專利名稱：癌胚抗原特異性結(jié)合肽及其與TNF-α的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了兩種與癌胚抗原特異性結(jié)合的環(huán)七肽，及其與腫瘤壞死因子的融合蛋白，更具體地說，包括兩條結(jié)合肽的氨基酸序列、核苷酸序列和融合蛋白的氨基酸序列、核苷酸序列以及構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)載體。
癌胚抗原(carcinoembryonic antign，CEA)是一種腫瘤標(biāo)志物和腫瘤相關(guān)性抗原，高表達(dá)于上皮源性的腫瘤組織，尤其是消化道腫瘤如結(jié)腸癌、直腸癌中。針對(duì)CEA的導(dǎo)向治療主要集中于特異性結(jié)合CEA的抗體或單鏈抗體的研究，將單抗或單鏈抗體與細(xì)胞毒素如阿霉素、氨甲喋呤、腫瘤壞死因子等偶聯(lián)，通過單抗的特異性結(jié)合作用使毒素能富集于腫瘤部位，提高靶部位的藥濃度，從而達(dá)到導(dǎo)向治療、降低毒副作用的目的。
本發(fā)明的目的在于提供一種CEA特異結(jié)合的結(jié)合肽，從而克服單抗和單鏈抗體分子量大，穿透力弱，難以到達(dá)靶部位尤其是實(shí)體瘤組織的缺點(diǎn)。并且鼠源性的單抗應(yīng)用于人體會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體，而小肽則具有免疫原性低的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)途徑是從噬菌體展示肽庫(kù)中篩選出CEA的特異性結(jié)合肽，將此結(jié)合肽與腫瘤壞死因子(TNF-α)融合表達(dá)，形成融合蛋白，以使結(jié)合肽的CEA結(jié)合活性與TNF-α的細(xì)胞毒活性偶聯(lián)，該融合蛋白為、能導(dǎo)向殺傷CEA陽(yáng)性腫瘤。其特征為1)從噬菌體隨機(jī)展示環(huán)七肽庫(kù)中篩選出與CEA特異結(jié)合的環(huán)七肽。2)CEA結(jié)合肽的氨基酸序列為CPAPWGRLC。3)構(gòu)建序列為CPAPWGRLC的結(jié)合肽CSP-1與TNF-α的融合蛋白CSP-1-TNF的表達(dá)載體，二者之間加入兩個(gè)甘氨酸作為柔性接頭。4)構(gòu)建序列為CLRGWPAPC的結(jié)合肽CSP-2與TNF-α的融合蛋白CSP-2-TNF的表達(dá)載體，二者之間加入兩個(gè)甘氨酸作為柔性接頭。5)表達(dá)并純化CSP-1-TNF、CSP-2-TNF，檢測(cè)表明上述二者均能與CEA特異性結(jié)合，并且能夠競(jìng)爭(zhēng)抑制篩選出的與CEA結(jié)合的單克隆噬菌體與CEA的結(jié)合。6)CSP-1-TNF、CSP-2-TNF均有殺傷L929細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，CSP-1-TNF具有對(duì)LoVo細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實(shí)施方法如下圖1CAE結(jié)合肽的氨基酸序列330-339為小肽的編號(hào)，氨基酸序列從左到右為N端到C端。
圖2噬菌體單克隆與CEA親和力比較圖3噬菌體單克隆特異性的比較圖4CSP-1-TNF表達(dá)載體pBV220-CSP-1-TNF的構(gòu)建5CSP-2-TNF表達(dá)載體pBV220-CSP-2-TNF的構(gòu)建6純化的CSP-1-TNF蛋白圖7純化的CSP-2-TNF蛋白圖8ELISA檢測(cè)CSP-1-TNF與CEA的特異結(jié)合橫坐標(biāo)中各組指CSP-1-TNF和TNF-α的不同濃度，其中“A”為89.25μg/ml，“B”“C”“D”……依次為5倍梯度稀釋后的蛋白濃度。
圖9ELISA檢測(cè)CSP-2-TNF與CEA的特異結(jié)合橫坐標(biāo)分組為CSP-2-TNF和TNF-α的蛋白濃度，A0.781μg/ml；B3.125μg/ml；C12.5μg/ml；D50μg/ml。
圖10CSP-1-TNF對(duì)338號(hào)噬菌體與CEA結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制“0”系列為加入CSP-1-TNF的濃度為0，系列“1”“2”“3”“4”中CSP-1-TNF的濃度依次升高，依次為0.714μg/ml、3.57μg/ml、17.85μg/ml、89.25μg/ml。根據(jù)包被的CEA濃度的不同分組，A50μg/ml；B5μg/ml；C0.5μg/ml；D0.05μg/ml。
