專利名稱：用靈芝孢子抗衰老\對(duì)絕經(jīng)癥狀的緩解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種給人口服有效量的萌芽激活的靈芝孢子(“GLSs”)來(lái)預(yù)防/減緩衰老過(guò)程和/或減少/緩解絕經(jīng)癥狀的方法。GLSs的抗衰老作用主要來(lái)自于它是自由基保護(hù)的抗氧化劑。GLSs也能夠減少和/或緩解與絕經(jīng)有關(guān)的癥狀，尤其是男性絕經(jīng)，特別是由衰老引起的。與男性絕經(jīng)有關(guān)的癥狀包括疲勞、厭食、心悸、遺忘、易怒、抑郁和/或陽(yáng)痿。
細(xì)胞中有可防止大多數(shù)但不是所有的自由基損害的抗氧化劑防御系統(tǒng)。不斷的自由基的損害最終能殺死細(xì)胞。當(dāng)自由基殺死或損害生命體中足夠的細(xì)胞時(shí)，該生命體就會(huì)衰老。
抗氧化劑防御系統(tǒng)通過(guò)使用抗氧化劑來(lái)除去自由基。有大量的證據(jù)支持自由基和衰老之間是有聯(lián)系的。例如，動(dòng)物活的越長(zhǎng)，在其體內(nèi)具有的抗氧化劑就越多。一些抗氧化劑是由機(jī)體通過(guò)外源性酶如催化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)所產(chǎn)生的。其他則來(lái)自于口腔消化如維生素C、維生素E、b-胡蘿卜素、硒等。人們相信服用抗氧化劑除去體內(nèi)多余的自由基能夠減緩衰老過(guò)程。一些研究表明抗氧化劑可以幫助預(yù)防心臟病、一些癌癥、白內(nèi)障和其他當(dāng)人變老時(shí)更常見(jiàn)的健康問(wèn)題。
人面部衰老的問(wèn)題之一是男性絕經(jīng)的發(fā)生。據(jù)估計(jì)大約40％的男性在其40、50和60歲時(shí)會(huì)經(jīng)歷某些程度的男性絕經(jīng)。男性絕經(jīng)是研究人員于1970年首次發(fā)表的最新認(rèn)識(shí)，也稱作雄性絕經(jīng)(andropause)。
不如女性絕經(jīng)那么普遍的男性絕經(jīng)發(fā)展較慢，并且一些人從沒(méi)有體驗(yàn)到。男性絕經(jīng)包括激素、生理和化學(xué)變化，常出現(xiàn)在40到55歲之間的男性。其特點(diǎn)是嗜眠、抑郁、更加易怒、情緒漲落、性欲減少、勃起障礙和識(shí)別警覺(jué)。盡管它的起因還沒(méi)有完全闡明，但已經(jīng)知道象激素缺乏、酒精消耗過(guò)渡、吸煙、高血壓、藥物、飲食較次、缺少鍛煉、循環(huán)較差和心理問(wèn)題等因素決定著這種疾病。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即使在健康男性到55歲比45歲時(shí)雄性激素睪酮的血液含量也顯著下降。實(shí)際上，到80歲，大多數(shù)雄性激素水平已經(jīng)下降到青春期前的水平。低睪酮是與疲勞、抑郁、注意力喪失和肌肉強(qiáng)度和耐受力下降有關(guān)的。
抑郁是男性絕經(jīng)另外一個(gè)常見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)。按照在1991 NIH Consens Statement中的流行病集中區(qū)研究，抑郁癥狀出現(xiàn)在大約15％的65歲公眾居民中?；颊弑憩F(xiàn)為心情沮喪、沒(méi)有胃口、失眠、無(wú)力和失去正常生活追求的興趣和快樂(lè)。通常抑郁在老年人中是診斷不出來(lái)和不進(jìn)行治療的，主要的原因是保健提供者和/或患者自己經(jīng)常認(rèn)為抑郁是生理疾病的正常結(jié)果以及與老年人有關(guān)的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。目前，沒(méi)有一種可提供綜合緩解與男性絕經(jīng)有關(guān)癥狀，尤其是用于老年人的最好的藥劑。
靈芝(Ganoderma lucidum Leyss ex Fr.Karst)是一種多孔真菌。它屬于擔(dān)子菌種多孔屬的靈芝科。自古以來(lái)，靈芝就被稱贊為益壽延年的奇異真菌。人們相信，靈芝的醫(yī)療作用取決于它所產(chǎn)生的天然或生物活性物質(zhì)，這種物質(zhì)能夠刺激或調(diào)節(jié)人體的神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)抵抗疾病。靈芝具有抗腫瘤和提高免疫性能的特性(Kim等，Int.J.Mol.Med.(1999)，4(3)273-277)、心血管作用(Lee等，Chem.Pharm.Bull.(1990)，381359-1364)以及清除自由基和抗肝細(xì)胞毒的活性(Lin等，J.Ethnopharmacol.，(1995)，47(1)33-41)也是公知的。
靈芝在中藥中是特別稀少的和最有價(jià)值的。在中國(guó)，它被稱作“靈芝”(”lingzhi”)，已有5,000年。有各種靈芝，例如G.Lucidum(紅色)、樹(shù)舌靈芝(棕色)、松杉靈芝(紅色)、G.Sinese(黑色)和G.Oregonense(黑棕色)。但是，由于野生型的靈芝只天然和非常稀少地生長(zhǎng)在高山枯樹(shù)上這一現(xiàn)象，所以很少進(jìn)行要求不斷提供大量和高質(zhì)量的靈芝的研究。
