專利名稱：抑制靶基因表達(dá)的方法和治療腫瘤疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞中至少一種靶基因表達(dá)的方法，以及治療腫瘤疾病的藥物。
WO 99/32619中公開了一種通過雙鏈寡核糖核苷酸抑制靶基因表達(dá)的方法。這一已知方法目的在于抑制無脊椎動物細(xì)胞中的基因表達(dá)。為此，所述的雙鏈寡核糖核苷酸必須具有一種由至少25個堿基組成的、與靶基因同一的序列。
WO 00/44895中公開了一種抑制細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法和一種藥物。在該方法中，將具有雙鏈結(jié)構(gòu)的寡核糖核苷酸(dsRNA)引入所述細(xì)胞。一條dsRNA鏈顯示由最多49個連續(xù)的核苷酸對組成的區(qū)域，該區(qū)域至少部分互補于靶基因。所述的藥物包含至少一個抑制給定靶基因的表達(dá)的dsRNA，其中，該dsRNA鏈至少部分互補于所述的靶基因。
由Gautschi O.et al.(2001)，J Natl Cancer Inst 93，463到471頁，可知抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的增量表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。裸鼠的體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，抗Bcl-2和Bcl-xL基因表達(dá)的單鏈反義寡核糖核苷酸的聯(lián)合療法可使腫瘤的生長量降低約50％到60％。應(yīng)用這一療法，每日每kg體重需20mg寡核糖核苷酸。由于需要大量的寡核糖核苷酸，所以這種治療相對昂貴。除此之外，所用的單鏈寡核糖核苷酸在血清中很快即被分解。需要大量的寡核糖核苷酸是因為，最終引入到靶細(xì)胞中的反義寡核糖核苷酸的量至少要與靶細(xì)胞中存在的靶基因mRNA的數(shù)量相當(dāng)。這一方法只能使腫瘤的生長減少，但不能使腫瘤縮小。
本發(fā)明的目的在于消除現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。具體說來，公開了一種方法和一種藥物，由此經(jīng)濟有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
這一目的是通過權(quán)利要求1和13的技術(shù)方案達(dá)到的。權(quán)利要求2到12和14到26提供了優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明提供試圖抑制至少一種在腫瘤細(xì)胞中抑制或阻止細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)的方法，其中，向該腫瘤細(xì)胞中引入至少一條雙鏈核糖核酸(dsRNA)，所述的核糖核酸的S1鏈包括由少于25個連續(xù)的核苷酸組成、至少部分互補于靶基因的區(qū)域。術(shù)語″靶基因″理解為指雙鏈DNA中與用作轉(zhuǎn)錄模板的DNA鏈相互補的那條DNA鏈，包括全部的轉(zhuǎn)錄區(qū)域。因此靶基因通常指有義鏈。因此，S1鏈可互補于靶基因表達(dá)過程中形成的RNA轉(zhuǎn)錄物，或其加工產(chǎn)物，如mRNA。當(dāng)由一條或兩條核糖核酸鏈組成的核糖核酸呈現(xiàn)雙鏈結(jié)構(gòu)時即出現(xiàn)dsRNA。不是所有的dsRNA核苷酸都必須遵循Watson-Crick堿基配對原則。特別的單一非互補堿基對幾乎不影響本發(fā)明的方法。最大的可能堿基對數(shù)目等于dsRNA中最短的鏈所包含的核苷酸數(shù)。所用的術(shù)語″引入″指攝取到細(xì)胞中。攝取可由細(xì)胞本身進(jìn)行。但也可以通過輔助試劑或裝置進(jìn)行。
令人驚訝的是，已表明通過這一方法僅用相當(dāng)少量的寡核糖核酸即可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，相比之下，要通過傳統(tǒng)的反義技術(shù)達(dá)到類似的抑制效果所需的寡核苷酸要多得多。此外，利用本發(fā)明的方法可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞群中細(xì)胞凋亡達(dá)到下述的程度，即不僅腫瘤細(xì)胞群的生長減少，腫瘤細(xì)胞的總數(shù)也減少。與應(yīng)用對照dsRNA的方法相比，利用正常的，即非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞實施本發(fā)明的方法并不引起細(xì)胞凋亡率的顯著提高。對照dsRNA是其中沒有一條鏈與存在于所述細(xì)胞中的基因的某一條鏈互補的dsRNA。
已表明當(dāng)所述dsRNA的至少一個末端具有由1到4個，特別是2或3個核苷酸組成的單鏈突出端時非常有益。與至少一個末端沒有單鏈突出端的dsRNA相比，這種dsRNA在抑制靶基因表達(dá)方面表現(xiàn)出優(yōu)越的效果。此處，一個末端指dsRNA區(qū)域，其中存在5′和3′鏈末端。因此，僅由S1鏈組成的dsRNA為環(huán)狀結(jié)構(gòu)并僅有一個末端。由S1鏈和S2鏈組成的dsRNA有兩個末端。此處，所有的情況下一個末端都是由S1鏈的一個鏈末端和S2鏈的一個鏈末端形成。
