專利名稱：由巨噬細(xì)胞遷移抑制因子調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在CD4+和/或CD8+T淋巴細(xì)胞和抗原接觸之前、接觸過(guò)程中或者接觸后，用對(duì)其降低或者提高巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)水平的方法來(lái)調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或者降低)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤相關(guān)抗原等抗原的反應(yīng)的方法和組合物。本發(fā)明還涉及通過(guò)基于細(xì)胞的免疫治療方法調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)來(lái)預(yù)防和治療疾病特別是腫瘤的組合物和方法。
背景技術(shù)：
實(shí)驗(yàn)室研究和人體臨床實(shí)驗(yàn)兩方面的數(shù)據(jù)均表明腫瘤相關(guān)抗原足以引發(fā)抗腫瘤細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，該反應(yīng)能夠使腫瘤明顯消退(27，28)。在一些實(shí)例中，利用基于細(xì)胞的免疫治療策略(肽免疫)來(lái)提高CTL細(xì)胞毒活性能夠使黑色素瘤得到長(zhǎng)期的消退(29)。不過(guò)，雖然存在遞呈給I類MHC的腫瘤特異性抗原，但是很少能夠體內(nèi)檢測(cè)到強(qiáng)有力的腫瘤殺傷免疫反應(yīng)。產(chǎn)生腫瘤特異的CTL需要適當(dāng)?shù)哪[瘤抗原加工，由MHC I類分子將腫瘤抗原進(jìn)行展示、T淋巴細(xì)胞表達(dá)對(duì)識(shí)別腫瘤抗原有合適特異性的T細(xì)胞受體、并起始向免疫系統(tǒng)進(jìn)行抗原遞呈。僅僅發(fā)動(dòng)CTL反應(yīng)是不夠的，CTL反應(yīng)必須達(dá)到一定強(qiáng)度并能維持下去才能成功抑制腫瘤。
人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到有幾種細(xì)胞因子能夠在不同方面加強(qiáng)CTL反應(yīng)。例如，IL-2的早期表達(dá)對(duì)于具有裂解活性的CTL細(xì)胞的增殖和發(fā)育起著重要作用(30)。另外，已經(jīng)證明INFγ(30)、IL-1和IL-6(31)、IL-2和IL-6(32)、IL-7(33)、IL-10(34)、IL-12(35-37)在CTL細(xì)胞的激活、增殖和/或分化中扮演一定角色。這些介導(dǎo)物通過(guò)增強(qiáng)抗原遞呈、CD4+輔助T細(xì)胞的功能、巨噬細(xì)胞附著或者增加重要的共刺激因子的表達(dá)來(lái)提高CTL的活性。在帶有腫瘤的小鼠中已經(jīng)觀察到了施用重組細(xì)胞因子后的抗腫瘤效果，這些細(xì)胞因子包括IL-1(38)、IL-2(39)、IL-12(40-42)，IFNα(43，44)，IFNγ(45)、和TNFα(46)。
與此相反，僅有少數(shù)細(xì)胞因子表現(xiàn)出對(duì)CTL分化和裂解活性的抑制作用，包括IL-4(47，48)和TGFβ(49)。IL-4抑制CD8+T細(xì)胞分泌IFNγ(50，51)，并且能夠限制具有高細(xì)胞裂解活性CD8+T細(xì)胞的激活和分化(52)。另外，在沒(méi)有IL-4時(shí)進(jìn)行CTL引發(fā)能夠在受激發(fā)后提高反應(yīng)潛力。目前尚未完全闡明這幾種細(xì)胞因子抑制CTL細(xì)胞裂解活性的機(jī)制。
最近，人們才對(duì)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)這種蛋白質(zhì)介體的生物學(xué)功能進(jìn)行了詳細(xì)的研究(在(1)中進(jìn)行了綜述)。雖然在40年前MIF就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是一種活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性活性產(chǎn)物(2，3)，但是直到發(fā)現(xiàn)小鼠垂體前頁(yè)腺體能夠分泌MIF的同源蛋白，人們才再次對(duì)MIF提起興趣(4)。隨后發(fā)現(xiàn)以前被認(rèn)做是MIF作用靶點(diǎn)的巨噬細(xì)胞在微生物毒素或者細(xì)胞因子TNFα和IFNγ的激活下成為產(chǎn)生MIF的重要來(lái)源(5)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明MIF在宿主對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)中具有重要意義。重組MIF(rMIF)和LPS共同給藥后能夠增加LPS的致死率。同時(shí)抗MIF抗體的中和作用能夠保護(hù)小鼠不死于致死性的內(nèi)毒素血癥(4)、外毒素血癥(6)和腹膜炎。MIF功能研究還表明在T細(xì)胞激活反應(yīng)過(guò)程中和B細(xì)胞產(chǎn)生抗體過(guò)程中，這種蛋白質(zhì)是IL-2表達(dá)所必需的。
最近的2篇報(bào)道還發(fā)現(xiàn)了MIF在腫瘤生長(zhǎng)中具有未曾預(yù)料的作用(9，10)。本發(fā)明者等人發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠進(jìn)行抗MIF抗體(mAb)給藥能夠顯著降低同基因皮下移植B細(xì)胞淋巴瘤38C13的生長(zhǎng)和血管形成(9)。有證據(jù)表明MIF具有這種抗腫瘤效果是(部分)因?yàn)镸IF是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成的必需條件。同樣，抗MIFmAb處理接種有人黑色素瘤G361的小鼠后，能夠顯著降低腫瘤生長(zhǎng)和血管新生(10)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明以本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)為依據(jù)(部分)，即在CTL反應(yīng)中MIF的表達(dá)上調(diào)，和在體內(nèi)和體外用特異性mAb抑制MIF能夠提高CTL活性。具體而言，在這里公開(kāi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)中和MIF能夠提高CTL活性、抑制腫瘤生長(zhǎng)、增加T淋巴細(xì)胞對(duì)在體內(nèi)腫瘤侵襲位點(diǎn)的歸巢作用(homing)。因此，下述實(shí)施例所示的體外CTL實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明在體外引發(fā)階段進(jìn)行MIF免疫中和能夠增加CTL培養(yǎng)物的IFNγ產(chǎn)量。因?yàn)橐呀?jīng)知道活化Th2細(xì)胞能夠增加MIF的分泌水平，而活化Th1細(xì)胞不能提高M(jìn)IF的分泌水平(8)，因此推測(cè)可溶性抗原可能刺激誘導(dǎo)MIF表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)抑制Th1細(xì)胞因子(包括IFNγ)的產(chǎn)生來(lái)體內(nèi)抑制CTL的激活。