盡管人們相信靈芝孢子存在靈芝的精華，因?yàn)樗鼈兒兴械纳锘钚晕镔|(zhì)，但是大多數(shù)的靈芝研究是用靈芝的子實(shí)體或菌絲體作為試驗(yàn)材料進(jìn)行的。很少有人研究靈芝孢子。
靈芝孢子是細(xì)小的，體積為5-8μm霧狀孢子，它有非常堅(jiān)硬的有彈性的雙層孢子壁，所以很難將其打開(kāi)。靈芝孢子一般在成熟靈芝的菌蓋播散。當(dāng)成熟時(shí)，靈芝孢子就從菌蓋中彈出。將所彈出的靈芝孢子收集起來(lái)就稱之為“孢子粉”。在野外，很難收集“孢子粉”，這是因?yàn)橄铝性?1)孢子的萌芽率(即大約3-15％)非常低；(2)彈射期很短(即每生命周期大約有10天)；(3)一些環(huán)境因素如風(fēng)和雨也會(huì)妨礙孢子的收集。此外，由于孢子壁的彈性所收集孢子的物質(zhì)也很難提取出來(lái)。
近年來(lái)，隨著孢子破壁技術(shù)的改進(jìn)，涉及靈芝孢子試驗(yàn)的許多研究也得以進(jìn)行。但是，孢子破壁技術(shù)的改進(jìn)沒(méi)有克服孢子低萌芽率的缺點(diǎn)。實(shí)際上，由于低萌芽率，對(duì)靈芝孢子的大多數(shù)研究是使用從代表睡眠狀態(tài)的排列到各種萌芽期的孢子中提取的生物活性物質(zhì)進(jìn)行的。因?yàn)樵诓煌h(huán)期的孢子會(huì)產(chǎn)生不同種和/或比例的生物活性物質(zhì)，所以每批孢子混合物含有不同的活性成分。由于無(wú)法提供適當(dāng)?shù)膶?duì)照，所以這類研究的結(jié)果顯然是沒(méi)有意義的。
在本申請(qǐng)的原始申請(qǐng)中公開(kāi)了萌芽激活方法，原始申請(qǐng)已經(jīng)公布為美國(guó)專利6,316,002B1，本文將其引用為參考。該方法提供了睡眠狀態(tài)的靈芝孢子的成功激活并將靈芝孢子的萌芽率增加到95％以上。
在下面所述的本發(fā)明中，將介紹一種使用萌芽激活的靈芝孢子(“GLSs”)作為白由基清除劑(即抗氧化劑)和抗衰老劑，特別是用于減少/緩解與男性絕經(jīng)有關(guān)的癥狀的方法。GLSs具有許多生物活性并能夠促進(jìn)一般健康。特別是，它在去除自由基、促進(jìn)激素產(chǎn)生和抗抑郁的活性使得GLSs對(duì)治療與老年有關(guān)的疾病(即抗衰老)和男性絕經(jīng)是有效的。
影響衰老的因素之一是自由基的損害。GLSs是一種抗氧化劑。當(dāng)給人每天口服大約0.5到10g，優(yōu)選每天大約1到5g的GLSs時(shí)，它顯示出保護(hù)人體不受自由基損害的抗氧化作用。例如，GLSs增加了人體中還原形式的谷胱甘肽(GSH)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
與男性絕經(jīng)有關(guān)的癥狀是疲勞、厭食、心悸、遺忘、易怒、抑郁、陽(yáng)痿以及它們的組合。男性絕經(jīng)在老年男性中是特別明顯的。
為了減少或緩解男性絕經(jīng)癥狀，給患者每天服用大約0.5到10g的GLSs，更優(yōu)選大約1到5g的GLSs。GLSs能夠增加患者的睪酮的血液含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。GLSs也降低了患者血液中丙二醛(MDA)的含量。此外，GLSs還改善了患者尤其是老年人的抑郁癥狀。
選擇靈芝的成熟孢子進(jìn)行加工處理。孢子的加工處理分為三個(gè)明顯的階段，從而有效保存萌芽激活的孢子所產(chǎn)生的大量生物活性物質(zhì)。第一階段包括誘發(fā)萌芽，將孢子浸泡在溶液中一定時(shí)間，接著在通風(fēng)很好的培養(yǎng)盒中培養(yǎng)萌芽誘發(fā)的孢子來(lái)實(shí)現(xiàn)。第二階段包括破壁(即，打破孢子的細(xì)胞壁)孢子的生產(chǎn)，它是通過(guò)酶處理和/或機(jī)械力量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。最后階段包括從破壁的孢子中提取生物活性物質(zhì)，它是通過(guò)用溶劑提取或通過(guò)薄膜濃縮后冷凍干燥或真空干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
以下是可生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的整體描述I.誘發(fā)萌芽的浸泡仔細(xì)挑選成熟和完整的靈芝孢子進(jìn)行誘發(fā)萌芽的浸泡過(guò)程。將孢子放在清澈或蒸餾水、生理鹽水或其他可使紅芝孢子快速萌芽的營(yíng)養(yǎng)溶液中。營(yíng)養(yǎng)溶液的例子包括可可果汁或1-5％麥芽提取液、0.5-25％的靈芝子實(shí)體或靈芝孢內(nèi)絲提取液或者0.1-5％含有生物素的培養(yǎng)溶液、0.1-3％含有磷酸鉀(音堿)和硫酸鎂的培養(yǎng)溶液。溶液的選擇取決于所需的浸泡時(shí)間、要加工的孢子量和其他如材料可獲得的因素。上述萌芽溶液可以使用一種或多種，加入量是紅芝孢子重量的0.1-5倍。浸泡時(shí)間按照水溫來(lái)確定，通常浸泡是在20-43℃水溫下進(jìn)行30分鐘到8個(gè)小時(shí)。優(yōu)選浸泡時(shí)間是2-4個(gè)小時(shí)而水溫是25-35℃。