所述的單鏈突出端優(yōu)選位于S1鏈的3′末端。這種單鏈突出端定位將導(dǎo)致該方法的效率進(jìn)一步提高。在一個實施例中，dsRNA只有一個末端具有單鏈突出端，特別是定位于S1鏈的3′末端。在有兩個末端的dsRNA中，另一個末端是平端，即沒有突出端。經(jīng)證明這種dsRNA在血清和多種細(xì)胞培養(yǎng)基中都特別穩(wěn)定。
互補的dsRNA區(qū)域可以有19到24個，優(yōu)選21到23個，并且特別22個核苷酸。帶有這種結(jié)構(gòu)的dsRNA對抑制靶基因特別有效。dsRNA的S1鏈可以有少于30個，優(yōu)選少于25個，特別是21到24個核苷酸。這些核苷酸的數(shù)目與dsRNA中的最多可能堿基對數(shù)目一致。
至少可對dsRNA的一個末端進(jìn)行修飾以抵抗腫瘤細(xì)胞中的破壞作用或雙鏈結(jié)構(gòu)的解離。此外，可通過至少一個，優(yōu)選兩個附加的化學(xué)鍵增強由互補核苷酸對實現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的鍵合。所述的化學(xué)鍵可由共價或離子鍵，氫鍵，疏水性相互作用，優(yōu)選或范德華力，堆積相互作用，或者金屬離子配位作用形成。也可以利用嘌呤類似物代替雙鏈結(jié)構(gòu)中的嘌呤而形成。
在該方法的優(yōu)選的實施方案中，靶基因是至少一個屬于Bcl-2家族的基因，特別是Bcl-2，Bcl-w，或Bcl-xL。所述的靶基因也可能是幾個基因。所以，Bcl-2和Bcl-xL都可能是靶基因。抑制Bcl-2家族的基因特別有益，這是因為這些基因的增量表達(dá)與許多腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和生長相關(guān)。由于存在表達(dá)多個抗凋亡基因的腫瘤細(xì)胞，所以能抑制多個靶基因是有益的。
dsRNA優(yōu)選地由具有SEQ ID NO1所示序列的S2鏈和具有SEQ IDNO2所示序列的S1鏈組成，或由具有SEQ ID NO3所示序列的S2鏈和具有SEQ ID NO4所示序列的S1鏈組成，所述序列如后附的序列表所示。這樣的dsRNA對抑制Bcl-2靶基因表達(dá)特別有效。所述的腫瘤細(xì)胞可以是胰腺癌細(xì)胞。為將dsRNA引入腫瘤細(xì)胞，可利用圍繞dsRNA的膠束(micellar)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體，或利用圍繞dsRNA的衣殼。具體說來，所述的衣殼可能是天然的病毒衣殼，或通過化學(xué)或酶學(xué)方法產(chǎn)生的合成衣殼，或由其衍生的結(jié)構(gòu)。
另外，本發(fā)明涉及治療腫瘤疾病的藥物，其包含至少一種抑制至少一個靶基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中，該dsRNA鏈的S1鏈具有由少于25個連續(xù)的核苷酸組成的、至少部分互補于所述靶基因的區(qū)域。此處，所述的靶基因是其表達(dá)抑制或阻止腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的基因。所述藥物的劑量為使至少一個靶基因的表達(dá)受到抑制。令人驚訝的是，已表明這種藥物的使用劑量非常低。每天每kg體重5mgdsRNA即足以抑制或完全禁止腫瘤細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。這種低劑量大大地消除了副作用。
優(yōu)選地，所述dsRNA的至少一個末端具有由1到4個，特別是2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。該單鏈突出端可定位于S1鏈的3′末端。若dsRNA只有一端具有單鏈突出端，特別是定位于S1鏈的3′末端特別有益。已表明這種dsRNA在體內(nèi)特別穩(wěn)定。其在血液中被破壞或排泄掉要比兩端都是單鏈突出端的dsRNA慢得多。因此可施用低劑量。
互補區(qū)可以有19到24個，優(yōu)選21到23個，特別是22個核苷酸。S1鏈可以有少于30個，優(yōu)選少于25個，特別是21到24個核苷酸。在一種實施形式中，可對dsRNA的至少一個末端進(jìn)行修飾以抵抗腫瘤細(xì)胞中的破壞作用或解離作用?？赏ㄟ^至少一個，優(yōu)選兩個附加的化學(xué)鍵增強由互補核苷酸對實現(xiàn)的雙鏈結(jié)構(gòu)的鍵合。
靶基因優(yōu)選是至少一個屬于Bcl-2家族的基因，特別是Bcl-2，Bcl-w，或Bcl-xL。帶有對靶基因Bcl-2和Bcl-xL具有特異性的dsRNA的藥物特別有效。
