專利名稱：含d－山梨醇的人干擾素包涵體的高效復性液及復性方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于重組人干擾素包涵體復性的復性液及其使用方法。
美國FDA于1986年首先批準基因工程IFNα2a(Roche公司生產)和IFNα2b(Schering公司生產)投放市場，中國學者侯云德等首創(chuàng)的IFNα1b也于1996年上市。隨后國內許多研究單位研制開發(fā)了α2a、α2b和γ型等干擾素產品。目前，由于IFN蛋白質表達量低，生產工藝復雜，以及表達物的生物活性較低，導致生產成本高，藥品價格昂貴，消費者使用干擾素的實際市場遠遠小于可以達到的規(guī)模。干擾素的社會和經(jīng)濟效益遠未發(fā)揮。
當外源基因在大腸桿菌中高效表達時，表達產物往往在細胞內聚集在一起，形成大小0.5～1μm的折光小體，即包涵體。盡管包涵體的形成原因尚不完全清楚，但它的形成卻能有效地抵抗細胞內蛋白酶的水解作用，并易于與細胞其他成分分離，極大地方便表達產物的純化。目前通過一些常規(guī)的方法即可得到較純的包涵體。包涵體內大部分成分(約50％以上)是目的蛋白，這些蛋白質的一級結構是正確的，但沒有經(jīng)過正確折疊形成天然的高級結構，因而缺乏生物學活性。因此，包涵體必須首先要被解散，分成單個目的蛋白，再使目的蛋白重新折疊成天然空間構型，才能得到具有生物學活性的目的蛋白。包涵體通常不溶于一般的水溶液，只溶于含變性劑(如鹽酸胍，脲)的溶液。但溶于變性液的包涵體蛋白完全失去了折疊構型，只保留一級結構和共價鍵。除去變性劑，讓變性蛋白產生折疊，獲得天然空間構型，恢復其生物活性的過程，就是蛋白質的復性。
目前蛋白質復性通常有兩種方法。一是稀釋法，稀釋溶有蛋白的變性液，溶液中變性劑濃度足夠低時，蛋白質開始復性；二是透析法，用透析、超濾等手段除去變性劑。稀釋法操作液體量太大，同時蛋白質濃度太小，為后續(xù)的提純蛋白增加困難，增加生產成本。透析法對設備要求較高，增加了設備投入，同時操作時間較長，可能導致蛋白質沉淀。專利文獻CN1299872A《人α2b型干擾素的基因合成、表達質粒構建及產物的制法》采用透析法復性，比活為1×108IU/mg。
包涵體經(jīng)目前的復性方法處理后，只有20％左右目的蛋白分子(汪家政等，蛋白質技術手冊，科學出版社，2001年，p31)得到正確的空間構型，獲得生物學活性，大部分寶貴的目的蛋白因為不能復性而不能利用。復性率較低的主要原因是，在重組蛋白的復性過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環(huán)境不適而無法形成正確的次級鍵等。復性效率、復性成本是制約基因藥物生產和成本的一個關鍵性的難題。
本發(fā)明的技術方案是，適當改變常規(guī)復性溶液的復性劑、離子強度和復性方法時，可使重組人IFN包涵體的復性率達到40％以上，是目前常用方法的2～3倍。
本發(fā)明用于重組蛋白質復性的復性液由Tris-HCl、EDTA、還原型谷胱苷肽、氧化型谷胱苷肽、D-山梨醇、雙蒸水或去離子水組成。具體地說，本發(fā)明的蛋白質復性溶液(以下均以1升溶液計)由100毫升0.06～0.20mol Tris-HCl液，pH7.0～8.5、0.44～0.60mol EDTA.pH7.5～8.5、1.0～2.8mmol還原型谷胱苷肽、0.1～0.36mmol氧化型谷胱苷肽、3.2％～8.2％D-山梨醇，余量為雙蒸水或去離子水組成。優(yōu)選Tris-HCl為0.08～0.17mol，pH7.5～8.3；更優(yōu)選Tris-HCl為0.10mol，pH8.0。優(yōu)選EDTA為0.44～0.55mol，pH7.5～8.3，最佳為0.50mol，pH為8.0。優(yōu)選還原型谷胱苷肽為1.0～2.8mmol，最佳為2.0mmol；氧化型谷胱苷肽優(yōu)選為0.1～0.36mmol，最佳為0.2mmol；D-山梨醇優(yōu)選為4.7％-7.1％，最佳為5.0％。
