專利名稱：Tie2受體介異的靶向性腫瘤基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因治療領(lǐng)域。具體地，涉及一種基于與促血管生成素受體Tie2結(jié)合的配體寡肽GA1的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。該轉(zhuǎn)移系統(tǒng)通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，將外源DNA靶向地導(dǎo)入腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和表達(dá)Tie2受體的腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
背景技術(shù)：
PCT申請(qǐng)PCT/CN97/00106(WO98/18951)公開了用于靶向性腫瘤基因治療的新型的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中公開了包括針對(duì)EGFR、IGF I/II R及VEGFR三種受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)用于腫瘤治療。然而，由于不同腫瘤細(xì)胞表面的受體多種多樣，表達(dá)量有多有少，甚至根本不表達(dá)某些受體，因此僅有三種系統(tǒng)不能解決全部的問題。
1996年Davis等發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白-Angiopoietin-1(Ang-1)，它是蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體家族中Tie2受體的配體，Tie2受體幾乎僅在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。Ang-1在結(jié)構(gòu)上與已知的血管生成因子或其它蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體的配體不同，在體外不能直接促進(jìn)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，所以推測(cè)它可能與腫瘤新生血管的啟動(dòng)無關(guān)，而在血管生成過程的后期起作用，使血管網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定。
在發(fā)現(xiàn)Ang-1后，利用同源篩選的方法，Maisonpierre又發(fā)現(xiàn)了Angiopoietin-2(Ang2)，該蛋白也可與Tie2受體結(jié)合。在體外Ang2不能激活內(nèi)皮細(xì)胞上的Tie2受體，但可以激活其它細(xì)胞，如NIH-3T3細(xì)胞上的Tie2受體，所以，Ang2的功能可能是與Ang1拮抗，使血管網(wǎng)處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，有利于內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和血管網(wǎng)的重新建立。
這兩種配體的受體-Tie2，發(fā)現(xiàn)于1992年。該蛋白由1124個(gè)氨基酸殘基組成，當(dāng)配體與受體結(jié)合后，使受體形成二聚體，897位的酪氨酸自身磷酸化并激活激酶活性。Tie2的表達(dá)具有相對(duì)特異性，在人體內(nèi)主要表達(dá)于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞、部分腫瘤細(xì)胞和一些造血細(xì)胞表面。Tie2基因敲除的小鼠出生后無法存活，病理檢查發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)有血管形成但不能構(gòu)成復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)。
在多種腫瘤，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌等，及這些腫瘤內(nèi)的新生血管中，Ang-1和Tie2受體的表達(dá)均增高，所以利用阻斷Tie2受體的信號(hào)傳導(dǎo)，可以同時(shí)抑制腫瘤新生血管和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，達(dá)到直接和間接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。
有文獻(xiàn)報(bào)道，利用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可溶性Tie2受體胞外區(qū)基因，可以在體內(nèi)抑制小鼠乳腺癌4T1和黑色素瘤B16F10.9細(xì)胞，抑制率分別達(dá)到64％和47％，并有效地抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。該研究表明抑制Tie2受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有一定的抑制效應(yīng)。
綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的、靶向性腫瘤基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，尤其是利用Tie2受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是就是提供一種Tie2受體介導(dǎo)的靶向性腫瘤基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，它是一種與Tie2受體結(jié)合的配體寡肽和內(nèi)吞小體釋放寡肽所構(gòu)建的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種生長(zhǎng)因子受體Tie2介導(dǎo)的靶向性基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，它包含(a)特異性結(jié)合于Tie2受體的配體寡肽和(b)多聚陽離子多肽。
