36<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>36Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>37<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>37Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>38<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>38Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>39<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>39Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>40<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>40Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>41<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>41Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>42<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Va l或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>42Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>43<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>43Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>44<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>44Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>45<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>45Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>46<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>46Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa XaaXaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>47<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>47Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>48<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>48Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>49<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>49Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>50<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>50Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>51<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>51Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>52<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>52Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>53<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>53Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>54<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>54Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20
權(quán)利要求
1.一組合成抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有序列表中所列的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽還包括所述多肽中個別氨基酸的取代、環(huán)化、L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的合成抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽含有(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)的核心結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A1、A1′、A1″為Lys或Arg中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A2、A2′、A2″為Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A3、A3′、A3″為Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A4、A4′、A4″為Lys或Arg中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的核心結(jié)構(gòu)中(A1-A2-A3-A4)的氨基端連接有11個氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的11個氨基酸中第1，3，6，7位氨基酸為Lys或Arg中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的11個氨基酸中第2位氨基酸為Trp或Phe中的一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的11個氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸為Leu、Ile、Ala、Val或Gly中的一種。
12.權(quán)利要求1所述合成抗菌肽的制備方法，其特征在于采用固相化學法合成。
13.權(quán)利要求1所述合成抗菌肽的制備方法，其特征在于將編碼所述抗菌肽的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得所述抗菌肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述合成抗菌肽的制備方法，其特征在于所述的載體是質(zhì)粒或病毒中的一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述合成抗菌肽的制備方法，其特征在于所述的宿主細胞是原核細胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述合成抗菌肽的制備方法，其特征在于所述的宿主細胞是真核細胞，包括酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
17.權(quán)利要求1或2所述合成抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于所述抗菌肽在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一組新的合成抗菌肽，這些合成抗菌肽具有比天然抗菌肽更強的殺菌活性。本發(fā)明合成抗菌肽的制備方法可以是固相化學法或是通過基因工程表達獲得。本發(fā)明合成抗菌肽可以用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌感染引起的疾病的藥物。
文檔編號A61P31/00GK1398897SQ0213676
公開日2003年2月26日 申請日期2002年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月2日
發(fā)明者黃青山 申請人:上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司