本發(fā)明復性液適用于重組蛋白質的復性，特別適用于重組人干擾素的復性。
有關使用本發(fā)明蛋白質復性溶液的具體實施方案如下，以重組IFN為例，說明重組蛋白質的分離、純化、洗滌、復性。1.1原核宿主細胞，優(yōu)選大腸桿菌(E.Coli BL21-DE3)以包涵體形式表達出所需的重組人IFN包涵體重組蛋白質，從培養(yǎng)物中按常規(guī)方法分離、提取和純化所述蛋白質包涵體。1.2洗滌液1由Tris-HCl(pH7.5)、EDTA和NaCl(濃度為0.2M)和水組成。
洗滌液2由Tris-HCl(pH7.5)、EDTA(pH8.0)、NaCl(濃度為0.2M)和水組成。
6M尿素洗滌液由尿素(濃度為6M)、Tris-HCl(pH7.5)、EDTA、NaCl(濃度為0.2M)和水組成。
8M鹽酸胍乙腚溶液由Tris-HCl(pH7.5)、鹽酸胍乙腚(guanidine-HCl(8M))、EDTA和水組成。1.3舉證性的分離、提取、純化、溶解步驟如下1)裂解菌體按離心后的沉淀菌體濕重，每克濕菌加入20～25毫升預冷的細菌裂解液，充分懸浮和裂解菌體。
2)分離可溶性IFN和IFN包涵體將上述裂解物離心(4℃，17000轉，60分鐘)。收集含IFN包涵體的沉淀物。另外，還可按照《分子克隆手冊》-實驗指南(美·J.薩姆布魯克等編，第二版，第845頁，科學出版社出版)描述的方法進行。
3)純化IFN包涵體步驟1將上步所得沉淀物充分懸浮混勻于洗滌液1，離心至液體清亮為止，棄上清，收沉淀。
4)純化IFN包涵體步驟2將上步所得沉淀物懸浮于洗滌液1，再加入等體積新鮮配制的6M尿素洗滌液，攪拌，離心至液體清亮為止，棄上清，收沉淀。
5)純化IFN包涵體步驟3將上步所得沉淀物懸浮混勻于洗滌液2，攪拌，離心至液體清亮為止，棄上清，收沉淀。
6)純化IFN包涵體步驟4將上步所得沉淀物懸浮混勻于雙蒸水或去離子水中洗滌，離心至液體清亮為止，棄上清，收沉淀。
7)純化IFN包涵體步驟5將上步所得沉淀物再次懸浮混勻于雙蒸水或去離子水中洗滌，離心至液體清亮為止，棄上清，收沉淀。此沉淀物的80％以上為重組人INF包涵體。
8)IFN包涵體的溶解將上步所得沉淀物放入8M鹽酸胍乙腚溶液，溶解IFN包涵體，攪拌，離心至液體清亮為止，棄沉淀，收獲含IFN的上清液。該收獲物經(jīng)薄層掃描檢測，干擾素蛋白純度可達到90％以上。1.4進行IFN蛋白復性步驟1)用8M鹽酸胍乙腚溶液將1.3第8步的收獲物稀釋到濃度為10mg蛋白/毫升。
2)將上步所得溶液，例如如果是300mg溶液，則分3次加入到1升本發(fā)明復性液中，復性48小時。
3)將上步所得溶液離心(4℃，6000～8000轉，60分鐘)，收獲上清液(干擾素蛋白純度可達90％以上)。
本發(fā)明獲得了能夠顯著提高復性率、設備要求非常簡單的復性液配方及復性方法。這將會大大降低產品的生產成本，意味著巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
A.變性洗滌溶解系統(tǒng)配液1.洗滌液1配制1M Tris-HCl(pH8.0)溶液10毫升0.5M EDTA(pH8.0)溶液 20毫升2M NaCl 50毫升雙蒸水(或去離子水)加到1000毫升2.6M尿素洗滌液1M Tris-HCl(pH8.0)溶液10毫升0.5M EDTA(pH8.0)溶液 20毫升2M NaCl 50毫升尿素 360克雙蒸水(或去離子水)加到1000毫升3.洗滌液2配制1M Tris-HCl(pH8.0)溶液10毫升0.5M EDTA(pH8.0)溶液 2毫升NaCl 58.4克雙蒸水(或去離子水)加到1000毫升4.IFN包涵體溶解液配制1M Tris-HCl(pH8.0)溶液100毫升0.5M EDTA(pH8.0)溶液 0.4毫升鹽酸胍乙腚(Guanidine.HCL) 764.24克雙蒸水(或去離子水)加到1000毫升B復性液配制

