專利名稱：雙側(cè)植入兩種細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種人下皮膚，特別是雙側(cè)植入成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞復(fù)合人工皮膚，屬醫(yī)用皮膚創(chuàng)面覆蓋物。
本發(fā)明還涉及該復(fù)合人工皮膚的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
人工皮膚在臨床上用于皮膚損傷的移植治療，可促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減少疤痕形成，防止感染，尤其是大面積皮膚缺失患者由于缺乏可移植的自體皮膚，只有通過(guò)使用創(chuàng)面覆蓋物來(lái)解決皮膚缺失的早期和晚期問(wèn)題。
目前，國(guó)外在臨床應(yīng)用的皮膚創(chuàng)面覆蓋物有表皮移植物、真皮移植物(如異體真皮、去表皮的死真皮、合成網(wǎng)膜、無(wú)細(xì)胞膠原海綿等)，以及復(fù)合皮膚移植物，如膠原凝膠皮膚替代物等。
復(fù)合人工皮膚是一種由表皮層和真皮層組成的雙層人工皮膚，而表皮層是由表皮細(xì)胞分化形成的，真皮層是由成纖維細(xì)胞接種于膠原基質(zhì)中形成的。近年來(lái)，人工皮膚在制備方面不斷發(fā)展進(jìn)步，如美國(guó)發(fā)明專利US 5 282 859公布了一項(xiàng)利用牛I、III型膠原構(gòu)建的人工復(fù)合皮，其不足之處是經(jīng)過(guò)戊二醛處理，殘存細(xì)胞毒性，且強(qiáng)度不夠，免疫原性較強(qiáng)，單純采用I、III型膠原作為支架，缺乏細(xì)胞因子的引入；在日本特許公開(kāi)的JP 97 173 362專利文獻(xiàn)中，它是利用甲殼素等為基質(zhì)，培養(yǎng)哺乳動(dòng)物皮膚來(lái)源的細(xì)胞，然后凍干制作出人工皮膚，其缺點(diǎn)是利用氨中和制作膠原凝膠，不適合細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間短，形成的培養(yǎng)皮膚在組織結(jié)構(gòu)上與天然皮膚有較大差別，膠原凝膠抵抗膠原降解能力差，皮膚脆性大，操作困難，膠原凝膠生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，正是為了克服上述已有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，而提供一種含有表皮生長(zhǎng)因子的以活性牛膠原皮膚組織工程支架兩側(cè)植入成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚，從而提高了人工皮膚的性能，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
本發(fā)明還提供了該復(fù)合人工皮膚的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的雙側(cè)植入兩種細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚，其特征在于它是以含人表皮生長(zhǎng)因子的牛膠原膜為皮膚組織工程支架，在支架的一側(cè)植入成纖維細(xì)胞密度為＞106個(gè)/cm2，另側(cè)植入表皮細(xì)胞密度為＞106個(gè)/cm2，內(nèi)部為生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞密度為＞106個(gè)/cm2。
所述復(fù)合人工皮膚的構(gòu)建方法按下述步驟進(jìn)行1).含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建a)、將胎牛皮或牛跟腱按常規(guī)方法進(jìn)行脫毛、清洗、冷凍、切薄片，用丙酮脫水，再用石油醚脫脂，真空抽去胎牛皮或牛跟腱切片上的石油醚，加入胃酶或無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，加入量按干胎牛皮或干牛跟腱重量的1～5％，在20～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)8～12小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀用蒸餾水洗滌后，再加入上述干料重量50～150倍的0.5M醋酸溶液，溫度0～20℃，振動(dòng)24～32小時(shí)，再加入氯化鈉至上述溶液中，氯化鈉濃度達(dá)到2M，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀裝入透析袋進(jìn)行透析3～4次，收集透析后膠原溶液，加入干胎牛皮或干牛跟腱重量1～3％無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，在30～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)4～8小時(shí)，去除抗原決定簇；用0.05～0.5M的醋酸溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的無(wú)抗原性膠原溶液；b)、再將(a)項(xiàng)的膠原溶液倒入模型中，并在-10～-70℃溫度下冷凍4～24小時(shí)，再冷凍干燥24～48小時(shí)，得到孔徑均勻的膠原海綿膜，將膠原海綿膜置于0.5～10％濃度的丙三醇溶液中，吸附膨脹后取出，在105～130℃溫度下真空干燥18～32小時(shí)；