較佳地，所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)還含有(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)還含有(d)外源DNA。
在另一優(yōu)選例中，所述的配體寡肽含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGNPSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
在另一優(yōu)選例中，所述的多聚陽離子多肽選自下組多聚賴氨酸、聚乙酰亞胺(PEI)、魚精蛋白、組蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的上述蛋白及其混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的外源DNA選自下組抗癌基因、細(xì)胞凋亡基因、細(xì)胞因子基因、癌基因反義序列的真核重組表達(dá)載體DNA，及其混合物。更佳地，所述的外源DNA選自下組
(i)抗癌基因p53、Rb；(ii)細(xì)胞凋亡基因Caspase、p15、p16及p21WAF-1；(iii)細(xì)胞因子基因GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子)基因、TNF(腫瘤壞死因子)α基因、INF(干擾素)α、γ基因、IL(白細(xì)胞介素)2、IL3、IL4、IL12、IL15、IL18基因；(iv)癌基因的反義序列癌基因ras、c-myc、Akt的反義序列；(v)真核重組表達(dá)載體病毒性真核重組表達(dá)載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體、腺病毒重組表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒重組表達(dá)載體)以及以SV40、CMV啟動(dòng)子為順式調(diào)控元件的非病毒真核重組表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的組分(a)配體寡肽GA1、(b)多聚陽離子多肽和(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽中的兩者或三者以融合蛋白形式存在。
在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)吞小體釋放寡肽元件選自下組HA20或VP-1。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種寡肽，它結(jié)合于Tie2受體，且含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備生長(zhǎng)因子受體Tie2介導(dǎo)的靶向性基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的方法，包括步驟將(a)特異性結(jié)合于Tie2受體的配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽和任選的(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽混合在一起，形成混合物。較佳地，對(duì)于組分(a)、(b)、(c)而言，可以使用任何二者形成二元復(fù)合物。


圖1是本發(fā)明的GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將β-gal基因?qū)肴朔蜗侔┘?xì)胞系SPC-A1的X-gal染色結(jié)果。
A.GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)介導(dǎo)β-gal基因進(jìn)入SPC-A1(×400)B.GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)介導(dǎo)β-gal基因進(jìn)入SPC-A1(×100)C.生理鹽水對(duì)照D.空質(zhì)粒β-gal對(duì)照?qǐng)D2是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)外源β-gal基因在體內(nèi)的分布情況。其中，A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.腎；F.腦；G.胃；H.腸。
圖3是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)外源β-gal基因在不同時(shí)間(1、2、3、7天)在裸鼠皮下所荷人黑色素瘤A375中的表達(dá)情況。其中，A第一天；B第二天；C第三天；D第四天。
圖4是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肺腺癌SPC-A1中的表達(dá)情況。
圖5是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌SMMC-7721中的表達(dá)情況。
圖6是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因在裸鼠皮下所荷人胃腺癌SGC-7901中的表達(dá)情況。
圖7是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因在裸鼠皮下所荷人乳腺癌BCaP-37中的表達(dá)情況。圖中放大的部分為一個(gè)小血管。
圖8是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌移植瘤中的表達(dá)情況。
