專利名稱：6－甲氧基雙脫氧鳥苷在制備抗乙肝藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及6-甲氧基雙脫氧鳥苷的一種新用途，具體說是其用于抗乙肝病毒的用途。
背景技術(shù)：
乙型肝炎作為一種傳染病已被認識了上千年，在引入現(xiàn)代抗病毒療法之前，我國傳統(tǒng)中醫(yī)就采用了黃芪、五味子和柴胡等中藥合劑治療肝炎取得了一定的抗乙肝病毒治療效果。直到今天這些藥物仍在我國廣泛使用。
干擾素作為第一個被廣泛用于治療乙型肝炎的現(xiàn)代西藥，其作用機理為刺激寡聚乙酰合成酶從而抑制病毒蛋白的合成，其它抗乙肝病毒機理主要為增強機體的細胞免疫功能殺傷感染乙肝病毒的肝細胞達到抑制乙肝病毒在肝細胞內(nèi)的復(fù)制的目的。在臨床上申請人觀察到約30-40％長期使用α-干擾素的慢性乙肝患者其乙肝病毒的e抗原轉(zhuǎn)陰，病毒復(fù)制受到控制，但對乙肝患者主要由母嬰垂直傳播感染的我國使用α-干擾素治療效果不太理想。再者干擾素不能經(jīng)口服，需肌肉或皮下注射以及高昂的價格(一個療程需數(shù)萬人民幣)，并常常引發(fā)流感樣癥狀以及骨髓毒性，精神系統(tǒng)紊亂等嚴(yán)重副作用，妨礙了干擾素的廣泛應(yīng)用。
1998年底，美國國家藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了拉米呋丁(葛蘭素制藥廠)用于治療乙型肝炎。這是世界上第一個用于抗乙肝病毒治療的核苷類藥物。該藥的抗病毒機理為滲入到乙肝病毒的正負鏈從而阻斷了病毒的DNA合成，它是抑制病毒復(fù)制的鏈阻滯劑。臨床應(yīng)用上，服用拉米呋丁的乙肝患者其乙肝病毒復(fù)制可得到迅速而明顯的控制，約30％患者的HbeAg轉(zhuǎn)陰，肝功能有明顯好轉(zhuǎn)，但在經(jīng)過約1年左右長期治療后，15-40％的患者體內(nèi)產(chǎn)生了針對拉米呋丁的耐藥突變病毒株。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，這種突變發(fā)生在病毒DNA多聚酶的552氨基酸殘基上由甘氨酸替換了原來的蛋氨酸，并且這種病毒突變株不在對拉米呋丁敏感(IC50升高了約1萬倍)，使其失去了原有的抗乙肝病毒作用，也表明單一使用拉米呋丁治療乙肝患者不能達到徹底清除乙肝病毒的效果。為此，一種能更有效地抑制乙肝病毒復(fù)制且還能抗拉米呋丁耐受突變株的藥物已被人們所期待。
1988年加拿大阿爾伯塔大學(xué)首次報道了2.6二氨嘌呤脫氧核酸(ddDAPR)化合物在乙肝病毒感染的北京鴨的肝細胞實驗中有明顯的抗乙肝病毒作用，其IC500.5um，還發(fā)現(xiàn)在細胞培養(yǎng)18天后，用斑點分子雜交實驗檢查從細胞提取的乙肝病毒DNA已完全消失。
該化合物還被用于肌肉注射10mg/kg每天2次治療感染乙肝病毒的北京鴨，治療2周后，病毒DNA已不能用雜交實驗測到，但停藥后乙肝病毒又回到治療前水平。
該化合物屬于雙脫氧鳥苷(ddG)的前體藥，在人體內(nèi)能迅速脫氨轉(zhuǎn)化成ddG，后者再被細胞內(nèi)的磷酸激酶活化成ddGTP，并推測可能是ddGTP滲入到病毒DNA鏈中從而阻斷病毒復(fù)制，但這個化合物較不穩(wěn)定，且難溶水，口服后生物利用度低。
