專利名稱：聚乙二醇修飾門(mén)冬酰胺酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的聚乙二醇-生物大分子藥物制備方法，特別是聚乙二醇修飾門(mén)冬酰胺酶的制備方法。
背景技術(shù)：
一般說(shuō)來(lái)，許多由生物技術(shù)如基因重組表達(dá)，或經(jīng)天然提取純化而得到的生物大分子醫(yī)藥產(chǎn)品，都是通過(guò)非腸道給藥的途徑而進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮其藥理以及藥效作用。此類由非腸道給藥的生物大分子藥物產(chǎn)品通常存在下面的一些問(wèn)題(1)生物大分子藥物往往具有致敏性，生物體一旦產(chǎn)生致敏反應(yīng)會(huì)對(duì)生物體造成嚴(yán)重的傷害并影響治療的進(jìn)行。(2)由于抗體的產(chǎn)生，生物大分子藥物在生物體內(nèi)和抗體結(jié)合而迅速地失去治療作用。(3)生物大分子藥物本身的生物半衰期受到抗體或其他非抗體而引發(fā)的代謝作用方式的影響而大為縮短。
目前，上述這些問(wèn)題可以利用對(duì)生物大分子進(jìn)行某種化學(xué)修飾的技術(shù)來(lái)加以改進(jìn)解決。1980年，Davis等人在美國(guó)專利4,179,337中公開(kāi)了利用單一分子不同聚合度的聚乙二醇對(duì)蛋白藥物進(jìn)行化學(xué)修飾。在保持藥物的生物活性同時(shí)，藥物的抗原性降低，水溶性以及藥物的生物半衰期等得到改善。與Davis專利類似，Katre等人公開(kāi)了通過(guò)與聚乙二醇結(jié)合而使蛋白水溶性增加并同時(shí)增加了蛋白的生物半衰期。Verones等人在Apllied Biochem and Biotech 11，142(1985)上公開(kāi)發(fā)表了用氯鉀酸苯酯活化的聚乙二醇修飾核糖核酸酶和超氧化物岐化酶。
上述先有技術(shù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的情況表明聚乙二醇修飾技術(shù)的確可以解決非腸道給藥生物大分子藥物存在的一些問(wèn)題。但該技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中也衍生出一些技術(shù)上的難題，例如(1)聚乙二醇對(duì)生物大分子的修飾是一種非選擇性化學(xué)反應(yīng)；同時(shí)，活化聚乙二醇在反應(yīng)過(guò)程中的迅速失活，往往會(huì)導(dǎo)致需要超過(guò)生物大分子(蛋白或核糖核酸)20倍至30倍的活化聚乙二醇量。(2)聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)僅僅能夠共價(jià)結(jié)合單一相同樣鏈長(zhǎng)的聚乙二醇。而有些時(shí)候，單一相統(tǒng)一鏈長(zhǎng)的聚乙二醇并不能完全達(dá)到增加生物利用度和延長(zhǎng)生物活性半衰期的目的。此外，已有事實(shí)證明該類聚乙二醇修飾蛋白結(jié)合物在體內(nèi)分解而斷開(kāi)(Wanget al.，Biochemistry 39，10634-10640，2000)。例如，分子量5000的聚乙二醇和蛋白表面的組氨酸間的結(jié)合產(chǎn)物不穩(wěn)定，會(huì)迅速的斷裂(Wang et al.，Advanced Drug Delivery Review 54，547-570，2002.)。(3)當(dāng)給藥之后發(fā)生這種斷裂時(shí)，經(jīng)聚乙二醇修飾的生物大分子藥物便完全喪失了修飾后的優(yōu)勢(shì)。
目前，尚未見(jiàn)報(bào)道從修飾生物大分子藥物制備工藝角度來(lái)改進(jìn)或克服上述各個(gè)方面的問(wèn)題。
本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)聚乙二醇-生物大分子表示由生物大分子(蛋白、核苷酸等)中的特定基團(tuán)和活化的聚乙二醇反應(yīng)經(jīng)共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)而形成。如聚乙二醇-門(mén)冬酰胺酶。聚乙二醇化生物大分子(蛋白)，聚乙二醇修飾的生物大分子(蛋白)或聚乙二醇生物大分子(蛋白)的意思是等同的。聚乙二醇按聚合單位與聚合方式的不同分直鏈和支鏈型；按聚合度的不同可以劃分出不同分子量大小的聚乙二醇，如PEG 5000，PEG 8000，PEG 20000等等。
