專利名稱：食管癌相關基因nmes1及其編碼多肽的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及食管癌相關基因NMES1。更具體地說，本發(fā)明涉及食管癌相關基因NMES1及其編碼多肽在消化道腫瘤預防和/或治療中的用途，以及包含該基因或蛋白質的藥物組合物。
背景技術：
食管癌是世界上頻發(fā)的10種惡性腫瘤之一，每年的新病例數(shù)超過300,000。我國是食管癌高發(fā)區(qū)，世界上70％的食管癌病例發(fā)生在我國。由于晚期就診及治療效果差，食管癌的死亡率與發(fā)病率極為相似，五年生存率低于10％。而要想提高食管癌長期生存率，降低發(fā)病率，在很大程度上將依賴于對其病因與癌變分子機理的進一步認識。
引發(fā)腫瘤的分子基礎是一系列基因的結構改變和/或表達異常。利用分子生物學技術，從分子水平認識疾病的病理根源是發(fā)現(xiàn)或提供這些疾病的有效治療方法的有利途徑。由于現(xiàn)有技術中還有大量疾病沒有找到有效的治療方法，包括大部分癌癥，因此迫切需要找到與這些疾病的病因相關的基因，特別是那些與這些疾病呈負相關、可能用于這些疾病的治療的基因。
因此，本領域仍然需要新的消化道腫瘤，尤其是食管癌的治療方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明出乎意料地發(fā)現(xiàn)，食管癌相關基因NMES1及其編碼多肽在消化道腫瘤的預防和/或治療中具有有益效果。
因此，本發(fā)明一方面涉及一種消化道腫瘤預防和/或治療方法，該方法包括對患者施用NMES1基因或其編碼多肽。在該方法中，還可以任選地組合施用一種或多種其它化學治療劑和/或放療。
本發(fā)明另一方面涉及NMES1基因或其編碼多肽在制備可用于消化道腫瘤預防和/或治療的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及包含NMES1基因或其編碼多肽以及藥學可接受載體的藥物組合物。
在本發(fā)明內容中，NMES1基因與NMES1多核苷酸同義，包括(1)編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其同源序列或部分的NMES1多肽的多核苷酸；(2)在中等嚴謹條件下能與(1)所述的多核苷酸雜交并與其有至少70％一致性的多核苷酸；和(3)包含(1)或(2)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
本發(fā)明的NMES1多核苷酸包括mRNA、DNA、cDNA和基因組DNA.
本發(fā)明的多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。DNA可以是雙鏈或者單鏈的，單鏈也可以是編碼鏈或者非編碼(反義)鏈。該多核苷酸可以具有與SEQID NO1所示核苷酸序列相同的序列，或者可以是一個不同的編碼序列，但由于遺傳密碼的冗余或簡并性，而編碼具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的NMES1多核苷酸可以包括僅僅是成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和任意的另外編碼序列及非編碼序列，例如內含子或成熟多肽編碼序列的5′端和/或3′端非編碼序列。
由此，術語“多肽的編碼多核苷酸”包括僅含有該多肽編碼序列的多核苷酸，也包括含有額外編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明的NMES1多核苷酸還包括上面所描述的多核苷酸的各種變體，它們編碼含有SEQ ID NO2所示推定氨基酸序列的多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸變體可以是天然存在的等位基因變體或非天然存在的多核苷酸變體。這些多核苷酸變體包括缺失變體、置換變體，添加變體或插入變體，其中發(fā)生了一個或多個核苷酸的取代、缺失，插入或添加式，但基本上并不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明進一步涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，這兩個序列間有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，至少85％，至少90％，甚至至少95％，最優(yōu)選至少97％的一致性。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。這里所用的術語“嚴格條件”意味著兩個序列之間有95％，優(yōu)選至少97％一致性才能發(fā)生雜交。在一優(yōu)選的實施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽基本保持了與具有SEQ ID NO2所示序列的多肽相同的生物學功能或活性。
