專利名稱：利用人和鼠Rhor基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療禿發(fā)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼禿發(fā)相關(guān)蛋白-Rhor的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。
背景技術(shù)：
人類的先天性禿發(fā)、稀發(fā)常見于男性女性患者較為少見，雖然不影響人的生存質(zhì)量，但是對于個人來講由其是女性這種先天性的遺傳疾病嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，遺憾的是迄今為止沒有可以從根本上治療的方法。此外，搜集人類的先天性禿發(fā)家系存在較大的困難。
然而，目前還沒有發(fā)現(xiàn)或分離出與禿發(fā)有關(guān)的基因。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的新的與禿發(fā)有關(guān)的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的禿發(fā)相關(guān)蛋白-Rhor蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的Rhor多肽，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述Rhor多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列具有SEQ ID NO1中1-2484位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備Rhor蛋白的方法，該方法包含(a)在表達(dá)Rhor蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出Rhor蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的Rhor多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的20-2484個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗Rhor多肽活性的化合物，以及抑制Rhor多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是Rhor多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在Rhor蛋白的方法，它包括將樣品與Rhor蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Rhor蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與Rhor多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病(如禿發(fā))易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。較佳地，所述的突變是缺失了SEQ ID NO1中351-580的核苷酸序列。此外，還提供了相應(yīng)的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增Rhor基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。較佳地，所述試劑盒還含有與突變部位結(jié)合的探針。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)Rhor多肽活性的激動劑，或者篩選抑制Rhor多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的Rhor蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的Rhor多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療禿發(fā)等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1是不同小鼠的Rhor基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中泳道1無毛小鼠；2稀毛小鼠；3和4正常小鼠。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，首次分離和證明了一種新基因Rhor與禿發(fā)密切相關(guān)，該基因編碼類似表皮生長因子受體的蛋白。Rhor的突變或功能下降或缺失將直接導(dǎo)致禿發(fā)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Rhor蛋白”、“Rhor多肽”或“禿發(fā)相關(guān)蛋白Rhor”可互換使用，都指具有禿發(fā)相關(guān)蛋白Rhor氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的Rhor蛋白。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的Rhor蛋白或多肽”是指Rhor多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化Rhor蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本發(fā)明還包括Rhor蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然Rhor蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Rhor多肽”指具有Rhor蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與Rhor蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括Rhor蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與Rhor DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗Rhor多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含Rhor多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了Rhor多肽的可溶性片段。