專利名稱：表達(dá)文庫融合疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
疫苗是一個古老的名詞，傳統(tǒng)疫苗的概念局限于對體外病原體(如細(xì)菌，病毒等)的預(yù)防，免于受其感染。由于近年來對腫瘤免疫的突破性進(jìn)展，治療性癌癥疫苗給癌癥患者帶來了新的希望。從此，疫苗從它的傳統(tǒng)概念中解放出來，不僅用于被動的預(yù)防，而且用于主動的治療了。隨著疫苗概念的進(jìn)展，疫苗的物質(zhì)基礎(chǔ)也隨之發(fā)生了改變預(yù)防性疫苗由原來用滅活病原體作疫苗，發(fā)展到合成多肽作疫苗和合成核酸(DNA和RNA)作疫苗。其原理是合成的多肽抗原和核酸抗原直接或間接地刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫預(yù)防作用。無論上述合成性多肽疫苗還是核酸疫苗，大都是針對病原體某一兩個蛋白質(zhì)的已知抗原為目標(biāo)設(shè)計的，雖然較傳統(tǒng)的用整個病原體作疫苗來得安全，無毒性和致感染性，但很難囊括到病原體抗原的變異多端，而會大大影響到預(yù)防效果。這種局限性可用cNDA表達(dá)文庫疫苗形式加以解決。因為cNDA表達(dá)文庫的抗原包羅萬千，近似病原體疫苗但無毒性和致感染性。因為要隨機(jī)收集數(shù)以千萬計的克隆加以混合同時表達(dá)，所以用這種表達(dá)文庫免疫所面臨的問題無疑是抗原表達(dá)率低；效價低。
治療性疫苗目前最大的突破是將上述的多肽或和核酸抗原在體外和機(jī)體樹狀細(xì)胞(dendritic cell)先作用，使樹狀細(xì)胞變成所謂抗原攜帶細(xì)胞(antigen presenting cell)，進(jìn)而刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫治療作用。目前已用于癌癥和病毒的治療。但有有待進(jìn)一步突破。即是否能用表達(dá)文庫融合疫苗的形式，結(jié)合抗原攜帶細(xì)胞為媒介，刺激機(jī)體細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte)產(chǎn)生更有效的免疫治療作用呢？

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗原表達(dá)率高、效價高的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是包括下列步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子；②將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段；③將全部隨機(jī)片段用連接酶重新組合(各種連接酶均可)；④將全部重組片段克隆到ORF篩選載體；⑤收集具有ORF的陽性克隆并加以純化質(zhì)粒；⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗。
步驟②將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段的方法是采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化?？梢圆捎卯a(chǎn)生粘端的限制性內(nèi)切酶如ECORI、BAMHI、HINDIII、ALUI、NOTI等，也可以采用產(chǎn)生平端的限制性內(nèi)切酶如ECORV、RSAI等。還可以用常規(guī)物理和化學(xué)方法將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段。
步驟④中的ORF篩選載體的結(jié)構(gòu)是啟動子 報告基因＝＝＝＝＝＝＝＝＝ATG------(xxx-xxx)n-----###########其中“ATG”代表起始密碼子。
啟動子是噬菌體RNA啟動子T7或T3、SP6、酵母菌啟動子、酶的啟動子。
ORF篩選載體具有篩選功能，如為開放閱讀框，蛋白表達(dá)順利啟動子 報告基因(+)＝＝＝＝＝＝＝＝＝ATG------(xxx-xxx)n-----###########表達(dá)融合蛋白，報告基因產(chǎn)物陽性 如為閱讀框錯誤，則出現(xiàn)終止密碼子蛋白質(zhì)表達(dá)中止啟動子 報告基因(一)＝＝＝＝＝＝＝＝＝ATG------(xxx-xxx)n-----###########
表達(dá)中止，報告基因產(chǎn)物陰性 步驟⑤收集具有ORF的陽性克隆并加以純化的方法是收集ORF陽性克隆，并進(jìn)行宿主細(xì)胞培養(yǎng)，純化質(zhì)粒。收集克隆數(shù)在50～5000之間。
步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是將經(jīng)步驟⑤的質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物指向性克隆到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，將整個DNA文庫純化質(zhì)粒，即得DNA表達(dá)文庫融合疫苗。
步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是通過經(jīng)步驟⑤的純化質(zhì)粒所具有的啟動子T7或T3、SP6，用相應(yīng)的RNA聚合酶把全部的克隆轉(zhuǎn)化為有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板，即得RNA表達(dá)文庫融合疫苗。