在本發(fā)明內容中，NMES1多肽是選自下組的多肽(1)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；(2)包含與SEQ ID NO2所述氨基酸序列同源的氨基酸序列的多肽；或(3)(1)或(2)所述多肽的功能活性片段、變體，類似物和衍生物，它們具有與(1)或(2)所述多肽基本相同的生物學功能或活性。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。
具有SEQ ID NO2所示序列或其同源序列的多肽的片段、變體、衍生物和類似物可以是一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基所取代(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)，取代的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸；一個或多個氨基酸殘基帶有取代基團；成熟多肽與另一化合物融合在一起；一個或多個另外的氨基酸與成熟多肽相融合，諸如幫助純化成熟蛋白的序列或蛋白原序列；在一端或兩端或內部插入和/或添加和/或缺失一個或多個氨基酸。從這些公開內容看，這樣的片段、衍生物和類似物相信處于本領域技術人員的知識范圍內。
在一個實施方案中，本發(fā)明所述多肽包含與SEQ ID NO2所示序列至少70％同源的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述多肽包含與SEQ ID NO2所示序列至少75％同源的氨基酸序列。在又一個實施方案中，本發(fā)明所述多肽包含與SEQ ID NO2所示序列至少80％同源的氨基酸序列。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述多肽包含與SEQ ID NO2所示序列至少85％同源的氨基酸序列。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述多肽包含與SEQ ID NO2所示序列至少90％，至少95％，至少97％同源的氨基酸序列，也包括這些多肽的N和/C端和/或內部缺失變體。
如本領域所知，兩個多肽的同源性是通過比較一個多肽與另一多肽的氨基酸序列而確定的。
本發(fā)明的NMES1多肽或多核苷酸可以用于預防和/或治療消化道腫瘤。在一個實施方案中，所述消化道腫瘤是食管癌。在另一個實施方案中，所述消化道腫瘤是直腸癌。在又一個實施方案中，所述消化道腫瘤是結腸癌。在還有一個實施方案中，所述消化道腫瘤是小腸癌。
藥物組合物可將本發(fā)明的NMES1多肽或多核苷酸與適當?shù)乃幱幂d體聯(lián)合使用以制成藥物組合物，用于治療動物，特別是哺乳動物(如猿、牛、馬、豬、野豬(boar)、綿羊、嚙齒動物、山羊、狗、貓、雞、猴、兔、雪貂、鯨和海豚)，尤其是人。這種組合物含有治療有效量的NMES1多肽或多核苷酸和藥學可接受的載體或賦形劑。所述載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽溶液，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其聯(lián)合。制劑應適合施用的模式。
另外，也可將本發(fā)明的NMES1多肽或多核苷酸與其它治療性的化合物一起使用。
具有NMES1活性的多肽可在藥物組合物中與一種或多種藥學可接受的賦形劑聯(lián)合施用。應理解當施用于人患者時，護理醫(yī)生在正確的醫(yī)學判斷范圍內可決定本發(fā)明藥物組合物每天的總用量。任何具體患者的特定治療有效劑量水平取決于多種因素，包括欲達到的反應的類型和程度，所用其它藥劑的特殊組合(如果有的話)；患者的年齡，體重，健康狀況，性別和飲食；施用的時間，施用的途徑和組合物外泌的速率；治療的期限；與特定組合物聯(lián)合或同時使用的藥物(如化學治療劑)；和醫(yī)學領域眾所周知的其它因素。本領域已知的適當制劑見于Remington’sPharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
考慮到各個患者的臨床條件，NMES1組合物釋放的位點，施用的方法，施用的計劃和實際操作人員已知的其它因素，以與良好的醫(yī)學實踐一致的方式配制和服用治療所用的NMES1組合物。因此，通過上述考慮可確定用于本文目的的“有效量”的NMES1(包括NMES1有效量)。
可以按方便的方式，例如以口服、局部、靜膜內、腹膜內、肌肉內、動脈內、皮下或皮內等途徑給藥。在大多數(shù)情況下，NMES1多肽或多核苷酸的劑量為每天大約1μg/kg體重至30mg/kg體重，并考慮到給藥途徑、病情等。但劑量可低至0.001μg/kg。
在一個實施方案中，用于腎腸道外給藥的NMES1多肽或多核苷酸一般是將其以所需純度，按可注射單位劑型與醫(yī)藥可接受的(即在所用劑量和濃度下對接受者是無毒的，并且是與配方的其他成分相容的)載體相混合而配制的。例如，配方中最好不含有已知對多肽有害的化合物。
通常通過將NMES1均勻和密切地與液體載體或精細分開的固體載體或這兩者接觸而制備制劑。然后，如有必要，將產物制成所需的制劑形狀。優(yōu)選載體是胃腸外載體，更優(yōu)選為與受體血液等滲的溶液。這種載體的例子包括水，鹽水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。如固定油和油酸乙酯之類的不含水的載體以及脂質體在本文中也是有用的。本領域中已知的適當?shù)闹苿┮娪赗emington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