圖9是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌移植瘤中的表達(dá)情況。
圖10是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因在裸鼠皮下所荷人宮頸癌移植瘤中的表達(dá)情況。
圖11是人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠皮下腫瘤在注射GA1基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)p53基因三周后各個(gè)組瘤塊體積大小的比較。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，制備了特異性結(jié)合于Tie2受體的配體寡肽以及基于該配體寡肽的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。利用本發(fā)明配體寡肽識(shí)別Tie2受體的特性，經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，通過該載體系統(tǒng)將外源DNA選擇性地導(dǎo)入表達(dá)Tie2受體的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，從而可以同時(shí)抑制血管新生和腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
配體寡肽配體寡肽是本發(fā)明靶向性非病毒載體的關(guān)鍵組分。如本文所用，“配體寡肽(Ligand oligopeptide，LOP)”和“受體識(shí)別寡肽”可互換使用，指任何識(shí)別并結(jié)合于表面含Tie2受體的靶細(xì)胞的寡肽。如上所述，本發(fā)明的配體寡肽可特異性識(shí)別并結(jié)合于Tie2受體。
一類特別優(yōu)選的配體寡肽是長(zhǎng)度為15-30個(gè)氨基酸，且含有基本單元序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)的寡肽。特別優(yōu)選的例子是寡肽GA1，其氨基酸序列為WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。GA1的氨基酸序列是根據(jù)對(duì)促血管生成素1和2的氨基酸序列的生物信息學(xué)分析而得出的。
此外，本發(fā)明的配體寡肽還包括一個(gè)或幾個(gè)(通常1-8個(gè)，較佳地1-5個(gè))位點(diǎn)的氨基酸可以用類似性能的氨基酸代替所形成的配體寡肽。
本發(fā)明的配體寡肽可以含有單個(gè)基本單元序列，或多個(gè)(如2-10個(gè))基本單元序列。
本發(fā)明的配體寡肽可方便地用人工合成或基因工程重組方法制備。關(guān)于這些合成寡肽制法，可參見諸如WO98/18951(PCT/CN97/00106)等諸多文獻(xiàn)。
多聚陽離子多肽多聚陽離子多肽是本發(fā)明靶向性非病毒載體的的另一關(guān)鍵組分。
如本文所用，“多聚陽離子多肽”指一類富含堿性氨基酸的多肽，其堿性氨基酸(賴氨酸、組氨酸和精氨酸)比例約20％以上，因而帶正電荷，能與帶負(fù)電荷的DNA藉靜電引力結(jié)合，使DNA更穩(wěn)定。
可用于本發(fā)明的多聚陽離子多肽沒有特別限制，只要其堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)比例約20％以上，較佳地30％，更佳地40％以上，因而帶正電荷即可。代表性的例子包括多聚賴氨酸、聚乙酰亞胺、魚精蛋白、組蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的上述蛋白及其混合物。
內(nèi)吞小體釋放寡肽元件本發(fā)明的靶向性非病毒載體還可含有內(nèi)吞小體釋放寡肽元件，它起到防止內(nèi)吞入細(xì)胞的DNA被降解的作用。
任何內(nèi)吞小體釋放寡肽都可用于本發(fā)明，代表性的例子包括(但并不限于)HA20、VP-1。
靶向性非病毒載體如本文所用，本發(fā)明的“靶向性非病毒載體”指含有以下組分(a)和(b)、或者含有組分(a)、(b)和(c)的混合物或復(fù)合物(a)特異性結(jié)合于Tie2受體的配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽、(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽。
在本發(fā)明中，組分(a)、(b)、(c)可以是非連接形式，也可以任何兩者或三者通過共價(jià)或非共價(jià)方式連接在一起。特別優(yōu)選的形式包括配體寡肽—多聚陽離子多肽二元復(fù)合物、多聚陽離子多肽—內(nèi)吞小體釋放寡肽二元復(fù)合物、配體寡肽—多聚陽離子多肽—內(nèi)吞小體釋放寡肽三元復(fù)合物。例如HA20-多聚賴氨酸、HA20-魚精蛋白、HA20-組蛋白共價(jià)連接物等。
連接可以通過化學(xué)法(如使用SPDP等偶聯(lián)劑)，也可以通過重組法，例如形成融合蛋白。
對(duì)于融合蛋白而言，在(a)配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽，和(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽元件之間，可任選地含有連接肽，以便增加復(fù)合多肽空間結(jié)構(gòu)的柔性和舒展性，讓各元件發(fā)揮各自的功能?？捎糜诒景l(fā)明的連接肽沒有特別限制，只要起連接作用即可。一類連接肽例子是(Gly)2-6Ser，例如(Gly)4Ser。連接肽可多個(gè)串聯(lián)使用。
本發(fā)明的(a)配體寡肽，(b)多聚陽離子多肽，和(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽元件都可以用類似性能的氨基酸替代，只要仍保留各自類似的生物功能。
