專利名稱：用于攜帶放射性物質(zhì)的載體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于攜帶放射性物質(zhì)的載體及其使用方法。
利用放射性物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行放射線治療興起于近20年，即利用腫瘤等快速分裂的細(xì)胞對(duì)放射線造成的傷害特別敏感，經(jīng)過足量的照射后會(huì)引起細(xì)胞代謝紊亂，進(jìn)而走向死亡。其中以放射性碘治療甲狀腺病變是目前放射性物資應(yīng)用于治療癌癥的最佳例子。放射性碘治療只要以最簡(jiǎn)便的口服方式即可，由于甲狀腺組織對(duì)碘的攝取具有高度親和性，所以放射性碘可以有效地累積在甲狀腺中。癌變后的甲狀腺組織同樣也具有攝取放射性碘的能力，此時(shí)借助于放射性碘釋放的β射線將病變組織破壞，以達(dá)到清除癌組織及預(yù)防復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的治療目的。又因放射性碘釋放的β射線在組織中射程約二毫米，因此對(duì)甲狀腺周圍正常組織的影響不大。
然而現(xiàn)有的放射線治療方法其實(shí)是不具有選擇性，即會(huì)同時(shí)殺死腫瘤細(xì)胞及正常組織，例如鈷60采用體外照射治療，放射線要先穿過正常組織后才能抵達(dá)腫瘤組織，因此，對(duì)于腫瘤周圍的正常組織造成的損傷也較大。放射性碘是利用甲狀腺組織對(duì)其特定攝取能力而能達(dá)到一定的療效，但由于放射性碘無(wú)法直接與其他腫瘤細(xì)胞結(jié)合，因此并不能適用在其他腫瘤細(xì)胞的治療中。手術(shù)方法雖然可以在特定組織部位中植入放射性物質(zhì)，但是已經(jīng)先造成傷害。
為此，如何提供一個(gè)可以攜帶放射性物質(zhì)到特定腫瘤組織中的載體是本發(fā)明中創(chuàng)作人所研創(chuàng)的動(dòng)機(jī)所在。
本發(fā)明中用于攜帶放射性物質(zhì)的載體是藻紅蛋白(Phycoerythrin；PE)，即利用藻紅蛋白(Phycoerythrin；PE)作為載體來(lái)攜帶放射性物質(zhì)，使放射性物質(zhì)能夠?qū)Ｒ恍缘乩鄯e在腫瘤細(xì)胞中。
本發(fā)明中利用藻紅蛋白作為載體將放射性物質(zhì)帶入腫瘤細(xì)胞中的方法，至少包含下列步驟提供一藻紅蛋白；將欲攜帶的放射性物質(zhì)與藻紅蛋白結(jié)合；借助于攜帶放射性物質(zhì)的藻紅蛋白與腫瘤細(xì)胞結(jié)合；將放射性物質(zhì)累積于腫瘤細(xì)胞中；借助于藻紅蛋白中攜帶的放射性物質(zhì)產(chǎn)生的放射線來(lái)消滅腫瘤細(xì)胞。
另外，所述藻紅蛋白可以是R-藻紅蛋白(R-PE)或B-藻紅蛋白(B-PE)，其中較佳的是R-藻紅蛋白。
另外，所述累積于腫瘤細(xì)胞中的藻紅蛋白可用于協(xié)助判定腫瘤的位置及范圍，其方式是經(jīng)投入有效量的藻紅蛋白于腫瘤細(xì)胞上，并以特定光波照射藻紅蛋白使其射出特定的熒光波長(zhǎng)，以判斷腫瘤的位置及范圍。
另外，所述R-藻紅蛋白(R-PE)的照射波長(zhǎng)范圍為488nm至633nm，其中最佳使用的波長(zhǎng)為488nm，經(jīng)照射后發(fā)出紅色熒光，波長(zhǎng)為575nm；所述B-藻紅蛋白(B-PE)的照射波長(zhǎng)范圍為488nm至633nm，其中最佳使用的波長(zhǎng)為543nm，經(jīng)照射后發(fā)出紅色熒光，波長(zhǎng)為575nm。
另外，前述放射性物質(zhì)包含任何易與蛋白質(zhì)接合的放射性物質(zhì)，例如放射性碘，其可產(chǎn)生放射線，至使腫瘤細(xì)胞死亡。
本發(fā)明是借助于藻紅蛋白與腫瘤細(xì)胞的高度親合力來(lái)識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并協(xié)助判定腫瘤的位置及范圍，再利用藻紅蛋白中攜帶的放射性物質(zhì)放出的放射線來(lái)有效地殺滅腫瘤細(xì)胞，而對(duì)其他正常組織細(xì)胞不會(huì)發(fā)生損傷。


圖1是顯示R-藻紅蛋白的光譜圖；圖2是顯示B-藻紅蛋白的光譜圖；圖3是顯示R-藻紅蛋白在人類纖維母細(xì)胞(正常細(xì)胞)中并無(wú)累積現(xiàn)象的影像圖；圖4是顯示R-藻紅蛋白在人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤(腫瘤細(xì)胞)中有明顯累積現(xiàn)象的影像圖。