載體可適當?shù)睾袠O少量的添加劑，如增強等滲性和化學穩(wěn)定性的物質。這種物質在所用劑量和濃度下對受體是無毒性的，包括如磷酸鹽，檸檬酸鹽，琥珀酸，乙酸，和其它有機酸或其鹽的緩沖液；如抗壞血酸之類的抗氧化劑；低分子量(少于約10個殘基)的多肽，如多精氨酸或三肽；蛋白質，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；單糖，二糖和包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精等的其它碳水化合物；如EDTA之類的螯合劑；如甘露醇或山梨醇之類的糖醇；如鈉之類的抗衡離子；和/或非離子型表面活性劑，如聚山梨酯，聚羥亞烴或PEG。
通常，NMES1可作為含水溶液或用于恢復的凍干制劑形式儲存在單位劑量或多劑量的容器中，例如，密閉的安瓿瓶或小瓶中。凍干制劑的一個例子是將5ml經除菌過濾的1％(w/v)含水NMES1溶液灌入10ml的小瓶，將所得混合物凍干。通過使用抑菌的注射用水恢復凍干的NMES1可制備灌注溶液。
“藥學可接受的載體”是指無毒性的固體，半固體或液體填充劑，稀釋劑，包裹材料或任何形式的制劑輔助物。本文所用的術語“胃腸外”指的是包括靜脈內，肌內，腹膜內，胸骨內，皮下和動脈內注射和灌注等的施用模式。
基因治療可以體內表達多肽，以所謂“基因治療”方式利用本發(fā)明的NMES1多肽?；蛑委煼椒ㄉ婕皩⒕幋aNMES1多肽的核酸序列導入動物體內，以實現(xiàn)NMES1多肽的表達。這樣的基因治療和輸送技術是已知的(如參見WO90/11092，將其引入本文作為參考)。
因此，例如可在體外用包括可操作連接了啟動子的NMES1多核苷酸的多核苷酸(DNA或RNA)工程化改造來自體內的病人細胞，然后為需要用NMES1多肽治療的病人提供此工程化細胞。這樣的方法是本領域已知的(例如參見Belldegrun，A.et al.，J.Natl.Cancer Inst.85207-216(1993))。
同樣，可按已知方法體內工程化改造細胞，以使體內表達治療性多肽?？捎萌魏我环N能將構建體之類物質送遞到動物細胞內的方法送遞構建體，例如注射到組織的胞間隙中?？蓪嫿w加在已知的藥用液體或含水載體中送遞。
在某些實施方案中，NMES1多核苷酸可作為裸多核苷酸被送遞?！奥恪倍嗪塑账崾侵覆缓蓭椭?、促進或有利于進入細胞的任何送遞載體的多核苷酸；包括病毒序列、病毒顆粒、脂質體配方、細胞轉染劑、沉淀劑等。這些方法是本領域已知的(如參見美國專利5,593,972、5,589,466和5,580,859)。
用于本發(fā)明的裸多核苷酸可以是不整合到宿主細胞的基因組中的多核苷酸。其可以是非復制序列，或工程化改造后失去基因組整合能力的特殊復制序列。或者，用于本發(fā)明的裸多核苷酸可以通過同源重組整合到宿主細胞的基因組中(詳見下文)。裸NMES1多核苷酸構建體最好包含在質粒中。適用的表達載體包括但不只限于pRSVcat(ATCC 37152)、pSVL和MSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。其他適用的質粒如上文所述。
如上所述，裸多核苷酸可投用于任何組織或器官。在另一個實施方案中，將裸多核苷酸投用于來源組織的組織周圍。在另一個實施方案中，通過靜脈內注射將裸多核苷酸全身投用。
可用已知方法送遞裸多核苷酸，這些方法包括但不只限于直接在送遞位點用針注射、靜脈內注射(特別是門靜脈注射)、局部投用、導管輸注及使用所謂“基因槍”。這些送遞方法是本領域已知的并在下文中詳細討論。
本領域普通技術人員可根據(jù)待治療的狀況和給藥途徑很容易地確定多核苷酸構建體的適當和有效劑量。
也可使用病毒序列、病毒顆粒、脂質體配方、脂轉染體、沉淀劑等送遞載體投用構建體。這此送遞方法是本領域已知的。例如，可通過Wuet al.，J.Biol.Chem.2646985-16987(1989)中所述的方法向靶細胞送遞多核苷酸構建體。
在某些實施方案中，于體內或離體方式使用含有RNA的反轉錄病毒顆粒工程化改造細胞，所說的RNA含有與啟動子可操作連接的編碼NMES1的多核苷酸?？捎芍苌崔D錄病毒質粒載體的反轉錄病毒包括但不只限于Moloney鼠白血病病毒、脾壞死病毒、Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳癌病毒。
用反轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系以形成生產細胞系?？杀晦D染的包裝細胞包括但不只限于PE501、PA317、φ-2、φ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、φCRE、φCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和Miller(Haman Gene Therapy 15-14，1990)所述的DNA細胞系。載體可通過任何已知方法來轉導包裝細胞。這些方法包括但不只限于電穿孔、使用脂質體和CaPO4沉淀。另外，亦可將反轉錄病毒質粒載體包裹到脂質體中，或偶聯(lián)到脂質上，然后投用于宿主。
