專利名稱：一種新型抗腫瘤人參皂苷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人參二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，簡稱Mx]，特別以Mx和含有Mx為活性成分的新穎抗腫瘤制劑。Mx具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移、增強機體免疫力和降低化療藥物毒副作用等抗腫瘤活性。
背景技術(shù)：
人參皂苷具有多種藥效功能，如抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)消化機能、安神、抗衰老、抗緊張、預(yù)防消化道潰瘍、提高生命質(zhì)量、增強記憶力和學(xué)習(xí)能力等。但天然人參皂苷幾乎不能被腸道直接吸收入血，并且，藥代動力學(xué)行為較差。
近來，先后發(fā)現(xiàn)多種由天然人參皂苷經(jīng)生物轉(zhuǎn)化而來的代謝產(chǎn)物如20-O-β-D-葡萄糖-20(S)-原人參二醇[20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，簡稱C-K]，20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人參二醇[20-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl20(S)-protopanaxadiol，簡稱C-Y]和20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人參二醇[20-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl20(S)-protopanaxadiol，簡稱Mc]。它們分別被證明是相應(yīng)天然人參皂苷的口服吸收形式。Hasegawa等研究發(fā)現(xiàn)C-K在抗腫瘤方面具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抑制腫瘤誘導(dǎo)的新生血管形成、抗擊腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等多種生物活性；另外，C-K具有良好的藥代動力學(xué)行為且基本無毒或毒性很低，目前，在韓國已進(jìn)入III期臨床研究。源于天然人參皂苷Rb2和Rc的代謝產(chǎn)物C-Y和Mc具有與C-K相似的藥效活性。
由于天然人參或天然人參皂苷口服后幾乎不直接吸收，口服后上述三種可吸收的代謝產(chǎn)物是通過人體腸道菌的轉(zhuǎn)化而來。因機體的人參皂苷腸道菌代謝能力存在個體差異，因此，理論上，直接使用轉(zhuǎn)化物可以避免吸收障礙，使臨床上易于掌握有效劑量，。
Hasegawa將天然人參皂苷與腸道菌一起體外厭氧培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中分離得到C-K，并申請了美國專利(5,919,770)。由于厭氧培養(yǎng)時，C-K不是唯一產(chǎn)物、C-K轉(zhuǎn)化率率低，因此，分離純化繁瑣，后處理不易。此外，厭氧培養(yǎng)條件苛刻也使成本大大生高。有柚皮苷酶、橙皮苷酶水解制備C-K的方法，但該法有下列缺陷水解時間長、酶的用量大，酶的來源不易，因此，不適于工業(yè)制備。
我們先前的研究開發(fā)了在工藝及成本上均有優(yōu)勢的C-K酶法制備方法(中國專利，申請?zhí)?1133410.X)和微生物發(fā)酵方法(中國專利，申請?zhí)?2132403.4)。兩項技術(shù)發(fā)明較之腸道菌和柚皮苷酶、橙皮苷酶的制備技術(shù)有多種優(yōu)勢。利用上述技術(shù)，以三七莖葉中富含的人參皂苷Rb3為原料，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了Mx這一具有抗腫瘤活性的新化合物，Mx具有與C-K相似的生物活性，而較之人參，三七及其莖葉在我國具有更加明顯的資源優(yōu)勢，因此，可以預(yù)見本發(fā)明具有極大的開發(fā)和應(yīng)用價值。
發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明提供了具有如下結(jié)構(gòu)式I的20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人參二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-proto-panaxadol]，以下簡稱Mx。
Mx的特性如下(1)結(jié)構(gòu)式
結(jié)構(gòu)式I(2)分子式C41H70O12(3)熔點℃(4)旋光性[α]D20+°(C＝1.0，甲醇)(5)IR(KBr)cm-1(6)FAB-MS m/z(M-H)(7)13C-NMR(d5-吡啶)δppm39.5(C-1)，28.3(C-2)，78.2(C-3)，39.5(C-4)，56.5(C-5)，18.8(C-6)，35.2(C-7)，40.2(C-8)，50.4(C-9)，37.4(C-10)，30.8(C-11)，70.3(C-12)，49.5(C-13)，51.5(C-14)，30.9(C-15)，26.7(C-16)，51.8(C-17)16.3(C-18)，16.1(C-19)，83.2(C-20)，22.4(C-21)，36.2(C-22)，23.2(C-23)，126.1(C-24)，131.0(C-25)，25.8(C-26)，17.9(C-27)，28.7(C-28)，16.4(C-29)，17.5(C-30)20-吡喃葡萄糖基的13C-NMR(d5-吡啶)δppm97.8(C-1′)，74.9(C-2′)，78.9(C-3′)，71.6(C-4′)，76.9(C-5′)，69.0(C-6′)6’-吡喃木糖基的13C-NMR(d5-吡啶)δppm105.0(C-1″)，74.3(C-2″)，77.4(C-3″)，70.7(C-4″)，66.0(C-5″)(8)無臭、無色、針狀結(jié)晶體(甲醇-水體系中結(jié)晶)(9)易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、異丙醇、正丙醇、吡啶、二甲亞砜。