本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)微藻中特有的藻紅蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞有高度的親合力，并會(huì)選擇性地累積在腫瘤細(xì)胞中，而不停留在正常細(xì)胞中，因此，本發(fā)明是利用藻紅蛋白的特性來(lái)作為癌癥治療中攜帶放射性物質(zhì)的載體。
本發(fā)明中利用藻紅蛋白作為載體將放射性物質(zhì)帶入并消滅腫瘤細(xì)胞的方法，至少包含下列步驟提供一藻紅蛋白；將欲攜帶的放射性物質(zhì)與藻紅蛋白結(jié)合；藉由攜帶放射性物質(zhì)的藻紅蛋白與腫瘤細(xì)胞結(jié)合；將放射性物質(zhì)累積于前述腫瘤細(xì)胞中；及藉由藻紅蛋白中攜帶的放射性物質(zhì)產(chǎn)生的放射線來(lái)消滅腫瘤細(xì)胞。
在一般的放射性物質(zhì)中如碘元素，其物質(zhì)本身就與蛋白質(zhì)有很好的反應(yīng)能力，能夠高效率地將碘鍵結(jié)合在酪胺酸(Tyrosine)上，同時(shí)又是常用的醫(yī)療用放射性元素之一。因此本發(fā)明的實(shí)施例之一是選擇R-藻紅蛋白作為放射性碘的載體，將放射性碘攜帶至腫瘤細(xì)胞所在的位置，再利用放射性碘放出的β射線來(lái)有效且專一性地使腫瘤細(xì)胞死亡，而不會(huì)破壞其他正常細(xì)胞。
另外，前述累積于腫瘤細(xì)胞中的藻紅蛋白可經(jīng)投入有效量的藻紅蛋白在腫瘤細(xì)胞上，并以特定光波照射藻紅蛋白使其放射出特定波長(zhǎng)的熒光，以判斷腫瘤的位置及范圍。
上述藻紅蛋白可以是R-藻紅蛋白(R-PE)或B-藻紅蛋白(B-PE)，其中較佳的是R-藻紅蛋白。
R-藻紅蛋白屬于藻類中特有的一類水溶性、發(fā)熒光的色素蛋白。該藻紅蛋白的主要理化特性如下其結(jié)構(gòu)由阿法(α)、貝塔(β)及加瑪(γ)三種亞單體(Subunit)組成，并通常以六聚體(Hexamer，(αβ)6γ)型態(tài)出現(xiàn)，其分子量為260000道爾頓(Dalton)，吸收光譜如圖1中的A線所示，吸收光譜的主峰落在566nm處，另外在498nm處有一個(gè)肩峰；其熒光發(fā)射光譜如圖1中的B線所示，熒光發(fā)射光譜的主峰位于575nm處，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，以該波長(zhǎng)激發(fā)的熒光產(chǎn)生率(Fluorescence Quantum Yield)為0.84。
B-藻紅蛋白的主要理化特性如下其結(jié)構(gòu)由阿法(α)、貝塔(β)及加瑪(γ)三種亞單體(subunit)組成，且通常以六聚體(Hexamer，(αβ)6γ)型態(tài)出現(xiàn)；分子量為240000道爾頓(Dalton)；吸收光范圍落在可見光區(qū)，其吸收光譜如圖2中的實(shí)線所示，吸收光譜的主峰落在545nm處，在498nm有一個(gè)肩峰；熒光放射光范圍落在可見光區(qū)，其熒光發(fā)射光譜如圖2中虛線所示，熒光發(fā)射光譜的主峰位于575nm處，發(fā)射熒光亮度強(qiáng)且穩(wěn)定，受環(huán)境PH值、溫度及其它生物分子存在的影響??；其最佳激發(fā)光波長(zhǎng)為543nm，以該波長(zhǎng)激發(fā)的熒光產(chǎn)生率(fluorescence quantum yield)為0.98。
本發(fā)明中所謂的腫瘤細(xì)胞，并無(wú)特殊限制，然而相對(duì)于不同類形的腫瘤細(xì)胞，投入的藻紅蛋白劑量也將有所變動(dòng)。
以下列舉本發(fā)明中的最佳實(shí)施例，以進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但并不以本
R-藻紅蛋白可選擇性地累積在腫瘤細(xì)胞中(1).R-藻紅蛋白(R-Phyoerythin)的制備R-藻紅蛋白的成份規(guī)格如下1.吸收光譜值A(chǔ)566/A280≥5.3；A566/A498≤1.5；A620/A566≤0.005；2.蛋白質(zhì)純度高于98％；3.保存于150mM磷酸鈉緩沖液(Sodium phosphate buffer，pH7.0)中，內(nèi)含60％飽和硫酸銨(ammonium sulfate)、1mM乙二胺四醋酸鹽(SodiumEthylene-diaminetetraacetateEDTA)，以及1mM疊氮化鈉(sodium azide)，需4℃冷藏。