以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明MIF對(duì)CD4+輔助T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)多種有絲分裂原或者可溶性抗原的激活反應(yīng)方面具有重要作用。有絲分裂原或抗原激活的T細(xì)胞表達(dá)大量的MIF mRNA和蛋白質(zhì)，對(duì)MIF的免疫中和處理能夠在體外抑制IL-2產(chǎn)生和T細(xì)胞增殖，并能在體內(nèi)降低T輔助細(xì)胞對(duì)可溶性抗原的反應(yīng)(8)。本研究表明腫瘤抗原刺激后MIF表達(dá)上調(diào)，并且MIF的中和作用不影響IL-2分泌或者抗原誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞增殖。但是，抗MIF處理能夠顯著增加IL-2受體γc亞單位的表達(dá)，該亞單位是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)所必需的(25)，同時(shí)對(duì)CD8+T細(xì)胞的生存具有重要意義(26)。因此，MIF中和作用能夠?qū)е耇細(xì)胞細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，不能歸因于CD8+T細(xì)胞的增殖，而歸因于提高細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的生存率。在由CD8+T細(xì)胞激發(fā)溶細(xì)胞活性后，為了成功消退腫瘤，必須維持這種溶細(xì)胞作用。因此，抑制MIF能夠延長(zhǎng)CTL的壽命，在體內(nèi)和體外表現(xiàn)出CTL抗腫瘤作用。
抗MIF mAb處理EG.7腫瘤小鼠能增強(qiáng)CTL活性并顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。而且，來(lái)自抗MIF處理的帶腫瘤的小鼠的遷移的CD8+T細(xì)胞在受體小鼠中能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。因?yàn)橛^察到腫瘤實(shí)體中的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，因此可合理推測(cè)增強(qiáng)并維持CTL細(xì)胞毒作用直接導(dǎo)致了抗MIF處理的小鼠中的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
最近的報(bào)道表明腫瘤細(xì)胞比非轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多的MIF(10，53，54)。腫瘤細(xì)胞通過(guò)丟失讓CTL細(xì)胞識(shí)別的腫瘤抗原來(lái)逃脫CTL細(xì)胞的致死作用，或者即使腫瘤細(xì)胞表達(dá)了能被識(shí)別的抗原，它仍然能夠通過(guò)降低MHC表達(dá)水平的方法來(lái)耐受CTL介導(dǎo)的裂解作用(55)。雖然EG.7細(xì)胞能夠組成型分泌MIF(～10ng/ml/106個(gè)細(xì)胞)，rMIF和抗MIF抗體都不能影響EG.7細(xì)胞的I類MHC的表達(dá)。有數(shù)據(jù)表明腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)分泌MIF造成CD8+T數(shù)量下降的新機(jī)制來(lái)逃脫宿主免疫系統(tǒng)反應(yīng)。
一些研究表明某些腫瘤細(xì)胞表達(dá)FasL，從而增加了腫瘤成為免疫赦免部位的可能性。例如在表達(dá)FasL黑色素瘤和肝細(xì)胞癌的原位發(fā)現(xiàn)了浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的凋亡(57)。不過(guò)，最近的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)最初的假說(shuō)提出了挑戰(zhàn)。這些研究表明某些腫瘤細(xì)胞不表達(dá)FasL(58，59)，并且用FasL cDNA轉(zhuǎn)染某些腫瘤細(xì)胞不能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)，而是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的消退(59，60)。進(jìn)一步的研究表明FasL表達(dá)促進(jìn)迅速產(chǎn)生移植排斥反應(yīng)(61)和炎癥(63)。這項(xiàng)研究沒(méi)有對(duì)腫瘤內(nèi)的FasL表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。不過(guò)本發(fā)現(xiàn)表明在這些系統(tǒng)中檢測(cè)MIF/抗MIF對(duì)FasL表達(dá)的影響是有意義的。
此研究還確定了MIF在T細(xì)胞運(yùn)輸中的重要作用。實(shí)驗(yàn)觀察到在抗MIF處理的小鼠腫瘤內(nèi)出現(xiàn)了CD4+和CD8+T細(xì)胞積累增加現(xiàn)象。目前已知腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)引起的腫瘤破壞過(guò)程有CD4+和CD8+T細(xì)胞參與。用IL-2和TILs處理大鼠乳房腫瘤能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)腫瘤消退(64)，并且在人黑色素瘤中的TILs積累與較好的臨床效果相關(guān)聯(lián)(65)。實(shí)驗(yàn)觀察到抗-MIF抗體能夠增強(qiáng)CD4+和CD8+T細(xì)胞向腫瘤塊的遷移，因此表明抗-MIF抗體能影響抗腫瘤T細(xì)胞的功能，這可能涉及到改變趨化因子或趨化因子受體表達(dá)等機(jī)制。