生產細胞系產生其中包括對可操作連接了啟動子之NMES1多核苷酸的反轉錄病毒載體顆粒。然后可利用這樣的反轉錄病毒載體顆粒于體外或體內轉導真核細胞。被轉導的真核細胞將表達所需的多肽。
在某些其他實施方案中，使用包含在腺病毒載體中的與啟動子可操作地連接的NMES1多核苷酸于體內或離體工程化改造細胞?？杉庸は俨《臼怪幋a并表達所需的基因產物，同時它被失活以失去其在正常裂解的病毒生命周期中復制的能力。在病毒DNA沒有整合到宿主細胞染色體內的情況下實現(xiàn)腺病毒表達，從而減少插入突變的機會。
用于本發(fā)明的腺病毒最好是復制缺陷型的。復制缺陷型腺病毒需要借助于輔助病毒和/或包裝細胞以形成感染性顆粒。所得到的病毒能夠感染細胞并可表達可操作地連接到啟動子上的有用多核苷酸(例如本發(fā)明的NMES1多核苷酸)，但不能在大多數(shù)細胞中復制。
在某些其他實施方案中，使用腺伴隨病毒(AAV)在體內或離體工程化改造細胞。AAV是天然存在的有缺陷病毒，其需要輔助病毒幫助產生感染性顆粒(Muzyczka，N.，Curr.Topics in Microbiol.Immunol.15887，1992)。該病毒還是少數(shù)幾種可將其DNA整合到非分裂細胞中的病毒之一。可以包裝并可整合含有少至AAV的300個堿基對的載體，但容納外源DNA的空間限于約4.5Kb。生產和使用這種AAV的方法是本領域已知的(如參見美國專利5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377)。
例如，用于本發(fā)明的適當?shù)腁AV載體將包括DNA復制、包殼和宿主細胞整合所必須的所有序列。使用標準克隆方法(如參見Sambrook etal.，Molecular CloringA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor PreSs，1989)將NMES1多核苷酸構建體插入到AAV載體中。然后使用脂轉染、電穿孔、磷酸鈣沉淀等標準技術，將重組AAV載體轉染到被輔助病毒感染的包裝細胞中。適用的輔助病毒包括腺病毒、巨細胞病毒、痘苗病毒或皰疹病毒。一旦包裝細胞被轉染和感染，它們將產生含有NMES1多核苷酸構建體的感染性AAV病毒顆粒。然后用這些病毒顆粒以離體方式或于體內轉導真核細胞。被轉導的細胞將含有整合到其基因組中的NMES1多核苷酸構建體，并將表達有用的分子。
基因治療的另一種方法包括通過同源重組(如參見美國專利No.5,641,670(1997年6月24日)、國際公開WO96/29411(1996年9月26日公開)、國際公開WO94/12650(1994年8月4日公開)、Koller et al.，PNASUSA 868932-8935(1989)和Zijlstra et al.，Nature 342435-438(1989))可操作地連接異源性控制區(qū)(如啟動子)和內源性多核苷酸序列(如NMES1)。該方法包括激活存在于靶細胞中但不能在其中正常表達或以較預期更低的水平表達的基因。
使用本領域已知的標準方法制備多核苷酸構建體，其含有有用的啟動子并且啟動子的側翼接有導向序列。導向序列與內源序列互補程度足以使啟動子-導向序列與內源序列進行同源重組。導向序列距所需的內源性核苷酸序列的5′足夠地近，以致在同源重組后該啟動子能與內源序列可操作連接。
作為裸多核苷酸，或與轉染促進劑如上文詳述的脂質體、病毒序列、病毒顆粒、完整病毒、脂轉染體、沉淀劑聯(lián)合，將啟動子-導向序列構建體送遞到細胞內?？捎糜谒瓦f啟動子-導向序列的方法包括直接針頭注射、靜脈內注射、局部投用、導管輸注、使用顆粒加速器等。下文詳細描述這些方法。
啟動子-導向序列構建體被細胞攝入，發(fā)生構建體和內源序列之間的同源重組，以使內源序列(如NMES1)處于該啟動子的控制之下。然后啟動子驅動內源序列(如NMES1)的表達。
可將本發(fā)明的NMES1多核苷酸用于基因治療，以治療本文所述的消化道腫瘤。最好本發(fā)明的NMES1多核苷酸可操作地連接到啟動子上，以便緩解本文所述待治療疾病的癥狀或治愈疾病。
只要使上述多核苷酸構建體的一個或多個分子以足可提供治療效果的量表達，其任何給藥方式均可使用。所說的給藥方式包括直接針頭注射、全身注射、導管輸注、biolistic噴射器、顆粒加速器(即“基因槍”)、凝膠泡沫海綿存儲物、其他市售存儲材料、滲透泵(如Alza小型泵)、口服或栓劑固體(片劑或丸劑)藥物配方，以及手術期間使用的移注或局部應用法。優(yōu)選的局部給藥方法是直接注射。
可依據(jù)許多因素來確定待送遞之物質的有效量，這些因素包括物質的化學結構和生物學活性、動物的年齡和體重、需要治療的確切狀況和其嚴重程度，以及給藥途徑。治療的用藥頻率取決于每劑投用的多核苷酸構建體的量及個體的健康狀況及病史等許多因素。由臨床醫(yī)生或獸醫(yī)來確定精確用量、給藥次數(shù)及療程。
本發(fā)明的治療組合物可投用于任何動物，特別是哺乳動物和鳥類。優(yōu)選的哺乳動物包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛、馬和豬，特別是人。
本發(fā)明將在下面的實施例中進一步描述。但并不限于這些實施例。所有的份和量，除非另有說明都按重量計算。