II.激活培養(yǎng)從浸泡溶液中去除靈芝孢子，多余的溶液讓其滴盡。然后將孢子放在固定溫度和濕度的通風(fēng)很好的培養(yǎng)盒中，從而進(jìn)行孢子的激活培養(yǎng)。培養(yǎng)基的相對(duì)濕度一般設(shè)定在65-98％，培養(yǎng)基的溫度在18-48℃，并且激活時(shí)間持續(xù)30分鐘到24小時(shí)。優(yōu)選濕度為85-97％，而溫度為25-35℃。使用該方法，紅芝孢子的激活可以達(dá)到95％以上的比率。在激活期間，紅芝孢子的細(xì)胞壁明顯軟化，從而很容易滲透過(guò)孢子細(xì)胞壁。
III.孢子壁的處理在萌芽激活處理后，用酶解處理這些孢子。該工藝是在低溫和可保持酶活性的條件下使用常用于工業(yè)的殼多糖酶、纖維素酶或其他酶進(jìn)行的。當(dāng)孢子壁失去彈性并變得脆弱時(shí)，工藝結(jié)束。另外一種選擇，進(jìn)行物理處理來(lái)滲透細(xì)胞壁，例如微粉化、球壓、研磨、超高壓微氣流處理和滲透率在99％以上的其他工業(yè)上可以使用的常用的機(jī)械方法。
IV.干燥/包囊在低溫下用常規(guī)方法如冷凍干燥或真空干燥等工業(yè)上常用的方法進(jìn)行。所得到的產(chǎn)物有低于4％的濕度。干燥的GLSs是粉狀并被鑲在囊中。每個(gè)膠囊含300mg的干燥GLSs。
GLSs的口服優(yōu)選劑量是大約每次2-4個(gè)膠囊，每日1-3次。
在本發(fā)明的描述中使用了特殊的術(shù)語(yǔ)。為了清楚，將這些術(shù)語(yǔ)解釋如下。可以理解為，每個(gè)特殊術(shù)語(yǔ)包括所有以相似方式完成相似目的的技術(shù)等同物。
術(shù)語(yǔ)“自由基”是指在細(xì)胞代謝中不斷產(chǎn)生的高活性物質(zhì)，它對(duì)生命體有損害作用。自由基是帶有不成對(duì)電子的原子。產(chǎn)生化學(xué)能量的細(xì)胞區(qū)域的線粒體產(chǎn)生自由基，并且對(duì)自由基損害來(lái)說(shuō)是在原始部位。自由基能夠誘發(fā)氧化反應(yīng)，引起蛋白交聯(lián)和損害、降低酶的活性、引起核酸的異常代謝并引起生物膜上多不飽和脂質(zhì)的過(guò)氧化。自由基攻擊的結(jié)果造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及生命體中的各種器官的損壞，從而導(dǎo)致衰老和多種病因。
術(shù)語(yǔ)“谷胱甘肽”或“GSH”是指谷胱甘肽的還原形式。谷胱甘肽是體內(nèi)小分子量的清除劑。普遍存在的三肽L-谷胱甘肽(GSH)(γ-谷氨二酰基-半胱氨酰-甘氨酸)是公知的生物抗氧化劑，并且實(shí)際上相信它是高級(jí)生命體最原始的細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑。當(dāng)被氧化時(shí)，它形成了二聚物(GSSG)，在有谷胱甘肽還原酶的器官中循環(huán)。GSH是體內(nèi)維持適當(dāng)氧化狀態(tài)的原始細(xì)胞抗氧化劑。大多數(shù)細(xì)胞可以合成GSH，在飲食中也可以提供GSH。它已顯示出可以將氧化過(guò)的生物分子循環(huán)回它們的活性還原形式。在成年人中，GSH是從肝臟最先氧化過(guò)的谷胱甘肽(GSSG)中生成，并且很小部分由骨骼肌、紅細(xì)胞和白細(xì)胞生產(chǎn)。細(xì)胞中缺乏谷胱甘肽會(huì)導(dǎo)致過(guò)量的自由基，這些自由基會(huì)引起大分子降解、脂質(zhì)過(guò)氧化、形成毒素并最終細(xì)胞死亡。因?yàn)楣入赘孰脑陬A(yù)防細(xì)胞氧化中的重要性，谷胱甘肽需要不斷供給組織。組織中的GSH含量是評(píng)價(jià)體內(nèi)抗氧化能力的重要因素。
術(shù)語(yǔ)“過(guò)氧化物歧化酶”或“SOD”是指可催化過(guò)氧化物離子歧化成氧和過(guò)氧化氫的金屬酶。有三種類型的SODs，每種都以活性部位的催化金屬為特征，即，Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。Cu/Zn-SOD主要發(fā)現(xiàn)于真核生物中。Fe-SOD主要發(fā)現(xiàn)于原核生物中。Mn-SOD跨越了從原核生物到真核生物的整個(gè)范圍。在人體內(nèi)，Cu/Zn-SOD位于胞質(zhì)溶膠和核中，同時(shí)Mn-SOD位于線粒體基質(zhì)中。SOD的分子量大，口服給藥不能被吸收到人體中。
術(shù)語(yǔ)“丙二醛”或”MDA”是指毒性和誘變的化合物丙二醛。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的二級(jí)還原產(chǎn)物。它是具有兩個(gè)功能團(tuán)的化合物，并且能夠與含氨基團(tuán)化合物如蛋白質(zhì)、核酸、腦磷脂等反應(yīng)，使其交聯(lián)并由此喪失其功能、蛋白變性結(jié)果、喪失酶活性和損害DNA。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，MDA也是一個(gè)可誘發(fā)動(dòng)物腫瘤的強(qiáng)致癌物。腫瘤組織中MDA的測(cè)定能夠直接反應(yīng)出腫瘤所引起的脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。
術(shù)語(yǔ)“男性絕經(jīng)”是指通常在40到55歲之間的所有男性出現(xiàn)的激素性、生理性和化學(xué)性變化。