dsRNA可以由具有SEQ ID NO1所示序列的S2鏈和具有SEQ ID NO2所示序列的S1鏈組成，或由具有SEQ ID NO3所示序列的S2鏈和具有SEQ ID NO4所示序列的S1鏈組成，所述序列如后附的序列表所示。用這種藥物治療的腫瘤疾病可以是胰腺癌。目前還沒有對胰腺癌足夠有效的治療。約3％的5年存活率是所有癌癥中最低的。所述的dsRNA可以溶液或經(jīng)膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體或衣殼圍繞的形式存在于藥物中。膠束結(jié)構(gòu)或衣殼可使dsRNA易于被攝入到腫瘤細(xì)胞中。所述的藥物可制備成制劑以適合于吸入、口服攝取或注射，特別是靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，或者直接注射到瘤組織內(nèi)。適合于吸入或注射的制劑，最簡單的可由本發(fā)明的dsRNA和生理上可耐受的緩沖液，特別磷酸緩沖鹽溶液組成。令人驚訝的是，已表明簡單溶于這種緩沖液的dsRNA即可被腫瘤細(xì)胞攝取并抑制靶基因的表達(dá)，而無需使所述dsRNA包裝到特定的載體中。
下面，結(jié)合附圖描述本發(fā)明的實施例。附圖顯示

圖1用互補于人Bcl-2基因第一序列的dsRNA1轉(zhuǎn)染120小時后，人胰腺癌細(xì)胞YAP的凋亡率(百分比)；圖2用互補于人Bcl-2基因第二序列的dsRNA轉(zhuǎn)染120小時后，YAPC細(xì)胞的凋亡率(百分比)；圖3用互補于新霉素抗性基因序列的dsRNA轉(zhuǎn)染120小時后，YAP C細(xì)胞的凋亡率(百分比)。
將可從德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，Braunschweig(No.ACC 382)得到的人胰腺癌細(xì)胞系YAP C細(xì)胞，在添加在10％胎牛血清(FCS)和1％青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2的恒定條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在相同的條件下，于添加了10％FCS和1％青霉素/鏈霉素的Dulbecco′s MEM中培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞。
用于轉(zhuǎn)染的雙鏈寡核糖核苷酸具有下述序列，即序列表中的SEQ IDNo1到SEQ ID No6與人Bcl-2基因第一序列互補的dsRNAS25′- cag gac cuc gcc gcu gca gac c-3′(SEQ ID NO1)S13′-cg guc cug gag cgg cga cgu cug g-5′(SEQ ID NO2)與人Bcl-2基因第二序列互補的dsRNA2S25′- g ccu uug ugg aac ugu acg gcc-3′(SEQ ID NO3)S13′-uac gga aac acc uug aca ugc cgg-5′(SEQ ID NO4)與新霉素抗性基因的序列互補的dsRNA 3S25′- c aag gau gag gau cgu uuc gca-3′(SEQ ID NO5)S13′-ucu guc cua cuc cua gca aag cg-5′(SEQ ID NO6)在6-孔板中用oligofectamine(Invitrogen Corp.，Karlsruhe)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔250,000個細(xì)胞。雙鏈寡核糖核苷酸的轉(zhuǎn)染按照Invitrogen推薦的oligofectamine相關(guān)方法進(jìn)行(與6-孔板的中的1孔相關(guān)的數(shù)據(jù))用175μl無添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋10μl雙鏈寡核糖核苷酸(0.1-10μM)。用12μl無添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋3μloligofectamine，在室溫下溫育10分鐘。將稀釋過的oligofectamine添加到經(jīng)稀釋的雙鏈寡核糖核苷酸中，混合，再在室溫下溫育20分鐘。這期間，將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用無添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基洗一次，再添加800μl新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基。然后，在每孔中添加200μl上述的oligofectamine-dsRNA-混合物，使進(jìn)行轉(zhuǎn)染的終體積達(dá)1000μl。由此產(chǎn)生的雙鏈寡核糖核苷酸的終濃度為1-100μm。轉(zhuǎn)染試驗是在37℃下溫育4小時。然后，每孔添加500μl含30％FCS的細(xì)胞培養(yǎng)基，使FCS的終濃度為10％。將所述試驗在37℃下溫育120小時。
溫育后，收集上清，用磷酸緩沖鹽溶液洗細(xì)胞，用胰蛋白酶分離，100g離心10分鐘。棄上清，將所得沉淀于4℃在黑暗中與低滲碘化丙啶(propidium iodide)溶液一起處理30分鐘。接下來在FACSCalibur熒光-活化細(xì)胞分類器(BD GmbH，Heidelberg)中通過流式細(xì)胞光度術(shù)分析。