不僅能調(diào)節(jié)CTL的活性，MIF在腫瘤形成其它方面也扮演一定角色。兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIF中和能顯著抑制腫瘤的血管生成(9，10)，Hudson及其合作者最近發(fā)現(xiàn)，在成纖維細(xì)胞中加入rMIF能夠抑制P53的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而抑制其功能(包括增殖和凋亡)(66)，雖然許多種類的宿主免疫效應(yīng)細(xì)胞參與了殺滅腫瘤的過(guò)程，但是腫瘤抗原特異性CTLs在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞殺傷過(guò)程中具有顯著效果，即使在靶細(xì)胞表面表達(dá)的抗原密度低的時(shí)候仍是如此(67)。因此，利用MIF免疫中和來(lái)治療性增加CD8+CTLs為基于細(xì)胞的抗腫瘤免疫治療提供了新基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明提供了在離體或體內(nèi)或這兩種情況下，在CD4+和/或CD8+T淋巴細(xì)胞和抗原接觸之前、之中或者之后，用降低或者提高其所暴露的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)水平的方法來(lái)調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或者降低)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤相關(guān)抗原等抗原的反應(yīng)的方法和組合物。
因此，一方面，本發(fā)明提供制備細(xì)胞的方法，優(yōu)選T細(xì)胞，尤其優(yōu)選CD8+T細(xì)胞，作為一種癌癥治療法，對(duì)癌癥患者或者其它需要CTL反應(yīng)進(jìn)行有效的免疫治療的患者進(jìn)行給藥。該方法包括在MIF拮抗劑或者抑制劑存在的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在這個(gè)方法中，從抗MIF抗體、MIF反義cDNA和MIF配體受體結(jié)合的拮抗劑中選擇MIF拮抗劑。該方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括在含有抗MIF抗體的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，該抗體能夠中和MIF活性或者使MIF失活。本發(fā)明方法所用的抗MIF抗體優(yōu)選為單克隆抗體、并選自人單克隆抗體、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和單鏈單克隆抗體。
另一方面，本發(fā)明涉及制備細(xì)胞組合物的方法，作為增強(qiáng)CTL反應(yīng)的免疫治療藥物，優(yōu)選對(duì)癌癥患者進(jìn)行癌癥治療給藥，該方法包括在(a)至少有一種所需CTL反應(yīng)的靶抗原，優(yōu)選腫瘤抗原和(b)抗MIF抗體存在的條件下孵育組合物的細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及制備自體同源細(xì)胞的方法，用于對(duì)癌癥患者進(jìn)行治療，該方法包括在某種試劑存在的情況下孵育細(xì)胞的步驟，該試劑選自抗MIF抗體、其MIF結(jié)合片段或者上述2種物質(zhì)的混合物。本方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括在(a)至少一種腫瘤抗原和(b)選自抗MIF抗體、其MIF結(jié)合片段或者這2種物質(zhì)的混合物的試劑存在的情況下孵育細(xì)胞的步驟。優(yōu)選該自體同源細(xì)胞包含免疫細(xì)胞，尤其優(yōu)選T細(xì)胞，更優(yōu)選CD8+T細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供細(xì)胞組合物，施用于需要增強(qiáng)其對(duì)某種抗原的CTK反應(yīng)的患者，例如癌癥患者。此組合物包含用抗MIF抗體培養(yǎng)的細(xì)胞。在此細(xì)胞組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，以抗MIF抗體培養(yǎng)的細(xì)胞還需要用至少一種對(duì)其需要增強(qiáng)CTL反應(yīng)的抗原，例如腫瘤抗原來(lái)培養(yǎng)。用抗MIF抗體培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選為離體培養(yǎng)，并且此細(xì)胞組合物可以包含同抗MIF抗體培養(yǎng)后從未結(jié)合的抗MIF抗體中分離得到的細(xì)胞。此細(xì)胞組合物中的細(xì)胞還可以從未結(jié)合的抗MIF抗體及未結(jié)合的抗原，例如腫瘤抗原中分離。本發(fā)明中的細(xì)胞組合物中細(xì)胞優(yōu)選包括免疫細(xì)胞，尤其優(yōu)選T細(xì)胞，且更為優(yōu)選CD8+T細(xì)胞。


圖1在體外，抗MIF mAb，而非rMIF或者對(duì)照IgG，增強(qiáng)CTL活性。7天前用EG.7細(xì)胞引發(fā)的C57BL/6小鼠作為脾細(xì)胞的來(lái)源(見(jiàn)材料與方法)。脾細(xì)胞培養(yǎng)物在有rMIF(A)，抗MIF抗體(B)或?qū)φ誌gG1，(C)存在時(shí)用輻射的EG.7細(xì)胞刺激5天。在脾細(xì)胞中按照不同的E∶T細(xì)胞比例加入新鮮的EG.7靶細(xì)胞，37培養(yǎng)4小時(shí)后，用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測(cè)定細(xì)胞毒性。(D)比較了脾細(xì)胞-輻射EG..7細(xì)胞剛開(kāi)始進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)加入抗體(E∶T＝20∶1)(第0天)和在共培養(yǎng)第2天后加入，抗MIF單克隆抗體對(duì)體外CTL活性的影響，和不加入抗體相比，用Student’s t檢測(cè)p＜0.05。
圖2用輻射的EG.7細(xì)胞培養(yǎng)引發(fā)的脾細(xì)胞時(shí)MIF和IFNγ分泌增加。脾細(xì)胞從EG.7引發(fā)的小鼠中分離得到，用或不用輻射的EG.7細(xì)胞和同型對(duì)照抗體(對(duì)照)或抗MIF mAb(抗MIF)(50μLg/ml)刺激1或2天。用特異性ELISA檢測(cè)培養(yǎng)物上清中的MIF(A)和IFNγ(B)，見(jiàn)材料與方法。TNFα和IL-12的量低于檢測(cè)線。用Student’st檢測(cè)對(duì)照+EG.7和對(duì)照-E.7相比*，p＜0.05。