靶向性非病毒載體的制備方法通常，將上述(a)、(b)、(c)組分或其復(fù)合物混合在一起，即可獲得本發(fā)明的靶向性非病毒載體。其中，(a)、(b)、(c)組分的混合比例通常為0.5-1∶1-2∶0-1，較佳地為0.8-1∶1-1.5∶0.5-1。
此外，當(dāng)以(a)-(b)復(fù)合物和(b)-(c)復(fù)合物的形式施用時(shí)，(a)-(b)復(fù)合物(b)-(c)復(fù)合物的混合比例通常為0.8-1.2∶0.8-1.2，較佳地為0.9-1.1∶0.9∶1.1。
外源DNA
可用于本發(fā)明的外源DNA沒有特別限制，可以是各種治療性或預(yù)防性的DNA，例如目的基因、反義癌基因、抗癌基因、自殺基因、細(xì)胞調(diào)亡基因、細(xì)胞因子基因、或其組合，或者含有上述基因的真核表達(dá)載體DNA。原癌基因反義序列包括原癌基因(rasH、rasK、rasN、c-myc、bcl-2、Akt)、生長(zhǎng)因子及其受體基因的反義DNA序列、反義寡核苷酸及反義寡脫氧核苷酸；抑癌基因包括p53、Rb、PTEN，自殺基因包括HSV-TK(單純皰疹病毒胸苷激酶)基因及CD(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)基因；細(xì)胞凋亡基因包括p15、p16、p21WAF-1；細(xì)胞因子基因包括GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)基因，TNFα(腫瘤壞死因子)基因，INF(干擾素)α、γ基因，IL(白細(xì)胞介素)2、3、4、12、15、18基因等。
靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)將本發(fā)明的靶向性非病毒載體與外源DNA混合，就構(gòu)成Tie2受體介導(dǎo)的靶向性腫瘤基因治療的基因?qū)胂到y(tǒng)。取決于所用的外源DNA，本發(fā)明的基因?qū)胂到y(tǒng)可用于治療遺傳疾病或腫瘤等疾病，尤其是用于基因治療。
藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的一種或多種本發(fā)明的靶向性非病毒載體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。
施用時(shí)，藥物組合物中還含有一種或多種上述的外源DNA。
具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于，(1)本發(fā)明的Tie2受體介導(dǎo)的基因治療用非病毒載體，利用了腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表面Tie2受體高表達(dá)的特點(diǎn)，可有效地將外源基因相對(duì)靶向性地導(dǎo)入腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞和表達(dá)Tie2受體的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。
(2)本系統(tǒng)有可能將外源治療性基因同時(shí)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過抑制腫瘤血管新生和直接抑制腫瘤細(xì)胞，達(dá)到對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的雙重抑制效果。
(3)另外該系統(tǒng)還有可能應(yīng)用于其它與血管增生有關(guān)的疾病，如糖尿病性眼疾、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1非病毒載體的構(gòu)建A.各組分的獲得(1)配體寡肽GA1的合成采用美國(guó)ABI公司的多肽合成儀并按照其多肽合成操作手冊(cè)進(jìn)行合成，柱層析分離得到寡肽GA1，其氨基酸序列為WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
(2)聚L-賴氨酸(Poly-L-lysine，簡(jiǎn)寫為P.L.)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，分子量分布為15000-30000道爾頓。
(3)HA20采用美國(guó)ABI公司的多肽合成儀并按照其多肽合成操作手冊(cè)進(jìn)行合成，柱層析分離得到寡肽HA20，其氨基酸序列為GLFEA IAEFI EGGWE ELIEG(SEQ IDNO2)。
B.二元復(fù)合物的制備首先，將GA1、HA20和聚L-賴氨酸(Poly-L-lysine，簡(jiǎn)寫為P.L.)溶于PSB(0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.4，含0.1M NaCl)中，然后，按下列步驟進(jìn)行反應(yīng)。
(1)P.L.+SPDP→P.L.-PDP注SPDP是N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯。
P.L.與SPDP(N-)的摩爾比為1∶5，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，溫度為25℃。反應(yīng)完畢后通過透析去除未反應(yīng)的SPDP。P.L.-PDP冷凍干燥。
(2)P.L.-PDP干粉溶于PSB中P.L.-PDP+DTT→P.L.-SH注DTT是二硫蘇糖醇。
反應(yīng)中DTT過量，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，溫度為25℃。反應(yīng)完畢后通過透析去除未反應(yīng)的DTT。產(chǎn)物冷凍干燥。
(3)GA1+SPDP→GA1-PDPHA20+SPDP→HA20-PDPGA1、HA20與SPDP的摩爾比均為1∶5，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，溫度為25℃。反應(yīng)完畢后通過MWCO1000的透析袋透析去除未反應(yīng)的SPDP。產(chǎn)物冷凍干燥。
(4)GA1-PDP、HA20-PDP和P.L.-SH干粉均溶于PSB中。