在研究的人胰腺癌細(xì)胞中雙鏈寡核糖核苷酸dsRNA1和dsRNA2降低由Bcl-2介導(dǎo)的對細(xì)胞凋亡的抑制。不需要額外的細(xì)胞凋亡刺激以誘導(dǎo)或引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率升高依賴于溫育時間。圖1顯示dsRNA1所得結(jié)果，圖2顯示dsRNA2所得結(jié)果。未經(jīng)處理的YAP C對照細(xì)胞和在無雙鏈寡核糖核苷酸的情況下用所述方法實施轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(模擬傳染細(xì)胞)在溫育120小時后，僅顯示出3.8％和7.1％的細(xì)胞凋亡，該120小時后的細(xì)胞凋亡率可通過100nM dsRNA的轉(zhuǎn)染提高，用dsRNA1可提高到37.2％、利用dsRNA2可提高到28.9％。用dsRNA3進(jìn)行的對照轉(zhuǎn)染得到的最大細(xì)胞凋亡率為13.5％。與模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比并沒有明顯的提高，由此證實了dsRNA1和dsRNA2作用的序列特異性。
作為對照，也用dsRNA1和dsRNA2轉(zhuǎn)染了作為非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的皮膚成纖維細(xì)胞。120小時后這些細(xì)胞沒有顯示出明顯的細(xì)胞凋亡率提高。
序列表<110>里伯藥品公司<120>抑制靶基因表達(dá)的方法和治療腫瘤疾病的藥物<130>412012GA<140>
<141>
<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>合成序列說明與人Bcl-2基因序列互補的dsRNA的有義鏈<223>
<400>1caggaccucg ccgcugcaga cc22<210>2<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說明與人Bcl-2基因序列互補的dsRNA的反義鏈<400>2ggucugcagc ggcgaggucc uggc 24<210>3<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說明與人Bcl-2基因序列互補的dsRNA的有義鏈<400>3gccuuugugg aacuguacgg cc22<210>4<211>24<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說明與人Bcl-2基因序列互補的dsRNA的反義鏈<400>4ggccguacag uuccacaaag gcau 24
<210>5<211>22<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說明與新霉素抗性基因序列互補的dsRNA的有義鏈<400>5caaggaugag gaucguuucg ca 22<210>6<211>23<212>RNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列說明與新霉素抗性基因序列互補的dsRNA的反義鏈<400>gcgaaacgau ccucauccug ucu 2權(quán)利要求
1.抑制至少一種在腫瘤細(xì)胞中抑制或阻止細(xì)胞凋亡的靶基因表達(dá)的方法，其中，向該腫瘤細(xì)胞中引入至少一條雙鏈核糖核酸(dsRNA)，所述的雙鏈核糖核酸的S1鏈具有由少于25個連續(xù)的核苷酸組成、至少部分互補于靶基因的區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述dsRNA的至少一個末端具有由1到4個，特別是2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。
3.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的單鏈突出端定位于S1鏈的3′-末端。
4.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的dsRNA僅在一端具有單鏈突出端，特別是定位于S1鏈的3′-末端。
5.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的互補dsRNA區(qū)具有19到24，優(yōu)選21到23，特別是22個核苷酸。
6.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的S1鏈具有少于30個，優(yōu)選少于25個，特別是21到24個核苷酸。
7.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的dsRNA的至少一個末端經(jīng)修飾以抵抗腫瘤細(xì)胞中的破壞作用或解離作用。