術(shù)語(yǔ)“SRS”是指監(jiān)控級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)。SRS測(cè)定了患者/對(duì)象接受給予關(guān)心者的監(jiān)控程度。SRS分為13個(gè)順序級(jí)別的監(jiān)控水平，它們可以任選為5個(gè)級(jí)別的類別(獨(dú)立的，監(jiān)控一夜、部分時(shí)間的監(jiān)控、全程間接監(jiān)控和全程直接監(jiān)控)。臨床醫(yī)生在與對(duì)象和對(duì)象所接受的首次觀察的監(jiān)控水平的被調(diào)查者的交談基礎(chǔ)上分級(jí)給出SRS。
術(shù)語(yǔ)“Zung自我分級(jí)的抑郁標(biāo)準(zhǔn)”或“Zung自我分級(jí)的抑郁標(biāo)準(zhǔn)”是指使用抑郁疾病中所發(fā)現(xiàn)的Trait簡(jiǎn)單和具體評(píng)估的儀器。它是在Zung WW，Arch.Gen.Psychiat.(1965)1263-70后命名的。
下列實(shí)施例是詳細(xì)說(shuō)明但不是限定本發(fā)明的范圍。在不脫離本發(fā)明的范圍本文都可以作合理的變化，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所能做到的那些。在本發(fā)明的描述中，為了清楚也使用了特殊術(shù)語(yǔ)。但是，本發(fā)明的目的不是限制所選擇的特殊術(shù)語(yǔ)?？梢岳斫鉃槊總€(gè)具體組成包括所有以相似方式完成顯示目的的技術(shù)等同物。
實(shí)施例1GLSs對(duì)小白鼠肝臟谷胱甘肽(GSH)含量的作用谷胱甘肽(GSH)是體內(nèi)低分子量的清除劑。它能夠除去O2-或H2O2。組織中GSH的含量是評(píng)價(jià)體內(nèi)抗氧化能力的重要因素。1.材料和方法1.1 材料從廣東省醫(yī)療試驗(yàn)動(dòng)物中心(Guangdong Provincial Animal Center for MedicalExperiments)，執(zhí)照統(tǒng)一號(hào)26-2001A008(動(dòng)物檢查)和26-2001B008(動(dòng)物設(shè)施)中獲得60只NIH小白鼠，一半雄性和一半雌性，體重18-22g。
萌芽激活的靈芝孢子(“GLSs”)(0.2g/mL)是從中山大學(xué)生命科學(xué)院的廣州綠色食品項(xiàng)目公司(Guangzhou Green Food Project Company of the College of LifeSciences，Zhongshan University)以及瑞士和香港的綠能健康產(chǎn)品國(guó)際公司(GreenPower Health Products International Co.Ltd.，Sweden and Hong Kong)中獲得。1.2 儀器和試驗(yàn)試劑試驗(yàn)儀器包括752 UV-Vis紫外分光光度計(jì)；TL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；CS-502超恒溫水浴；SL122電子天平；渦動(dòng)攪拌器。
試驗(yàn)試劑包括GSH試驗(yàn)試劑盒，由中國(guó)南京的Jenchun生物技術(shù)研究所(Jenchun Biotech Research Institute，Nanjing，China)提供；總蛋白試驗(yàn)試劑盒，由中國(guó)北京的Chungshen生物技術(shù)高科技公司(Chungshen Biotech Hi-tech Co.，Beijing，China)提供。1.3 方法將小白鼠隨機(jī)地分為5組，每組12只。4個(gè)治療組連續(xù)15天，通過(guò)管飼法接受1g/kg/天、2g/kg/天、4g/kg/天或8g/kg/天的GLSs。對(duì)照組連續(xù)15天，每天通過(guò)管飼法接受鹽水。
在治療期后，將動(dòng)物殺死并取出肝臟。從各精確稱量的大約0.2g肝臟組織中制備10％勻漿并離心分離。取30μL等份的各上清液并使用GSH試劑盒和總蛋白試劑盒測(cè)定GSH和蛋白質(zhì)的含量。GSH的含量表示為mg/mg蛋白。2.結(jié)果如表1所示，當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)，所有的治療組肝臟組織中的GSH含量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都具有顯著意義的增加(成對(duì)的t試驗(yàn)，p＜0.01)。表1.GLSs對(duì)小白鼠肝臟GSH含量的作用(x±s)

3.結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)GLSs顯著增加了NIH小白鼠的GSH含量。這表明在該試驗(yàn)條件下，GLSs具有抗衰老和抗氧化活性，這一點(diǎn)通過(guò)它增加體內(nèi)GSH含量的能力所證實(shí)。
實(shí)施例2GLSs對(duì)小白鼠肝臟的超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用1.材料和方法1.1 材料從廣東省醫(yī)療試驗(yàn)動(dòng)物中心，執(zhí)照統(tǒng)一號(hào)26-2001A009(動(dòng)物檢查)和26-2001B008(動(dòng)物設(shè)施)中獲得60只NIH小白鼠，一半雄性和一半雌性，體重18-22g。