單一相反應(yīng)是指采用相同聚合方式和聚合度(同樣分子量)的聚乙二醇對(duì)生物大分子進(jìn)行修飾。修飾反應(yīng)可以一次完成，也可重復(fù)多次完成。
多相反應(yīng)是指用不同聚合方式或不同聚合度(不同分子量)的聚乙二醇對(duì)生物大分子進(jìn)行修飾。修飾反應(yīng)需要經(jīng)過(guò)至少兩次或兩次以上的重復(fù)反應(yīng)才能完成。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，發(fā)明的目的在于提供一種新的聚乙二醇-生物大分子藥物制備方法，特別是聚乙二醇修飾門(mén)冬酰胺酶的制備方法。
因此，本發(fā)明涉及一種經(jīng)共價(jià)結(jié)合的聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶的制備方法，經(jīng)至少一步的化學(xué)反應(yīng)，利用不同聚合方式或不同聚合鏈長(zhǎng)度的活化聚乙二醇對(duì)門(mén)冬酰胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾，其特征在于包括以下步驟(1)將線性聚乙二醇與門(mén)冬酰胺酶接觸，反應(yīng)使用聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度范圍為1000-5000，門(mén)冬酰胺酶與聚乙二醇的用量比(W/W)范圍為1∶5-1∶30；(2)將線性聚乙二醇再與生物大分子接觸，乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度范圍為5000至30000，聚乙二醇與門(mén)冬酰胺酶反應(yīng)的用量比(W/W)范圍為1∶10，優(yōu)選用量比為1∶5。
在所述的步驟(1)中，優(yōu)選的反應(yīng)使用聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度為5000。在步驟(1)中，優(yōu)選的門(mén)冬酰胺酶與聚乙二醇的用量比為1∶5。
在步驟(2)中，優(yōu)選的乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度為20000。
本發(fā)明的反應(yīng)可以采用多步反應(yīng)，其中第一步反應(yīng)與第二步反應(yīng)是獨(dú)立分開(kāi)的。第一步反應(yīng)pH范圍應(yīng)控制在8.0至9.5，優(yōu)選為8.5±0.1；第二步聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)的pH范圍應(yīng)控制在5.5 to 6.8，優(yōu)選為6.5±0.1。第一步和第二步反應(yīng)的溫度范圍應(yīng)控制在25至30℃，優(yōu)選的溫度控制在25±0.1℃。
本發(fā)明所述的生物大分子包括聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶。
本發(fā)明還涉及聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶在預(yù)防和治療鼻咽病毒(Epstein Barr)淋巴癌，充血同心軸性T細(xì)胞/天然殺手細(xì)胞惡性淋巴腫瘤，HIV-1引起的T-細(xì)胞淋巴癌，以及非霍金斯鼻咽惡性T細(xì)胞淋巴腫瘤藥物中的應(yīng)用。聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶臨床使用劑量至少為1000至3000國(guó)際單位/平方米體表面積/14天(1000 to 3000IU/m2/14天)聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶可制成相應(yīng)的藥用劑型用于通過(guò)各種化學(xué)或非化學(xué)修飾的試劑、載體以及給藥方式改進(jìn)得到的粉末，液體，懸浮液和其它藥用劑型供皮下，皮內(nèi)，膜間，栓劑和氣霧劑給藥。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明的方法可用于新型或改進(jìn)的聚乙二醇-生物大分子藥物的生產(chǎn)。聚乙二醇-生物大分子的傳統(tǒng)的制備方法是利用均一分子量的聚乙二醇和生物大分子經(jīng)單次化學(xué)反應(yīng)作為主要制備工藝。本項(xiàng)發(fā)明可以根據(jù)被修飾生物大分子的特點(diǎn)，利用一次或多次的化學(xué)反應(yīng)、采用單一分子量或不同分子量的聚乙二醇對(duì)生物大分子如蛋白的表面氨基酸進(jìn)行不同方式和不同程度的修飾，從而延長(zhǎng)生物大分子藥物的生物活性半衰期，增加水溶性及降低生物大分子的免疫抗原性，在非腸道給藥條件下獲得預(yù)期的治療效果。并在制備工藝上提供一條降低活化聚乙二醇的用量，改進(jìn)產(chǎn)品的生物活性損失和提高產(chǎn)品收率的途徑。