c)、將肝素溶于0.005～1M醋酸溶液中，肝素與醋酸溶液用量比為W/V0.1～100mg/ml，用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，得到肝素醋醋溶液；d)、將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，表皮生長(zhǎng)因子與三蒸水的用量比為W/V0.1～100mg/ml，得到表皮生長(zhǎng)因子水溶液；e)、最后將(c)項(xiàng)的肝素醋酸溶液和(d)項(xiàng)的表皮生長(zhǎng)因子水溶液按體積比1∶1～50∶1混合，振動(dòng)混合48小時(shí)后取混合液與5％的丙三醇溶液以體積比0.1～5％混合，用混合液浸潤(rùn)(b)項(xiàng)的膠原海綿膜，潤(rùn)濕后，在-10～-70℃冷凍4～10小時(shí)，再真空干燥，得含有表皮生長(zhǎng)因子的膠原海綿膜。
2).雙側(cè)植入兩種細(xì)胞復(fù)合人工皮膚的構(gòu)建將1)項(xiàng)含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架，經(jīng)Co60γ射線消毒后，用含有1×105μg/l青霉素與100mg/l鏈霉素的D-Hanks液沖洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡24小時(shí)，換培養(yǎng)液，將傳代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架一側(cè)，在37℃、5％Co2條件下液面培養(yǎng)二周后，用含有表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子10mg/ml、牛腦垂體提取物200mg/l、氫化可的松0.5mg/l、胰島素5mg/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg/l的MCDB153培養(yǎng)液培養(yǎng)1天，反轉(zhuǎn)支架180度，將表皮細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架另一側(cè)，每天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)10天，用不銹鋼篩網(wǎng)作支持，并以氣液界面培養(yǎng)14天，即構(gòu)建成雙側(cè)植入成纖維和表皮細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚。
本發(fā)明的復(fù)合人工皮膚及其構(gòu)建是采用胎牛皮或牛跟腱為基料經(jīng)過(guò)預(yù)處理、脫水、脫脂后，用酶進(jìn)行一次處理，以降解組織纖維之間的共價(jià)鍵，然后再經(jīng)過(guò)透析，進(jìn)行二次酶處理，可除去抗原決定簇，用醋酸溶解制成含無(wú)抗原性膠原膜為支架，經(jīng)過(guò)制模、冷凍、干燥，再用肝素和表皮生長(zhǎng)因子的混合液浸潤(rùn)膠原膜，構(gòu)成含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架，在支架兩側(cè)植入成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞，而內(nèi)部為生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞。該人工皮膚具有良好的物理特征，抗感染能力強(qiáng)，移植手術(shù)簡(jiǎn)單，并與周圍皮膚能很好融合一體，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明它是與正常皮膚組織結(jié)構(gòu)相近，又促進(jìn)創(chuàng)面愈合的人工皮膚。
由于采取上述技術(shù)方案，使本發(fā)明技術(shù)與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果a)、本發(fā)明的人工皮膚具有良好的物理特性，彈性好、柔韌性好、能抵抗一定的拉力，而且能像天然皮膚一樣可剪切、縫合、大小和形狀可隨創(chuàng)面而變、移植手術(shù)簡(jiǎn)單；b)、基質(zhì)膠原膜支架的收縮率低、抗感染能力高、能夠防止微生物的侵襲，并可抵御傷口微生物的感染，移植后換藥次數(shù)少，術(shù)后護(hù)理簡(jiǎn)單；c)、本發(fā)明的人工皮膚，經(jīng)組織學(xué)檢查，真皮基質(zhì)為多孔狀，孔徑略大于成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞在膠原膜基質(zhì)中生長(zhǎng)均勻，而且在中間有生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞，其密度均＞106個(gè)/cm2；d)、本發(fā)明的人工皮膚用裸鼠作了動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，移植后的人工皮膚與周圍皮膚融合一體，真皮替代物中有大量的血管形成，膠原排列漸趨規(guī)則，表皮分化良好。


圖1為本發(fā)明的復(fù)合人工皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)成纖維細(xì)胞接種側(cè)(H.E染色×400倍)。
圖2為本發(fā)明的復(fù)合人工皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞接種側(cè)(H.E染色×1000倍)。