萌芽激活的靈芝孢子粉(GLSs)是從中山大學(xué)生命科學(xué)院的廣州綠色食品項(xiàng)目公司和瑞士和香港的綠能健康產(chǎn)品國(guó)際公司中獲得的。1.2 儀器和試驗(yàn)試劑試驗(yàn)儀器包括752UV-Vis紫外光光度計(jì)；TL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；CS-502超恒溫水?。籗L122電子天平；渦動(dòng)攪拌器。
試驗(yàn)試劑包括SOD試劑盒，由中國(guó)南京的Jenchun生物技術(shù)研究所提供。SOD的酶活性以nmol/mL計(jì)算。1.3 方法將60只小白鼠隨機(jī)地分為5組(4個(gè)治療組和1個(gè)對(duì)照組)，每組12只。4個(gè)治療組連續(xù)15天通過(guò)管飼法接受1g/kg/天、2g/kg/天、4g/kg/天或8g/kg/天的GLSs。對(duì)照組連續(xù)15天每天通過(guò)管飼法接受鹽水。
在治療期結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物殺死并取出肝臟。從各動(dòng)物中取大約0.2g的肝臟組織并加入到2mL的鹽水溶液，通過(guò)勻化形成10％的勻漿。將該勻漿離心分離。取30μL等份的各勻漿的上清液并使用SOD試劑盒測(cè)試SOD。2. 結(jié)果如表2所示，當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)，所有的治療組小白鼠的總肝臟SOD(T-SOD)酶活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都具有顯著意義的增加(成對(duì)的t試驗(yàn)，p＜0.01-0.05)。表2.GLSs對(duì)小白鼠肝臟T-SOD酶活性的作用(x±s)

T-SOD總SOD如表3所示，當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)，所有的治療組的肝臟Cu.Zn-SOD酶活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都具有顯著意義的增加(成對(duì)的t試驗(yàn)，p＜0.01-0.05)。表3.GLSs對(duì)小白鼠肝臟Cu.Zn-SOD酶活性的作用(x±s)

如表4所示，當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)，所有的治療組的肝臟Mn-SOD酶活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都具有顯著意義的增加(成對(duì)的t試驗(yàn)，p＜0.01-0.05)。表4.GLSs對(duì)小白鼠肝臟Mn-SOD酶活性的作用(x±s)

3. 結(jié)論結(jié)果顯示，用GLSs治療15天，顯著增加了NIH小白鼠肝臟的SOD酶活性。當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)，總SOD(T-SOD)、細(xì)胞溶質(zhì)SOD(Cu.Zn-SOD)和線粒體SOD(Mn-SOD)酶活性在所有劑量時(shí)全都顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增長(zhǎng)。這表明在該試驗(yàn)條件下，GLSs具有抗氧化活性。
實(shí)施例3GLSs對(duì)小白鼠肝臟丙二醛(MDA)含量的作用體內(nèi)酶反應(yīng)或非酶反應(yīng)所產(chǎn)生的氧自由基在生物膜上攻擊多不飽和脂肪酸(PUFA)。這些攻擊使得脂質(zhì)過(guò)氧化；形成含有功能基如醛(例如丙二醛，MDA)、酮、羥基、羰基、過(guò)氧化氫、過(guò)氧化物等的脂質(zhì)過(guò)氧化物；并形成新自由基等。這樣MDA水平反應(yīng)了脂質(zhì)過(guò)氧化的程度并間接地與細(xì)胞損害的嚴(yán)重程度相關(guān)。
MDA的測(cè)定經(jīng)常與SOD的發(fā)現(xiàn)結(jié)合起來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞功能。SOD的活性提示了細(xì)胞除去氧自由基的能力而由于氧自由基的攻擊，所以MDA的含量反應(yīng)了細(xì)胞的損害嚴(yán)重程度。1. 材料和方法1.1 材料從廣東省醫(yī)療試驗(yàn)動(dòng)物中心，執(zhí)照統(tǒng)一號(hào)26-2001A008(動(dòng)物檢查)和26-2001B008(動(dòng)物設(shè)施)中獲得60只NIH小白鼠，一半雄性和一半雌性，體重18-22g。
萌芽激活的靈芝孢子粉(GLSs)是從中山大學(xué)生命科學(xué)院的廣州綠色食品項(xiàng)目公司和瑞士和香港的綠能健康產(chǎn)品國(guó)際公司中獲得的。將GLSs溶于適當(dāng)?shù)乃芤旱阶罱K濃度為0.2g/mL。1.2 儀器和試驗(yàn)試劑試驗(yàn)儀器包括752UV-Vis紫外光光度計(jì)；TL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；CS-502超恒溫水浴；SL122電子天平；渦動(dòng)攪拌器。