由于近年來(lái)分子生物診斷技術(shù)不斷的發(fā)展和創(chuàng)新，對(duì)許多惡性腫瘤疾病的病源起因的探討已經(jīng)發(fā)生了巨大的改變。尤其在最近4-5年，因新的單克隆抗體的不斷出現(xiàn)和去氧核糖核酸多聚酶鏈反應(yīng)(DNAPolymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)下述各類惡性淋巴腫瘤的診斷治療的認(rèn)識(shí)不斷提高，逐漸演變出一個(gè)新的人類疾病類型。這些惡性淋巴腫瘤包括1、中線型周邊性T細(xì)胞惡性淋巴腫瘤，2、天然殺手細(xì)胞(Natural Killer Cell)惡性鼻咽淋巴腫瘤，3、充血同心軸性惡性淋巴腫瘤以及4、非霍金斯頭頸惡性淋巴腫瘤(Koch et，.Laryngorhinootologie，80，(7)，410-415，2001)。此類型的腫瘤在北美，歐洲均甚為罕見(jiàn)；但在亞洲人，尤其是中國(guó)人的族群，無(wú)論他們是居住在中國(guó)本土，或者在香港，臺(tái)灣以及東南亞的華人社區(qū)，具有很高的發(fā)病率。由于此特殊類型的惡性腫瘤具有其特有的流行病學(xué)分布(Vramis et al，In Vivo，15(1)1-9，2001，Hongo et al，CancerRes 60(9)2345-2347，2000)，腫瘤醫(yī)學(xué)專家們已經(jīng)把此類惡性淋巴腫瘤劃歸為一種新的疾病，認(rèn)為這是一種“中國(guó)人族群的腫瘤”。
腫瘤分子生物學(xué)研究揭示，該中國(guó)人族群中經(jīng)常發(fā)生的惡性淋巴腫瘤有以下特征1、此類腫瘤疾病的發(fā)生程度與鼻咽病毒(EBV)的傳播和病毒攜帶者的情況有關(guān)。2、此類腫瘤疾病的腫瘤細(xì)胞往往造成T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T Cell Receptor)基因重組，或者是C-Kit原始細(xì)胞昂可基因(C-Kit Protooncogene)的基因突變?；谶@些基因的重組和突變的特點(diǎn)，現(xiàn)已逐漸發(fā)展成為一種新的腫瘤分子生物學(xué)檢測(cè)診斷技術(shù)。從臨床醫(yī)學(xué)診斷而言，此類腫瘤首先出現(xiàn)在頭，頸和鼻咽等器官，多數(shù)涉及大量的T淋巴細(xì)胞或天然殺手淋巴細(xì)胞。腫瘤部位通常腫大，充血以及高度發(fā)炎，局部發(fā)熱，腫瘤細(xì)胞侵入局部的骨骼系統(tǒng)而造成局部的結(jié)締組織壞死。惡性淋巴腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步通過(guò)血管或淋巴管擴(kuò)散到身體的其他部位的淋巴結(jié)和淋巴組織從而發(fā)展成為中期到晚期的致死性腫瘤疾病。
在過(guò)去的臨床診斷中，由于此類惡性淋巴腫瘤常常易與許多其他良性的頭、頸、鼻咽的炎癥疾病相混淆，往往在腫瘤已發(fā)展到第三期或第四期后才得以診斷確認(rèn)。
隨著腫瘤診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，現(xiàn)在已能夠?qū)υ擃悙盒阅[瘤做出早期診斷。與此同時(shí)，新的藥物和治療方法也在出現(xiàn)。2001年，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院首次報(bào)導(dǎo)(Yong等，中華醫(yī)學(xué)雜志(1)，81(33)773-775)利用門(mén)冬酰胺酶治療上述中國(guó)人族群特有的中線型惡性淋巴腫瘤。但由于病人對(duì)注射門(mén)冬酰胺酶藥物產(chǎn)生抗體過(guò)敏反應(yīng)而不得不縮短療程或終止治療，從而無(wú)法獲得預(yù)期的療效。因此，對(duì)此類中國(guó)人族群特有的其它惡性淋巴腫瘤的治療，包括鼻咽病毒淋巴癌，充血同心軸性T細(xì)胞/天然殺手細(xì)胞惡性淋巴腫瘤，HIV病毒引起的T-細(xì)胞淋巴癌以及非霍金斯鼻咽惡性T細(xì)胞淋巴腫瘤仍然有待于新一代的藥物的實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用才能決定是否有治療效果。