具體實(shí)施方案實(shí)施例1將胎牛皮按常規(guī)方法進(jìn)行脫毛、去筋膜、脂肪和血污，清洗、冷凍、切成厚0.5mm薄片，用丙酮脫水三次，用石油醚脫脂三次，再抽真空除去石油醚，制成脫水脫脂的胎牛皮為原料，取10g原料，用雙蒸水洗滌后加入反應(yīng)器內(nèi)，加入由0.1g胃酶和100g水配制的水溶液，進(jìn)行一次酶處理，在20℃、pH＝2條件下，機(jī)械振動(dòng)24小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液、取沉淀，用雙蒸水洗滌三次，加入500g的0.5M醋酸水溶液，在0℃溫度下，機(jī)械振動(dòng)32小時(shí)后，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達(dá)2M，沉淀完全后，離心分離、棄上清、取沉淀裝入透析袋進(jìn)行透析三次，收集透析后膠原溶液，加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入0.3g菠蘿酶與100g水配制的水溶液，進(jìn)行二次酶處理，在30℃、pH＝6條件下，機(jī)械振動(dòng)8小時(shí)，除去抗原決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離、棄上清，用0.05M的醋酸水溶液100g溶解，用失重法測(cè)得含有0.4mg/ml無(wú)抗原性膠原溶液，并倒入直徑100mm的預(yù)冷模具中，在-10℃溫度下，冷凍24小時(shí)，再真空干燥24小時(shí)，得到孔徑均勻的厚度為0.1mm膠原海綿膜0.15g，然后置入0.5％濃度的7.5ml丙三醇水溶液中吸附膨脹后取出，在150℃溫度下，真空干燥32小時(shí)，得干膠原海綿膜，取肝素于0.005M醋酸水溶液中，使肝素含量為0.1mg/ml。再將肯皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，使表皮生長(zhǎng)因子含量為0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液100ml與表皮生長(zhǎng)因子水溶液100ml混合，機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，取上述混合液0.1ml與5％濃度丙三醇水溶液100ml，再次混合，并浸潤(rùn)干膠原海綿網(wǎng)，潤(rùn)濕后在-70℃溫度下冷凍4小時(shí)，再真空干燥，得到構(gòu)建的含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架。取1cm2支架，用Co60γ射線消毒后，用含有1×105μg/l青霉素與100mg鏈霉素的D-Hanks液沖洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡24小時(shí)，換培養(yǎng)液，將傳代的成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架一側(cè)，在37℃、5％CO2條件下液面培養(yǎng)二周后，用含有表皮生長(zhǎng)因子10μg/ml、牛腦垂體提取物200mg/l、氫化可的松0.5mg/l、胰島素5mg/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg/l的MCDB153培養(yǎng)液培養(yǎng)一天，反轉(zhuǎn)支架180度，將表皮細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架另一側(cè)，每天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)10天，用不銹鋼篩網(wǎng)作支持，并以氣液面培養(yǎng)14天，即構(gòu)建1cm2雙側(cè)植入成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚。由圖1所示，1-支架，2-成纖維細(xì)胞接種側(cè)的成纖維細(xì)胞，3-表皮細(xì)胞接種側(cè)的表皮細(xì)胞，4-內(nèi)部生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞。
實(shí)施例2將牛跟腱按實(shí)施例1的方法進(jìn)行脫水脫脂、抽真空除去石油醚，制成脫水脫脂的牛跟腱為原料，取原料10g，用雙蒸水洗滌后加入反應(yīng)容器內(nèi)，加入由0.3g胰凝乳蛋白酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行一次酶處理，在30℃、pH＝6條件下，機(jī)械振動(dòng)16小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離、棄上清、取沉淀，用雙蒸水洗滌四次，加入1000g 0.5M醋酸水溶液，在10℃溫度下，機(jī)械振動(dòng)28小時(shí)，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達(dá)2M，沉淀完全后，經(jīng)離心分離、棄上清、取沉淀，裝入透析袋進(jìn)行透析四次，收集透析后，膠原溶液加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入0.2g木瓜酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行二次酶處理，在35℃、pH＝7條件下，機(jī)械振動(dòng)6小時(shí)，除去抗原性決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清，用0.1M的醋酸水溶液100g溶解，用失重法測(cè)得含有2mg/ml無(wú)抗原性膠原溶液，并倒入直徑100mm預(yù)冷模具中，在-40℃溫度下，冷凍10小時(shí)，再真空干燥36小時(shí)，得到孔徑均勻厚度為0.25mm膠原海綿膜0.3g，并置入5％濃度的30ml丙三醇水溶液，吸附膨脹后取出。在120℃溫度下，真空干燥20小時(shí)，得到干膠原海綿膜，取肝素溶于0.1M的醋酸溶液中，使肝素含量為5mg/ml，再將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，使表皮生長(zhǎng)因子含量為0.01g/ml。