為便于理解下面的實施例，先解釋一些經常出現(xiàn)的方法和/或術語。
“質?！钡拿靡恍懙膒，在前面和/或后面接大寫的字母和/或數(shù)字。起始質粒可從商業(yè)獲得，也可在不受限制的基礎上公開獲得，或者按已公布的方法從可獲得的質粒構建。另外，所描述質粒的等價質在本領域中已知，對于一般的技術人員來說是很清楚的。
“寡核苷酸”指能化學合成的單鏈多脫氧核糖核苷酸或兩條互補的多脫氧核糖核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不含有5’端磷酸，所以如果沒有在激酶作用下用ATP加上一個磷酸，它就不能與一個寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有被脫磷酸化的片段連接。
“連接”指在兩個雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程。除非提供了別的方法，連接可以在已知的緩沖液和條件下進行，即每0.5mg約等摩爾量的用于連接的DNA片段加10個單位的T4連接酶。
除非另有說明，轉化均用Graham & Van der EbVirology 1973中所描述的方法進行。


圖1是顯示NMES1在食管癌和正常組織中差異表達的Northern雜交。
圖2顯示NMES1在16種成人組織中主要在消化系統(tǒng)中表達。
圖3是食管癌和正常組織中NMES1的RT-PCR分析結果。
圖4是NMES1真核重組表達質粒pcDNA3.1-NMES1的示意圖。
圖5是pcDNA3.1-NMES1所轉化細胞的生長曲線。
圖6是轉染-NMES1(左圖)或空載體pcDNA3.1(右圖)的食管癌細胞的形態(tài)照片。
圖7是經RT-PCR檢測pcDNA3.1-NMES1轉化克隆中NMES1基因表達狀況的結果圖，以GAPDH作為陽性對照。
具體實施例方式
實施例1NMES1基因全長的獲得及鑒定用Trizol試劑(Life Technologies，USA)按說明書分別提取手術切除的食管癌標本及切端正常組織標本(病理切片證實無癌細胞)的總RNA，用無RNase活性的DNase消化以去除殘留的基因組DNA。1.2％瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA質量。紫外分光光度儀定量后，應用SmartcDNA Synthesis System試劑盒(Clontech)，以1μg總RNA為模板，按照試劑盒操作手冊oligol(dT)引物合成cDNA第一鏈，應用AdvantagePCR試劑盒(Clontech)以及引物FP1(5′GGTTCAAATGTATTTTTCTCCCAT 3′，SEQ ID NO3)和RP1(5′TTTGGGCTCTGGATAAGGAAT 3′，SEQ ID NO4)擴增雙鏈cDNA。以正常組織的cDNA為受檢者，癌組織的cDNA為驅動者，應用PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit(Clontech)，進行抑制消減雜交(Suppressionsubtractive hybridization，SSH)，操作按說明書進行。但在第二次選擇性擴增時用以5′末端帶有SalI識別位點的2R+(5′ttgtcgacagcgtggtcgcggccgaggt3′，SEQ ID NO5)代替2R oligo。所有PCR產物以限制性內切酶NotI、SalI消化消化產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下大于300bp的凝膠條帶，以QIAEXII DNA純化試劑盒回收純化，操作按試劑盒說明書進行。將純化物克隆入經NotI、SalI消化的pBluescript SK(-)質粒載體上。每一質?？寺U增插入片段，按常規(guī)反Northern方法篩選出差異表達片段，并用標準Northern印跡法和半定量RT-PCR法檢測配對食管癌組織中此片段的差異表達狀況。用SMARTTM RACE system(Clontech)及基因特異性引物15GSP1(5′tgcagttattgctgcactcctttaattc3′，SEQ ID NO6)15GSP2(5′tgtcgactgtagcagaagcagttccgcac3′，SEQ ID NO7)擴增相應的5′cDNA末端，PCR產物經瓊脂糖電泳分離，紫外光下切下cDNA帶，用QiagexII試劑盒回收cDNA，并克隆到pGEM-T Easy(Promega)載體上，測序鑒定。應用end-to-end PCR技術及引物15FULF(5′GTCCAGGTGAGTCTCCCATCT 3′，SEQ ID NO8)和15FULR(5′TATACCTAATCTTTGAGAAATCTTGCA 3′，SEQ ID NO9)擴增NMES1基因的cDNA全長并將其克隆到pGEM-T Easy載體上從而獲得全長NMES1的cDNA克隆。
實施例2 NMES1基因的Northern印記和RT-PCR分析以克隆的NMES1 3′端序列為探針，用Primer-a-Gene隨機引物標記試劑盒，α-32P-dATP/dCTP對探針進行標記。將食管癌和切斷正常組織RNA轉移至尼龍膜并固定，用標記的探針與之進行常規(guī)Northern雜交，并以β-肌動蛋白作為對照。結果表明，NMES1基因在全部8例正常組織中高表達，而在對應的正常組織中表達缺失或明顯降低，說明所克隆的NMES1 cDNA片段確實為差異表達，結果見圖1。
