專利名稱：組織工程化瓣膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程化瓣膜及其制備方法。
組織工程學(xué)應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，研究、開(kāi)發(fā)用于修復(fù)、增進(jìn)或改善人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)的生物替代品。所述生物替代品的基本制備方法是將細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與可降解生物材料相結(jié)合形成細(xì)胞——可降解生物材料復(fù)合體，用以替代受損組織器官。它具有形成具有生命力的活體組織，少量細(xì)胞修復(fù)大塊缺損，并可按組織、器官缺損情況任意塑型等特點(diǎn)。就組織工程化心瓣膜而言，目前尚存在血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源及尋找合適的可降解支架材料兩大技術(shù)難點(diǎn)。
組織工程化瓣膜包含血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞兩類種子細(xì)胞，目前重建瓣膜實(shí)驗(yàn)需取患者大段血管，再通過(guò)復(fù)雜的技術(shù)分離成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，故無(wú)法擺脫以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷的模式。此外眾所周知體細(xì)胞體外培養(yǎng)難度極大，一般傳幾代即發(fā)生變性，而構(gòu)建瓣膜需要大量血管內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)此，既往研究重點(diǎn)大多放在胚胎干細(xì)胞與端粒酶上，但前者面臨倫理學(xué)的異議，后者因其可能誘發(fā)腫瘤而鮮有問(wèn)津。
目前認(rèn)為，組織工程支架材料有如下作用1)維持組織結(jié)構(gòu)的完整性并防止變形，2)作為屏障抑制周?chē)M織的過(guò)度再生，3)作為細(xì)胞遷移和增殖的支架，4)通過(guò)與細(xì)胞表面細(xì)胞受體的相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。理想的支架材料應(yīng)具備良好的細(xì)胞相容性、組織相容性、與細(xì)胞生長(zhǎng)速率相匹配的降解速率及一定的強(qiáng)度和可塑性。既往多利用聚羥基乙酸(PGA)等合成高分子降解材料，但其生物相容性和細(xì)胞親和性不甚理想。
本發(fā)明采用脫細(xì)胞基質(zhì)作為可降解支架材料。其生物相容性好、易于種植細(xì)胞，并能保存正常組織的天然結(jié)構(gòu)和組織強(qiáng)度。
本發(fā)明通過(guò)多種途徑提取種子細(xì)胞。所述種子細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明通過(guò)提取骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞，靜脈、動(dòng)脈血管血管內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞得到內(nèi)皮細(xì)胞種子細(xì)胞；通過(guò)提取骨髓成纖維細(xì)胞，皮下結(jié)締組織成纖維細(xì)胞得到成纖維細(xì)胞種子細(xì)胞。將所得種子細(xì)胞體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，達(dá)到所需數(shù)量后，分步接種于可降解支架材料，先接種成纖維細(xì)胞制成成纖維細(xì)胞—支架材料復(fù)合物，再于復(fù)合物表面接種血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建成本發(fā)明組織工程化瓣膜。
本發(fā)明所述脫細(xì)胞基質(zhì)可以是同種異體和異種瓣膜組織脫細(xì)胞基質(zhì)，心包組織脫細(xì)胞基質(zhì)和血管組織脫細(xì)胞基質(zhì)。
本發(fā)明所述血管內(nèi)皮細(xì)胞可來(lái)源于骨髓，靜脈血管、動(dòng)脈血管和脂肪組織。還可以是經(jīng)過(guò)基因修飾、改造的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞可來(lái)源于骨髓和皮下結(jié)締組織。還可以是經(jīng)過(guò)基因修飾、改造的成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明組織工程化瓣膜，具有以下特點(diǎn)具有正常瓣膜組織的組織結(jié)構(gòu)，表面為血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，中間是以成纖維細(xì)胞為主要成分的結(jié)締組織，是具有新陳代謝功能的活組織。
靜脈血管、動(dòng)脈血管來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取方法取靜脈血管、動(dòng)脈血管5-10CM，兩端結(jié)扎，管腔內(nèi)灌注經(jīng)0.25---0.5％胰酶或0.5％中性蛋白酶(DispaseII)，37℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘，放開(kāi)一端，倒出內(nèi)容物，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r/min離心5分鐘。PBS清洗兩次。
脂肪組織來(lái)源血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取方法將抽取的脂肪組織移入離心管中，1200r/min離心5分鐘。棄去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，混勻。如此分離脂肪組織中毛細(xì)血管。0.25---0.5％胰酶或0.5％中性蛋白酶(DispaseII)，37℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘。加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r/min離心5分鐘。PBS清洗兩次。