通常，該片段具有Rhor多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供Rhor蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然Rhor多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“Rhor蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼Rhor蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的Rhor核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或Rhor蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的Rhor多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼Rhor多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，Rhor多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含Rhor編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的Rhor蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療Rhor蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如無精子，或精子活力低下等疾病)，和用于篩選促進(jìn)或?qū)筊hor蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組Rhor蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激Rhor蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對Rhor DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于Rhor基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與Rhor基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制Rhor蛋白的分子，也包括那些并不影響Rhor蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的Rhor基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的Rhor基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)Rhor蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷Rhor蛋白功能的抗體以及不影響Rhor蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用Rhor基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與Rhor基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗Rhor蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的Rhor蛋白。此外，與Rhor蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用Rhor蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Rhor蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于禿發(fā)的治療。在使用本發(fā)明Rhor蛋白時，還可同時使用其他用于同一病癥的治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Rhor多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的Rhor蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約5毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
Rhor蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于Rhor蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的Rhor蛋白的表達(dá)所致的禿發(fā)。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將Rhor基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。另外重組Rhor基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與Rhor蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，必須對Rhor蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測Rhor蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗(yàn)中所檢測的Rhor蛋白水平，可以用作解釋Rhor蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷Rhor蛋白起作用的疾病(如禿發(fā))。
一種檢測檢測樣品中是否存在Rhor蛋白的方法是利用Rhor蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與Rhor蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Rhor蛋白。