用Human Adult Normal Tissue Total RNA Northern BlotI，II(Biochain，Hayward，CA)如上進行雜交，并以β-肌動蛋白作為對照，其中泳道1-16分別是心、腦、腎、肝、肺、胰、脾、肌肉、食管、胃、小腸、結腸、子宮、胎盤、膀胱、脂肪組織。結果顯示NMES1在16種成人組織中主要在消化系統(tǒng)中表達，見圖2。
按照NMES1 3′端序列合成下列引物FP2(5‘GGTTCAAATGTATTTTTCTCCCAT3’，SEQ ID NO10)和RP2(5’TTTGGGCTCTGGATAAGGAAT3，SEQ ID NO11)，對8對人配對食管癌和正常組織進行RT-PCR分析并以β-肌動蛋白作為對照。RT-PCR分析結果見圖3。圖中上邊一行代表β-肌動蛋白對照，下邊一行代表NMES1。 N代表正常組織，C代表食管癌組織。圖3可看出，NMES1基因在正常組織標本中均有表達，而在大多數(shù)食管癌標本中表達降低甚至沒有。由此推定NMES1是與消化道癌發(fā)生相關，且在消化道癌中下調的基因。
實施例3 pcDNA3.1-NMES1真核表達質粒的構建以正常人第一鏈cDNA為模板，如下建立PCR反應體系，在50μl體積中含39μl水，5μl 10xAdvantage2 PCR反應緩沖液，1.0μl 50xdNTP混合液，2.0μl正常成人食管cDNA，15EXTF(5′TTTGGATCCATTTGGCAATTCTTCGCT 3′，SEQ ID NO12)和15EXTR(5′TTTCTCGACAAAGAGGCGAGGGCT 3′，SEQ ID NO13)引物(10μM)分別1.0μl，1.0μl 50xAdvantage2 PolymeraseMIX，混合后，于9600PCR系統(tǒng)(PE)中進行PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為94℃預變性30秒，94℃變性5秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共進行30個循環(huán)。PCR產物經酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，重溶于25μl去離子水中，用BamHI和XhoI酶切，凝膠電泳分離，紫外燈下切下cDNA片段，用QiagexII試劑盒回收cDNA。pcDNA3.1(+)質粒也用上述兩種酶消化，如前電泳分離，回收純化。取50ng純化物與200ng經消化的pcDNA3.1(+)質粒載體在10μl反應體系中，在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜。按常規(guī)方法轉化，挑出陽性克隆，并進行PCR及酶切鑒定后，送大連寶生物公司測序。從而獲得NMES1基因的真核表達質粒pcDNA3.1-NMES1，參見圖4。
實施例4 pcDNA3.1-NMES1轉染人食管癌細胞系并對其生長的影響(1)細胞轉雜在25cm2培養(yǎng)瓶中接種食管癌細胞系EC9706，用M199(Gibco)培養(yǎng)液(含15％小牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素)培養(yǎng)。用Lipofectamine(Gibco)進行細胞轉染，操作按所附說明書進行。轉染48小時后，用含200μg/ml新霉素(G418，Gibco)的上述M199培養(yǎng)液，進行篩選，常規(guī)換液至克隆形成，并以空白載體pcDNA 3.1進行轉染作為對照。
(2)生長曲線繪制接種105個轉染細胞于24孔板，在選擇培養(yǎng)基(含200μg/ml新霉素的M199培養(yǎng)液)中常規(guī)培養(yǎng)，每隔一天消化收集細胞，顯微鏡下計數(shù)，由此繪制各克隆細胞的生長曲線。如圖5和6所示，與轉染空載體pcDNA3.1的細胞對照相比，轉染pcDNA3.1-NMES1的食管癌細胞生長速度減慢，且細胞形態(tài)發(fā)生改變。
(3)經RT-PCR分析轉染細胞中NMES1基因的表達培養(yǎng)克隆細胞至70％至80％鋪滿，用Trizol試劑提取總RNA，按SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑說明書進行cDNA第一鏈合成，然后以NMES1的基因特異性引物15EXTF(5′TTTGGATCCATTTGGCAATTCTTCGCT 3′，SEQ IDNO12)、15EXTR(5′TTTCTCGACAAAGAGGCGAGGGCT 3′，SEQ IDNO13)進行RT-PCR分析(條件同前)，檢測各陽性克隆中NMES1基因的表達狀況。從圖7中可看到在轉染空載體pcDNA3.1的對照組細胞中無NMES1基因的表達(泳道1)，而在轉染pcDNA3.1-NMES1所得陽性克隆中均有NMES1基因的表達(泳道2-9，各編號與圖5中的生長曲線序列號一致)。
以上結果說明，NMES1多肽和多核苷酸能夠抑制食管癌細胞的生長，并使其形態(tài)改變。