然而，聚乙二醇化門(mén)冬酰胺酶克服了門(mén)冬酰胺酶自身的缺點(diǎn)，在上述惡性淋巴瘤的預(yù)防和治療方面有著更實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。因而，研制開(kāi)發(fā)聚乙二醇修飾門(mén)冬酰胺酶治療藥物，對(duì)滿足臨床治療的迫切需要有著重要的意義。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的內(nèi)容，生物大分子蛋白的聚乙二醇修飾化，蛋白和活化聚乙二醇的用量比一般要高達(dá)1∶30(W/W)或1∶50(W/W)才能將蛋白表面的賴氨酸(Lysine)進(jìn)行足以有效的共價(jià)修飾而達(dá)到預(yù)期的目的。同時(shí)，當(dāng)鏈長(zhǎng)度縮短而單向分散性加大時(shí)，共價(jià)鍵相連的聚乙二醇往往產(chǎn)生斷裂或解離。
但是，本發(fā)明提出一種新的聚乙二醇修飾門(mén)冬酰胺酶處理方法，可以在充分利用已有的化學(xué)反應(yīng)方式的同時(shí)，不需要消耗高比值的活化聚乙二醇。生物大分子蛋白和聚乙二醇間的化學(xué)反應(yīng)必需分開(kāi)兩步或三步，已使反應(yīng)在優(yōu)化的條件下進(jìn)行和得到有效的控制。
第一步反應(yīng)活化聚乙二醇對(duì)生物大分子蛋白修飾的第一步反應(yīng)是通過(guò)控制優(yōu)化的反應(yīng)的pH值在8.5±1.0，使生物大分子蛋白表面的半胱氨酸和賴氨酸能夠充分的與活化聚乙二醇進(jìn)行反應(yīng)以獲得特定分子量(一定鏈長(zhǎng))的聚乙二醇修飾產(chǎn)物。高純度、狹窄單向分布(分子量分布在1.01-1.05之間)平均分子量為5000的單功能線性聚乙二醇(PEG5000)通過(guò)與丁二酸酐反應(yīng)和羧酸的活化而得到高反應(yīng)活性但穩(wěn)定的產(chǎn)物線性鏈聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG5000)。SS-PEG5000的優(yōu)點(diǎn)在于與生物蛋白大分子反應(yīng)完并除去反應(yīng)副產(chǎn)物后，經(jīng)酰胺鍵形成的聚乙二醇化蛋白保持相對(duì)的穩(wěn)定并在通常的生理?xiàng)l件下不會(huì)發(fā)生斷裂。在這一步反應(yīng)中，生物大分子蛋白與SS-PEG5000聚乙二醇的用量比為1∶5(W/W)。反應(yīng)結(jié)束后，清除未反應(yīng)的原料或溶液中其他反應(yīng)副產(chǎn)物。
第二步反應(yīng)第二步聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)為本發(fā)明最重要的控制步驟。在清除第一步反應(yīng)雜質(zhì)之后，優(yōu)化反應(yīng)的pH值應(yīng)控制在6.5±0.1使生物大分子蛋白分子表面的組氨酸(Histamine)與聚乙二醇結(jié)合不會(huì)出現(xiàn)斷解。在第二步反應(yīng)中，可以采用和第一步反應(yīng)完全相同分子量的活化聚乙二醇繼續(xù)和生物大分子蛋白反應(yīng)，最終獲得單一分子量(單一鏈長(zhǎng))聚乙二醇修飾的產(chǎn)品。另外，也可采用與第一步反應(yīng)完全不同分子量或聚合方式不同的活化聚乙二醇對(duì)生物大分子蛋白做進(jìn)一步的修飾，最終獲得經(jīng)混合聚乙二醇修飾的產(chǎn)品。高純度、狹窄單向分布(分子量分布在1.01-1.05之間)平均分子量為20000的單功能線性聚乙二醇(PEG20000)通過(guò)與琥珀酸酐反應(yīng)和羧酸的活化而得到高反應(yīng)活性但穩(wěn)定的產(chǎn)物線性鏈聚乙二醇20000琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG20000)。SS-PEG20000的優(yōu)點(diǎn)在于與生物蛋白大分子反應(yīng)完并除去反應(yīng)副產(chǎn)物后，經(jīng)酰胺鍵形成的聚乙二醇化蛋白保持相對(duì)的穩(wěn)定并在通常的生理?xiàng)l件下不會(huì)發(fā)生斷裂。第二步反應(yīng)中生物大分子蛋白與聚乙二醇的用量控制在1∶5(W/W)。
本發(fā)明可以采用第三步反應(yīng)，其中第三步比較對(duì)照反應(yīng)用于確定第一、二步反應(yīng)的使用條件的適用程度。反應(yīng)的溫度和pH范圍和優(yōu)化條件以及試驗(yàn)過(guò)程可以依照第一步或二步的反應(yīng)條件，但生物大分子蛋白與活化聚乙二醇(SS-PEG5000和SS-PEG20000)的用量比改為1∶30(W/W)。由對(duì)照反應(yīng)的結(jié)果可以得出兩次聚乙二醇修飾化學(xué)反應(yīng)效率情況。