圖11CSP-2-TNF對(duì)338號(hào)噬菌體與CEA結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制圖中橫坐標(biāo)中CSP-2-TNF的濃度，“0”指只加噬菌體，不加CSP-2-TNF；從“A”到“E”CSP-2-TNF的濃度逐漸升高，依次為0.714μg/ml、3.57μg/ml、17.85μg/ml、89.25μg/ml。
圖12CSP-1-TNF對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒作用對(duì)照數(shù)值為蛋白濃度為0的三個(gè)平行孔OD570的平均值。
蛋白濃度從“A”到“J”濃度5倍梯度稀釋A89.250μg/ml；B17.850μg/ml；C3.570μg/ml；D0.714μg/ml；E0.143μg/ml；F0.0286μg/ml；G5.712ng/ml；H1.142ng/ml；I0.229ng/ml；J0.0457ng/ml。
圖13CSP-2-TNF對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒活性蛋白濃度從“8”到“1”為10倍梯度稀釋“8”50μg/ml；“7”5μg/ml；“6”0.5μg/ml；“5”0.05μg/ml；“4”0.005μg/ml；“3”0.5ng/ml；“2”0.05ng/ml；“1”0.005ng/ml；“不加藥”系列加入過濾除菌過的TE緩沖液作對(duì)照。
圖14CSP-1-TNF對(duì)LoVo細(xì)胞的細(xì)胞毒作用實(shí)施例一CEA結(jié)合肽的篩選以CEA為靶蛋白從噬菌體隨機(jī)展示環(huán)七肽庫(kù)中篩選與CEA特異結(jié)合的結(jié)合肽，經(jīng)過四輪的篩選，得到了一系列與CEA特異結(jié)合的噬菌體單克隆，從中隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆測(cè)序，其外源展示肽序列見圖1。
用ELISA的方法檢測(cè)各個(gè)單克隆噬菌體的CEA結(jié)合力的大小及特異性(圖2、圖3)，確定結(jié)合力和特異性最好的的單克隆的外源展示肽的序列為PAPWGRL，因?yàn)槭黔h(huán)肽庫(kù)，所以結(jié)合肽應(yīng)在兩側(cè)加上半胱氨酸，即CPAPWGRLC。
實(shí)施例二CSP-1-TNF表達(dá)載體的構(gòu)建(圖4)1.合成CSP-1的基因合成CSP-1基因的兩互補(bǔ)片段，并在其基因的5’端加上兩個(gè)甘氨酸的基因密碼子，基因兩側(cè)分別加上EcoR I的酶切位點(diǎn)。
片段15’AATTCACCACCGCACAGACGACCCCACGGAGCCGGGCACATG 3’片段25’AATTCATGTGCCCGGCTCCGTGGGGTCGTCTGTGCGGTGGTG 3’將片段1和2等比例混勻，94℃水浴變性3min，待其慢慢冷卻至室溫，使兩互補(bǔ)片段退火。
酶切并連接pBV220-TNF用EcoR I酶切，酶切體系為pBV220-TNF質(zhì)粒溶液8.5μl，10×H buffer 1μl，EcoR I 0.5μl，37℃溫育1h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，片段切下回收，與退火的CSP-1基因片段連接，連接體系為pBV220-TNF質(zhì)粒酶切后回收的片段4μl，退火后的目的基因片段6μl，Ligation Solution I 10μl，混勻，16℃連接1h。
鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，挑單克隆培養(yǎng)，分別測(cè)序鑒定和表達(dá)鑒定，確定正確克隆。
實(shí)施例三CSP-2-TNF表達(dá)載體的構(gòu)建(圖5)將CSP-1的氨基酸序列顛倒，為CLRGWPAPC，記為CSP-2。以pBV220-TNF為模板，通過兩次PCR將CSP-2的基因逐步加入到TNF-α基因的上游。
1、PCR反應(yīng)第一次PCR上游引物為5’CGGCTCCGTGCGGTGGTGTCAGATCATCTTCTCGA 3’，下游引物為5’GGGTCATCACAGGGCAATGATC 3’，含Sma I酶切位點(diǎn).
