專利名稱：白細胞介素－2及其基因在戒毒應用中的測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及白細胞介素-2(IL-2)及其基因在戒毒應用中的測試方法。
背景技術(shù)：
毒品，不僅嚴重危害人類健康，全世界吸毒者有1乙多人口，給社會帶來了一系列難以解決的問題。對危害世界人們身心健康的毒品，各國政府和科學家們正不遺余力地研究、開發(fā)解除毒品產(chǎn)生生理/心理反應的藥物及方法，使吸毒者迅速達到脫毒、脫癮的目的。但由于毒品引發(fā)的特殊的生理及心理反應，至今未能發(fā)現(xiàn)一種使吸毒者安全、有效、無依賴性地脫離毒品的“靈丹妙藥”?，F(xiàn)有的治療方法存在著難以接受的副作用，而且它的應用也常常由于成癮性而受限。而整個對藥物依賴性研究的工作仍停留在“新的嗎啡類化合物取代舊的嗎啡類化合物”的怪圈中，“美沙酮遞減法”被發(fā)達國家作為“標準治療”，至今仍在使用。社會迫切需要一種本身無成癮性、有較好控制戒斷癥狀、且毒副作用小的藥物。
免疫系統(tǒng)中的一種重要的淋巴因子-白細胞介素-2的鎮(zhèn)痛作用和控制嗎啡戒斷癥狀作用的發(fā)現(xiàn)，可能為我們提供了一個重要的工具。我國劉新垣院士等首先發(fā)現(xiàn)IL-2具有鎮(zhèn)痛作用。實驗表明IL-2既有中樞鎮(zhèn)痛作用又有外周鎮(zhèn)痛作用，臨床觀察發(fā)現(xiàn)對止痛效果不佳的晚期癌癥痛患者使用IL-2后具有很好的止痛作用。實驗還發(fā)現(xiàn)IL-2的鎮(zhèn)痛作用可能與阿片受體有關(guān)。在嗎啡耐受及對嗎啡不敏感的神經(jīng)病理痛模型上，IL-2較嗎啡具有更為顯著的鎮(zhèn)痛作用。由于吸毒者的免疫功能低下，IL-2有望一方面提高機體的免疫功能，一方面控制戒斷癥狀。然而IL-2在機體內(nèi)活性半衰期很短，必須大劑量連續(xù)用藥，醫(yī)藥費用高及長期注射的麻煩，從而影響了治療效果及這一藥物的廣泛應用?；蛑委煘榻鉀Q這一問題帶來了新的希望，它是一種通過基因轉(zhuǎn)移的方法，將具有表達目的基因的載體導入到相關(guān)的細胞和組織中，使轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的方法。目前用于基因治療的基因載體有病毒載體和非病毒載體。脂質(zhì)體屬于后者，它介導的轉(zhuǎn)基因安全性好，可用于在體(in vivo)基因治療；病毒載體穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)基因效率高，可轉(zhuǎn)染分裂或不分裂細胞；腺病毒進入細胞核后，以附加體(episome)的形式存在，不發(fā)生整合，因此沒有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體潛在的致癌、致突變性，安全性較好，這些特點決定了腺病毒非常適合于神經(jīng)系統(tǒng)的在體基因治療。當腺病毒載體注入蛛網(wǎng)膜下腔后，腺病毒進入軟脊膜和蛛網(wǎng)膜內(nèi)增殖，基因表達產(chǎn)物以“旁分泌模式”作用于脊髓和感覺神經(jīng)根，可在脊髓水平對神經(jīng)進行調(diào)控，這種基因治療方式通過腰穿即可完成，所以有希望應用于門診患者的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于設計IL-2基因在戒毒應用中的測試方法，從而能采用IL-2蛋白、pcDNA3質(zhì)粒-脂質(zhì)體或腺病毒載體介導IL-2基因轉(zhuǎn)移至蛛網(wǎng)膜下腔，達到控制嗎啡戒斷癥狀，使IL-2的戒毒功能達到臨床應用的目的。
本發(fā)明提供了一種白細胞介素-2及其基因在戒毒應用中的測試方法，該方法包括下列步驟(1)真核表達質(zhì)粒pcDNA3-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長含信號肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體(Invitrogen)。IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化。通過測定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度，注射時質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液(PB)中；(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長含信號肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體(Microbix)。得到pCA13-IL-2，此時IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10(Microbix)共轉(zhuǎn)染293細胞，進行同源重組，篩選重組腺病毒，擴增純化腺病毒，注射時病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中；(3)嗎啡依賴(成癮)小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型(此組小鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組；(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型(此組大鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組；(5)IL-2蛋白及pcDNA3質(zhì)粒介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時后將成癮的小鼠隨機分為8組，每組10只。蛋白治療組經(jīng)第5與第6腰椎之間(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液(PB)。IL-2基因治療組8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(對照組，提前24小時注射)，8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(基因治療組，提前24小時注射)。注射總體積為10μl。注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時后，將成癮的大鼠隨機分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl。