專利名稱：金黃色葡萄球菌腸毒素在制備治療或預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療艾滋病的藥物，具體地說是金黃色葡萄球菌腸毒素在制備治療或預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病是由人類免疫缺陷性病毒(HIV)感染引起的，導(dǎo)致被感染者免疫功能的部分或全部喪失，繼而發(fā)生機(jī)會(huì)性感染、腫瘤等疾病。HIV侵入人體后主要攻擊的是一種帶有CD4的淋巴細(xì)胞(T4淋巴細(xì)胞)，這種細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本組成部分，HIV通過大量、不斷地復(fù)制與釋放，導(dǎo)致T4淋巴細(xì)胞大量死亡，使人體內(nèi)的T4淋巴細(xì)胞明顯減少，感染者免疫功能受到嚴(yán)重破壞，造成免疫缺陷；臨床表現(xiàn)為各種機(jī)會(huì)性感染與腫瘤。HIV一旦進(jìn)入人體，這個(gè)人就成為HIV的感染者，先是處于潛伏期，以后可逐漸發(fā)展成為艾滋病病人；處于潛伏期限的感染者免疫功能沒有受到嚴(yán)重破壞，因而沒有明顯的臨床癥狀。從HIV感染者到艾滋病病人這段時(shí)間的長短與感染者的年齡、生活條件、生理狀況、感染病毒的類型等多種因素有關(guān)，短則幾個(gè)月，長者20年以上；當(dāng)感染者的免疫系統(tǒng)遭到一定程度的破壞(檢查發(fā)現(xiàn)T4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降，CD4/CD8淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比值≤1)，可出現(xiàn)一系列的臨床癥狀(如發(fā)生各種細(xì)菌、真菌、病毒的感染及腫瘤的發(fā)生)，就發(fā)展成為艾滋病人；人一旦受到HIV病毒的感染將終身攜帶該病毒，因此HIV攜帶者和艾滋病病人都能傳播病毒。
目前尚無可根治HIV感染的藥物，也沒有證據(jù)表明人體會(huì)對(duì)HIV產(chǎn)生保護(hù)性免疫，因此大多數(shù)病人會(huì)死于反復(fù)的繼發(fā)感染及腫瘤，但早期治療預(yù)防可延緩病程的發(fā)展，提高生活質(zhì)量；HIV感染者可定期檢測T4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(下常值為500～1600/微升，T4/T8比值為(1.5～1.7)∶1)，當(dāng)T4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≥200/微升時(shí)，可按免疫功能正常情況對(duì)感染者進(jìn)行處理。目前臨床上常用的治療方法有以下三個(gè)方面(1)抗病毒治療如用疊氮胸苷(AZT)、雙脫氧胞苷(DDC)等到，目前國際上認(rèn)為聯(lián)合用藥效果好，但費(fèi)用昂貴，一般發(fā)展中國家的感染者難以承受。(2)各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤的處理由于HIV感染者免疫功能異常，發(fā)生感染時(shí)往往病情較重，難以控制，加上感染導(dǎo)致肝、腎功能不全，使用藥物治療時(shí)還要注意HIV感染者容易出現(xiàn)藥物的毒副作用或過敏反應(yīng)。(3)支持療法以提高機(jī)體的免疫力為主要目的，同時(shí)要重視心理治療和營養(yǎng)療法。
隨著社會(huì)的發(fā)展，艾滋病越來越嚴(yán)重威脅著人們的健康，尤其是我國，艾滋病的發(fā)病呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢；從目前世界范圍來看，用于治療艾滋病的藥物大多為人工合成的化學(xué)物質(zhì)，而且價(jià)格昂貴，給社會(huì)和病人造成了沉重的負(fù)擔(dān)。
腸毒素的分子量為28000D～30000D，具有耐熱、穩(wěn)定的特性；從血清分類學(xué)看，腸毒素是一類金黃色葡萄球菌分泌的腸外蛋白，可被分為A、B、C1、C2、D、E和F幾種類型，這些蛋白都可以引起人們的食物中毒，其中腸毒素F又稱為中毒性休克因子(TSST-1)，人體服用了被腸毒素污染的食品2～6小時(shí)內(nèi)，即可出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等癥狀；從其結(jié)構(gòu)上看，各個(gè)類型的腸毒素蛋白分子量都相近似，在分子中都有一個(gè)二硫鍵的環(huán)，易溶于水和鹽的溶液，相對(duì)于其它蛋白來源，它們較耐熱，可抵抗蛋白酶的作用；由于它們具有較高的類似性，所以具有相同的臨床癥狀，如發(fā)熱、血壓升高，中毒的癥狀；腸毒素的性質(zhì)如表1所示。
表1.金黃色葡萄球菌腸毒素的生理性質(zhì)