圖3抗MIF mAb處理EG.7腫瘤小鼠增加CTL活性并且抑制腫瘤生長(zhǎng)。用EG.7細(xì)胞注射C57BL/6小鼠(每組n＝5)，然后每天用PBS或?qū)φ誌gG1或抗MIF單克隆抗體(0.5mg)處理，在第7天時(shí)，收獲并分離脾細(xì)胞并和輻射的EG.7細(xì)胞共培養(yǎng)5天，然后用LDH釋放法進(jìn)行4小時(shí)CTL體外檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞裂解狀況(A)。第7天時(shí)測(cè)定腫瘤體積(B)?？筂IF處理和對(duì)照IgG處理的Student’s t檢測(cè)*，p＜0.05。
圖4抗MIF mAb處理EG.7腫瘤小鼠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)。小鼠(每組n＝5)，每天用對(duì)照IgG或抗MIF mAb處理，連續(xù)處理7天。然后切取EG.7腫瘤，用PE-抗-鼠CD4(L3T4)或FITC-抗-鼠CD8(ly-2)單克隆抗體對(duì)腫瘤切片進(jìn)行染色。用熒光顯微鏡對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算出和對(duì)照IgG處理的動(dòng)物相比抗MIF mAb處理的動(dòng)物的腫瘤中免疫反應(yīng)性浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)量平均百分比的增加(加減S.D.)。腫瘤切片與熒光標(biāo)記的同種對(duì)照抗體孵育后未表現(xiàn)出免疫反應(yīng)活性，抗MIEF和對(duì)照IgG處理的相比，Student’s t檢測(cè)同*，p＜0.05。
圖5抗MIF mAb處理促進(jìn)EG.7腫瘤細(xì)胞凋亡。用TUNEL方法標(biāo)記斷裂DNA鏈，在原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞。用抗MIF mAb處理的小鼠(A)在其腫瘤組織中能夠觀察到許多凋亡的EG.7細(xì)胞(黑棕色)，相反，用對(duì)照IgG處理的小鼠(B)在其腫瘤組織中觀察到很少的凋亡小體。圖中展示了10個(gè)代表性腫瘤組織的切片(放大100倍)(每組n＝5個(gè)動(dòng)物)。
圖6體內(nèi)用抗MIF抗體處理增加IL-2Rγc的表達(dá)量。每天用抗MIF或?qū)φ誌gG處理EG.7腫瘤小鼠，連續(xù)處理7天，然后收集其脾細(xì)胞和天然小鼠的脾細(xì)胞(每組3只小鼠)，每組的脾細(xì)胞混合在一起，分選并計(jì)算CD8+T細(xì)胞數(shù)量后對(duì)CD8和IL-2Ra(A)、β(B)或γc(C)表面標(biāo)志物進(jìn)行染色。陰影柱狀圖表示被同型對(duì)照抗體染色的細(xì)胞。
圖7用抗MIF抗體處理供體有腫瘤小鼠增加遷移T淋巴細(xì)胞向受體有腫瘤小鼠的EG.7腫瘤中遷移的能力，并且促進(jìn)受體鼠中CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性。經(jīng)抗MIF或者對(duì)照IgG處理8天后(0.5mg×7天)，從正常(對(duì)照)或者有腫瘤的小鼠中分離未分級(jí)的脾細(xì)胞(A)或者純化的CD8+脾T細(xì)胞(B)，并用熒光染料PKH-26標(biāo)記。標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)靜脈轉(zhuǎn)入有腫瘤的受體小鼠(n＝每組5只)，一天后，切取腫瘤，制備恒溫冷凍切片，測(cè)定每個(gè)高亮區(qū)(HPF)熒光細(xì)胞的數(shù)目(均值±S.D.)，與對(duì)照抗體處理小鼠相比Student t檢驗(yàn)*，p＜0.05**，p＜0.01(C)。向C57BL/6小鼠注射5×106的EG.7細(xì)胞(i.p.)，然后用抗MIF mAb或者對(duì)照IgG(0.5mg/天)處理7天。純化的脾CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)入到受體小鼠中(5×106個(gè)細(xì)胞/小鼠，i.v.)，該小鼠(每組5只)已在24小時(shí)前s.c.接種5×106的EG.7細(xì)胞。測(cè)定腫瘤重量(平均值±S.D.)。與對(duì)照抗體處理的小鼠相比Student t檢驗(yàn)p＜0.05。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在體內(nèi)或者體外抑制MIF釋放和/或活性的組合物和方法，用于治療任何需要CTL反應(yīng)的疾病，包括但不限于腫瘤(惡性或者良性)、病毒感染、寄生蟲(chóng)感染，例如包括瘧疾和/或細(xì)菌感染。
根據(jù)本發(fā)明，抑制MIF活性的方法有幾種，其中包括但不限于使用能夠與MIF結(jié)合并中和其生物活性的因子；使用MIF受體拮抗劑；使用能夠抑制體內(nèi)細(xì)胞釋放MIF的化合物；及使用根據(jù)MIF編碼序列、非編碼序列和/或調(diào)控序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸抑制或減少M(fèi)IF的表達(dá)。根據(jù)相關(guān)的條件，可以使用任何一種或幾種上述方法來(lái)抑制MIF的活性來(lái)治療相關(guān)疾病，并且還可以和其它的CTL增強(qiáng)治療，包括例如肽免疫、細(xì)胞因子治療等聯(lián)合使用。
在本文中提到的MIF結(jié)合伴侶是指能夠結(jié)合MIF并中和其生物活性的因子，根據(jù)本發(fā)明它們可被用于需要CTL反應(yīng)的疾病的治療。由于腫瘤分泌或者Th2T輔助細(xì)胞的激活可能提高M(jìn)IF蛋白水平，抑制性MIF結(jié)合伴侶和MIF蛋白的相互作用能夠抑制MIF活性的伴隨增加。這些因子可包括但不限于抗MIF抗體、抗體片段、MIF受體和MIF受體片段。
可采用本領(lǐng)域公知的多種方法生產(chǎn)針對(duì)重組生產(chǎn)或天然純化的MIF的抗原表位的抗體(例如采用下文中的重組DNA技術(shù))。在診斷和治療中優(yōu)先選擇中和性抗體，例如競(jìng)爭(zhēng)MIF受體結(jié)合位點(diǎn)或者造成MIF受體結(jié)合位點(diǎn)空間位阻的那些抗體。這類抗體包括但不限于多克隆、單克隆、人源單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段和Fab表達(dá)庫(kù)產(chǎn)生的片段。