Rhor蛋白的多聚核苷酸可用于Rhor蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，Rhor蛋白的多聚核苷酸可用于檢測Rhor蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下Rhor蛋白的異常表達(dá)。如Rhor DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷Rhor蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用Rhor蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測Rhor蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測Rhor基因的突變也可用于診斷Rhor蛋白相關(guān)的疾病。Rhor蛋白突變的形式包括與正常野生型Rhor DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。本發(fā)明的試驗(yàn)已表明，Rhor的突變與禿發(fā)直接相關(guān)。
在本發(fā)明的一個實(shí)例中，根據(jù)無毛、稀毛和正常小鼠的表型和遺傳分析等手段，確定了一個從未被報導(dǎo)過的新基因，并分離了相應(yīng)的多核苷酸序列，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸的序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為2484個堿基，其開放讀框位于1-2481位，編碼全長為827個氨基酸的Rhor蛋白(SEQ ID NO2)。研究表明，該基因的突變可能阻斷了信號的傳導(dǎo)，影響了毛囊細(xì)胞的發(fā)育，從而導(dǎo)致了小鼠的先天性無毛。由于該蛋白的編碼區(qū)存在高度的保守性，因此人類基因組內(nèi)該基因的部分缺失極有可能導(dǎo)致人類的先天性禿發(fā)、稀發(fā)。Rhor為治療禿發(fā)等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1無毛相關(guān)基因的定位正常小鼠Balb/c在培養(yǎng)中產(chǎn)生了先天性無毛的突變，雜合子表型為稀毛，純合子表型為無毛。無毛小鼠與正常小鼠的雜交后代無一例外的表現(xiàn)為稀毛。稀毛小鼠自交后代出現(xiàn)了性狀分離且符合典型的孟德爾單基因遺傳規(guī)律，其比例符合計算值即正?！孟∶脽o毛＝1∶2∶1。此外，根據(jù)其系譜確定該種突變是單基因的不完全顯性。
為了檢測該種突變，抽提2000只小鼠的基因組DNA進(jìn)行g(shù)enotyping所得的數(shù)據(jù)用計算機(jī)進(jìn)行分析，所用軟件為Linkage，將突變定位于微衛(wèi)星標(biāo)記D11mit103和D11mit338之間，它們的物理距離為1700kb，隨后構(gòu)建了該區(qū)域精細(xì)的物理圖譜，進(jìn)一步將突變定位到了800kb的區(qū)域，然后對該區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行基于直接測序方法的全基因掃描。從而將突變位點(diǎn)定位于一個較小的區(qū)域內(nèi)。
實(shí)施例2基因組DNA缺失的鑒定用分子克隆中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法從無毛、稀毛和正常Balb/c小鼠組織中抽提基因組DNA，使用以下合成引物正向引物5’gcaggctagcgtgttaaagg 3’(SEQ ID NO3)反向引物5’aaaacggggtcatagcagc 3’(SEQ ID NO4)以基因組DNA為模板使用ABI公司的TaqGold高溫聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR熱循環(huán)條件是高溫聚合酶熱啟動，模板變性95℃10分鐘第一輪熱循環(huán)95℃30秒68℃45秒每一次循環(huán)降低一度72℃2分30秒循環(huán)12次第二輪熱循環(huán)95℃30秒56℃45秒72℃2分30秒循環(huán)35次72℃10分鐘產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色結(jié)果如圖1所示。雜合稀毛小鼠的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條特異性條帶其分子量與無毛和正常小鼠的擴(kuò)增產(chǎn)物分別吻合。
實(shí)施例3Rhor的基因組測序本實(shí)施例進(jìn)一步通過基因組測序的方法，驗(yàn)證Rhor與無毛的相關(guān)性。方法如下用Omega公司的Cycle-Pure Kit純化上述無毛與正常小鼠基因組PCR產(chǎn)物，其中使用以下合成引物正向引物5’gcacatctgagggaaggaag 3’(SEQ ID NO5)反向引物5’cttccggtcaaatgcaaagt 3’(SEQ ID NO6)用ABI公司的BigDye terminal試劑及3100全自動測序儀，測序反應(yīng)條件是模板變性98度 2分96度 20秒51度 20秒
60度 4分循環(huán) 25次測序結(jié)果如下所示AGCCTACCTG AAGAGTGTCA GCCTACAGGA GCCCCGGGGA CGATGGCAGG AGGGCGCAGA 60GAAGCGCCCC GGCTTCCGCC GCCAGGCCTC CCTGTCCCAG AGCATCCGCA AGAGCACAGC 120CCAGTGGTTT GGGGTCAGCG GCGACTGGGA GGGCAAGCGA CAAAACTGGC ATCGTCGCAG 180CCTGCACCAC TGCAGCGTGC ACTATGGCCG CCTCAAGGCC TCGTGCCAGA GAGAACTGGA 240GCTGCCCAGC CAGGAGGTGC CATCCTTCCA GGGCACTGAG TCTCCAAAAC CGTGCAAGAT 300GCCCAAGATT GTGGATCCAC TGGCTCGGGG TAGGGCCTTC CGCCATCCAG ATGAGGTGGA 360CCGGCCTCAC GCTGCCCACC CACCTCTGAC TCCAGGGGTC CTGTCTCTCA CATCCTTCAC 420CATGTCCGCT CTGGCTACTC CCATCTGCCC CGCCGCAAGA GGATATCTGT TGCCCATATG 480AGCTTTCAGG CAGCCGCCGC CCTCCTCAAG GGGCGTTCCG TGCTAGATGC GACTGGGCAG 540CGGTGCCGGC ATGTCAAACG CAGCTTCGCT TACCCCAGCT TCCTGGAGGA GGATGCTGTC 600(SEQ ID NO7)將正常小鼠的序列與無毛小鼠的序列比較可發(fā)現(xiàn)，無毛小鼠的基因組發(fā)生了230堿基的缺失(下劃線部分)。