注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動、異常姿勢、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計算戒斷癥狀總評分值；(7)腺病毒載體介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型(Ad5)，1×107pfuAd5-IL-2。注射總體積為10μl。注射后一周測定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(8)成癮性試驗a.小鼠豎尾試驗小鼠隨機分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1(陽性對照)，腹腔注射含5％葡萄糖的PB(陰性對照)，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU。觀察給藥后2小時內(nèi)小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應；b.小鼠跳躍反應試驗小鼠隨機分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB(陰性對照組)或嗎啡(陽性對照組)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU。于最后一次給藥后2小時，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應次數(shù)；(9)統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。
本發(fā)明的方法研究結(jié)果(1)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白(1×104IU)可明顯延長小鼠開始跳躍的潛伏期(p＜0.01)，并明顯抑制小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)(p＜0.01)，其效果呈劑量依賴性；IL-2蛋白(2×104IU)可明顯抑制小鼠的體重減少(p＜0.05)(圖1，A、B、C)。
(2)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2基因(pcDNA3-IL-2)抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀8μgpcDNA3-IL-2/8μglipofectamine可明顯抑制小鼠的體重變化(p＜0.05)，并可延長小鼠開始跳躍的潛伏期(p＜0.01)和抑制小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)(p＜0.01)(圖1，A、B、C)。
(3)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白可明顯抑制大鼠的戒斷癥狀總分值(p＜0.05)，包括異常姿勢、激惹、腹瀉、流涎、體重減少；對濕狗樣抖動、咬牙的評分值有減少的傾向，但無統(tǒng)計意義?？偟慕Y(jié)果表明，IL-2蛋白也可明顯抑制大鼠大部分的嗎啡戒斷癥狀。
(4)IL-2蛋白無成癮性a.小鼠豎尾試驗嗎啡組小鼠均出現(xiàn)S形豎尾反應，興奮跑動，而IL-2蛋白組小鼠無豎尾反應，活動正常。
b.小鼠跳躍反應試驗IL-2蛋白組(0.9±0.5)與對照組(0.4±0.3)比較相近，與嗎啡組(14.1±1.6)比較則有非常顯著的差異(p＜0.01)。
表1.蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白對大鼠嗎啡戒斷癥狀的影響形成嗎啡依賴大鼠模型后，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對照組(vehicle)為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl。注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動、異常姿勢、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計算戒斷癥狀總評分值。統(tǒng)計學意義定為*P＜0.05(與vehicle比較)。
表1IL-2劑量 2.0×104IU4.0×104IU 1.4×105IUvehicle動物數(shù)5 5 5 11運動性癥候分值濕狗樣抖動 1.60±0.75 0.80±0.49 0±0 1.27±0.49異常姿勢6.40±1.60 6.80±0.49 5.6±0.75*8.00±0流涎1.20±0.49 0±0*0.4±0.4*1.82±0.12咬牙0.20±0.20 0.10±0.10 0.0±0 0.27±0.10非運動性癥候分值腹瀉5.60±0.98 3.20±1.50*2.4±1.6*7.27±0.49激惹1.60±1.60 0.8±0.49*0.4±0.4*3.54±0.68體重減少10.00±1.58 6.00±1.00*7.00±1.22*11.82±1.02總評分值26.60±3.01*17.70±1.74*15.8±3.43*33.95±1.06表2.小鼠注射7次IL-2蛋白(腹腔)或嗎啡(皮下)后，腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的小鼠跳躍小鼠分別皮下注射含5％葡萄糖的PB(陰性對照組)或嗎啡(陽性對照組)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105及6.4×105IU。于最后一次給藥后2小時，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應次數(shù)。統(tǒng)計學意義定為*P＜0.05(與嗎啡組比較)。
表2藥物及給藥途徑 跳躍次數(shù)(跳躍的小鼠/總數(shù))
含5％葡萄糖的PB(皮下注射)0.4±0.3*(2/10)嗎啡(皮下注射) 14.1±1.6(10/10)IL-2蛋白(腹腔注射) 0.9±0.5*(3/10)