PCR參數(shù)為94℃，2min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94℃，30sec，60℃，1min，72℃，1min，共25個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段回收，與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化后挑單克隆測(cè)序，從中選正確克隆的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行第二次PCR。
第二次PCR上游引物為5’GGAATTCATGTGCCTGCGTGGTTGGCCGGCTCCGTGCGGTGGT 3’，含EcoR I酶切位點(diǎn)。
下游引物為5`GGGTCATCACAGGGCAATGATC 3’，PCR參數(shù)為94℃，2min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94℃，30sec；60℃，1min；72℃，1min，共25個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單克隆測(cè)序，從中選擇正確克隆。
2、酶切及連接正確克隆用EcoR I，Sma I雙酶切，酶切體系為ECoR I、Sma I各0.5μl，質(zhì)粒溶液7μl，10×T buffer 1μl，10×BSA 1μl，37℃，1h，同時(shí)將pBV220用EcoR I、Sma I雙酶切。酶切產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳?；厥漳康钠危B接。
實(shí)施例四CSP-1-TNF、CSP-2-TNF的表達(dá)與純化1、表達(dá)分別選取CSP-1-TNF和CSP-2-TNF經(jīng)鑒定正確的克隆，從保存的菌液中吸取100μl轉(zhuǎn)接至10ml LB-Amp中，37℃，200rpm振搖培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)的菌5ml轉(zhuǎn)接至500ml含LB-Amp中，37℃，200rpm振搖培養(yǎng)至OD600約為0.5時(shí)，42℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。菌液在4℃下10,000rpm離心10min，倒掉上清，菌體于-20℃凍存。
2、純化CSP-1-TNF、CSP-2-TNF菌體沉淀反復(fù)凍融后，分別超聲破碎(Cycle 0.5，Amplitude 40％)，裂解液4℃下10,000rpm離心10min，上清分別在冰浴條件下邊攪拌邊緩緩加入適量的硫酸銨，使之硫酸銨終濃度為20％飽和度，充分溶解后，4℃下10,000rpm離心10min，取上清，在冰浴條件下，邊攪拌邊緩緩加入適量硫酸銨，使之硫酸銨終濃度為40％飽和度，充分溶解后，4℃下10,000rpm離心10min，沉淀用上樣緩沖液(20 mmol/L Tris、150mmol/L Nacl、1mmol/L EDTA，pH值8.0)溶解，用上樣緩沖液平衡ULTROGELAcA 44凝膠過濾柱，將上述溶解好的蛋白溶液上樣，用上述上樣緩沖液洗脫，280nm檢測(cè)洗脫峰，SDS-PAGE檢測(cè)，合并目的蛋白。純化結(jié)果見圖6、圖7。
實(shí)施例五ELISA法檢測(cè)CSP-1-TNF、CSP-2-TNF與CEA的特異結(jié)合包被CEA，4℃過夜，用0.5％的BSA封閉，室溫3小時(shí)，每孔加入不同濃度的CSP-1-TNF或CSP-2-TNF，二者均以同樣濃度的TNF-α作對(duì)照，每孔100μl，每一濃度設(shè)3個(gè)平行孔，37℃結(jié)合1小時(shí)，PBST洗板6次，加TNF-α的單抗，37℃結(jié)合1小時(shí)，PBST洗板6次，加HRP標(biāo)記的二抗，37℃結(jié)合1小時(shí)，，PBST洗板6次，加入TMB底物顯色5-15min，2M H2SO4終止，酶聯(lián)儀測(cè)OD450。結(jié)果表明CSP-1-TNF和CSP-2-TNF與CEA的結(jié)合比TNF-α與CEA的結(jié)合要高2-3倍，說明CSP-1-TNF和CSP-2-TNF能與CEA特異性結(jié)合。(圖8、圖9)實(shí)施例六CSP-1-TNF、CSP-2-TNF對(duì)338號(hào)噬菌體與CEA結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)抑制包被CEA抗原，4℃過夜，用0.5％的BSA封閉，室溫3小時(shí)，每孔加入不同濃度的CSP-1-TNF或CSP-2-TNF與固定濃度(1010pfu/ml)的338號(hào)噬菌體的溶液100μl，每一濃度設(shè)3個(gè)平行孔，37℃結(jié)合1小時(shí)，PBST洗板6次，加HRP標(biāo)記的M13單抗，37℃結(jié)合1小時(shí)，PBST洗板6次，加入TMB底物顯色5-15min，2M H2SO4終止，酶聯(lián)儀測(cè)OD450。結(jié)果表明，隨著CSP-1-TNF或CSP-2-TNF蛋白濃度的提高，338號(hào)噬菌體與CEA的結(jié)合量逐漸降低(圖10、圖11)，證明CSP-1-TNF、CSP-2-TNF能夠競(jìng)爭(zhēng)抑制338號(hào)噬菌體與CEA的結(jié)合，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，表達(dá)在噬菌體表面的小肽與表達(dá)在TNF-α蛋白N末端的小肽具有類似的空間結(jié)構(gòu)，都能與CEA特異性結(jié)合。