試驗(yàn)試劑包括MDA試劑盒，由中國(guó)南京的Jenchun生物技術(shù)研究所提供。1.3 方法將60只小白鼠隨機(jī)地分為5組(4個(gè)治療組和1個(gè)對(duì)照組)，每組12只。4個(gè)治療組連續(xù)15天通過(guò)管飼法接受1g/kg/天、2g/kg/天、4g/kg/天或8g/kg/天的GLSs。對(duì)照組連續(xù)15天每天通過(guò)管飼法接受鹽水。
在治療期結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物殺死并取出肝臟。在大約2mL的勻化溶液中勻化大約0.2g的肝臟組織來(lái)制得10％的勻漿。將該勻漿離心分離。取10μL等份的各勻漿的上清液并用MDA試劑盒測(cè)試MDA。2. 結(jié)果如表5所示，當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)，所有的治療組的肝臟組織中的MDA在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都具有顯著意義的下降(成對(duì)的t試驗(yàn)，p＜0.01)。表5.GLSs對(duì)小白鼠肝臟MDA含量的作用(x±s)

3. 結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果顯示，用GLSs有效地減少了NIH小白鼠的MDA含量。這提提示了在該試驗(yàn)條件下，GLSs具有體內(nèi)預(yù)防或減少M(fèi)DA合成的抗氧化活性。
實(shí)施例4GLSs在治療人男性絕經(jīng)癥狀的作用男性絕經(jīng)癥狀特別是老年人已經(jīng)是一個(gè)健康問(wèn)題。越來(lái)越多的證據(jù)表明，除了男性性激素的產(chǎn)生和功能的降低外，人體總代謝的整體水平(例如微循環(huán)代謝、血液粘稠度、氧自由基的代謝等)能夠影響老年人的生理和精神狀態(tài)。人們已經(jīng)假定，改善總體代謝可以幫助延遲癡呆的發(fā)作、提高識(shí)別功能、緩解抑郁、提高睪酮水平并調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和大腦受體功能。1.材料和方法1.1 試驗(yàn)材料萌芽激活的靈芝孢子(“GLSs”)膠囊是從中山大學(xué)生命科學(xué)院的廣州綠色食品項(xiàng)目公司和瑞士和香港的綠能健康產(chǎn)品國(guó)際公司中獲得。每個(gè)膠囊含大約300mg的GLSs。1.2 包含標(biāo)準(zhǔn)符合下列標(biāo)準(zhǔn)的男性患者才準(zhǔn)許試驗(yàn)(1)55-76歲；(2)有絕經(jīng)癥狀(例如疲勞、失眠、血管緊張、意識(shí)和心理癥狀、性障礙)6個(gè)月-2年(3)血液睪酮含量低于正常值(140ng/dL)；(4)沒(méi)有嚴(yán)重的心腦血管疾病，沒(méi)有傳染的疾病，并且沒(méi)有診斷出腫瘤；(5)在SRS自我評(píng)價(jià)的分?jǐn)?shù)高于16的中年人和老年人；(6)Zung抑郁定量分?jǐn)?shù)高于或等于50。1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)該試驗(yàn)是在中國(guó)廣東省廣州第一人民醫(yī)院的泌尿外科(Urology SurgicalDepartment of Guangzhou First People’s Hospital，Guangdong Province，China)進(jìn)行的。1.4 試驗(yàn)步驟治療開(kāi)始前，收集患者的基本醫(yī)療史、Zung分?jǐn)?shù)(Zung自我分級(jí)抑郁標(biāo)準(zhǔn))和SRS分?jǐn)?shù)。在早晨空腹時(shí)收集每位患者動(dòng)脈血樣并測(cè)定睪酮、紅血細(xì)胞SOD和血液中的MDA含量。
治療組接受2粒GLSs膠囊(大約600mg的GLSs)，每天三次共3周，沒(méi)有任何意識(shí)/心理疾病的伴隨治療。對(duì)照組接受安慰劑。一周一次評(píng)估所有患者的癥狀、SRS分?jǐn)?shù)和Zung分?jǐn)?shù)。在3周治療結(jié)束時(shí)，收集每位患者的動(dòng)脈血樣并測(cè)定睪酮、紅血細(xì)胞SOD和血液的MDA水平。2. 結(jié)果在該試驗(yàn)中總共138名平均年齡在66歲的合格的男性登記。絕經(jīng)癥狀的平均期為12.3月。在138名患者中，是單一療法。將80名患者分為治療組而58名為對(duì)照組。
如表6所示，治療3周后，對(duì)照組大多數(shù)改善不顯著，比較治療組的患者證實(shí)，所有的絕經(jīng)癥狀在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著改善(p＜0.05)。此外，根據(jù)患者自我評(píng)價(jià)改善，治療組的患者相對(duì)于對(duì)照組中患者28.6％的改善而言，報(bào)道有74.3％的總有效率。表6.GLSs治療后絕經(jīng)癥狀的改善


*p＜0.05如表7所示，相對(duì)于治療組的基礎(chǔ)值以及接受安慰劑3周后對(duì)照組的數(shù)值，用GLSs膠囊治療3周顯著增加了睪酮和SOD的血液水平(p＜0.05)。用GLSs膠囊治療3周也顯著降低了MDA的血液水平(p＜0.05)，而在對(duì)照組中觀察到?jīng)]有改善。表7.GLSs對(duì)絕經(jīng)癥狀患者睪酮、SOD和MDA血液水平的作用