圖1(A、B、C)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白及pcDNA3-IL-2基因?qū)π∈髥岱冉鋽喟Y狀的影響形成嗎啡依賴小鼠模型后，經(jīng)第5與第6腰椎之間(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射5×103、1×104，2×104、4×104、8×104IU IL-2蛋白，對照組(vehicle)為含5％葡萄糖的PB，n＝9-18；基因治療組為8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(提前24小時注射)，其對照組為8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(提前24小時注射)，n＝10。注射總體積為10μl。注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，分別統(tǒng)計各組小鼠開始跳躍的潛伏期(秒)(圖1A)及15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)(圖1B)及30分鐘內(nèi)小鼠體重變化(克)(圖1C)，圖中橫坐標為蛛網(wǎng)膜下腔注射的IL-2濃度，縱坐標分別為潛伏期(秒)(圖1A)、跳躍次數(shù)(圖1B)和體重變化(克)(圖1C)，統(tǒng)計學意義定為*P＜0.05，**P＜0.01(與vehicle比較)；#P＜0.05，##P＜0.01(與8μg pcDNA3/8μg lipofectamine比較)。
注1.對照組(vehicle)2.5×103IU IL-2蛋白3.1×104IU IL-2蛋白4.2×104IU IL-2蛋白5.4×104IU IL-2蛋白6.8×104IU IL-2蛋白7.8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine8.8μg pcDNA3/8μg lipofectamine通過本發(fā)明的測試方法結(jié)果表明蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白具有較好的戒毒作用，其效果呈劑量依賴性。其特點是本身沒有成癮性，且能同時增強機體的免疫功能，這對免疫力低下的吸毒者來說是很有益的，不成癮，又能增強免疫功能，乃目前任何治療方法所無法做到的。pcDNA3-IL-2基因也有一定的戒毒作用，其效果比高劑量IL-2蛋白差，可能是由于IL-2蛋白的瞬時分泌量較低。但另一方面，由于pcDNA3-IL-2表達IL-2蛋白可持續(xù)6天(比注射的IL-2蛋白的半衰期延長約300倍)，對整個戒毒過程來說是很方便、經(jīng)濟的。通過對pcDNA3-IL-2基因?qū)霔l件的進一步優(yōu)化，其戒毒效果可望更好，更適合實際應用。
具體實施例方式(1)真核表達質(zhì)粒pcDNA3-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長含信號肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體(Invitrogen)。IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化。通過測定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度。注射時質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液(PB)中。
(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長含信號肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體(Microbix)。得到pCA13-IL-2，此時IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10(Microbix)共轉(zhuǎn)染293細胞，進行同源重組，篩選重組腺病毒。擴增純化腺病毒，注射時病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中。
(3)嗎啡依賴小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型(此組小鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組。
(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型(此組大鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組。
(5)IL-2蛋白及pcDNA3質(zhì)粒介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時后，將成癮的小鼠隨機分為8組，每組10只。蛋白治療組經(jīng)第5與第6腰椎之間(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液(PB)。IL-2基因治療組8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(對照組，提前24小時注射)，8μgpcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(基因治療組，提前24小時注射)。注射總體積為10μl。注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化。
(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時后，將成癮的大鼠隨機分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl。注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動、異常姿勢、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計算戒斷癥狀總評分值。
(7)腺病毒載體介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型(Ad5)，1×107pfuAd5-IL-2。注射總體積為10μl.注射后一周測定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化。
(8)成癮性試驗a.小鼠豎尾試驗小鼠隨機分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1(陽性對照)，腹腔注射含5％葡萄糖的PB(陰性對照)，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU。觀察給藥后2小時內(nèi)小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應。
b.小鼠跳躍反應試驗小鼠隨機分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB(陰性對照組)或嗎啡(陽性對照組)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU。于最后一次給藥后2小時，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應次數(shù)。