實施例2人干擾素α2a基因表達產物的純化及復性1)用于表達新型人干擾素α2a修飾重組基因的表達系統(tǒng)是E.coli原核表達系統(tǒng)，原始質粒為PBR32。采用常規(guī)培養(yǎng)條件和常規(guī)LB培養(yǎng)基。配制1.升培養(yǎng)基，蛋白胨(Trypton)10克，酵母提取物(Yeast Extract)10克，氯化鈉(NaCl)5克，雙蒸水1000毫升。培養(yǎng)采用37℃恒溫，振蕩培養(yǎng)，以IPTG誘導劑誘導表達。從接種菌種到收獲培養(yǎng)物的全過程時間為7小時，離心收獲8.2克濕菌體。
2)復性液配制配制復性液1共3升。
3)按1.3所述方法初步純化不溶性干擾素表達產物。
4)按1.4所述方法，用本實施例2)所述復性液，將溶解于8M鹽酸胍乙腚溶液的干擾素α2a蛋白復性。
5)收獲復性重組人干擾素α2a蛋白。經(jīng)測定，總量為613毫克/升培養(yǎng)物，比活性為1.15×108U/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度達90％以上，復性率為43％。實施例3人基因重組干擾素α2b的分離、純化與復性1)用于表達新型人干擾素α2b修飾重組基因的表達系統(tǒng)是E.coli原核表達系統(tǒng)，原始質粒為PBR32。采用常規(guī)培養(yǎng)條件和常規(guī)LB培養(yǎng)基。配制1升培養(yǎng)基，蛋白胨(Trypton)10克，酵母提取物(Yeast Extract)10克，鹽(NaCl)5克，雙蒸水1000毫升。培養(yǎng)采用37℃恒溫，振蕩培養(yǎng)，以IPTG誘導劑誘導表達。從接種菌種到收獲培養(yǎng)物的全過程時間為7小時，離心收獲8.4克濕菌體。
2)配制復性溶液復性液1共3升。
3)按1.3所述方法初步純化不溶性干擾素表達產物。
4)按1.4所述方法，用本實施例2)所述復性液，將溶解于8M鹽酸胍乙腚溶液的干擾素α2b蛋白復性。
5)收獲重組人干擾素α2b蛋白，經(jīng)測定，復性后IFN蛋白總量為861毫克/升培養(yǎng)物，比活性1.31×108U/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度達到90％以上，復性率為41％。實施例4人干擾素α2a基因表達產物的純化及復性基本按實施例1所述步驟進行，不同的是用復性液2。
培養(yǎng)所得濕菌體8.1克，復性后獲得人干擾素α2a蛋白575毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.16×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率為42％。實施例5人基因重組干擾素α2b的分離、純化與復性基本上按實施例2所述分離純化大腸桿菌表達的人干擾素α2b，不同的是，在復性過程中使用復性液2。
培養(yǎng)所得濕菌體8.0克，復性后獲得人干擾素α2b蛋白915毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.30×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率44％。實施例6人干擾素α2a基因表達產物的純化及復性基本按實施例1所述步驟進行，不同的是用復性液3。