以下將結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明采用的實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例僅僅是說(shuō)明，而非限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。其中圖1是聚乙二醇化門(mén)冬酰胺酶和門(mén)冬酰胺酶的凝膠電泳。其中，凝膠Novex 4-20％Tris-Glycine Gel at 125 V for approx.90min.凝膠帶說(shuō)明1.分子量標(biāo)記2.無(wú)樣品3.聚乙二醇化前的門(mén)冬酰胺酶4.無(wú)樣品5.經(jīng)SS-PEG5000兩次聚乙二醇化的門(mén)冬酰胺酶(1∶5，w/w)6.無(wú)樣品7.經(jīng)SS-PEG5000聚乙二醇化門(mén)冬酰胺酶(1∶30，w/w)8.無(wú)樣品圖2是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術(shù)來(lái)分析利用相同或不同分子量的活化性聚乙二醇分兩步修飾蛋白酶的氨基酸之后的蛋白分子產(chǎn)物。
凝膠Novex 4-20％Tris-Glycine Gel at 125 V for approx.90min.
凝膠帶說(shuō)明1.無(wú)聚乙二醇化的門(mén)冬酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)(2μg)2.活化聚乙二醇5000∶門(mén)冬酰胺酶在1∶5(w/w)條件下的反應(yīng)結(jié)果3.分子量標(biāo)準(zhǔn)4.分子量標(biāo)準(zhǔn)5.活化聚乙二醇5000∶門(mén)冬酰胺酶在1∶30(w/w)條件下的反應(yīng)結(jié)果
6.活化聚乙二醇20000∶門(mén)冬酰胺酶在1∶5(w/w)條件下的反應(yīng)結(jié)果7.活化聚乙二醇20000∶門(mén)冬酰胺酶在1∶30(w/w)條件下的反應(yīng)結(jié)果8.在1∶5(w/w)條件下，活化聚乙二醇5000和活化聚乙二醇20000分步修飾門(mén)冬酰胺酶的反應(yīng)結(jié)果9.與上述8相同10.無(wú)聚乙二醇化的門(mén)冬酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)(20μg)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 聚乙二醇化門(mén)冬酰胺酶(PEG-Asparaginase)的制備第一步反應(yīng)1.取152ml 0.1M pH 8.5的磷酸鈉鹽緩沖液于水浴中預(yù)熱至25℃，取0.75克門(mén)冬酰胺酶，緩慢加入磷酸鈉緩沖液中充分溶解。取3.75克分子量5000的活化聚乙二醇(SS-PEG5000)，迅速加入上述溶液中，適當(dāng)攪拌而使活化聚乙二醇(SS-PEG5000)在30秒內(nèi)完全溶解，同時(shí)要避免大量氣泡產(chǎn)生。此時(shí)門(mén)冬酰胺酶與聚乙二醇用量比為1∶5(w/w)。反應(yīng)于25℃進(jìn)行30分鐘，反應(yīng)溶液經(jīng)濃縮沖洗后，可進(jìn)一步純化或進(jìn)行第二步反應(yīng)。
2.聚乙二醇-門(mén)冬酰胺酶反應(yīng)溶液的濃縮沖洗利用中空纖維分離柱。首先用蠕動(dòng)泵將150毫升反應(yīng)溶液通過(guò)中空纖維分離柱濃縮至原體積的1/10(15ml)。向15ml濃縮液中再加入0.1M，pH 7.0磷酸鈉鹽緩沖液至150毫升，通過(guò)中空纖維分離柱再將體積濃縮至15ml。同樣的操作重復(fù)10次，使得0.1M，pH 7.0磷酸鈉鹽緩沖液完全取代聚乙二醇反應(yīng)中的0.1M，pH 8.5的磷酸鈉鹽緩沖液，同時(shí)除去原反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的聚乙二醇。第10次濃縮后，取50ml 0.1M，pH 7.0磷酸鈉鹽緩沖液清洗真空纖維分離柱以及分離管。清洗液與15ml的濃縮液相合并后用No 1 Whatman濾紙過(guò)濾去除不溶性雜質(zhì)。濾液經(jīng)0.2μm的無(wú)菌濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾而得聚乙二醇-門(mén)冬酰胺酶(PEG-L-Asparaginase)最終產(chǎn)物。置于4℃密封無(wú)菌避光保存。