GA1-PDP+P.L.-SH→P.L.-GA1HA20-PDP+P.L.-SH→P.L.-HA20GA1-PDP、HA20-PDP與P.L.-SH的摩爾比為3∶1，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)，溫度為25℃。反應(yīng)完畢后通過透析去除未反應(yīng)的GA1-PDP和HA20-PDP。
C.靶向性非病毒載體的制備分別以質(zhì)量比1∶1、0.8∶1.2、1.2∶0.8混合P.L.-GA1與P.L.-HA20，即得所需的非病毒載體。
或者，按質(zhì)量比1∶1.5∶1將GA1、聚賴氨酸和HA20混合在一起，形成所需的非病毒載體。
實(shí)施例2質(zhì)粒DNA的抽提與純化本實(shí)施例中所用重組真核表達(dá)載體質(zhì)粒DNA的分離與純化均利用QIAGEN公司的Maxi plasmid kit而得到的DNA純品。
從LB平板上挑選單克隆接種于含氨芐青霉素的5mlLB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm振搖過夜。1∶1000轉(zhuǎn)接于含氨芐青霉素的200ml LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm振搖16小時(shí)。轉(zhuǎn)移菌液于500ml離心管中，4,000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，收集菌體。沉淀重懸于10ml Buffer P1(50mM Tris·Cl，pH8.0，10mM EDTA pH8.0，100μg/ml Rnase A)。加入10ml Buffer P2(200mM NaOH，1％SDS)后輕輕顛倒4-6次，混勻，室溫下靜置5分鐘。加10ml Buffer P3(3.0M NaAc，pH5.5)，顛倒混勻后，轉(zhuǎn)移至50ml離心管，10,000rpm，4℃離心30分鐘，取上清。上清經(jīng)四層無菌過濾到QIAGEN Maxi質(zhì)粒抽提柱中(預(yù)先用10ml Buffer QBT平衡)，讓其自然流下，等上清完全進(jìn)入柱中，再加Buffer QC 30ml洗滌二次，最后加入BufferQF 15ml，收集流出液，加入0.7倍體積異丙醇，10,000rpm，4℃離心30分鐘，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1次，室溫下自然干燥，溶于適量體積的TE(pH 8.0)中，1％瓊脂糖凝膠電泳堅(jiān)定DNA的質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度并定量，-20℃保存。
實(shí)施例3四元復(fù)合體基因?qū)胂到y(tǒng)的構(gòu)建1).GA1-P.L.和HA20-P.L.溶解于水后，經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｋ匈|(zhì)粒經(jīng)QIAGEN柱提取和純化，再用2倍體積的酒精和1/3體積的3M NaAc沉淀，75％酒精洗一次后，空氣中干燥。用適量MilliQ水溶解，使?jié)舛瘸蔀?.2μg/μl。
2).非病毒載體與DNA形成復(fù)合物時(shí)二者之間的最佳質(zhì)量比。
0.2μg CMV-β-gal質(zhì)粒DNA與非病毒載體以質(zhì)量比1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2混合，25℃靜置30分鐘，以1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的阻滯情況，確定最佳質(zhì)量比。
3).按上述確定的配比制備四元復(fù)合體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。
實(shí)施例4 GA1基因?qū)胂到y(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)CMV-β-gal基因的體外導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)1).細(xì)胞培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞傳代培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞用0.25％胰酶消化后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2).體外導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞用0.25％胰酶消化后，接種于六孔板中，每孔1.5×105，第二天細(xì)胞滿度約60％時(shí)，于1ml培養(yǎng)液中加入相當(dāng)于2μg DNA的四元復(fù)合體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，換新鮮的含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后細(xì)胞用PBS洗2次，加入新鮮配制的固定液于室溫固定10分鐘，再用PBS漂洗3次，每次15分鐘，以徹底去除固定液，用濾紙吸干瘤塊和臟器上的PBS，加入新鮮配制的染色液于37℃保溫24小時(shí)后，觀察外源基因?qū)氲那闆r(染色液組成是1mg/ml X-gal，5mM K4[Fe(CN)6]，5mMK3[Fe(CN)6]，2mM MgCl2)。
結(jié)果如圖1所示。由圖中可以看出，轉(zhuǎn)導(dǎo)β-gal基因的細(xì)胞呈藍(lán)色，而分別加入生理鹽水和單純質(zhì)粒的對(duì)照組則未見外源基因的導(dǎo)入。