上文以例示的方式描述了本發(fā)明。但根據(jù)上面的講授，本領域普通技術人員可以對本發(fā)明進行各種修改和變異，而仍不脫離本發(fā)明的精神和范圍，因此這些修改和變異均落入所附權利要求的保護范圍內。
序列表<110><120>食管癌相關基因NMES1及其編碼多肽<130><140><141><150><151><160>13<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>135<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>1gtcggttccg ggcgttacca tcgtccgtgc gcaccgcccg gcgtccaggt gagtctccca60tctgcagaga cgcggacgcg ccggcccgca gttggcctgc ggagcgcggt ggacggtttg120gcgcccacca ggcgatcaat actttggatt tttaatttct agatttggca attcttcgct180gaagtcatca tgagcttttt ccaactcctg atgaaaagga aggaactcat tcccttggtg240gtgttcatga ctgtggcggc gggtggagcc tcatctttcg ctgtgtattc tctttggaaa300accgatgtga tccttgatcg aaaaaaaaat ccagaacctt gggaaactgt ggaccctact360gtacctcaaa agcttataac aatcaaccaa caatggaaac ccattgaaga gttgcaaaat420gtccaaaggg tgaccaaatg acgagccctc gcctctttct tctgaagagt actctataaa480tctagtggaa acatttctgc aaactagatt ctggacacca gtgtgcggaa atgcttctgc540tacattttta gggtttgtct acattttttg ggctctggat aaggaattaa aggagtgcag600caataactgc actgtctaaa agtttgtgct tattttcttg taaatttgaa tattgcatat660tgaaattttt gtttatgatc tatgaatgtt tttcttaaaa tttacaaagc tttgtaaatt720agattttctt taataaaatg ccatttgtgc aagatttctc aaagattagg tatatattta780aatggaagag aaaatatttt tatgggagaa aaatacattt gaaccatgaa atttcatctt840ttaaataaca tccagtacag atatctgtgt aaaaaaaaaa aaaa 884<210>2<211>135<212>PRT<213>Artificial Sequence<400>2SFFQLLMKR KELIPLVVFM TVAAGGASSF AVYSLWKTDV ILDRKKNPEP WETVDPTVPQ60KLITINQQWK PIEELQNVQR VTK 83<210>3<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>3ggttcaaatg tatttttctc ccat24<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>4tttgggctct ggataaggaa t 21<210>5<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>5ttgtcgacag cgtggtcgcg gccgaggt28<210>6<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>6tgcagttatt gctgcactcc tttaattc28<210>7<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>7tgtcgactgt agcagaagca gttccgcac 29<210>8<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>8gtccaggtga gtctcccatc t21<210>9<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>9tatacctaat ctttgagaaa tcttgca 27<210>10<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>10ggttcaaatg tatttttctc ccat 24<210>11<211>135<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>11tttgggctct ggataaggaa t21<210>12<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>12tttggatcca tttggcaatt cttcgct 27<210>13<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>13tttctcgaca aagaggcgag ggct 2權利要求