實(shí)施例4Rhor基因完整開放閱讀框架的獲得按照Qiagen公司的Total Rna純化試劑盒提供的方法抽提小鼠皮膚總RNA，1％瓊脂糖電泳鑒定純度后用Promega公司的Reverse TranscriptSystem將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.后用以下引物正向引物5’ACTCTGCTCTCAGCCGCTT 3’(SEQ ID NO8)反向引物5’CCAGACACATGCTGGAGCTA 3’(SEQ ID NO9)使用Takara公司的LA高溫聚合酶PCR熱循環(huán)條件95度 30秒54度 45秒72度 3分循環(huán) 45次
72度 10分鐘0.8％瓊脂糖電泳分離，割膠純化，測序鑒定，得到Rhor的完整ORF全長序列。
Rhor基因的完整開放閱讀框架如SEQ ID NO1所示。其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
實(shí)施例5Rhor基因cDNA缺失的鑒定方法使用上述方法獲得的無毛及正常小鼠cDNA為模板，使用ABI公司的GoldTaq高溫聚合酶。引物如下正向引物5’gcacatctgagggaaggaag 3’(SEQ ID NO10)反向引物5’cttccggtcaaatgcaaagt 3’(SEQ ID NO11)PCR熱循環(huán)條件模板熱變性，高溫聚合酶熱啟動95度 10分第一輪熱循環(huán)95度 30秒68度 45秒每一循環(huán)降低1度72度 90秒循環(huán) 14次第二輪熱循環(huán)95度 30秒54度 45秒72度 90秒循環(huán) 40次72度 10分0.8％瓊脂糖電泳鑒定后用Omega公司的Cycle-Pure Kit純化產(chǎn)物，用ABI公司的BigDye terminal仍用上述引物測序，測序反應(yīng)模板變性98度 2分96度 20秒51度 20秒
60度 4分循環(huán) 25次結(jié)果如下GTGTCAGCCT ACAGGAGCCC CGGGGACGAT GGCAGGAGGG CGCAGAGAAG CGCCCCGGCT 60TCCGCCGCCA GGCCTCCCTG TCCCAGAGCA TCCGCAAGAG CACAGCCCAG TGGTTTGGGG 120TCAGCGGCGA CTGGGAGGGC AAGCGACAAA ACTGGCATCG TCGCAGCCTG CACCACTGCA 180GCGTGCACTA TGGCCGCCTC AAGGCCTCGT GCCAGAGAGA ACTGGAGCTG CCCAGCCAGG 240AGGTGCCATC CTTCCAGGGC ACTGAGTCTC CAAAACCGTG CAAGATGCCC AAGATTGTGG 300ATCCACTGGC TCGGGGTAGG GCCTTCCGCC ATCCAGATGA GGTGGACCGG CCTCACGCTG 360CCCACCCACC TCTGACTCCA GGGGTCCTGT CTCTCACATC CTTCACCATG TCCGCTCTGG 420CTACTCCCAT CTGCCCCGCC GCAAGAGGAT ATCTGTTGCC CATATGAGCT TTCAGGCAGC 480CGCCGCCCTC CTCAAGGGGC GTTCCGTGCT AGATGCGACT GGGCAGCGGT GCCGGCATGT 540CAAACGCAGC TTCGCTTACC CCAGCTTCCT GGAGGAGGAT GCTGTCGATG GAGCTGACAC 600(SEQ ID NO12)其中，下劃線部分為無毛小鼠與正常小鼠比較后發(fā)生缺失的序列。其中cDNA序列中的缺失部分與基因組序列中的缺失部分相同。
實(shí)施例6Rhor的結(jié)構(gòu)分析通過結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Rhor基因編碼的蛋白序列包含了二個非常保守的結(jié)構(gòu)域(1)Rhor蛋白的的氨基酸619-759位形成一個Rhomboid結(jié)構(gòu)域。這表明，Rhor蛋白屬于Rhomboid蛋白家族成員，該家族成員在細(xì)菌和真核生物中都有報道，大部分是完整的膜蛋白，它們預(yù)測跨膜區(qū)存在三個高度保守的組氨酸。
(2)Rhor蛋白的的氨基酸610-804位形成一個competence結(jié)構(gòu)域。這表明，它屬于competence蛋白家族成員，該家族成員是完整的膜蛋白，它們具有6個跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)，這些蛋白行使跨膜運(yùn)輸核酸的功能。一些家族成員曾被報導(dǎo)在細(xì)菌吸收細(xì)胞外DNA功能中起了關(guān)鍵的作用。該家族成員有一個氨基末端的跨膜區(qū)，該區(qū)內(nèi)兩個組氨酸形成一個高度保守的結(jié)構(gòu)單元(motif)作為金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。
上述結(jié)構(gòu)分析提示，Rhor蛋白的突變可能使其失去了跨核膜運(yùn)輸信使RNA(mRNA)的功能，從而阻斷了毛囊細(xì)胞的發(fā)育。
實(shí)施例7Rhor的其他功能除了無毛之外，還發(fā)現(xiàn)無毛小鼠普遍較正常小鼠要消瘦，在解剖的過程中發(fā)現(xiàn)其脂肪儲備幾乎不可見。這表明，認(rèn)為Rhor基因也參與了脂肪代謝通路的調(diào)節(jié)，它的突變導(dǎo)致了脂代謝的紊亂。
此外，無毛小鼠在生長過程中出現(xiàn)了淋巴瘤，Rhor基因的突變會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的生長失去正常調(diào)控。這暗示Rhor有可能處于多個代謝途徑的調(diào)控點(diǎn)。
實(shí)施例8Rhor在原核細(xì)胞中的表達(dá)合成以下引物正向引物5’CGGATCCATGGCCTCAGCTGACAAGAATGGCAGCAACCTCCCA3’(SEQ ID NO13)(引入BamHI切點(diǎn)GGATCC，第一個C為保護(hù)堿基)反向引物5’ATAAAGCTTGCTCGATCTGGTCCACGATGTGATT 3’(SEQ ID NO14)(引入HindIII切點(diǎn)AAGCTT，起始ATA為保護(hù)堿基)以小鼠cDNA為模板，PCR擴(kuò)增編碼Rhor蛋白的DNA。