步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是用PCR方法制備帶POLY(A)尾的有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板，即得RNA表達(dá)文庫融合疫苗；其中用PCR方法制備帶POLY(A)尾的有義鏈RNA的方法是5’端引物內(nèi)含上述RNA啟動子序列，3’端引物內(nèi)含POLY(T)序列，將ORF陽性克隆作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的RNA聚合酶把全部的克隆轉(zhuǎn)化為有義鏈RNA。
步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是將經(jīng)步驟⑤的純化質(zhì)粒DNA作模板，整體表達(dá)為蛋白質(zhì)，即得蛋白質(zhì)文庫融合疫苗。
步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，可以采用下列方法中的一種1)對屬DNA基因組的生物體(例如細(xì)菌、DNA病毒等)，抽取純化的雙鏈DNA分子即可；2)對屬RNA基因組的生物體(例如RNA病毒等)，先抽取并純化雙鏈RNA分子，再將雙鏈的RNA分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，具體步驟包括a)將雙鏈RNA分子和隨機(jī)引物按分子比1∶50或1∶100或1∶500或1∶1000或1∶10000的比例進(jìn)行混合。隨機(jī)引物序列
5′-----------------------XXXX-3′5′-----------------------XXXXX-3′5′-----------------------XXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機(jī)堿基A或T或G或C。
“-----”為隨意DNA序列，其中可含有內(nèi)切酶位點。引物的的熔點(Tm)為50-80℃。
b)將雙鏈RNA分子和隨機(jī)引物的混合液加熱變性(溫度85-98℃；30秒-30分鐘)。
c)迅速置于4℃到-4℃，退火3分鐘左右。
d)加逆轉(zhuǎn)錄酶、相應(yīng)緩沖液和dNTP完成第一鏈的的合成。
e)用PCR完成第二鏈的合成。所用引物與第一鏈合成相同。
也可用傳統(tǒng)的第二鏈合成方法合成。如由大腸桿菌DNA多聚酶加大腸桿菌RNA連接酶和核糖核酸酶H(RNase H)共同完成。在此情形下，上述隨機(jī)引物的隨意DNA序列可以去除。隨機(jī)引物序列如下所示5′-XXXX-3′5′-XXXXX-3′5′-XXXXXX-3′5′-XXXXXXX-3′5′-XXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXX-3′
5′-XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機(jī)堿基A或T或G或C。
3)如生物體是具有POLY(A)RNA的寄生蟲等，總體RNA的抽提可用中國專利申請?zhí)?1113523.9的抽提液抽提(或用現(xiàn)有技術(shù)的其它方法抽提)，第二鏈合成方法可按中國專利申請?zhí)?1113524.7的相應(yīng)方法進(jìn)行(或用現(xiàn)有技術(shù)的其它方法進(jìn)行)；如生物體是具有POLY(A)RNA的人體，其總體RNA的抽提可采用中國專利申請?zhí)?1113523.9的抽提液抽提(或用現(xiàn)有技術(shù)的其它方法抽提)，但在第二鏈合成以前必須加一步腫瘤相關(guān)基因的扣除性篩選，去除和正常細(xì)胞相同的基因，篩選出腫瘤基因，以防疫苗產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，此扣除性篩選步驟可按公開號為US6,465,219的美國專利和申請?zhí)枮镻CT/US01/24730的相應(yīng)方法進(jìn)行。
本發(fā)明提供了一種抗原表達(dá)率高、效價高的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，有效解決了治療性疫苗以表達(dá)文庫融合疫苗形式出現(xiàn)的問題。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1一種表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，包括下列步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子對屬DNA基因組的生物體(例如細(xì)菌、DNA病毒等)，抽取純化的雙鏈DNA分子即可；②將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化(可以采用產(chǎn)生粘端的限制性內(nèi)切酶如ECORI、BAMHI、HINDIII、ALUI、NOTI等，也可以采用產(chǎn)生平端的限制性內(nèi)切酶如ECORV、RSAI等)。還可以用常規(guī)物理和化學(xué)方法將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段。