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在SEA、SEB、SEC1、SEC2和SEE中賴氨酸天門冬氨酸和酪氨酸的含量較高，SEA和SEE中，甲硫氨酸、亮氨酸和精氨酸的含量基本一致，在這一點(diǎn)上它們不同于SEB、SEC1和SEC2；SEB是由此239個(gè)氨基酸組成的，在第92個(gè)氨基酸和第112個(gè)氨基酸之間形成一個(gè)二硫鍵，其它的腸毒素也有這一結(jié)構(gòu)；腸毒素的氨基酸序列分析和免疫交叉反應(yīng)表明腸毒素可以分為兩類SEA，SEE和SED一類，SEC和SEB為另一類，氨基酸序列表明SEA和SEE的序列基本相同，而SEC和SEB序列基本相同。結(jié)果如表2、表3所示。
表2.腸毒素中的氨基酸序列


參考文獻(xiàn)Iandolo，J.J.，Annu.Rev.Microhiol.，43，375，1989.
表3.腸毒素中氨基酸的組成(100g)蛋白中的含量

參考文獻(xiàn)*Schantz et al，1972+Bergdoll，M.S.，Chu，F(xiàn).S.Huang，I.Y，Rowe，C.，Shih，T.，ArchBiochphys，112，104，1965++Huang，I.Y，Shih，T.Borja，C.R.Avena，R.M.，Bergdou，M.S.，Biochemistry，6，1480，1967t$Borja et al，1972發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供金黃色葡萄球菌腸毒素的新用途，即在治療或預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用。
據(jù)推測腸毒素是通過影響腸中的嘔吐受體來發(fā)揮作用的；這些毒素也能刺激H淋巴細(xì)胞的有絲分裂，及淋巴因子、溶血素和血清蛋白酶的產(chǎn)生，已知通過腸毒素所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子有干擾素、腫瘤壞死因子、白介素-1、白介素-2等。而且這些毒素也可以抑制免疫反應(yīng)，增加自然細(xì)胞的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)發(fā)燒和高血壓的產(chǎn)生；金黃色葡萄球菌腸毒素也是效力最強(qiáng)的T細(xì)胞的有絲分裂源，如SEA在濃度為10-13-10-16M的條件下，即可引起T細(xì)胞的增殖，所有的腸毒素都可引起CD4和CD8值的增加，而這些有絲分裂源的活性是通過組織相容性分子II的抗原得以限制的；此外這一類物質(zhì)的生理活性包括它們的有絲分裂作用，及所誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素，白介素和腫瘤壞因子的活性，而且這些所有的細(xì)胞因子都能誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)熱和休克。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案為所用的抗原(腸毒素)是從金黃色葡萄球菌的發(fā)酵液中分離提取得到的，其為SEA、SEB、SEC1、SEC2和SED；作為藥用金黃色葡萄球菌的發(fā)酵液提取物中腸毒素的含量應(yīng)大于等于95％；其中腸毒素以口服方式給藥，劑量為每日15～90ng。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)金黃色葡萄球菌腸毒素給病人服用后，能明顯提高病人的抗病毒能力，顯著提升CD4/CD8的比值。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1金黃色葡萄球的培養(yǎng)與發(fā)酵液的分離方法一般來說，分離純化腸毒素的步驟比較復(fù)雜，其制備按以下步驟進(jìn)行1)菌種的復(fù)蘇采用產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素的A、B、C1、C2、C3、D及TSST-1的標(biāo)準(zhǔn)菌株，在LB瓊脂科面上培養(yǎng)復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)20小時(shí)，LB培養(yǎng)基配方如下0.5～1％胰蛋白胨，0.1～0.5％酵母浸出物，0.1～0.5％氯化鈉；2)接種無菌操作，將復(fù)蘇菌種接種于300mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩20小時(shí)培養(yǎng)4℃保存作為種子液，保存時(shí)間不超過48小時(shí)；3)擴(kuò)大培養(yǎng)于細(xì)菌發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，配制5升LB培養(yǎng)液，121℃高壓滅菌15分，冷卻至37℃后按5％量將種子液轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，80％溶氧量，PH6.0～7.8連續(xù)發(fā)酵20小時(shí)；4)收集上清液4℃離心30分，棄菌體，收集上清液，用0.45μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