取上述肝素醋酸水溶液10ml和表皮生長(zhǎng)因子水溶液200ml混合，機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，取上述混合液1ml，與5％濃度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸潤(rùn)干膠原海綿膜，浸潤(rùn)后在-40℃溫度下，冷凍6小時(shí)，再真空干燥，得到構(gòu)建的含有表皮因子的皮膚組織工程支架。取1cm2支架，用Co60γ射線消毒后，用含有1×105μg/l青霉素與100mg/l鏈霉素的D-Hanks液沖洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡24小時(shí)，換培養(yǎng)液，將傳代的成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架一側(cè)，在37℃、5％CO2條件下液面培養(yǎng)二周后，用含有表皮生長(zhǎng)因子10g/ml、牛腦垂體提取物200mg/l、氫化可的松0.5mg/l、胰島素5mg/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg/l的MCDB153培養(yǎng)液培養(yǎng)10天，反轉(zhuǎn)支架180度，將表皮細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架另一側(cè)，每天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)一天，用不銹鋼篩網(wǎng)作支持，并以氣液面培養(yǎng)14天，即構(gòu)建1cm2雙側(cè)植入成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚。
實(shí)施例3用實(shí)施例2的脫水脫脂的牛跟腱為原料，取原料10g，用雙蒸水洗滌后加入反應(yīng)容器內(nèi)，加入由0.5g菠蘿酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行一次酶處理。在40℃、pH＝8條件下，機(jī)械振動(dòng)8小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清，取沉淀，用雙蒸水洗滌四次，加入1500g的0.5M醋酸水溶液中，在20℃溫度下，機(jī)械振動(dòng)24小時(shí)后，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達(dá)2M，沉淀完全后，離心分離、棄上清、取沉淀，裝入透析袋進(jìn)行透析三次，收集透析后，膠原溶液加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入0.1g胰凝乳蛋白酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行二次酶處理，在40℃、pH＝8條件下，機(jī)械振動(dòng)4小時(shí)，除去抗原性決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清，取沉淀，用0.5M的醋酸水溶液100g溶解，用失重法測(cè)得含有4mg/ml無(wú)抗原性膠原溶液，并倒入直徑50mm預(yù)冷模具中，在-70℃溫度下，冷凍4小時(shí)，再真空干燥48小時(shí)，得到孔徑均勻厚度為0.5mm膠原海綿膜0.3g，置入10％濃度的45ml丙三醇水溶液，吸附膨脹后取出，在130℃溫度下，真空干燥18小時(shí)，得到干膠原海綿膜，取肝素溶于1M的醋酸水溶液中，使肝素含量為10mg/ml，再將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，使表皮生長(zhǎng)因子含量為0.1μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液50ml與表皮生長(zhǎng)因子水溶液150ml混合，機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，取混合液5ml與5％濃度丙三醇水溶液100ml，再次混合，并浸潤(rùn)干膠原海綿膜，潤(rùn)濕后在-10℃溫度下冷凍10小時(shí)，再真空干燥，得到構(gòu)建的含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架。取1cm2支架，用Co60γ射線消毒后，用含有1×105μg/l青霉素與100mg/lm鏈霉素的D-Hanks液沖洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡24小時(shí)，換培養(yǎng)液，將傳代的成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架一側(cè)，在37℃、5％CO2條件下液面培養(yǎng)二周后，用含有表皮生長(zhǎng)因子10μg/ml、牛腦垂體提取物200mg/l、氫化可的松0.5mg/l、胰島素5mg/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg/l的MCDB153培養(yǎng)液培養(yǎng)一天，反轉(zhuǎn)支架180度，將表皮細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架另一側(cè)，每天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)10天，用不銹鋼篩網(wǎng)作支持，并以氣液面培養(yǎng)14天，即構(gòu)建1cm2雙側(cè)植入成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚。
權(quán)利要求