利用BamHI和Hind III位點(diǎn)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到相同酶切的質(zhì)粒pET32a(Novagen公司)中，然后轉(zhuǎn)化宿主E.ColiBL21(DE3)。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)。
表達(dá)產(chǎn)物在SDS-PAGE膠中分子量大約為90Kda。
實(shí)施例9抗體的制備用實(shí)施例8中獲得蛋白用作抗原，在兔中制備多克隆抗體。具體程序如下第一次免疫純種新西蘭兔，蛋白用量為240ug/只，用弗氏完全佐劑。4周后，第二次免疫，蛋白用量為140ug/只，用不完全佐劑。之后2周，第三次免疫，蛋白用量為120ug/只，用不完全佐劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生物工程研究中心<120>利用人和鼠Rhor基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療禿發(fā)的方法<130>026816<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2484<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(2481)<223>
<400>1atg gcc tca gct gac aag aat ggc agc aac ctc cca tct gtg tct ggt48Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Ser Asn Leu Pro Ser Val Ser Gly1 5 10 15agc cgc ctg cag agc cgg aag cca ccc aac ctc tcc atc acc atc ccg96Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro20 25 30cca cca gag agc cag gcc ccc ggc gag cag gat agc atg ctt cct gag144Pro Pro Glu Ser Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu Pro Glu35 40 45agg cgc aag aac cca gcc tac ctg aag agt gtc agc cta cag gag ccc192Arg Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Mal Ser Leu Gln Glu Pro50 55 60cgg gga cga tgg cag gag ggc gca gag aag cgc ccc ggc ttc cgc cgc240Arg Gly Arg Trp Gln Glu Gly Ala Glu Lys Arg Pro Gly Phe Arg Arg65 70 75 80cag gcc tcc ctg tcc cag agc atc cgc aag agc aca gcc cag tgg ttt288Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Ser Thr Ala Gln Trp Phe85 90 95ggg gtc agc ggc gac tgg gag ggc aag cga caa aac tgg cat cgt cgc336Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Lys Arg Gln Asn Trp His Arg Arg100 105 110agc ctg cac cac tgc agc gtg cac tat ggc cgc ctc aag gcc tcg tgc384Ser Leu His His Cys Ser Val His Tyr Gly Arg Leu Lys Ala Ser Cys115 120 125cag aga gaa ctg gag ctg ccc agc cag gag gtg cca tcc ttc cag ggc432Gln Arg Glu Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Val Pro Ser Phe Gln Gly
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<221>misc_feature<223>引物<400>14ataaagcttg ctcgatctgg tccacgatgt gatt 3權(quán)利要求
1.一種分離的Rhor多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQ ID NO1中1-2484位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種Rhor蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在表達(dá)Rhor蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出Rhor蛋白。
9.一種檢測禿發(fā)易感性的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增Rhor基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
10.一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的禿發(fā)相關(guān)蛋白－Rhor蛋白，編碼Rhor蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生Rhor蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼Rhor蛋白的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了此Rhor蛋白用于治療多種疾病的方法，如用于禿發(fā)等疾病。
文檔編號A61P17/14GK1500807SQ0214525
公開日2004年6月2日 申請日期2002年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月13日
發(fā)明者孔祥銀, 李善如, 胡蘭靛, 史耀舟, 滕曉坤 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院