實(shí)施例2金黃色葡萄球菌腸毒素A的純化1)分子截留濃縮；將收集的上清液用10KD的膜超濾濃縮，并用0.008～0.15M磷酸鈉緩沖液(PH6.0)清洗平衡，最終收集此濃縮液15～25ml，每毫升含腸毒素5～10mg；2)離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(PH6.0)平衡羧甲基纖維素柱，將上述濃縮液泵入柱中，用8mM磷酸鈉緩沖液(PH6.0)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.01M和0.05M磷酸鈉緩沖液(PH6.0)梯度洗脫腸毒素，將洗脫下的腸毒素液的PH值調(diào)至5.7，用用羥基磷灰石柱再次分離，用8mM磷酸鈉緩沖液(PH5.7)清洗平衡磷灰石(1g/3.5)裝柱，用30mM磷酸鈉緩沖液(PH5.7)清洗24小時(shí)后，將上一步驟洗脫下的腸毒素液泵入柱中，用0.2M磷酸鈉緩沖液(PH7.5)洗脫雜質(zhì)蛋白，用0.2M和0.4M磷酸鈉緩沖液(PH5.7)梯度洗脫收集腸毒素蛋白，洗脫后用10KD的膜超濾濃縮腸毒素；3)分子篩純化用含1M無機(jī)鹽(例如磷酸鹽)的0.5M緩沖液(例如磷酸緩沖液)(PH6.8)平衡SepheroxyLS-200柱20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮腸毒素洗脫液泵入柱中，用0.05M鈉緩沖液(PH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，可獲得腸毒素A的純度大于99％，-20℃下凍存。
實(shí)施例3金黃色葡萄球菌腸毒素B的純化1)分子截留濃縮；將收集的上清液用分子量10KD的膜超濾濃縮，并用0.008～0.15M磷酸鈉緩沖液(PH6.0-6.2)清洗平衡，最終收集50～100ml濃縮液，每毫升含腸毒素5～10mg；2)離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(PH6.2)平衡羧甲基纖維素柱，將上述濃縮液泵入柱中，用10mM磷酸鈉緩沖液(PH6.2)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.02M和0.07M磷酸鈉緩沖液(PH6.0～6.8)梯度洗脫腸毒素，洗脫液用10KD的膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽(例如磷酸鹽)的0.5M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)平衡；3)分子篩純化用含0.5M磷酸鈉(PH6.8)的緩沖液平衡SepheroxyLS-200柱20(15～25)小時(shí)，將5％柱體積的濃縮液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，可得純度大于或等于95％腸毒素B，-20℃下凍存。
實(shí)施例4金黃色葡萄球菌腸毒素C1的純化1)分子截留濃縮；將收集的上清液用分子量10KD的膜進(jìn)行超濾濃縮，并用0.05～0.3M磷酸鈉緩沖液(PH5.5)清洗平衡，最終收集50～100ml濃縮液，每毫升含腸毒素5～10mg；2)離子交換分離用0.1M磷酸鈉緩沖液(PH5.5)平衡羧甲基纖維素柱，將上述濃縮液泵入柱中，用0.1M磷酸鈉緩沖液(PH5.5)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.02M磷酸鈉緩沖液(PH6.0)分級(jí)梯度洗脫，腸毒素用0.06M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)洗脫，洗脫液用10KD的膜超濾濃縮，并用0.5M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)平衡；3)分子篩純化用0.5M磷酸鈉的緩沖液(PH6.8)平衡SepheroxyLS-200柱20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，可得純度大于或等于98％腸毒素SEC1、SEC3，-20℃下凍存。
實(shí)施例5金黃色葡萄球菌腸毒素C2的純化
1)分子截留濃縮；將收集的上清液用分子量10KD的膜進(jìn)行超濾濃縮，并用0.01～0.05M磷酸鈉緩沖液(PH5.4)清洗平衡，最終收集50～100ml濃縮液，每毫升含腸毒素5～10mg；2)離子交換分離用20mM磷酸鈉緩沖液(PH5.4)平衡羧甲基纖維素柱，將上述濃縮液泵入柱中，用20mM磷酸鈉緩沖液(PH5.4)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.06M磷酸鈉緩沖液(PH6.7)洗脫腸毒素，洗脫液用膜超濾濃縮，并用5mM磷酸鈉緩沖液(PH5.8)清洗平衡羧甲基纖維素柱，將上一步驟洗脫下的腸毒素液泵入柱中，用5mM磷酸鈉緩沖液(PH5.8)洗脫雜質(zhì)蛋白，用0.005M和0.05M磷酸鈉緩沖液(PH5.8)梯度洗脫腸毒素蛋白，洗脫液用10KD的膜超濾濃縮，并用0.5mM磷酸鈉緩沖液(PH6.8)平衡；3)分子篩純化用0.5M磷酸鈉的緩沖液(PH6.8)平衡SepheroxyLS-200柱，將5％柱體積的濃縮液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，可得純度大于或等于95％腸毒素SEC2，-20℃下凍存。
實(shí)施例6金黃色葡萄球菌腸毒素D的純化1)分子截留濃縮；將收集的上清液用分子量10KD的膜超濾濃縮，并用0.04～0.15M磷酸鈉緩沖液(PH6.0-6.2)清洗平衡，最終收集50～100ml濃縮液，每毫升含腸毒素5～10mg；2)離子交換分離用10mM磷酸鈉緩沖液(PH6.2)平衡羧甲基纖維素柱，將上述濃縮液泵入柱中，用10mM磷酸鈉緩沖液(PH6.2)將不能吸附的雜蛋白去除，再使用0.03M和0.08M磷酸鈉緩沖液(PH6.0～6.8)梯度洗脫腸毒素，洗脫液用10KD的膜超濾，濃縮腸毒素，并用含1M無機(jī)鹽的0.5M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)平衡；3)分子篩純化用含0.5M磷酸鈉(PH6.8)的緩沖液平衡SepheroxyLS-200柱20小時(shí)，將5％柱體積的濃縮液泵入柱中，用0.05M磷酸鈉緩沖液(PH6.8)洗脫收集腸毒素蛋白峰，可得純度大于或等于95％腸毒素D，-20℃下凍存。
實(shí)驗(yàn)例通過上述方法所得到的腸毒素，制成5～10ng的制品，給艾滋病人服用(口服)，一日三次，一個(gè)月后，T細(xì)胞亞群的檢查比較如下1.服用SEA后，治療前及治療后T細(xì)胞亞群檢查的比較(X±S)