為了生產(chǎn)抗體，可以用MIF和/或MIF蛋白的一部分注射免疫多種宿主動(dòng)物。這些宿主動(dòng)物包括但不限于兔子、小鼠和大鼠等。針對(duì)不同種類的宿主動(dòng)物，可采用多種佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚以及可用于人體的佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriun parvum)。
可采用各種技術(shù)方法通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)針對(duì)MIF的單克隆抗體分子。其中包括但不限于最初由Kohler和Milstein介紹的雜交瘤技術(shù)(Nature，1975，256495-497)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，1983，今日免疫學(xué)雜志，Immunology Today，472頁(yè)；Cote等人，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院刊，Proc.Natl.Aad.Sci.，802026-2030頁(yè))和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985，單克隆抗體和癌癥治療，MonoclonalAtibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss有限公司，77-96頁(yè))。另外，還可使用生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等人，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院刊，816851-6855頁(yè)；Neuberger等人，1984，自然雜志，Nature，312604-608頁(yè)；Takeda等人，1985，自然雜志，Nature，314452-454頁(yè))，該技術(shù)將具有適當(dāng)抗原特異性的鼠抗體分子基因片段和具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子基因片段剪接在一起。此外，還可以采用單鏈抗體生產(chǎn)技術(shù)(美國(guó)專利第4946778號(hào))制備MIF特異的單鏈抗體。
雜交瘤技術(shù)已經(jīng)被用于生產(chǎn)抗MIF單克隆抗體。見(jiàn)Bucala等人的美國(guó)專利第6,030,615號(hào)，此專利的全部?jī)?nèi)容已經(jīng)作為參考文獻(xiàn)在此處被引用。已經(jīng)分離了能夠分泌直接針對(duì)人和鼠MIF的IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于此抗體能中和MIF的生物活性?？筂IF單克隆抗體能夠抑制細(xì)胞內(nèi)寄生物刺激的巨噬細(xì)胞殺傷作用?？筂IF單克隆抗體還能被用于特異并且靈敏地篩選檢測(cè)MIF的ELISA反應(yīng)。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以制備識(shí)別MIF特異表位的抗體片段。例如這些片段包括但不限于胃蛋白酶降解抗體分子得到的F(ab’)2片段和由還原F(ab’)2片段的二硫橋得到的Fab片段。并且，還可以構(gòu)建Fab表達(dá)庫(kù)(Huse等人，1989，科學(xué)雜志，2461275-1281)，快速并簡(jiǎn)易地鑒定針對(duì)MIF的特異性單克隆Fab片段。
根據(jù)本發(fā)明，MIF受體、MIF受體片段和/或MIF受體類似物可用作為MIF生物活性的抑制劑。這些分子和MIF蛋白結(jié)合，可抑制MIF和細(xì)胞的MIF受體的結(jié)合，進(jìn)而干擾MIF行使生物學(xué)活性的機(jī)制。模擬這些分子活性的小的有機(jī)分子也包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)。MIF受體包括任何能夠以氨基酸序列特異性和/或者結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合MIF的細(xì)胞表面分子。MIF受體片段也可以作為MIF的抑制劑，任何能夠和MIF特異性結(jié)合、并且能夠抑制MIF生物學(xué)活性的MIF受體的任何氨基端、羧基端和/或內(nèi)部缺失的片段都包括在本發(fā)明范疇之內(nèi)。氨基和/或羧基端缺失指的是該分子氨基端和/或羧基末端至少有一個(gè)氨基酸的缺失。內(nèi)部缺失指的是分子含有1個(gè)或者多個(gè)非末端氨基酸的缺失。MIF受體片段是刪除了胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域或者部分胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域的截短的受體蛋白質(zhì)，刪除胞質(zhì)和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域可以產(chǎn)生含有全部或部分MIF受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性MIF受體片段。
也可以用能夠特異結(jié)合MIF的MIF受體類似物來(lái)抑制MIF活性。這樣的MIF受體類似物可包括在氨基酸的氨基末端、羧基末端、或者在MIF受體的任何2個(gè)相鄰氨基酸殘基之間添加一或者多個(gè)額外的氨基酸的MIF受體或者受體片段。增加的氨基酸可以是功能性附著于MIF受體蛋白全部或部分而形成MIF受體融合蛋白的異源肽的一部分。例如(但不限于)MIF受體、或者其截短的部分，可以通過(guò)遺傳工程手段融合所需的免疫球蛋白的Fc片段。MIF受體類似物還包括在天然保守區(qū)和非保守區(qū)置換了一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的MIF受體或者M(jìn)IF受體片段。置換保守氨基酸包括使用具有相似電荷、大小和/或者疏水性的氨基酸對(duì)一或者多個(gè)氨基酸進(jìn)行替換。例如用谷氨酸(E)替換天冬氨酸(D)。置換非保守性氨基酸包括用具有不同電荷、大小和/或者疏水性的氨基酸對(duì)一或者多個(gè)氨基酸進(jìn)行替換。例如用谷氨酸(E)替換纈氨酸(V)?？刹捎弥亟MDNA技術(shù)制備MIF受體、MIF受體片段和/或者類似物。
可以用能夠結(jié)合MIF進(jìn)而抑制MIF生物活性的分子治療需要CTL反應(yīng)的疾病。這些分子包括但不限于抗MIF受體的抗體和MIF類似物?？筂IF受體的抗體能被生產(chǎn)并用來(lái)中和MIF受體功能?？梢灾苽溽槍?duì)整個(gè)或者任何部分的MIF受體的抗體，例如根據(jù)美國(guó)專利No.6080407所記載的技術(shù)方法，見(jiàn)上文。