③將全部隨機(jī)片段用常規(guī)連接酶重新組合；④將全部重組片段克隆到ORF(open reading frame)篩選載體
ORF篩選載體的結(jié)構(gòu)是啟動子(promoter) 報告基因＝＝＝＝＝＝＝＝＝ATG------(xxx-xxx)n-----###########其中“ATG”代表起始密碼子。
啟動子是噬菌體RNA啟動子T7或T3、SP6、酵母菌啟動子、酶的啟動子。
ORF篩選載體具有篩選功能，如為開放閱讀框，蛋白表達(dá)順利啟動子 報告基因(+)＝＝＝＝＝＝＝＝＝ATG------(xxx-xxx)n-----###########表達(dá)融合蛋白，報告基因(report gene)產(chǎn)物陽性 如為閱讀框錯誤，則出現(xiàn)終止密碼子蛋白質(zhì)表達(dá)中止啟動子 報告基因(一)＝＝＝＝＝＝＝＝＝ATG------(xxx-xxx)n-----###########表達(dá)中止，報告基因產(chǎn)物陰性 ⑤收集具有ORF的陽性克隆并加以純化質(zhì)粒收集ORF陽性克隆，并進(jìn)行宿主細(xì)胞培養(yǎng)，純化質(zhì)粒。收集克隆數(shù)在50～5000之間。
⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗經(jīng)下列方法之一，制取DNA表達(dá)文庫融合疫苗或RNA表達(dá)文庫融合疫苗、蛋白質(zhì)文庫融合疫苗1)將經(jīng)步驟⑤的質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物指向性克隆到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，將整個DNA文庫純化質(zhì)粒，即得DNA表達(dá)文庫融合疫苗。
2)通過經(jīng)步驟⑤的純化質(zhì)粒所具有的啟動子T7或T3、SP6，用相應(yīng)的RNA聚合酶把全部的克隆轉(zhuǎn)化為有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板，即得RNA表達(dá)文庫融合疫苗。
3)用PCR方法制備帶POLY(A)尾的有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板，即得RNA表達(dá)文庫融合疫苗；其中用PCR方法制備帶POLY(A)尾的有義鏈RNA的方法是5’端引物內(nèi)含上述RNA啟動子序列，3’端引物內(nèi)含POLY(T)序列，將ORF陽性克隆作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的RNA聚合酶把全部的克隆轉(zhuǎn)化為有義鏈RNA。
4)將經(jīng)步驟⑤的純化質(zhì)粒DNA作模板，整體表達(dá)為蛋白質(zhì)，即得蛋白質(zhì)文庫融合疫苗。
實施例2步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，采用下述列方法對屬RNA基因組的生物體(例如RNA病毒等)，先抽取并純化雙鏈RNA分子，再將雙鏈的RNA分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，具體步驟包括a)將雙鏈RNA分子和隨機(jī)引物按分子比1∶50(或1∶100或1∶500或1∶1000或1∶10000)的比例進(jìn)行混合。隨機(jī)引物序列5′-----------------------XXXX-3′5′-----------------------XXXXX-3′5′-----------------------XXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機(jī)堿基A或T或G或C。
“-----”為隨意DNA序列，其中可含有內(nèi)切酶位點。引物的的熔點(Tm)為50-80℃(例50、60、70、80℃)。
b)將雙鏈RNA分子和隨機(jī)引物的混合液加熱變性，溫度85-98℃(例85、90、95℃)；時間30秒-30分鐘(例30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘)。
c)迅速置于4℃到-4℃(例4、2、0、-2、-4℃)，退火3分鐘左右(例2、3、4分鐘)。
d)加逆轉(zhuǎn)錄酶、相應(yīng)緩沖液和dNTP完成第一鏈的的合成。
e)用PCR完成第二鏈的合成。所用引物與第一鏈合成相同。
也可用傳統(tǒng)的第二鏈合成方法合成。如由大腸桿菌DNA多聚酶加大腸桿菌RNA連接酶和核糖核酸酶H(RNase H)共同完成。在此情形下，上述隨機(jī)引物的隨意DNA序列可以去除。隨機(jī)引物序列如下所示5′-XXXX-3′5′-XXXXX-3′5′-XXXXXX-3′5′-XXXXXXX-3′5′-XXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機(jī)堿基A或T或G或C。其余步驟同實施例1。
實施例3步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，采用下述列方法如生物體是具有POLY(A)RNA的寄生蟲等，總體RNA的抽提可用中國專利申請?zhí)?1113523.9的抽提液抽提(或用現(xiàn)有技術(shù)的其它方法抽提)，第二鏈合成方法可按中國專利申請?zhí)?1113524.7的相應(yīng)方法進(jìn)行(或用現(xiàn)有技術(shù)的其它方法進(jìn)行)；其余步驟同實施例1 。