第二步反應(yīng)經(jīng)上述1、2步所得到的濃縮液，在第10次濃縮液中加入150ml，0.1M，pH 6.5之磷酸鈉鹽緩沖液。置此150ml溶液于水浴中預(yù)熱至25℃，另取15.0克分子量20000活化聚乙二醇(SS-PEG20000)迅速加入上述溶液中適當(dāng)攪動(dòng)而使分子量20000活化聚乙二醇于30秒內(nèi)完全溶解，同時(shí)避免氣泡產(chǎn)生。聚乙二醇與門(mén)冬酰胺酶的用量為1∶5(w/w)。反應(yīng)持續(xù)30分鐘。反應(yīng)溶液經(jīng)上述2同樣的方法濃縮，純化和無(wú)菌過(guò)濾后得到混合型聚乙二醇化門(mén)冬酰胺酶終產(chǎn)物并置4℃密封無(wú)菌避光保存。
實(shí)驗(yàn)例1分析方法蛋白濃度分析方法1采用Bradford-Lowry方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。該法基于不同濃度的蛋白質(zhì)所結(jié)合上取得蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍(lán)的數(shù)據(jù)亦有所不同而建立。首先以已知的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白所結(jié)合染料的量為依據(jù)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定蛋白的染料結(jié)合量推斷出該蛋白質(zhì)樣品濃度。
方法2取酶活力測(cè)定的供試品溶液，依照分光光度法(中國(guó)藥典1995年版二部附錄第20頁(yè))在280±1nm和260±1nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收度，按下式算出每毫升含蛋白的毫克數(shù)。
蛋白含量(mg/ml)＝1.55×D280nm-0.76×D260nm實(shí)驗(yàn)例2蛋白純度分析生物大分子，如蛋白質(zhì)，酶，多肽，氨基酸等，由于帶電性質(zhì)不同，在同一電場(chǎng)條件下，有著不同的移動(dòng)方向和遷移率。帶電多，分子量小，則電泳速度快，因而通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳可將不同分子量，不同種類的蛋白等生物大分子分開(kāi)。在確定雜蛋白是否存在的同時(shí)，亦可以確定未知蛋白質(zhì)的純度和蛋白分子的大小。
門(mén)冬酰胺酶-聚乙二醇活性測(cè)定利用Mashburn Wriston方法。該方法通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物中氨基酸的濃度來(lái)確定門(mén)冬酰胺酶(Asparaginase)對(duì)底物的水解速率，所產(chǎn)生的氨量通過(guò)Nessler試劑與蛋白質(zhì)間的顏色反應(yīng)而確定。
聚乙二醇在蛋白表面地結(jié)合數(shù)量TNBS方法用來(lái)確定結(jié)合有聚乙二醇的賴氨酸殘基數(shù)目的方法。TNBS可以和無(wú)聚乙二醇結(jié)合的賴氨酸殘基發(fā)生顏色反應(yīng)，通過(guò)聚乙二醇結(jié)合前后蛋白質(zhì)的吸光值的變化差即可計(jì)算出共價(jià)結(jié)合的聚乙二醇的數(shù)目。
聚乙二醇修飾門(mén)冬酰胺酶蛋白的結(jié)果A.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白分析一般用兩種方法用來(lái)評(píng)估聚乙二醇對(duì)蛋白表面氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾效果。第一種方法是利用SDS-聚丙烯酰胺凝焦電泳來(lái)測(cè)定被修飾后的蛋白在電場(chǎng)上移動(dòng)速率作為確定修飾程度。第二種方法是直接測(cè)定蛋白被聚乙二醇修飾前后氨基酸數(shù)量的差異而直接分析(詳見(jiàn)前述的TNBS測(cè)定方法)。聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)修飾后的門(mén)冬酰胺酶在圖二SDS-聚丙烯酰胺凝焦電泳結(jié)果顯示用1∶5(蛋白∶聚乙二醇質(zhì)量比)的反應(yīng)條件下，門(mén)冬酰胺經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾而使其分子量明顯升高，而使其修飾后的蛋白在電泳場(chǎng)的移動(dòng)速度降低。分子量明顯升高是因?yàn)槊傅鞍妆砻娴陌被嵋驯痪垡叶挤肿拥墓矁r(jià)健結(jié)合而造成。由于蛋白表面被聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目有一定的范圍，同時(shí)修飾后的聚乙二醇蛋白在電泳場(chǎng)影響下其分子構(gòu)型有所改變，此修飾后的蛋白在凝膠上顯示出一種分布均勻的區(qū)域而不是一個(gè)狹長(zhǎng)的電泳帶。