(9)統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。
權(quán)利要求
1.白細胞介素-2 IL-2及其基因在戒毒應用中的測試方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)真核表達質(zhì)粒pcDNA3-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長含信號肽的人IL-2 cDNA 462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體Invitrogen，IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化，通過測定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度，注射時質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液中；(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長含信號肽的人IL-2 cDNA 462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體Microbix，得到pCA13-IL-2，此時IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10 Microbix共轉(zhuǎn)染293細胞，進行同源重組，篩選重組腺病毒，擴增純化腺病毒，注射時病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中；(3)嗎啡依賴小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型，此組小鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組；(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型，此組大鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組；(5)IL-2蛋白及pcDNA3質(zhì)粒介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時后，將成癮的小鼠隨機分為8組，每組10只，蛋白治療組經(jīng)第5與第6腰椎之間，蛛網(wǎng)膜下腔， 分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液，IL-2基因治療組8μg pcDNA3/8μg lipofectamine，對照組，提前24小時注射，8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine，基因治療組，提前24小時注射，注射總體積為10μl，注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時后，將成癮的大鼠隨機分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl，注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動、異常姿勢、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計算戒斷癥狀總評分值；(7)腺病毒載體介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型Ad5，1×107pfuAd5-IL-2。注射總體積為10μl。注射后一周測定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(8)成癮性試驗a.小鼠豎尾試驗小鼠隨機分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1陽性對照，腹腔注射含5％葡萄糖的PB陰性對照，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU，觀察給藥后2小時內(nèi)小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應；b.小鼠跳躍反應試驗小鼠隨機分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB陰性對照組或嗎啡陽性對照組，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次，9:00、10:00、11:00、13:00、15:00，第二天注射2次9:00、11:00，嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and 6.4×105IU，于最后一次給藥后2小時，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應次數(shù)；(9)統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細胞介素-2及其基因在戒毒應用中的測試方法，其特征在于其中采用的給藥途徑為蛛網(wǎng)膜下腔給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細胞介素-2及其基因在戒毒應用中的測試方法，其特征在于IL-2及pcDNA3-IL-2或Ad5-IL-2在蛛網(wǎng)膜下腔表達的IL-2蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細胞介素-2及其基因在戒毒應用中的測試方法，其特征在于其中所述的成癮類型為阿片類物質(zhì)成癮。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種白細胞介素－2(IL－2)及其基因在戒毒應用中的測試方法。通過本發(fā)明的方法表明蛛網(wǎng)膜下腔注射IL－2蛋白有較好的戒毒作用，其效果呈劑量依賴性。pcDNA3－IL－2基因也有一定的戒毒作用，通過對該基因?qū)霔l件的進一步優(yōu)化，其戒毒效果可望更好，更適合實際實用。
文檔編號A61K48/00GK1508265SQ02155058
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者劉新恒, 顧錦法, 王晉慧, 姚明忠 申請人:中國科學院上海生命科學研究院