1996年阿爾伯塔大學(xué)再次報道了ddDAPR抗乙肝病毒復(fù)制是由于其在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成ddGTP，后者能結(jié)合在病毒多末端蛋白物的道轉(zhuǎn)錄復(fù)制的起始端，從而阻斷了DNA的合成，因為在人乙肝病毒和鴨乙肝病毒負鏈DNA第一個被合成的核苷酸便是dGTP，由于ddGTP取代了其位置，從而終止了負鏈DNA的合成。但同時ddGTP也可以象拉米呋丁一樣滲入到正負鏈中，從而阻滯病毒的復(fù)制。
所以找到一個象ddDAPR化合物，但比其更穩(wěn)定，生物利用度更高的雙脫氧鳥嘌呤前體藥物就成為了人們孜孜以求的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是尋找一種既能抗乙肝病毒又能抗耐受拉米呋丁的乙肝病毒突變株的化合物。
為解決上述問題，本發(fā)明通過大量的實驗，發(fā)現(xiàn)有著和ddDAPR類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)的6-甲氧基雙脫氧鳥苷有明顯的抗乙肝病毒的作用。其抗乙肝病毒的機理也是通過在機體內(nèi)脫氨轉(zhuǎn)化成ddG，后者在細胞內(nèi)激活成ddGTP，分享與ddDAPR一樣的抗乙肝病毒的機理。但比ddDAPR更穩(wěn)定，口服后生物利用度更高的雙脫氧鳥嘌呤前體化合物。
實驗表明，6-甲氧基雙脫氧鳥苷單用或者聯(lián)合用藥都可以抗乙肝病毒，且可以防止耐藥株的產(chǎn)生，防止肝癌的產(chǎn)生，是一種即能抗乙肝病毒又能抗耐受拉米呋丁的乙肝病毒突變株的化合物。6-甲氧基雙脫氧鳥苷合成方法已有報道(Robins M.J..等人，J.Org.Chem.1995，60(24)，7902-7908)。以下是該化合物的結(jié)構(gòu)式
具體實施例方式
下面是申請人用6-甲氧基雙脫氧鳥苷在原代鴨肝細胞和北京鴨、土撥鼠乙肝病毒動物模型中的抗病毒作用和細胞毒性所作的部分實驗1、在原代鴨肝細胞中的抗乙肝病毒活性測定選用剛出生10天的先天感染乙肝病毒的北京鴨，取其肝臟并制備出肝細胞，在直徑60mm的培養(yǎng)皿中加入2×106個肝細胞，培養(yǎng)液為L-15營養(yǎng)液并含有5％的牛血清，培養(yǎng)在5％CO237℃的孵箱中，培養(yǎng)第二天后在加入不同濃度的試驗化合物于培養(yǎng)皿中，使其最后濃度為0，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml。每兩天換培養(yǎng)液和試驗藥物直到16天。然后加入細胞裂解液于培養(yǎng)皿中裂解細胞，并加入200ug/mlprotenase K繼續(xù)孵育1個半小時，加入同體積的飽和酚和氯仿提取DNA，最后溶解于TE緩沖液中DNA樣本被點在尼龍膜上(Hybond-N，Amersham)，經(jīng)變性、中和以及紫外線照射后與32P標(biāo)記的鴨乙肝病毒DNA探針雜交，洗滌涼干、壓片沖洗后即可讀出結(jié)果，分析出所試化合物的抗乙肝病毒的IC50。
該化合物鴨乙肝原代細胞的抗乙肝病毒IC50為0.3um稍好于ddDAPR，后者為IC500.5um。
2、在原代鴨乙肝細胞和人體髓樣白血病細胞(HL-60)的細胞毒性測定申請人用MTT當(dāng)今最常用的測定細胞毒性的實驗來測定該化合物在原代鴨乙肝細胞和人體髓樣白血病(HL-60)的細胞毒性。
簡言之，申請人選用10天大小的北京鴨，取其肝臟、分離出單個肝細胞懸浮于L-15培養(yǎng)液中，經(jīng)計數(shù)后，置于96孔板的細胞培養(yǎng)板中，每孔含有8×103細胞，培養(yǎng)在有5％CO2的37℃孵箱中，培養(yǎng)第二天后，開始加入不同稀釋度的試驗化合物，培養(yǎng)48小時后，加入MTT試劑后再繼續(xù)培養(yǎng)2小時，離心培養(yǎng)板取出上清液再加入，每小時96孔培養(yǎng)板在540nm用分光光度計讀出其光密度值(OD)。