先以150mM磷酸鈉緩沖液透析完全，再以MEM培養(yǎng)基對(duì)該R-藻紅蛋白做系列稀釋，得到濃度范圍從1至100ug/ml的R-藻紅蛋白稀釋液。
(2).腫瘤細(xì)胞的制備使用的腫瘤細(xì)胞是人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Human Neuroblastoma)，對(duì)照組正常細(xì)胞是人類纖維母細(xì)胞(Human Fibroblast)。首先，將細(xì)胞置于含有10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(PH7.4)，并在95％飽和濕度、37℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每二天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，首先，棄置培養(yǎng)基，并以磷酸鈉緩沖液清洗細(xì)胞一次。其后，加入0.25％胰蛋白酵素(Trypsin-EDTA)使細(xì)胞從培養(yǎng)器皿表面脫落，再加入適量的上述培養(yǎng)基以終止胰蛋白酵素的作用，制得細(xì)胞懸浮液。其次，接種10萬(wàn)至40萬(wàn)的細(xì)胞到適當(dāng)?shù)妮d體上(如蓋玻片(Cover Slip)，并將該載體置于12孔培養(yǎng)器皿中，在95％飽和濕度、37℃的條件下，培養(yǎng)16小時(shí)。
(3)細(xì)胞親合力試驗(yàn)以下將進(jìn)行R-藻紅蛋白對(duì)于正常人類纖維母細(xì)胞及人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤的親合力測(cè)試。取前述步驟(2)所得載有細(xì)胞的培養(yǎng)器皿，棄置培養(yǎng)基，并以磷酸鈉緩沖液清洗細(xì)胞一次。其后，加入上述步驟(1)的R-藻紅蛋白稀釋液1ml，置于95％飽和濕度、37℃的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，棄置培養(yǎng)基，并用磷酸鈉緩沖液清洗細(xì)胞3次。其次，在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)，放置在室溫下，直到細(xì)胞完全固定在載體上。經(jīng)過一次磷酸鈉緩沖液清洗后，將細(xì)胞載體自培養(yǎng)器皿中取出，用80％的甘油(Glycerol)包埋細(xì)胞，隨后用熒光顯微鏡觀察R-藻紅蛋白對(duì)細(xì)胞的染色程度。
其結(jié)果如圖3及圖4所示，圖3A顯示了正常的人類纖維母細(xì)胞中未加入R-藻紅蛋白的效果圖，圖3B至圖3D是顯示分別加入10μg/ml、20μg/ml及40μg/ml的R-藻紅蛋白的正常人類纖維母細(xì)胞的熒光觀測(cè)圖，結(jié)果顯示，在正常的人類纖維母細(xì)胞中并無(wú)觀察到熒光放射反應(yīng)，即表示R-藻紅蛋白并不會(huì)累積在正常細(xì)胞中。
圖4A表示腫瘤細(xì)胞中未加入R-藻紅蛋白，圖4B至圖4D是顯示分別加入有10μg/ml、20μg/ml及40μg/ml的R-藻紅蛋白的人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤的熒光觀測(cè)圖，結(jié)果顯示，在腫瘤細(xì)胞中隨著加入R-藻紅蛋白量的增加，觀察到的熒光放射越強(qiáng)(即圖4中反白之處1)，此即表示R-藻紅蛋白會(huì)選擇性滯留在腫瘤細(xì)胞中。
綜上所述，本發(fā)明是利用藻紅蛋白作為癌癥放射性治療中有效攜帶放射性物質(zhì)的載體，經(jīng)投入有效量的藻紅蛋白在腫瘤細(xì)胞上。以上述最佳實(shí)施例的結(jié)果證實(shí)1.R-藻紅蛋白會(huì)選擇性的滯留在腫瘤組織內(nèi)；2.以特定光波(波長(zhǎng)范圍為488nm至633nm；最佳使用波長(zhǎng)為488nm)照射會(huì)發(fā)出紅色熒光(熒光波長(zhǎng)575nm)，可協(xié)助腫瘤位置及范圍的判定；3.若投入的R-藻紅蛋白已事先鍵結(jié)有放射性碘，可藉由放射性碘所放出的β射線，即可造成腫瘤細(xì)胞死亡。