實(shí)施例5 GA1基因?qū)胂到y(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)pCMV-β-gal基因在體內(nèi)的分布取人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠，于皮下瘤周注射包裹了0.2μg DNA的GA1基因?qū)胂到y(tǒng)100μl。于第2天后犧牲裸鼠，取裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸等臟器用上述方法進(jìn)行染色并進(jìn)行冰凍切片和復(fù)染。
結(jié)果見圖2所示。結(jié)果表明，心、肝、肺、腎、腦均未見藍(lán)染，而在脾臟中有外源基因?qū)搿６谖?、腸粘膜中，雖然也有藍(lán)染，但是我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)未作任何處理的裸鼠胃、腸進(jìn)行染色，腺上皮細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)有藍(lán)染，說明這些組織中存在非特異性的半乳糖苷酶活性。
實(shí)施例6 GA1基因?qū)胂到y(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)pCMV-β-gal基因在不同時(shí)間的表達(dá)情況取人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠，于皮下瘤周注射包裹了0.2μg DNA的GA1基因?qū)胂到y(tǒng)100μl，在注射后的第1、2、3和7天犧牲裸鼠，取出皮下腫瘤，按方法6進(jìn)行組織染色和切片，于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。
結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，GA1基因?qū)胂到y(tǒng)導(dǎo)入的基因在第1天即開始有表達(dá)，第2天表達(dá)量最多，以后開始減少，至第7天仍有一定量的表達(dá)。
實(shí)施例7體內(nèi)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)取荷不同腫瘤的裸鼠(SPC-A1肺腺癌、SMMC-7721肝癌、SK-OV-3卵巢癌、SGC胃癌細(xì)胞株、A375人黑色素瘤、BCaP-37人乳腺癌、荷人宮頸癌移植瘤裸鼠)，于皮下瘤周注射相當(dāng)于0.2μgβ-gal DNA的GA1基因?qū)胂到y(tǒng)100μl，在注射后48小時(shí)犧牲裸鼠，取皮下腫瘤，用PBS漂洗2次，加入新鮮配制的固定液于室溫固定20分鐘，再用PBS漂洗3次，每次15分鐘，以徹底去除固定液，用濾紙吸干瘤塊和臟器上的PBS，加入新鮮配制的染色液(染色液組成是1mg/ml X-gal，5mM K4[Fe(CN)6]，5mMK3[Fe(CN)6]，2mM MgCl2)，于37℃保溫24小時(shí)后，觀察瘤塊導(dǎo)入外源基因的情況，48小時(shí)后進(jìn)行石蠟切片，然后用核固紅對(duì)病理切片進(jìn)行復(fù)染，觀察外源基因?qū)肭闆r(是否有藍(lán)色斑點(diǎn)產(chǎn)生)。
結(jié)果如圖4-10所示?？梢钥闯觯谀[瘤包膜及腫瘤內(nèi)的部分血管中有報(bào)告基因的表達(dá)。由于在部分腫瘤細(xì)胞的表面也存在Tie2受體的表達(dá)，所以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)也可觀察到有外源基因的表達(dá)。
這表明，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，可有效地介導(dǎo)外源基因靶向性地導(dǎo)入腫瘤包膜及腫瘤內(nèi)的部分血管和腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例8體內(nèi)有效實(shí)驗(yàn)1)荷瘤裸鼠的準(zhǔn)備將A375人黑色素瘤細(xì)胞株接種于5周齡裸鼠皮下，待瘤直徑長(zhǎng)至0.5cm后，作為瘤源。犧牲裸鼠，取出瘤塊并切割成大小約1mm3碎塊，用穿刺針接種到6周齡裸鼠皮下。
一周后，待腫瘤長(zhǎng)到直徑約為0.3-0.4cm時(shí)，挑選出瘤體均勻的動(dòng)物，隨機(jī)分為5組，每組6只備用。
2)GA1系統(tǒng)介導(dǎo)pCEP-p53基因的有效實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分五個(gè)組，分別是①生理鹽水組，
②非病毒載體組(1μg GA1-PL)，③單純質(zhì)粒pCEP-p53組(1μg pCEP-p53質(zhì)粒)，④低劑量組(每只注射相當(dāng)于0.2μg質(zhì)粒的四元復(fù)合體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng))，⑤高劑量組(每只注射相當(dāng)于1μg質(zhì)粒的四元復(fù)合體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng))。
每周注射一次，持續(xù)1個(gè)月。每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠皮下瘤體的長(zhǎng)(a)、短(b)徑，根據(jù)V＝πab2/6計(jì)算瘤體積。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，圖11所示。結(jié)果表明，五個(gè)組的平均值分別為①1.498±0.600cm3②1.734±0.811cm3③1.727±0.526cm3④1.169±0.381cm3⑤0.731±0.328cm3，高劑量組與①、②、③組相比，抑制率分別為51.2％、57.8％、57.7％，并且與三個(gè)對(duì)照組的差別均有顯著意義(P＜0.05)，而低劑量組只與單純質(zhì)粒組的差別有顯著意義(P＜0.05)。這表明，本發(fā)明基于Tie2受體的配體寡肽的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，可有效地介導(dǎo)pCEP-p53基因進(jìn)入細(xì)胞并有效的抑制人黑色素瘤A375的生長(zhǎng)。