8.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，通過至少一個，優(yōu)選兩個附加的化學(xué)鍵增強由互補核苷酸對實現(xiàn)的所述的dsRNA的鍵合。
9.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的靶基因是至少一個屬于Bcl-2家族的基因，特別是Bcl-2，Bcl-w，或Bcl-xL，或者靶基因是Bcl-2和Bcl-xL。
10.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的dsRNA由具有如后附的序列表的SEQ ID NO1所示序列的S2鏈和具有SEQID NO2所示序列的S1鏈組成，或由具有SEQ ID NO3所示序列的S2鏈和具有SEQ ID NO4所示序列的S1鏈組成。
11.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的腫瘤細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞。
12.如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的dsRNA利用圍繞dsRNA的膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體，或利用圍繞dsRNA的衣殼引入腫瘤細(xì)胞。
13.一種治療腫瘤疾病的藥物，其包含至少一種抑制至少一個抑制或阻止腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的靶基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中，該dsRNA的S1鏈具有一個由少于25個連續(xù)的核苷酸組成的、至少部分互補于所述靶基因的區(qū)域。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物，其中，所述dsRNA的至少一個末端具有由1到4個，特別是2或3個核苷酸組成的單鏈突出端。
15.如權(quán)利要求13或14所述的藥物，其中，所述的單鏈突出端定位于S1鏈的3′-末端。
16.如權(quán)利要求13到15的任意一項所述的藥物，其中，所述的dsRNA僅在一個末端具有單鏈突出端，特別是定位于S1鏈的3′-末端。
17.如權(quán)利要求13到16的任意一項所述的藥物，其中，所述的互補區(qū)具有19到24，優(yōu)選21到23，特別是22個核苷酸。
18.如權(quán)利要求13到17的任意一項所述的藥物，其中，所述的S1具有少于30個，優(yōu)選少于25個，特別是21到24個核苷酸。
19.如權(quán)利要求13到18的任意一項所述的藥物，其中，所述的dsRNA的至少一個末端經(jīng)修飾以抵抗腫瘤細(xì)胞中的破壞作用或解離作用。
20.如權(quán)利要求13到19的任意一項所述的藥物，其中，通過至少一個，優(yōu)選兩個附加的化學(xué)鍵增強由互補核苷酸對實現(xiàn)的dsRNA的鍵合。
21.如權(quán)利要求13到20的任意一項所述的藥物，其中，所述的靶基因是至少一個屬于Bcl-2家族的基因，特別是Bcl-2，Bcl-w，或Bcl-xL，或者靶基因是Bcl-2和Bcl-xL。
22.如權(quán)利要求13到21的任意一項所述的藥物，其中，所述的dsRNA由具有如后附的序列表的SEQ ID NO1所示序列的S2鏈和具有SEQ ID NO2所示序列的S1鏈組成，或由具有SEQ ID NO3所示序列的S2鏈和具有SEQ ID NO4所示序列的S1鏈組成。
23.如權(quán)利要求13到22的任意一項所述的藥物，其中，所述的腫瘤細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求13到23的任意一項所述的藥物，其中，所述的dsRNA在溶液中或利用膠束結(jié)構(gòu)，優(yōu)選脂質(zhì)體，或衣殼圍繞而存在于藥物中。
25.如權(quán)利要求13到24的任意一項所述的藥物，其中，所述的藥物制備成適合于吸入、口服攝取或注射，特別是靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，或者直接注射到瘤組織內(nèi)的制劑。
26.如權(quán)利要求25所述的藥物，其中，所述的制劑由dsRNA和生理上可耐受的緩沖液，特別是磷酸緩沖鹽溶液組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制至少一種在腫瘤細(xì)胞中抑制或阻止細(xì)胞凋亡的靶基因表達(dá)的方法，其中，向該腫瘤細(xì)胞中引入至少一條雙鏈核糖核酸(dsRNA)，所述雙鏈核糖核酸的S1鏈具有由少于25個連續(xù)的核苷酸組成、至少部分互補于靶基因的區(qū)域。
文檔編號A61K31/7105GK1650010SQ02803555
公開日2005年8月3日 申請日期2002年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月9日
發(fā)明者R·克羅伊策爾, S·林默, H·－P·沃恩羅赫爾, P·哈德維格, A·蓋克, M·奧克, C·赫洛爾德, D·舒潘 申請人:里伯藥品公司