權(quán)利要求
1.一種用于攜帶放射性物質(zhì)的載體，是以藻紅蛋白(Phycoerythrin；PE)為載體來(lái)攜帶放射物質(zhì)，使放射性物質(zhì)能夠?qū)Ｒ恍缘乩鄯e在腫瘤細(xì)胞中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的載體，其特征在于所述藻紅蛋白為R-藻紅蛋白(R-PE)或B-藻紅蛋白(B-PE)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的載體，其特征在于所述累積于腫瘤細(xì)胞中的藻紅蛋白可協(xié)助判定腫瘤的位置及范圍。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的載體，其特征在于所述R-藻紅蛋白(R-PE)的照射波長(zhǎng)范圍為488nm至633nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的載體，其特征在于所述R-藻紅蛋白(R-PE)最佳使用的照射波長(zhǎng)為488nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的載體，其特征在于所述B-藻紅蛋白(B-PE)的照射波長(zhǎng)范圍為488nm至633nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的載體，其特征在于所述B-藻紅蛋白(B-PE)最佳使用的照射波長(zhǎng)為543nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的載體，其特征在于所述放射性物質(zhì)包含有任何易與蛋白質(zhì)接合的放射性物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的載體，其特征在于所述放射性物質(zhì)為放射性碘。
10.一種利用藻紅蛋白作為載體將放射性物質(zhì)帶入腫瘤細(xì)胞中的方法，其至少包含下列步驟提供一藻紅蛋白；將欲攜帶的放射性物質(zhì)與藻紅蛋白結(jié)合；借助于攜帶放射性物質(zhì)的藻紅蛋白與腫瘤細(xì)胞結(jié)合；將放射性物質(zhì)累積于前述腫瘤細(xì)胞中及借助于藻紅蛋白中攜帶的放射性物質(zhì)產(chǎn)生的放射線來(lái)消滅腫瘤細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的方法，其特征在于所述藻紅蛋白為R-藻紅蛋白(R-PE)或B-藻紅蛋白(B-PE)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的方法，其特征在于所述R-藻紅蛋白(R-PE)的照射波長(zhǎng)范圍為488nm至633nm。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其特征在于所述R-藻紅蛋白(R-PE)最佳使用的照射波長(zhǎng)為488nm。
14.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的方法，其特征在于所述累積于腫瘤細(xì)胞中的藻紅蛋白可協(xié)助判定腫瘤的位置及范圍。
15.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的方法，其特征在于所述放射性物質(zhì)為放射性碘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于攜帶放射性物質(zhì)的載體及其使用方法，其是以藻紅蛋白(Phycoerythrin；PE)為載體來(lái)攜帶放射性物質(zhì)，使放射性物質(zhì)能夠?qū)Ｒ恍缘乩鄯e在腫瘤細(xì)胞中，再借助于放射性物質(zhì)產(chǎn)生的放射線從而有效地造成腫瘤細(xì)胞死亡，因此可應(yīng)用在各種腫瘤治療中。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1478552SQ02142259
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者闕壯群, 闕壯卿 申請(qǐng)人:闕壯群