2.服用SEB后，治療前及治療后T細(xì)胞亞群檢查的比較(X±S)

3.服用SEC1后，治療前及治療后T細(xì)胞亞群檢查的比較(X±S)

4.服用SEC2后，治療前及治療后T細(xì)胞亞群檢查的比較(X±S)

5.服用SED后，治療前及治療后T細(xì)胞亞群檢查的比較(X±S)

從表1～5可知，金黃色葡萄球菌腸毒素在給病人服用后，能明顯提高病人的抗病毒能力，顯著提升CD4/CD8的比值。
權(quán)利要求
1.金黃色葡萄球菌腸毒素在制備治療或預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用。
2.一種權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素在治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，其特征在于其中所述腸毒素是從金黃色葡萄球菌的發(fā)酵液中分離提取得到的，其為SEA、SEB、SEC1、SEC2和SED。
3.一種權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素在治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，其特征在于其中所述腸毒素其中腸毒素的含量應(yīng)大于等于95％。
4.一種權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌腸毒素在治療艾滋病藥物中的應(yīng)用，其特征在于其中腸毒素以口服方式給藥，劑量為每日15～90ng。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療艾滋病的藥物，具體地說是金黃色葡萄球菌腸毒素在制備治療或預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用，其為SEA、SEB、SEC
文檔編號(hào)A61P31/18GK1509762SQ0215692
公開日2004年7月7日 申請日期2002年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者陳巨余 申請人:沈陽協(xié)合集團(tuán)有限公司