Mx具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移、增強機體免疫力和降低化療藥毒副等抗腫瘤活性，具極大的開發(fā)潛力。
本發(fā)明還提供了含有Mx為活性成分的新穎抗腫瘤制劑。
本發(fā)明所提供的新穎抗腫瘤制劑中，Mx的有效劑量為1-50mg/Kg/天。
本發(fā)明所提供的新穎抗腫瘤制劑中，Mx可與任何法定藥用賦形劑和配合劑制成各種藥用劑型的制劑。
本發(fā)明所提供的新穎抗腫瘤制劑中，以Mx為活性成分的制劑可單獨使用，也可與目前市場上的任何化療藥(包括激素類、烷化劑類、鉑類、抗代謝類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑類、抗微絲微管類、誘導(dǎo)分化類及其它)聯(lián)合使用，或制成復(fù)方制劑使用。
本發(fā)明所提供的新穎抗腫瘤制劑中，制劑劑型可為口服、注射或局部用藥劑型。
本發(fā)明所提供的新抗腫瘤制劑中，口服劑型可為片劑、粉劑、懸濁液、乳濁液、膠囊、顆粒劑、糖衣片、藥丸、液體、醑劑、糖漿或檸檬水劑等。
本發(fā)明所提供的新穎抗腫瘤制劑中，注射劑型可為水劑、懸濁液或溶液等。
本發(fā)明所提供的新穎抗腫瘤制劑中，局部用藥劑型可為軟膏、固體、懸濁液、水劑、醑劑、粉劑、糊劑、栓劑、氣溶膠、泥敷劑、涂抹劑、洗劑、灌腸劑或乳劑等。
本發(fā)明所提供的新穎抗腫瘤制劑中，賦形劑可以是下列中的一種或多種(a)、口服劑型的粉狀賦形劑如乳糖、結(jié)晶纖維素、淀粉、糊精、磷酸鈣、碳酸鈣、合成或天然的二氧化鋁、干燥的氫氧化鋁，硬脂酸鎂、碳酸氫鈉等；(b)、局部用藥劑型的粉狀賦形劑如氧化鋅、滑石、淀粉、高陶土、硼酸鹽粉末、硬脂酸鋅、硬脂酸鎂、碳酸鎂、沉淀碳酸鈣、堿式?jīng)]食子酸鉍和硫酸鉀鋁粉末生等；(c)、液體用賦形劑如水、甘油、丙二醇、甜味糖漿、乙醇、脂肪油、乙烯甘油、聚乙二醇、山梨醇；軟膏用賦形劑，如混合脂肪，脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蠟、日本蠟、石蠟、硫酸石蠟、樹脂、高級醇、塑料、乙二醇、水或表面活性劑(包括脂溶基、水溶基和懸浮基)等。
具體實施例方式實施例1Mx的制備人參皂苷Rb3(500mg)蝸牛酶(84mg)溶于磷酸-檸檬酸緩沖液(32mL，pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；離心反應(yīng)液收集沉淀，用水將沉淀物制成懸濁液，用乙酸乙酯萃取(10mL×5)，合并乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯后獲Mx(193mg)。
實施例2片劑配方實例Mx(30mg)與乳糖、結(jié)晶纖維素和1％硬脂酸鎂的混合物均勻混合，經(jīng)壓片機制成每片為200mg的片劑。
實施例3注射劑配方實例無菌操作下，將Mx(15mg)和多乙氧基醚的溶液灌入小瓶，除水份后，獲注射用制劑。
實施例4抑制MCF-7和K562細(xì)胞生長的活性a)、方法以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和人紅自血病K562細(xì)胞株為實驗用細(xì)胞株，取對數(shù)生長期細(xì)胞(2.5×105/mL)接種在96孔板內(nèi)，由高至低濃度加入藥物溶液，對照組則加入等體積RPM1640培養(yǎng)液。藥物作用48小時后，按MTT法求生長抑制率和IC50生長抑制率(％)＝[1-實驗組OD值/對照組OD值]×100％IC50是生長抑制率為50％時的藥物濃度。
b)、實驗結(jié)果如表1所示。
表1.Mx對MCF-7和K562細(xì)胞生長的抑制作用IC50(μM)MCF-7 K562ADM1.4±0.12.6±0.2Mx 47±9 32±5
C-K41±9 27±7C-Y90±14 50±8Mc 97±11 57±6結(jié)果表明Mx對兩種腫瘤細(xì)胞株具有生長抑制作用，IC50分別為47μM和32μm。
實施例5Mx對腫瘤細(xì)胞浸潤滲透能力的影響a)、方法采用transwell浸潤滲透方法，依Cancer Res.，47，3239，1987操作。transwell是一個插件，可插入標(biāo)準(zhǔn)24孔板中某一孔的上部。在transwell插件培養(yǎng)腔的底部有8μm大的孔徑，由一濾膜隔斷，在濾膜上用5μg的martigel模擬纖維粘連蛋白涂于表面，形成上下兩培養(yǎng)腔室的屏障。HT1080人腺肉瘤細(xì)胞株，經(jīng)Mx(1-1000μM)處理30分鐘后置于transwell的培養(yǎng)腔(細(xì)胞數(shù)為每100μL 1×105)內(nèi)，上下均加入600μL含0.1％小牛血清的MEM培養(yǎng)液，4小時孵育后，取下24孔板，用乙醇固定孔內(nèi)細(xì)胞，HE染色，光鏡計數(shù)，獲浸潤滲透細(xì)胞數(shù)。將處理前后的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，求滲透抑制率和ED50。