培養(yǎng)所得濕菌體8.1克，復性后獲得人干擾素α2a蛋白575毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.16×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率為42％。實施例7人基因重組干擾素α2b的分離、純化與復性基本按實施例2所述步驟進行，不同的是，在復性過程中使用復性液3。
培養(yǎng)所得濕菌體8.0克，復性后獲得人干擾素α2b蛋白915毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.30×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率44％。實施例8人干擾素α2a基因表達產物的純化及復性基本按實施例1所述步驟進行，不同的是用復性液4。
培養(yǎng)所得濕菌體8.1克，復性后獲得人干擾素α2a蛋白575毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.16×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率為42％。實施例9人基因重組干擾素α2b的分離、純化與復性基本上按實施例2所述步驟進行，不同的是，在復性過程中使用復性液4。
培養(yǎng)所得濕菌體8.0克，復性后獲得人干擾素α2b蛋白915毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.30×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率44％。實施例10人干擾素α2a基因表達產物的純化及復性基本按實施例1所述步驟進行，不同的是用復性液5。
培養(yǎng)所得濕菌體8.1克，復性后獲得人干擾素α2a蛋白575毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.16×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率為42％。實施例11人基因重組干擾素α2b的分離、純化與復性基本上按實施例2所述步驟進行，不同的是，在復性過程中使用復性液5。
培養(yǎng)所得濕菌體8.0克，復性后獲得人干擾素α2b蛋白915毫克/升培養(yǎng)物，比活性達1.30×108IU/mg，經(jīng)薄層掃描證實，純度為90％以上，復性率44％。實施例12測定重組人干擾素蛋白質的復性效果對實施例1-4的復性效果進行測定。
1)蛋白含量測定采用Bradford比色法測定重組人IFNα2a、IFNα2b復性液中的蛋白含量方法a)分別在兩組試管各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA；5、10、15、20ul)以復性液補足至100ul，同時分別以兩管100ul的復性液作空白對照。
b)每管各加入0.9ml考馬斯亮藍染料溶液，振蕩混勻，置室溫2min。
c)用1cm光徑的微量比色杯測A595，取A595吸光值，對標準蛋白濃度作圖，畫出標準曲線。
d)將待測樣品用包涵體復性液稀釋5倍，取100ul，重復上述步驟測A595，從BSA標準曲線中確定待測樣品的蛋白濃度。
表1標準濃度BSA溶液A595值

表2重組人干擾素各樣品濃度測定

2)重組人干擾素的蛋白純度測定。
采用非還原型SDS-PAGE電泳凝膠薄層掃描法檢定方法a)樣品用2×SDS加樣緩沖液按1∶1(V/V)處理；b)采用10％丙烯酰胺濃度的分離膠；c)上樣量為15ul；
d)脫色后的凝膠應存放于由脫色液和染色液配制的平衡液(A650＝0.1)中過夜，直至掃描測定。
e)對已脫色的凝膠以650nm波長掃描，測定主帶(目的蛋白)及各副帶(雜蛋白)中所含染料結合物的量，以此確定純度。