*p＜0.05如表8所示，用GLSs膠囊治療3周后，治療組中患有絕經(jīng)癥狀的患者顯示出抑郁有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改善，正如Zung和SRS分?jǐn)?shù)所證實(shí)的。在對(duì)照組中的絕經(jīng)患者沒(méi)有觀察到顯著改善。
表8.對(duì)Zung分?jǐn)?shù)和SRS分?jǐn)?shù)的影響

*p＜0.05據(jù)接受3周GLSs膠囊的患者報(bào)導(dǎo)，沒(méi)有顯著的副反應(yīng)。兩名患者報(bào)導(dǎo)在長(zhǎng)期GLSs治療后出現(xiàn)短暫的便秘。沒(méi)有水或鹽貯留、排尿困難、肝臟功能障礙或腸功能失調(diào)。3. 討論盡管近年來(lái)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)在理解老年疾病上有很大提高，但是直到1960年人們才意識(shí)到在男性衰老過(guò)程中出現(xiàn)激素的變化和伴隨的疾病。稱之為“男性絕經(jīng)”現(xiàn)在也被醫(yī)療領(lǐng)域所接受。與男性絕經(jīng)相關(guān)的一些癥狀與女性相似。但是，還沒(méi)有建立起男性絕經(jīng)中激素變化(例如性激素產(chǎn)生下降、Leydig細(xì)胞活性下降、性功能障礙)和神經(jīng)功能(例如視丘下部和垂體腺的反應(yīng)下降)之間的聯(lián)系。
因?yàn)閭€(gè)體間較大的差異，睪酮的血液含量不能作為診斷男性絕經(jīng)的唯一指標(biāo)。心理狀態(tài)也對(duì)男性的性動(dòng)力有影響，使得臨床觀察變得困難。所以我們用客觀指標(biāo)(例如血液中睪酮、SOD和MDA的含量)和主觀評(píng)價(jià)(例如SRS和Zung分?jǐn)?shù))設(shè)計(jì)了GLSs對(duì)男性絕經(jīng)癥狀的試驗(yàn)來(lái)觀察總體治療作用。
衰老的自由基理論支持自由基損害和衰老過(guò)程之間的聯(lián)系。自由基與老年男性絕經(jīng)癥狀的發(fā)作和發(fā)展有緊密的關(guān)系。在正常生理?xiàng)l件下，SOD能夠有效地除去過(guò)氧化物自由基，預(yù)防自由基鏈反應(yīng)。如果由于任何原因自由基產(chǎn)生過(guò)量或體內(nèi)除去能力下降，機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡將會(huì)受損，這可能導(dǎo)致加速衰老過(guò)程的內(nèi)分泌系統(tǒng)變性。
1948年首次報(bào)導(dǎo)了隨著年齡增加睪酮產(chǎn)生下降的觀察結(jié)果。大約20％的60歲男性的血液睪酮含量地域正常值。人們發(fā)現(xiàn)血液睪酮水平能夠影響對(duì)男性行為，如性喚起、攻擊、感覺(jué)和識(shí)別有影響的神經(jīng)功能。睪酮產(chǎn)生下降對(duì)男性心理狀態(tài)的影響一直在進(jìn)行研究，盡管有證據(jù)支持抑郁與低血睪酮水平有關(guān)。
在上述試驗(yàn)中，SOD的能力是作為機(jī)體除去自由基能力的指標(biāo)來(lái)測(cè)定的，MDA的含量是作為自由基損害的指標(biāo)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用GLSs治療顯著增加了自由基周轉(zhuǎn)，這一點(diǎn)正如SOD活性的增加和MDA水平的下降所證實(shí)的。SRS和Zung分?jǐn)?shù)的結(jié)果提示了低睪酮會(huì)造成抑郁，接著它與不同程度的性功能障礙(例如陽(yáng)痿)有關(guān)。用GLSs治療不僅有效地增加了血液睪酮水平，而且也顯著地增加了機(jī)體除去自由基的能力。
對(duì)比而言，對(duì)照組的患者顯示出了改善，這時(shí)因?yàn)榘参縿┛赡芴峁┑男睦碇委熥饔?。但是，在?duì)照組的總體改善率28.6％在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低于用GLSs治療的患者所報(bào)導(dǎo)的總體改善率74.3％。
目前，老年男性絕經(jīng)癥狀經(jīng)常用睪酮補(bǔ)充療法來(lái)治療。但是，激素補(bǔ)充有關(guān)的危險(xiǎn)會(huì)影響心血管系統(tǒng)和前列腺。男性激素的代謝會(huì)誘發(fā)胰島素抗性并增加內(nèi)皮素水平(引起血管緊張)，這樣對(duì)心血管的不利影響會(huì)增加心血管疾病的發(fā)病率。結(jié)果，心血管的缺陷是睪酮補(bǔ)充療法的禁忌。在對(duì)前列腺的治療危險(xiǎn)方面，沒(méi)有直接的證據(jù)表明睪酮補(bǔ)充療法會(huì)引起前列腺癌。但是，臨床數(shù)據(jù)顯示睪酮能夠增加前列腺癌患者的腫瘤生長(zhǎng)。