實(shí)施例七用L929細(xì)胞測(cè)定CSP-1-TNF和CSP-2-TNF的生物學(xué)活性選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的L929細(xì)胞，0.25％胰酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，稀釋到5×104個(gè)細(xì)胞/ml，100μl/孔接種細(xì)胞，37℃，5％CO2，培養(yǎng)24h；CSP-1-TNF、CSP-2-TNF分別過濾除菌，稀釋到一定濃度后，分別加入到各孔培養(yǎng)的細(xì)胞中，37℃，5％CO2，培養(yǎng)48h；5mg/ml MTT溶液，10μl/孔，37℃溫育4h；小心吸去上層培養(yǎng)液，加入DMSO，100μl/孔，輕輕振蕩溶解結(jié)晶，測(cè)OD570。結(jié)果表明，CSP-1-TNF、CSP-2-TNF均具有對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。(圖12、圖13)實(shí)施例八檢測(cè)CSP-1-TNF對(duì)LoVo細(xì)胞的細(xì)胞毒作用選生長(zhǎng)狀態(tài)好的LoVo細(xì)胞，0.25％胰酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，稀釋到5×104個(gè)細(xì)胞/ml，100μl/孔接種細(xì)胞，37℃，5％CO2，培養(yǎng)24h；將CSP-1-TNF過濾除菌，稀釋到一定濃度后，分別加入到各孔培養(yǎng)的細(xì)胞中，37℃，5％CO2，培養(yǎng)48h；5mg/ml MTT溶液，10μl/孔，37℃溫育4h；小心吸去上層培養(yǎng)液，加入DMSO，100μl/孔，輕輕振蕩溶解結(jié)晶，測(cè)OD570。結(jié)果表明，CSP-1-TNF具有對(duì)LoVo細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。(圖14)
權(quán)利要求
1.一種能特異性結(jié)合癌胚抗原的小肽，其氨基酸序列從N末端到C末端為C-P-A-P-W-G-R-L-C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述小肽的反向序列，其氨基酸序列從N末端到C末端為C-L-R-G-W-P-A-P-C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽的基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽進(jìn)行優(yōu)化產(chǎn)生的變異肽。
5.根據(jù)利要求1所述小肽融合表達(dá)于TNF-α的N末端所構(gòu)成的融合蛋白，它的氨基序列從N末端到C末端為MCPAPWGRLC GGEFMVRSSS RTPSDKPVAH VVANPQAEGQ LQWLNRRANA LLANGVELRDNQLVVPSEGL YLIYSQVLFK GQGCPSTHVL LTHTISRIAV SYQTKVNLLS AIKSPCQRETPEGAEAKPWY EPIYLGGVFQ LEKGDPLSAE INRPDYLDFA ESGQVYFGII AL
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述小肽融合表達(dá)于TNF-α的N末端構(gòu)成的融合蛋白，它的氨基酸序列從N末端到C末端為MCLRGWPAPC GGVRSSSRTP SDKPVAHVVA NPQAEGQLQW LNRRANALLA NGVELRDNQLVVPSEGLYLI YSQVLFKGQG CPSTHVLLTH TISRIAVSYQ TKVNLLSAIK SPCQRETPEGAEAKPWYEPI YLGGVFQLEK GDPLSAEINR PDYLDFAESG QVYFGIIAL
7.一種根據(jù)權(quán)利要求5和6所述融合蛋白的表達(dá)載體。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽用作對(duì)癌胚抗原陽(yáng)性腫瘤導(dǎo)向治療的載體。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽用作對(duì)癌胚抗原陽(yáng)性腫瘤診斷的方法。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求5和6所述融合蛋白用作對(duì)癌胚抗原陽(yáng)性腫瘤治療的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌胚抗原陽(yáng)性腫瘤的導(dǎo)向治療研究，屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。通過噬菌體隨機(jī)展示肽庫(kù)篩選出與癌胚抗原特異性結(jié)合的結(jié)合肽，這些結(jié)合肽可以用作癌胚抗原陽(yáng)性腫瘤導(dǎo)向治療藥物的載體；將該結(jié)合肽與TNF－α融合，表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白能特異結(jié)合癌胚抗原，并且對(duì)癌胚抗原陽(yáng)性的LoVo細(xì)胞有細(xì)胞毒活性，表明該融合蛋白能用于癌胚抗原陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的治療。
文檔編號(hào)A61K38/08GK1502631SQ02149419
公開日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者陳惠鵬, 孔麗君, 王清明, 陳吉中, 范國(guó)才, 劉剛, 高紅偉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)