圖一凝膠電泳的結(jié)果同時(shí)顯示了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即酶蛋白在電泳場(chǎng)的移動(dòng)速率比較，用1∶5或1∶30的蛋白，在聚乙二醇質(zhì)量比的反應(yīng)條件下所得到的化學(xué)反應(yīng)修飾作用基本相同。此一結(jié)果間接證明了本申請(qǐng)要求下的反應(yīng)的優(yōu)化條件。
圖二是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術(shù)來(lái)分析利用相同或不同分子量的活化性聚乙二醇分兩步修飾蛋白酶的氨基酸之后的蛋白分子產(chǎn)物。由圖二凝膠電泳蛋白的移動(dòng)速率來(lái)看，同樣的反應(yīng)條件下，蛋白和活化聚乙二醇(分子量5000)的用量比在1∶30略優(yōu)于1∶5(第5和第2項(xiàng)目相比較。但使用分子量20000聚乙二醇和1∶5的反應(yīng)條件時(shí)，化學(xué)反應(yīng)修飾的結(jié)果相同。但由于分子量的增加的結(jié)果使得修飾后的蛋白電泳速率明顯降低(比較第2和第6項(xiàng))。
若要使門(mén)冬酰胺酶經(jīng)化學(xué)修飾后的分子量增加有特定要求，則可以利用兩步分開(kāi)的化學(xué)修飾在相同1∶5比值的反應(yīng)條件下，第一步用分子量5000的活化聚乙二醇，第二步利用分子量20000的活化聚乙二醇對(duì)其加以修飾(比較第2及第8，9項(xiàng)電泳圖形)。
表一的數(shù)據(jù)表明兩步的反應(yīng)條件比一步反應(yīng)條件易達(dá)到充分修飾蛋白氨基酸的目的。利用兩步反應(yīng)可以達(dá)到最終用分子量5000及20000的活化聚乙二醇雙相化學(xué)修飾門(mén)冬酰胺酶的目的。實(shí)驗(yàn)例3.聚乙二醇結(jié)合數(shù)量以及聚乙二醇化酶活性分析利用TNBS方法來(lái)測(cè)定修飾前后氨基酸數(shù)量的變化是一種直接的定量分析方法用來(lái)分析門(mén)冬酰胺酶表面氨基酸修飾狀況。表一給出了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。當(dāng)活化聚乙二醇和酶的反應(yīng)比為1∶5時(shí)，經(jīng)兩次反應(yīng)后，酶蛋白表面平均每一個(gè)分子有20±1個(gè)氨基酸被聚乙二醇修飾。在相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，聚乙二醇和酶的比值為1∶30時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一次反應(yīng)結(jié)果酶表面的氨基酸可以和19±2個(gè)聚乙二醇進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。此一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示本專利申請(qǐng)條件之下，利用較低的聚乙二醇和酶的比值可以達(dá)到相同的化學(xué)修飾結(jié)果。
表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)顯示利用分子量20000的活化聚乙二醇在第二步修飾反應(yīng)中亦可以達(dá)到修飾蛋白酶氨基酸的目的而不至于使大量的門(mén)冬酰胺酶在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中失去酶活性。
表1門(mén)冬酰胺酶和聚乙二醇用量比以及酶活性與聚乙二醇結(jié)合數(shù)量的關(guān)系表1

權(quán)利要求