1.NMES1多肽或多核苷酸在制備可用于預防和/或治療消化道腫瘤的藥物組合物中的用途，其中所述多肽選自下組(1)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；或(2)包含與SEQ ID NO2所述氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列的多肽；或(3)(1)或(2)所述多肽的功能活性片段、變體，類似物和衍生物，它們具有與(1)或(2)所述多肽基本相同的生物學功能或活性；所述多核苷酸包括(a)編碼上述(1)，(2)或(3)所述的NMES1多肽的多核苷酸；(b)在中等嚴謹條件下能與(a)所述的多核苷酸雜交并與其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)包含(a)或(b)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
2.根據(jù)權利要求1的用途，其中所述多肽包含與SEQ ID NO2所述氨基酸序列至少75％，優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少85％，還更優(yōu)選地至少90％，甚至更優(yōu)選地至少95％，最優(yōu)選地至少99％同源的氨基酸序列。
3.根據(jù)權利要求2的用途，其中所述多肽包含SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
4.根據(jù)權利要求1的用途，其中所述多核苷酸具有與SEQ IDNO1所示核酸序列至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，至少85％，至少90％，甚至至少95％，最優(yōu)選至少97％一致性的序列。
5.根據(jù)權利要求4的用途，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1所示核酸序列。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項的用途，其中所述消化道腫瘤是食管癌，小腸癌，直腸癌或結腸癌。
7.一種藥物組合物，其中包含有NMES1多肽或多核苷酸以及藥學可接受載體，其中所述多肽選自下組(1)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；或(2)包含與SEQ ID NO2所述氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列的多肽；或(3)(1)或(2)所述多肽的功能活性片段、變體，類似物和衍生物，它們具有與(1)或(2)所述多肽基本相同的生物學功能或活性；和/或所述多核苷酸包括(a)編碼上述(1)，(2)或(3)所述的NMES1多肽的多核苷酸；(b)在中等嚴謹條件下能與(a)所述的多核苷酸雜交并與其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)包含(a)或(b)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
8.根據(jù)權利要求7的藥物組合物，其中所述多肽包含與SEQ IDNO2所述氨基酸序列至少75％，優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少85％，還更優(yōu)選地至少90％，甚至更優(yōu)選地至少95％，最優(yōu)選地至少99％同源的氨基酸序列。
9.根據(jù)權利要求8的藥物組合物，其中所述多肽包含SEQ IDNO2所述的氨基酸序列。
10.根據(jù)權利要求7的藥物組合物，其中所述多核苷酸具有與SEQID NO1所示核酸序列至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，至少85％，至少90％，甚至至少95％，最優(yōu)選至少97％一致性的序列。
11.根據(jù)權利要求7的藥物組合物，其中所述多核苷酸具有SEQ IDNO1所示核酸序列。
12.根據(jù)權利要求7-11任一項的藥物組合物，其用于預防和/或治療消化道腫瘤。
13.根據(jù)權利要求12的藥物組合物，其中所述消化道腫瘤是食管癌，小腸癌，直腸癌或結腸癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了食管癌相關基因NMES1及其編碼蛋白質的用途，以及含有它們的藥物組合物。
文檔編號A61K38/16GK1480211SQ0214199
公開日2004年3月10日 申請日期2002年9月2日 優(yōu)先權日2002年9月2日
發(fā)明者劉芝華, 周津, 丁芳, 駱愛萍, 王秀琴, 吳旻 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所