MIF類似物可以包括結(jié)合MIF受體但沒(méi)有生物活性的分子。這些類似物能夠和MIF競(jìng)爭(zhēng)同MIF受體的結(jié)合，所以，當(dāng)在體內(nèi)使用時(shí)，能阻斷MIF在細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞毒過(guò)程中發(fā)揮作用?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的多種技術(shù)設(shè)計(jì)MIF類似物。重組DNA技術(shù)可以用來(lái)生產(chǎn)修飾的MIF蛋白，其包括例如插入、刪除和/或者替換MIF蛋白中的氨基酸，所產(chǎn)生的MIF類似物具有MIF受體結(jié)合能力，卻不具有生物活性。另外，可以采用化學(xué)方法合成MIF類似物(見(jiàn)，例如Sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)，冷泉港出版社，N.Y.(1989))。MIF受體和/或表達(dá)MIF受體的細(xì)胞系可被用來(lái)鑒定和/或者分析潛在的MIF類似物。
如美國(guó)專利No.6080407見(jiàn)上文所述，某些類固醇，通常被認(rèn)為沒(méi)有活性或是抗甾體的(anti-steroidal)，實(shí)際上能夠抑制MIF的釋放；例如20α氫化可的松。在本發(fā)明中可以將這些固醇或者任何其他能夠抑制MIF釋放的化合物與其他抗MIF藥物結(jié)合使用。
可以采用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)對(duì)MIF生物活性抑制劑，如抗MIF抗體、MIF受體、MIF受體片段、MIF受體類似物、抗MIF受體的抗體、MIF類似物和MIF釋放抑制劑進(jìn)行給藥。優(yōu)選系統(tǒng)性制劑并給藥。制劑和給藥的技術(shù)可參考Remington藥學(xué)(Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，1990年，Mack出版公司，Easton，pa.)。適合的給藥途徑包括口服給藥、直腸給藥、粘膜給藥或者腸給藥；腸胃外給藥途徑包括肌內(nèi)、皮下、骨髓注射，鞘內(nèi)、腦室、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、眼球內(nèi)注射等，這里只能列舉少數(shù)幾種。最優(yōu)選靜脈給藥。為了實(shí)現(xiàn)注射給藥，本發(fā)明的藥物可以配制成水性溶液，優(yōu)選溶解在生理相容的緩沖液中，例如Hanks′溶液、Ringer′s溶液或者生理鹽水。為了實(shí)現(xiàn)粘膜給藥，在劑型中使用合適滲透屏障的穿透劑。這些穿透劑為技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)公知。
可以采用該領(lǐng)域內(nèi)公知的方法來(lái)確定MIF抑制劑化合物的有效濃度和給藥次數(shù)，需要確定的參數(shù)包括生物半衰期、生物有效利用度和毒性。當(dāng)采用抗MIF抗體時(shí)，優(yōu)選的劑量濃度是從大約0.1mg/每公斤體重到約20mg/每公斤體重，最優(yōu)選10mg/每公斤體重。對(duì)于抗體或者其他循環(huán)半衰期長(zhǎng)的抑制劑化合物，單次給藥就可以維持所需的循環(huán)濃度。當(dāng)使用半衰期短的化合物時(shí)，要求多次給藥以維持所需的循環(huán)濃度。
可以對(duì)患者進(jìn)行MIF抑制劑單獨(dú)給藥或者同其他治療藥物聯(lián)合給藥，其它治療藥物包括順序或者同時(shí)給藥的腫瘤或者病毒的抑制劑或者拮抗劑，CTL反應(yīng)對(duì)該腫瘤或病毒治療是有益的。
本發(fā)明中使用抗MIF藥物的方法中使用的抗MIF藥物還包括寡核糖核苷酸序列，包括能夠抑制MIF和/或MIF受體mRNA翻譯的反義RNA和DNA分子以及核酶。反義RNA和DAN分子的作用是通過(guò)結(jié)合靶mRNA來(lái)直接抑制蛋白翻譯，或者通過(guò)抑制核糖體的結(jié)合和/或移位，或者通過(guò)使mRNA分子本身被核酸酶降解來(lái)達(dá)到直接抑制蛋白翻譯的目的。核酶是一種具有酶活性的RNA分子，該分子能夠特異切斷RNA。核酶的作用機(jī)制涉及與互補(bǔ)的靶RNA序列特異性雜交，然后發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性。在本發(fā)明內(nèi)，基因工程改造的核酶分子的錘頭形基元能夠特異并且有效的催化內(nèi)切MIF和/或MIF受體mRNA序列。可以根據(jù)該技術(shù)領(lǐng)域公知的核酸分子合成技術(shù)制備本發(fā)明涉及的反義RNA、DNA分子和核酶。其中包括該領(lǐng)域公知的化學(xué)合成寡核苷酸技術(shù)，例如固相亞磷酰胺(phosphoramidite)化學(xué)合成。另外，在體內(nèi)或者體外轉(zhuǎn)錄編碼反義RNA分子的DNA也可以得到RNA分子。這樣的DNA序列可以整合到多種載體中，該載體整合有適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動(dòng)子，例如T7或者SP6聚合酶啟動(dòng)子。另外，組成型或誘導(dǎo)型(由啟動(dòng)子決定)合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建體可以穩(wěn)定地導(dǎo)入到細(xì)胞系中。
可以對(duì)DNA分子進(jìn)行多種修飾來(lái)增加其細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期?？梢允褂玫男揎椃椒ò?但不僅限于)在分子的5’和/或3’端添加核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸翼側(cè)序列、或者在寡脫氧核糖核酸骨架上使用phosphorothioate或者2’-O甲基替代磷酸二酯酶連接。
為了進(jìn)行抗MIF治療，寡核苷酸抑制劑可以同細(xì)胞一起制劑并且在體外應(yīng)用，和/或采用不同的方式給藥，包括系統(tǒng)性、局部定位性(localize)、或者局部性(topical)給藥。制劑制備和給藥的技術(shù)可以參考Remington′s藥學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，Easton，pa.)的最新版?？梢圆捎脤?duì)體內(nèi)所需靶器官產(chǎn)生最大輸送效率的給藥方式。