1.雙側(cè)植入兩種細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚，其特征在于它是以含人表皮生長(zhǎng)因子的牛膠原膜為皮膚組織工程支架，在支架的一側(cè)植入成纖維細(xì)胞密度為＞106個(gè)/cm2，另側(cè)植入表皮細(xì)胞密度為＞106個(gè)/cm2，內(nèi)部為生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞密度為＞106個(gè)/cm2。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合人工皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于它按下述步驟進(jìn)行1).含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建a)、將胎牛皮或牛跟腱按常規(guī)方法進(jìn)行脫毛、清洗、冷凍、切薄片，用丙酮脫水，再用石油醚脫脂，真空抽去胎牛皮或牛跟腱切片上的石油醚，加入胃酶或無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，加入量按干胎牛皮或干牛跟腱重量的1～5％，在20～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)8～12小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀用蒸餾水洗滌后，再加入上述干料重量50～150倍的0.5M醋酸溶液，溫度0～20℃，振動(dòng)24～32小時(shí)，再加入氯化鈉至上述溶液中，氯化鈉濃度達(dá)到2M，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀裝入透析袋進(jìn)行透析3～4次，收集透析后膠原溶液，加入干胎牛皮或干牛跟腱重量1～3％無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，在30～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)4～8小時(shí)，去除抗原決定簇；用0.05～0.5M的醋酸溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的無(wú)抗原性膠原溶液；b)、再將(a)項(xiàng)的膠原溶液倒入模型中，并在-10～-70℃溫度下冷凍4～24小時(shí)，再冷凍干燥24～48小時(shí)，得到孔徑均勻的膠原海綿膜，將膠原海綿膜置于0.5～10％濃度的丙三醇溶液中，吸附膨脹后取出，在105～130℃溫度下真空干燥18～32小時(shí)；c)、將肝素溶于0.005～1M醋酸溶液中，肝素與醋酸溶液用量比為W/V0.1～100mg/ml，用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，得到肝素醋醋溶液；d)、將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，表皮生長(zhǎng)因子與三蒸水的用量比為W/V0.1～100mg/ml，得到表皮生長(zhǎng)因子水溶液；e)、最后將(c)項(xiàng)的肝素醋酸溶液和(d)項(xiàng)的表皮生長(zhǎng)因子水溶液按體積比1∶1～50∶1混合，振動(dòng)混合48小時(shí)后取混合液與5％的丙三醇溶液以體積比0.1～5％混合，用混合液浸潤(rùn)(b)項(xiàng)的膠原海綿膜，潤(rùn)濕后，在-10～-70℃冷凍4～10小時(shí)，再真空干燥，得含有表皮生長(zhǎng)因子的膠原海綿膜。2).雙側(cè)植入兩種細(xì)胞復(fù)合人工皮膚的構(gòu)建將1)項(xiàng)含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架，經(jīng)Co60γ射線消毒后，用含有1×105μg/l青霉素與100mg/l鏈霉素的D-Hanks液沖洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡24小時(shí)，換培養(yǎng)液，將傳代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架一側(cè)，在37℃、5％Co2條件下液面培養(yǎng)二周后，用含有表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子10μg/ml、牛腦垂體提取物200mg/l、氫化可的松0.5mg/l、胰島素5mg/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白10mg/l的MCDB153培養(yǎng)液培養(yǎng)1天，反轉(zhuǎn)支架180度，將表皮細(xì)胞以3×105個(gè)/cm2密度接種于支架另一側(cè)，每天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)10天，用不銹鋼篩網(wǎng)作支u持，并以氣液界面培養(yǎng)14天，即構(gòu)建成雙側(cè)植入成纖維和表皮細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙側(cè)植入兩種細(xì)胞的復(fù)合人工皮膚及其構(gòu)建方法，它以含有表皮生長(zhǎng)因子的牛膠原膜為支架，雙側(cè)植入成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞，中部為生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞，其密度均＞10
文檔編號(hào)A61L27/00GK1511594SQ0215953
公開(kāi)日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者劉杰, 王德文, 崔雪梅, 張燕, 楊穎颙, 于淑賢, 劉 杰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所, 中國(guó)皮革和制鞋工業(yè)研究院, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)