表3凝膠掃描數(shù)據(jù)

掃描結果顯示該樣品達到電泳級純度，純度計算值為100％，保守估計純度大于90％。3)重組人干擾素抗病毒活性的效價測定采用國家藥品質量控制標準規(guī)定的方法，測定干擾素抗病毒活性及抗病毒效價，以檢定干擾素活性的標準細胞株(WISH細胞)和病毒株(VSV)，采用細胞病變抑制法進行檢測，并以國家標準干擾素α2a參比品校準確定效價(IU/ml)。每一樣品分別由兩名質檢人員獨立重復一次，取平均值。樣品及參比品以含7％牛血清的MEM培養(yǎng)液連續(xù)4倍稀釋8個梯度，每個梯度各100微升(μL)平行4孔加入預先鋪有WISH細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時后，每孔以100TCID50 VSV攻毒，37℃、5％ CO2培養(yǎng)24小時。觀察記錄各孔細胞病變情況，計算各樣品效價，結果見表4。
表4干擾素效價測定

注樣品1、2、3、4分別取自實施例1、2、3、4。
權利要求
1.一種蛋白質復性溶液，其特征在于所述復性溶液(以每升溶液計)由Tris-HCl、EDTA、還原型谷胱苷肽、氧化型谷胱苷肽、D-山梨醇、雙蒸水或去離子水組成。
2.權利要求1的蛋白質復性溶液，其特征在于Tris-HCl為0.06mol～0.20mol，pH7.0～8.5。
3.權利要求2的蛋白質復性溶液，其特征在于Tris-HCl為0.45mol～0.55mol，pH7.0～8.3。
4.權利要求3的蛋白質復性溶液，其特征在于Tris-HCl為0.50mol，pH8.0。
5.權利要求1～4的任一蛋白質復性溶液，其特征在于EDTA為0.44mol～0.60mol，pH7.5～8.5。
6.權利要求1～4的任一蛋白質復性溶液，其特征在于EDTA為0.45mol～0.55mol，pH7.5～8.5。
7.權利要求1～4的任一蛋白質復性溶液，其特征在于EDTA為0.50mol，pH8.0。
8.權利要求1～7的任一蛋白質復性溶液，其特征在于D-山梨醇的濃度為3.2％～8.2％。
9.權利要求1～7的任一蛋白質復性溶液，其特征在于D-山梨醇的濃度為4.7％～7.1％。
10.權利要求1～7的任一蛋白質復性溶液，其特征在于D-山梨醇的濃度為5.0％。
11.權利要求1～10的任一蛋白質復性溶液，其特征在于氧化型谷胱苷肽為0.1mmol～0.36mmol。
12.權利要求1～10的任一蛋白質復性溶液，其特征在于氧化型谷胱苷肽為0.17mmol～0.3mmol。
13.權利要求1～10的任一蛋白質復性溶液，其特征在于氧化型谷胱苷肽為0.2mmol。
14.權利要求1～13的蛋白質復性溶液，其特征在于還原型谷胱苷肽的含量為1.0mmol～2.8mmol。
15.權利要求1～13的蛋白質復性溶液，其特征在于還原型谷胱苷肽的含量為1.5mmol～2.4mmol。
16.權利要求1～13的蛋白質復性溶液，其特征在于還原型谷胱苷肽的含量為2.0mmol。
17.權利要求1～16任一蛋白質復性溶液用于重組人干擾素包涵體復性的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人干擾素包涵體蛋白質的復性溶液及復性方法。其特征在于:所述復性溶液(以每升溶液計)由Tris－HCl、EDTA、還原型谷胱苷肽、氧化型谷胱苷肽、D－山梨醇、雙蒸水或去離子水組成。本發(fā)明的復性溶液及分步加樣、一次復性的方法,使蛋白質的復性率大大提高,同時簡化復性工藝及所需設備,從而大大提高目的蛋白的收獲率,降低重組人干擾素的生產成本。
文檔編號A61K38/21GK1422866SQ0214621
公開日2003年6月11日 申請日期2002年10月16日 優(yōu)先權日2002年10月16日
發(fā)明者白憲鶴, 林雨霖 申請人:武漢柏傲生物工程有限公司