實施例4步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，采用下述列方法如生物體是具有POLY(A)RNA的人體，其總體RNA的抽提可采用中國專利申請?zhí)?1113523.9的抽提液抽提(或用現(xiàn)有技術(shù)的其它方法抽提)，但在第二鏈合成以前必須加一步腫瘤相關(guān)基因的扣除性篩選，去除和正常細(xì)胞相同的基因，篩選出腫瘤基因，以防疫苗產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，此扣除性篩選步驟可按公開號為US6,465,219的美國專利和申請?zhí)枮镻CT/US01/24730的相應(yīng)方法進(jìn)行。其余步驟同實施例1。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是包括下列步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子；②將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段；③將全部隨機(jī)片段用連接酶重新組合；④將全部重組片段克隆到ORF篩選載體；⑤收集具有ORF的陽性克隆并加以純化質(zhì)粒；⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)文庫融合疫苗制各方法，其特征是步驟②將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段的方法是采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是步驟④中的ORF篩選載體的結(jié)構(gòu)是啟動子 報告基因＝＝＝＝＝＝＝＝＝ATG------(xxx-xxx)n-----###########其中“ATG”代表起始密碼子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是啟動子是噬菌體RNA啟動子T7或T3、SP6、酵母菌啟動子、酶的啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)文摩融合疫苗制備方法，其特征是步驟⑤收集具有ORF的陽性克隆并加以純化的方法是收集ORF陽性克隆，并進(jìn)行宿主細(xì)胞培養(yǎng)，純化質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是將經(jīng)步驟⑤的質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物指向性克隆到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，將整個DNA文庫純化質(zhì)粒，即得DNA表達(dá)文庫融合疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是通過經(jīng)步驟⑤的純化質(zhì)粒所具有的啟動子T7或T3、SP6，用相應(yīng)的RNA聚合酶把全部的克隆轉(zhuǎn)化為有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板，即得RNA表達(dá)文庫融合疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是用PCR方法制備帶POLY(A)尾的有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板，即得RNA表達(dá)文庫融合疫苗；其中用PCR方法制備帶POLY(A)尾的有義鏈RNA的方法是5’端引物內(nèi)含上述RNA啟動子序列，3’端引物內(nèi)含POLY(T)序列，將ORF陽性克隆作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的RNA聚合酶把全部的克隆轉(zhuǎn)化為有義鏈RNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，其特征是步驟⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗的方法是將經(jīng)步驟⑤的純化質(zhì)粒DNA作模板，整體表達(dá)為蛋白質(zhì)，即得蛋白質(zhì)文庫融合疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，包括下列步驟①將全部靶基因轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子；②將全部雙鏈DNA分子隨機(jī)切割成片段；③將全部隨機(jī)片段用連接酶重新組合；④將全部重組片段克隆到ORF篩選載體；⑤收集具有ORF的陽性克隆并加以純化質(zhì)粒；⑥制取表達(dá)文庫融合疫苗。本發(fā)明提供了一種抗原表達(dá)率高、效價高的表達(dá)文庫融合疫苗制備方法，有效解決了治療性疫苗以表達(dá)文庫融合疫苗形式出現(xiàn)的問題。
文檔編號A61K39/00GK1416897SQ0214843
公開日2003年5月14日 申請日期2002年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月2日
發(fā)明者朱遠(yuǎn)源 申請人:朱遠(yuǎn)源