實(shí)施例材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系C57BL/6(H-2b)小鼠(雌性，8-12周)購(gòu)自The JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程均遵照NSUH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)養(yǎng)和使用委員會(huì)的指導(dǎo)按照經(jīng)驗(yàn)證的流程進(jìn)行。EG.7細(xì)胞(用編碼OVA(11)的cDNA轉(zhuǎn)染EL4細(xì)胞后得到)和EL4細(xì)胞(兩種都是II型MHC陰性，H-2b鼠胸腺瘤)，以及YAC-1細(xì)胞購(gòu)自ATCC(Rockville，NM)。
細(xì)胞因子和抗體按照上述方法制備得到重組鼠MIF(rMIF)(12；13)(＜1pg內(nèi)毒素/μg蛋白質(zhì))。按照上述方法制備得到中和性抗MIF mAb(XIV克隆.15.5，IgG1，同種型)(9，14)。在相似條件下用雜交瘤5D4-11純化同種型對(duì)照抗體(IgG1)，5D4-11能夠分泌特異于3型登革熱病毒(ATCC)的抗體。FITC-大鼠抗小鼠CD3Ab、PE-大鼠抗小鼠CD4、PerCp-大鼠抗小鼠CD8Ab、PE-大鼠抗小鼠CD25Ab、PE-大鼠抗小鼠CD28Ab、FITC-大鼠抗小鼠CD44、PE-大鼠抗小鼠CD25(IL-2Rα)、PE-大鼠抗小鼠CD28Ab、FITC大鼠抗小鼠CD44Ab、PE-大鼠抗小鼠CD25(IL-2Rα)、PE-大鼠抗CD122(IL-2Rβ)、PE-大鼠抗小鼠CD132(共享γ鏈)和PE-大鼠抗小鼠H-2Kb均購(gòu)自PharMingen公司(圣地亞哥，加拿大)。
產(chǎn)生抗原特異性的CTL上面已經(jīng)介紹了產(chǎn)生OVA特異性的CTL的方法(11)。簡(jiǎn)而言之，在1-2周前i.p.注射5×106的EG.7細(xì)胞來(lái)引發(fā)小鼠，然后從中得到脾細(xì)胞。分離得到的脾細(xì)胞(3×106)和輻射的EG.7細(xì)胞(20,000rad；106個(gè)細(xì)胞)共同孵育5天(在有或無(wú)細(xì)胞因子或者抗體情況下，如下)。從這些培養(yǎng)物中收集用于體外CTL分析(見(jiàn)下)的效應(yīng)細(xì)胞，并且在H-2Kb中能夠識(shí)別OVA257-264(SIINFKEL)肽(15)。為了研究MIF的體外中和效果，從腫瘤移植之日起，每天給EG.7引發(fā)的小鼠注射抗MIF抗體或者對(duì)照IgG(0.5mg，i.p.)，連續(xù)一周。按照如下所述方法從抗MIF抗體或?qū)φ誌gG處理過(guò)的小鼠中分離脾細(xì)胞，并用來(lái)測(cè)定體外CTL活性。
細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒分析在96孔圓底平板中系列稀釋效應(yīng)脾細(xì)胞(按照上述方法制備)，然后添加EG.7靶細(xì)胞(5×105/孔)，E∶T比為1∶1到30∶1，同時(shí)添加不同濃度的抗MIF mAb、對(duì)照IgG、或者純化的rMIF。37孵育4小時(shí)，用CytoTox96°分析(Promega Madison，WI)測(cè)定培養(yǎng)物上清(n＝3)中胞質(zhì)酶、乳酸脫氫酶(LDH)，對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行定量。各個(gè)E∶T比例下的“特異性裂解”表達(dá)為特異性裂解＝[(實(shí)驗(yàn)釋放)-(自發(fā)釋放)/(靶最大值-靶自發(fā)釋放)。當(dāng)沒(méi)有CTL存在時(shí)，自發(fā)LDH釋放值小于去污劑裂解細(xì)胞時(shí)釋放最大值的10％。所有實(shí)驗(yàn)操作和分析均重復(fù)2次到更多次，結(jié)果相似。
NK分析如前所述，用NK敏感YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行NK分析(16)。
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析從實(shí)驗(yàn)小鼠中制備去紅細(xì)胞的脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)其進(jìn)行分析。所有熒光標(biāo)記抗體均購(gòu)自PharMingen公司，并且按照推薦的操作流程進(jìn)行操作。用含有3％BSA和0.1％odium疊氮化合物(FACS緩沖液)的PBS重懸細(xì)胞(106/份)，和熒光標(biāo)記抗體孵育30分鐘(4)，然后用FACS緩沖液洗滌2次，。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton，Dickinson，Mountainview，加拿大)獲取熒光數(shù)據(jù)，并且用CELLQuest軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)過(guò)一次并且得到了相似的結(jié)果。
細(xì)胞因子產(chǎn)物的分析用夾心ELISA對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行分析來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子產(chǎn)物。該ELISA所用的鼠IFNγ、TNFα、IL-2和IL-12試劑盒均購(gòu)自R&DSystem公司(Minneapolis，MN)。按照前文中介紹的方法進(jìn)行針對(duì)鼠MIF的ELISA檢測(cè)(14)。雖然在培養(yǎng)物中存在中和性抗MIF mAb和有生物學(xué)活性的MIF復(fù)合會(huì)導(dǎo)致MIF失活，但是MIF活性仍然能被后續(xù)的ELISA檢測(cè)出來(lái)。
體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)按照前述方法(9)在C57BL/6小鼠中檢測(cè)抗MIF抗體對(duì)EG.7腫瘤生長(zhǎng)的作用。洗滌培養(yǎng)的EG.7細(xì)胞，重懸到PBS中，將5×106個(gè)細(xì)胞(重懸在0.1ml PBS中)s.c.注射到小鼠(每組n＝5)的上脅腹中。1小時(shí)后小鼠接受一次0.3ml的PBS或者IgG1同型對(duì)照抗體(0.5mg)或者純化的抗MIF mAb(0.5mg)的i.p.注射，然后每24小時(shí)注射一次，連續(xù)注射7天。在第7天用游標(biāo)卡尺正交線性測(cè)量腫瘤的大小，按照公式重量(mg)＝[(寬度，mm)2×(長(zhǎng)度，mm)]/2(17)計(jì)算重量。重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)得到相似結(jié)果。