隨著培養(yǎng)方法的發(fā)展，使用靈芝，尤其是孢子已經(jīng)逐漸成為近年來(lái)許多試驗(yàn)的目標(biāo)。但是，大多數(shù)的試驗(yàn)是用完整的(沒(méi)有破壁的)孢子進(jìn)行的。相比而言，臨床試驗(yàn)所用的GLSs膠囊是用美國(guó)專利6,316,002B1中所述的萌發(fā)激活激素所生產(chǎn)的。這些破壁孢子具有更強(qiáng)的抗氧化和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的活性，這是因?yàn)樵擁?xiàng)技術(shù)使得所有孢子的活性遺傳物質(zhì)為生產(chǎn)治療作用而用。4. 結(jié)論GLSs是老年男性絕經(jīng)癥狀的更好治療選擇，因?yàn)樗鼈兪亲杂苫那宄齽?。此外，GLSs能夠促進(jìn)睪酮的產(chǎn)生、緩解抑郁并延遲衰老過(guò)程，而沒(méi)有激素補(bǔ)充療法的副作用。
說(shuō)明書(shū)中詳細(xì)說(shuō)明和討論的實(shí)施方案目的只是為了教導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解發(fā)明人所知道的制備和使用本發(fā)明的最好方法。不能認(rèn)為說(shuō)明書(shū)是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。本發(fā)明的上述實(shí)施方案可以在上述說(shuō)明書(shū)的基礎(chǔ)上由本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思下進(jìn)行改進(jìn)或變化，并且增加或刪減組成部分。所以應(yīng)當(dāng)理解為在本發(fā)明的權(quán)利要求及其等同范圍內(nèi)本發(fā)明可以用具體描述的方式之外的方法加以實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防/延緩人衰老和/或減少絕經(jīng)癥狀的方法，它包括給所述的人口服有效量的萌芽-激活的靈芝孢子(GLSs)。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的衰老是由自由基的損害引起的。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的GLSs是抗氧化劑。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中所述的GLSs以每天0.5到10g用量給予所述的人。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述的GLSs以每天1到5g用量給予所述的人。
6.按照權(quán)利要求3的方法，其中所述的GLSs增加了所述人的還原形式的谷胱甘肽(GSH)和過(guò)氧化物歧化酶(SOD)的活性。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的絕經(jīng)癥狀至少一個(gè)選自于下組疲勞、厭食、心悸、遺忘、易怒、抑郁和陽(yáng)痿。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述的人是男性。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述的患者是老人
10.按照權(quán)利要求7的方法，其中所述的GLSs可以每天0.5到10g的量給予所述人。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中所述的GLSs以每天1到5g用量給予所述的人。
12.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述的GLSs能夠增加所述人血液中的睪酮。
13.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述的GLSs能夠增加所述人血液中過(guò)氧化物歧化酶(SOD)。
14.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述的GLSs降低了所述人血液中丙二醛(MDA)。
15.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述的GLSs能夠改善所述人的抑郁。
16.一種預(yù)防/延緩人衰老過(guò)程的藥劑，它包括權(quán)利要求1所述的萌芽-激活的靈芝孢子(GLSs)。
17.一種減少/緩解人絕經(jīng)癥狀的藥劑，它包括權(quán)利要求1所述的萌芽-激活的靈芝孢子(GLSs)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種給人口服有效量的萌芽－激活的靈芝孢子(GLSs)來(lái)預(yù)防/延緩人衰老和/或減少絕經(jīng)癥狀的方法。用于絕經(jīng)的療法尤其對(duì)雄性患者有效。GLSs作為抗氧化劑對(duì)減少自由基的損害是有效的，具體來(lái)說(shuō)是增加還原形式的谷胱甘肽(GSH)和過(guò)氧化物歧化酶(SOD)活性。GLSs也能夠增加血液中睪酮含量并改善老年男性患者的憂郁尤其是老年憂郁。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1426812SQ0214646
公開(kāi)日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2002年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月21日
發(fā)明者鐘志強(qiáng), 唐筱勤 申請(qǐng)人:鐘志強(qiáng), 唐筱勤