1.一種經(jīng)共價(jià)結(jié)合的聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶的制備方法，經(jīng)至少一步的化學(xué)反應(yīng)，利用不同聚合方式或不同聚合鏈長(zhǎng)度的活化聚乙二醇對(duì)門(mén)冬酰胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾，其特征在于包括以下步驟(1)將線性聚乙二醇與門(mén)冬酰胺酶接觸，反應(yīng)使用聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度范圍為1000-5000，門(mén)冬酰胺酶與聚乙二醇的用量比范圍為1∶10-1∶5-1∶30；(2)將線性聚乙二醇再與生物大分子接觸，聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度范圍為5000至30000，聚乙二醇與門(mén)冬酰胺酶反應(yīng)的用量比范圍為1∶10，優(yōu)選用量比為1∶5。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)反應(yīng)使用聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度為5000。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中門(mén)冬酰胺酶與聚乙二醇的用量比為1∶5。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度為20000。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一步反應(yīng)與第二步反應(yīng)是獨(dú)立分開(kāi)的。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第一步反應(yīng)pH范圍應(yīng)控制在8.0至9.5，優(yōu)選為8.5±0.1；第二步化學(xué)反應(yīng)的pH范圍應(yīng)控制在5.5 to 6.8，優(yōu)選為6.5±0.1。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第一步和第二步反應(yīng)的溫度范圍應(yīng)控制在25至30℃，優(yōu)選的溫度控制在25±0.1℃。
8.經(jīng)權(quán)利要求1所述的方法得到的聚乙二醇修飾的生物大分子。
9.如權(quán)利要求8所述的大分子，其特征在于，所述的大分子是聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶。
10.如權(quán)利要求8所述的聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶在制備預(yù)防和治療鼻咽病毒(Epstein Barr)淋巴癌，充血同心軸性T細(xì)胞/天然殺手細(xì)胞惡性淋巴腫瘤，HIV-1引起的T-細(xì)胞淋巴癌，以及非霍金斯鼻咽惡性T細(xì)胞淋巴腫瘤藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶臨床有效藥劑量至少為1000至3000國(guó)際單位/平方米體表面積/14天(1000 to 3000IU/m2/14days)
12.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，可通過(guò)各種化學(xué)或非化學(xué)修飾的試劑、載體以及給藥方式改進(jìn)得到的粉末，液體，懸浮液和其它藥用劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)共價(jià)結(jié)合的聚乙二醇修飾的門(mén)冬酰胺酶的制備方法，經(jīng)至少一步的化學(xué)反應(yīng)，利用不同聚合方式或不同聚合鏈長(zhǎng)度的活化聚乙二醇對(duì)門(mén)冬酰胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾，其特征在于包括以下步驟將線性聚乙二醇與門(mén)冬酰胺酶接觸，反應(yīng)使用聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度范圍為1000－5000，門(mén)冬酰胺酶與聚乙二醇的用量比范圍為1∶10－1∶5－1∶30；將線性聚乙二醇再與生物大分子接觸，聚乙二醇線性鏈的長(zhǎng)度范圍為5000至30000，聚乙二醇與門(mén)冬酰胺酶反應(yīng)的用量比范圍為1∶10。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1498965SQ02149328
公開(kāi)日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者孟憲臺(tái), 彭瀅, 孫飄揚(yáng), 周云曙 申請(qǐng)人:連云港新陽(yáng)醫(yī)藥有限公司