滲透抑制率(％)＝[1-實驗組滲過的細(xì)胞數(shù)/對照組滲過的細(xì)胞數(shù)]×100％ED50＝滲透抑制率為50％時的藥物濃度。
b)、實驗結(jié)果如表2所示。
表2.Mx對腫瘤細(xì)胞基底膜滲透能力的抑制ED50(μM)對照RGSD4000Mx 7.2C-K 4.1C-Y 35Mc 52結(jié)果表明Mx較RGSD(Arg-Gly-Asp-Ser，已知具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性的多肽)具有更強的抑制活性，在50％滲透抑制作用時的濃度(ED50)為7.2μM。
實施例6逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性a)、方法以人乳腺癌阿霉素耐藥株MCF-7/ADM及其敏感株MCF-7/S人紅白血病阿霉素耐藥株K562/A及其敏感株K562/S為實驗用細(xì)胞株(以敏感細(xì)胞株的IC50為基數(shù)，耐藥細(xì)胞株對阿霉素的耐藥倍數(shù)MCF-7為30倍，K562為62倍)，用MTT法考察化合物在無毒劑量下化合物對阿霉素IC50(阿霉素耐藥株)影響，根據(jù)下列公式計算耐藥倍數(shù)。
耐藥倍數(shù)＝耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50；b)、實驗結(jié)果如表3所示。
表3.Mx對腫瘤多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用濃度耐藥倍數(shù)(μM)MCF-7/A K562/Acontrol 30.1 62.5Verapamil 8 6.6 11.0Mx 6 13.3 33.7C-K 6 14.8 36.3C-Y 6 18.4 39.0Mc 6 16.4 37.8PPD 12 26.1 52.2結(jié)果表明Mx對兩種多藥耐藥性腫瘤細(xì)胞株的逆轉(zhuǎn)活性≥50％。
權(quán)利要求
1.一種具有如下結(jié)構(gòu)式I的人參皂苷20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人參二醇[20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，簡稱Mx] 結(jié)構(gòu)式I
2.按照權(quán)利要求1所述的化合物Mx，其特征在于Mx具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移、增強機體免疫力和降低化療藥物毒副作用等抗腫瘤活性。
3.一種抗腫瘤藥物，其特征在于以Mx為有效成分，劑量為1-50mg/Kg/天。
4.按照權(quán)利要求3所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述的Mx與任何法定藥用賦形劑和配合劑制備成各種藥用劑型的制劑。
5.按照權(quán)利要求3所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述的Mx與目前市場上的任何化療藥，包括激素類、烷化劑類、鉑類、抗代謝類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑類、抗微絲微管類、誘導(dǎo)分化類及其它，制備成復(fù)方制劑。
6.按照權(quán)利要求4所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述劑型為口服、注射或局部用藥劑型中的任何一種。
7.按照權(quán)利要求6所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述口服劑型包括片劑、粉劑、懸濁液、乳濁液、膠囊、顆粒劑、糖衣片、藥丸、液體、醑劑、糖漿和檸檬水劑等。
8.按照權(quán)利要求6所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述注射劑型包括水劑、懸濁液和溶液。
9.按照權(quán)利要求6所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述局部用藥劑型包括軟膏、固體、懸濁液、水劑、醑劑、粉劑、糊劑、栓劑、氣溶膠、泥敷劑、涂抹劑、洗劑、灌腸劑和乳劑等。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的人參皂苷，化合物名稱為20－O－β－D－木糖(1→6)－β－D－葡萄糖－20(s)－原人參二醇[20－O－β－D－xylopyranosyl(1→6)－β－D－glucopyranosyl－20(S)－protopanaxadiol，簡稱Mx]，及含有Mx為活性成分的新抗腫瘤制劑。Mx及其制劑具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移、增強機體免疫力和降低化療藥物毒副作用等抗腫瘤活性，開發(fā)潛力和應(yīng)用價值很大。
文檔編號A61P9/00GK1508146SQ02144778
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者凌 楊, 楊凌, 何克江, 李鵬, 韓蔚 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所