細胞的存活度可由不同濃度的化合物OD值/540nm/對照的OD值540nm來計算，最后再算出TC50，實驗結(jié)果表明該化合物的TC50在鴨乙肝原代細胞中為500um但在人體髓樣白血病(HL-60)的TC50為3000um，該化合物的藥物選擇指數(shù)為TC50/IC50＝500/0.3＝1667，再次表明這是一個有效且非常安全的抗乙肝病毒的化合物。
3、為了比較該化合物和拉米呋丁這兩種作用機理不同的化合物在抗乙肝病毒中的作用以及探討聯(lián)合用藥的效果，申請人分別在土撥鼠和北京鴨動物模型進行了分組治療。
本實驗共用了年齡為一周年的已感染乙肝病毒的土撥鼠12只。每組3只，分別為拉米呋丁治療組(30mg/kg)、該化合物治療組(20mg/kg)及聯(lián)合用藥組(20mg/kg拉米呋丁加20mg/kg該化合物)以及磷酸緩沖液對照組，每天肌肉注射兩次共60周。
血清采樣分別為治療前一周、開始治療當(dāng)日、治療后一周、第4周，以后為每4周一次直到60周。
北京鴨為出生1月大小的已感染鴨乙肝病毒的北京鴨12只，區(qū)組治療同土撥鼠一樣，每天肌肉注射2次共治療60周。血液采樣分別為治療前一周，開始治療當(dāng)時、治療后一周第2周，以后為每2周一次，直到60周。
此外，申請人還對北京鴨進行了肝活檢、分別在治療前，治療后4周、12周、36周、60周。
血清標(biāo)本分別用來作斑點分子雜交試驗，PCR、AST、ALT、α-AFP，白蛋白和膽紅素的分析。肝穿組織分別用來做CCC-DNA以及乙肝病毒中間復(fù)合體檢查和免疫組化查乙肝病毒核心抗原。
在土撥鼠動物模型治療中，經(jīng)過4-8周的治療后。在拉米呋丁組，該化合物組以及聯(lián)合用藥組用斑點雜交試驗已不能測到病毒，而聯(lián)合用藥組到2周后病毒已幾乎消失，但用PCR檢查，除一只聯(lián)合用藥組的土撥鼠沒能測到病毒外，均還能查到病毒DNA。治療20周后在一只拉米呋丁治療組的土撥鼠中查到了曾經(jīng)一度消失的病毒DNA，與此同時在該土撥鼠中查到了混合的野毒株和拉米呋丁耐藥突變株。
相較于對照組，肝內(nèi)WHVCCC-DNA大致出現(xiàn)了3-5倍的下降，但直到治療60周后仍不能徹底的消除。
另一個有趣的發(fā)現(xiàn)是聯(lián)合用藥組所有3只土撥鼠均沒有發(fā)生肝癌，而安慰對照組以及拉米呋丁組該化合物組則分別有2只和1只土撥鼠出現(xiàn)肝癌跡象，如食欲下降、消瘦和活動減少、血液檢查L-AFP升高。在對照組60周治療結(jié)束后有兩只土撥鼠死于肝癌，總之，在對土撥鼠各組治療當(dāng)中，盡管病毒受到明顯的抑制，但都沒能徹底消除，然而，在聯(lián)合用藥組或該化合物組還沒有發(fā)現(xiàn)耐藥突變株的產(chǎn)生，并且因能長期控制病毒的復(fù)制而能防止或延緩肝癌的發(fā)生。
在整個60周的治療期間，除了土撥鼠冬眠所造成的體重減輕和治療后期個別土撥鼠發(fā)生肝癌所出現(xiàn)的食欲下降、消瘦外，均沒有發(fā)現(xiàn)別的異常表現(xiàn)，如跋腿、脫毛、體重減輕、食欲下降等嚴(yán)重副作用。在北京鴨的治療組中，僅一周的治療，該化合物和聯(lián)合用藥組，乙肝病毒DNA用雜交試驗已不能測到，但拉米呋丁組卻治療2周后才達到同樣的結(jié)果，治療8周后，大多數(shù)治療組的鴨子病毒DNA已不能用第一輪PCR測到，但卻仍能在第二輪PCR查到，但只有一只在聯(lián)合用藥組中的鴨子病毒DNA已徹底消失，無論用何種方法檢測均不能查到。在肝穿組織的免疫組織分析中，發(fā)現(xiàn)各治療組乙肝病毒核心抗原明顯下降，在長期的聯(lián)合治療組的個別鴨子其它已測不到病毒抗原在肝組織的存在。與土撥鼠治療組不同，所有北京鴨治療組均沒有發(fā)現(xiàn)耐受突變株的產(chǎn)生，這主要和北京鴨本身缺乏免疫反應(yīng)功能，不能對鴨子乙肝病毒產(chǎn)生壓力所致。