成纖維細(xì)胞的提取骨髓來(lái)源成纖維細(xì)胞的提取方法將上述(A1.1)過(guò)柱細(xì)胞(CD31陰性)另置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，DMED培養(yǎng)液，成纖維細(xì)胞較易生長(zhǎng)，利用差速貼壁法可得到成纖維細(xì)胞。
皮下結(jié)締組織來(lái)源成纖維細(xì)胞的提取方法將撕下表皮后的真皮剪成碎塊，用0.2％的膠原酶在37℃消化2小時(shí)，經(jīng)150目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，以1200r/min離心5分鐘，棄去上清，加入無(wú)鈣鎂PBS清洗3次。加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，混勻。
細(xì)胞培養(yǎng)和傳代將上述方法得到的細(xì)胞計(jì)數(shù)后制成單細(xì)胞懸液，按1-2×106/75cm2密度接種培養(yǎng)，含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)液3天換一次。細(xì)胞融合到60％-75％密度時(shí)，用10ml無(wú)鈣鎂PBS沖洗，經(jīng)0.25％胰酶37℃消化5分鐘，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r/min離心5分鐘。棄去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，混勻，計(jì)數(shù)，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。2-3日換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合至60％-75％密度，再傳代培養(yǎng)。
制備脫細(xì)胞基質(zhì)取供體瓣膜、心包或血管組織，順次放入下列溶液中處理1、預(yù)冷的蒸餾水漂洗；2、5％鹽酸-10％氯化鈉溶液中持續(xù)攪拌，4℃；3、氯仿∶甲醇(1∶1)，25℃；4、疊氮化鈉，25℃；5、過(guò)氧化氫浸泡；6、磷酸鹽緩沖液，25℃；再經(jīng)冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，備用。所述供體可以來(lái)源于同種異體或異種組織。
制備組織工程化瓣膜
先收集成纖維細(xì)胞，將其接種于上述支架材料上，接種密度為1×105---108/CM。培養(yǎng)液3天換一次，培養(yǎng)7-10天，構(gòu)建得成纖維細(xì)胞—支架材料復(fù)合物。
收集血管內(nèi)皮細(xì)胞，將其接種在成纖維細(xì)胞—支架材料復(fù)合物表面，制備血管內(nèi)皮細(xì)胞—成纖維細(xì)胞—支架材料復(fù)合物，再將其按瓣膜形狀縫合塑型，制成組織工程化瓣膜。
本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化瓣膜組織具有正常瓣膜組織組織結(jié)構(gòu)，是可自我更新，自我修復(fù)的活組織，并且無(wú)抗原性，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化瓣膜，其特征是按下述方法制備通過(guò)多種途徑提取種子細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代和增殖后，分步種植于可降解支架材料，構(gòu)建成組織工程化瓣膜。
2.按權(quán)利要求1所述的組織工程化瓣膜，其特征是所述的可降解支架材料是脫細(xì)胞基質(zhì)。
3.按權(quán)利要求1所述的組織工程化瓣膜，其特征是所述的種子細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
4.按權(quán)利要求1和2所述的組織工程化瓣膜，其特征是所述的脫細(xì)胞基質(zhì)是同種異體和異種瓣膜組織脫細(xì)胞基質(zhì)，心包組織脫細(xì)胞基質(zhì)和血管組織脫細(xì)胞基質(zhì)。
5.按權(quán)利要求1和3所述的組織工程化瓣膜，其特征是所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于骨髓，靜脈血管、動(dòng)脈血管和脂肪組織。
6.按權(quán)利要求1和3所述的組織工程化瓣膜，其特征是所述的成纖維細(xì)胞來(lái)源于骨髓和皮下結(jié)締組織。
7.按權(quán)利要求1所述的組織工程化瓣膜，其特征是所述瓣膜制備方法是先接種成纖維細(xì)胞于支架材料上，制成成纖維細(xì)胞---支架材料復(fù)合物，再于復(fù)合物表面接種血管內(nèi)皮細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程瓣膜，其特征是種子細(xì)胞接種密度為1×105---108/CM。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程化瓣膜及其制備方法。本發(fā)明采用脫細(xì)胞基質(zhì)作為可降解支架材料，提取血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞，由經(jīng)培養(yǎng)和傳代，種植于可降解支架材料，制成組織工程化瓣膜。本發(fā)明的可降解支架材料其生物相容性好、易于種植細(xì)胞，并能保存正常組織的天然結(jié)構(gòu)和組織強(qiáng)度。本組織工程化瓣膜組織是一種具有正常瓣膜組織組織結(jié)構(gòu)，并可自我更新，自我修復(fù)的活組織。無(wú)抗原性，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61L27/54GK1410036SQ02145458
公開(kāi)日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者譚強(qiáng) 申請(qǐng)人:譚強(qiáng)