表1體內(nèi)有效實(shí)驗(yàn)中瘤塊體積的比較①生理鹽水 ②空載體 ③單純質(zhì)粒 ④高劑量 ⑤低劑量0.849 0.697 1.218 0.315 0.9280.998 0.934 1.277 0.421 0.9411.094 1.752 1.286 0.558 1.0001.735 2.037 1.979 0.719 1.1152.0036 2.081 2.353 1.120 1.2322.306 2.901 2.248 1.255 1.795平均值± 1.498± 1.734± 1.727± 0.731± 1.169±標(biāo)準(zhǔn)差 0.600 0.811 0.526 0.381 0.328在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市腫瘤研究所<120>Tie2受體介導(dǎo)的靶向性腫瘤基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)<130>025446<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(19)<223>結(jié)合于Tie2受體的配體寡肽<400>1Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp15 10 15Leu Gly Asn<210>2<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>內(nèi)吞小體釋放寡肽HA20
<400>2Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Glu1 5 10 15Leu Ile Glu Gly20
權(quán)利要求
1.一種生長(zhǎng)因子受體Tie2介導(dǎo)的靶向性基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，它包含(a)特異性結(jié)合于Tie2受體的配體寡肽和(b)多聚陽離子多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，它還含有(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，它還含有(d)外源DNA。
4.如權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所述的配體寡肽含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
5.如權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，多聚陽離子多肽選自下組多聚賴氨酸、聚乙酰亞胺、魚精蛋白、組蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，經(jīng)聚乙二醇修飾的上述蛋白及其混合物。
6.如權(quán)利要求3所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所述的外源DNA選自下組抗癌基因、細(xì)胞凋亡基因、細(xì)胞因子基因、癌基因反義序列的真核重組表達(dá)載體DNA，及其混合物。
7.如權(quán)利要求3所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所述的外源DNA選自下組(i)抗癌基因p53、Rb；(ii)細(xì)胞凋亡基因Caspase、p15、p16及p21WAF-1；(iii)細(xì)胞因子基因GM-CSF基因、TNFα基因、INFα、γ基因、IL2、IL3、IL4、IL12、IL15、IL18基因；(iv)癌基因的反義序列癌基因ras、c-myc、Akt的反義序列；(v)真核重組表達(dá)載體病毒性真核重組表達(dá)載體以及以SV40、CMV啟動(dòng)子為順式調(diào)控元件的非病毒真核重組表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求3所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所述的組分(a)配體寡肽GA1、(b)多聚陽離子多肽和(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽中的兩者或三者以融合蛋白形式存在。
9.如權(quán)利要求2所述的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所述的內(nèi)吞小體釋放寡肽元件選自下組HA20或VP-1。
10.一種寡肽，其特征在于，它結(jié)合于Tie2受體，且含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種由促血管生成素受體Tie2介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，它包括它包含(a)特異性結(jié)合于Tie2受體的配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽和任選的(c)內(nèi)吞小體釋放寡肽和(d)外源DNA。所述基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)能有效地在體內(nèi)外將外源基因靶向性地導(dǎo)入腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和表達(dá)Tie2受體的腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1504235SQ0215090
公開日2004年6月16日 申請(qǐng)日期2002年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月2日
發(fā)明者顧健人, 韓峻松, 田培坤 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所