在對鴨肝組織病毒CCC-DNA的檢查中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)免疫的CCC-DNA下降幾乎出現(xiàn)在所有治療組中，尤其在聯(lián)合治療組中下降更為明顯，但卻長期存在。
盡管該化合物還不能從根本上徹底清除乙肝病毒，但申請人發(fā)現(xiàn)與拉米呋丁聯(lián)合用藥已有徹底清除乙肝病毒的可能性。整個60周的治療期和對照組相比，均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用如體重下降、跋腳、脫毛、食欲下降等。
4、對拉米呋丁耐藥突變株的抗病毒試驗。
自從拉米呋丁進入抗乙肝病毒的臨床試驗后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療一年后大約30％的試驗病人產(chǎn)生耐藥突變病毒株主要為M512V突變株，使拉米呋丁失去了繼續(xù)抗病毒的能力。
1996年加拿大阿爾伯塔大學(xué)首先用體外定點突變的辦法，構(gòu)建了鴨乙肝病毒M512V拉米呋丁耐受突變株，并成功的感染了LMH細胞(雞頸淋巴瘤細胞)。此外，申請人又用這種在LMH細胞中產(chǎn)生的M512V突變株成功感染了北京鴨并建立了拉米呋丁耐受突變株北京鴨動物模型并在此動物模型上試驗了該新型抗病毒化合物。
本實驗申請人選用了四只成功感染了拉米呋丁耐突變株的北京鴨。2只為拉米呋丁治療組，2只為拉米呋丁和該化合物的聯(lián)合用藥組。
血清標(biāo)本采集為治療前一周，治療開始當(dāng)日，第一周、第二周、第四周、第8周，用于斑點雜交試驗和Saunthecn DNA的雜交斑點，申請人也在治療前后測定了血中病毒DNA序列，確定其是M512V突變株。申請人發(fā)現(xiàn)在拉米呋丁組，病毒DNA在8周治療后維持不變，但聯(lián)合用藥組僅在治療第一周用斑點雜交試驗已不能測到病毒DNA，這表明對拉米呋丁耐突變株對該化合物仍象野毒株一樣敏感，但仍然維持對拉米呋丁的耐受。也象申請人提示如與拉米呋丁抗病毒機理不同的化合物聯(lián)合用藥可能會達到抑制病毒甚至徹底清除病毒的作用，并且能防止耐藥突變株的產(chǎn)生。
權(quán)利要求
1.6-甲氧基雙脫氧鳥苷在制備抗乙肝藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及6－甲氧基雙脫氧鳥苷在制備抗乙肝藥物中的應(yīng)用。實驗表明，6－甲氧基雙脫氧鳥苷單用或者聯(lián)合用藥都可以抗乙肝病毒，且可以防止耐藥株的產(chǎn)生，防止肝癌的產(chǎn)生，是一種既能抗乙肝病毒又能抗耐受拉米呋丁的乙肝病毒突變株的化合物。
文檔編號A61P31/00GK1493301SQ02138510
公開日2004年5月5日 申請日期2002年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月29日
發(fā)明者劉曉宇, 李戰(zhàn), 黃海燕, 陳靜 申請人:劉曉宇, 南京長澳醫(yī)藥科技有限公司