組織學(xué)研究在第7天切除對(duì)照IgG和抗MIF處理的小鼠的腫瘤。用PE-CD4(L3T4)和FITC-CD8(Ly-2)mAb(PharMingen)對(duì)冷凍腫瘤切片染色。用熒光顯微鏡對(duì)CD8+和CD4+T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每片腫瘤切片染色細(xì)胞平均數(shù)和對(duì)照IgG處理小鼠組織切片染色細(xì)胞平均數(shù)相比并計(jì)算增加的百分?jǐn)?shù)。每片切片用10x物鏡計(jì)數(shù)10個(gè)視野(每組n＝5只小鼠)。用熒光偶聯(lián)同型對(duì)照抗體共同孵育對(duì)照切片沒(méi)有出現(xiàn)免疫反應(yīng)。
原位凋亡檢測(cè)根據(jù)商家推薦的操作流程(R&DSystems公司)用末端脫氧核糖核酸遷移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)方法來(lái)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用光學(xué)顯微鏡(100x)對(duì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每片腫瘤切片中凋亡細(xì)胞的均數(shù)(±S.D.)。對(duì)每張切片隨機(jī)挑選5個(gè)視野(每只小鼠一張切片，每組5只小鼠)進(jìn)行分析，用Student’s t檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)是否具有顯著性(p＜0.05)。
體內(nèi)淋巴細(xì)胞遷移分析按照前述的Zou等人(18)所述的方法對(duì)無(wú)腫瘤小鼠和具有大小相似的EG.7腫瘤的小鼠(注射腫瘤細(xì)胞7天后)每天注射抗MIF抗體(0.5mg/小鼠，i.p.)或者對(duì)照IgG，這些鼠作為此分析的細(xì)胞來(lái)源。得到并且用PKH-26標(biāo)記未分級(jí)的脾細(xì)胞或者純化的脾CD8+T細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)，所用的PKH-26是一種膜嵌入型紅色熒光染料(Sigma公司，St.Louis，Mo)。按照前述方法(19)對(duì)體內(nèi)淋巴細(xì)胞遷移進(jìn)行分析(n＝每組5只小鼠)。簡(jiǎn)而言之，將標(biāo)記的細(xì)胞注射(i.v.)到有腫瘤的受體小鼠中。24小時(shí)后切除腫瘤塊，并且制備低溫冷凍切片。用FITC抗CD4或者FITC抗CD8對(duì)切片進(jìn)行染色，據(jù)此確定T細(xì)胞的類型。用顯微鏡對(duì)PKH-26熒光供體細(xì)胞進(jìn)行定量，計(jì)算腫瘤組織切片每個(gè)視野中標(biāo)記的供體細(xì)胞的均數(shù)。用10x物鏡檢測(cè)每個(gè)切片(每只小鼠一張切片)的10個(gè)視野。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)2次得到了相似的結(jié)果。
過(guò)繼性免疫療法用5×106EG.7細(xì)胞(s.c.)注射C57BL/6小鼠之后，用抗MIF mAb或者對(duì)照IgG(0.5mg/天，i.p.)處理，連續(xù)處理7天(n＝每組5只)。在最后一次注射的第二天，分離脾細(xì)胞，并用CD8+富集柱(R&DSystems公司)純化CD8+脾T細(xì)胞。然后，將未分級(jí)的脾細(xì)胞或者CD8+T細(xì)胞(5×106個(gè)細(xì)胞/每只小鼠)遷移(i.v.)到受體鼠中，該受體鼠在1天前已經(jīng)被注射了5×106個(gè)EG.7細(xì)胞。按照前述方法在第1-13天檢測(cè)腫瘤的重量。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)1次，得到相似結(jié)果。
結(jié)果在體外抗MIF抗體增強(qiáng)CTL活性以前的研究表明MIF蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)是巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞激活反應(yīng)的一部分(5，8，20)。為了評(píng)價(jià)MIF在宿主對(duì)腫瘤侵襲的反應(yīng)中的作用，發(fā)明人員首先檢測(cè)了rMIF或者中和性抗MIFmAb是否能夠在體外影響抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。從由移植EG.7細(xì)胞引發(fā)的小鼠中分離得到脾細(xì)胞，在rMIF、中和性抗MIFmAb、或者對(duì)照IgG同型抗體存在或不存在的條件下，用輻射EG.7細(xì)胞刺激上述脾細(xì)胞培養(yǎng)物，連續(xù)刺激5天。如圖1B所示，當(dāng)添加抗MIF mAb的量為50μg/ml時(shí)，能夠顯著增強(qiáng)體外CTL反應(yīng)，添加外源性rMIF(圖1A)或者對(duì)照IgG(圖IC)對(duì)CTL活性沒(méi)有影響。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明單獨(dú)用抗MIF mAb處理脾細(xì)胞或者EG.7細(xì)胞不能影響它們的生存和生長(zhǎng)特性，在體外用抗MIFmAb預(yù)處理后，不會(huì)單獨(dú)引起非條件(unconditioned)脾細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
在用EG.7靶細(xì)胞分析脾細(xì)胞培養(yǎng)物的最后4小時(shí)，添加抗MIFmAb或者rMIF，來(lái)分析MIF在CTL反應(yīng)效應(yīng)期中的可能作用。在這個(gè)分析周期中發(fā)現(xiàn)這些試劑對(duì)體外細(xì)胞毒活性沒(méi)有影響。與之相反，研究發(fā)現(xiàn)在為期5天的共培養(yǎng)期間，在第1、2天加入抗MIF mAb能表現(xiàn)出增強(qiáng)體外CTL反應(yīng)的最大活性(圖1D)。
這些數(shù)據(jù)表明在細(xì)胞毒T細(xì)胞活化早期MIF免疫中和可以誘導(dǎo)后續(xù)的CTL活性。并不意外地發(fā)現(xiàn)，在體外，與沒(méi)有用輻射的EG.7細(xì)胞共培養(yǎng)的腫瘤小鼠的脾細(xì)胞相比，用輻射的EG.7細(xì)胞刺激脾細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞能夠顯著提高培養(yǎng)物上清中MIF的量(圖2A)。然而，添加生物活性rMIF到平行的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中，沒(méi)有顯著影響CTL的活性，認(rèn)為這些培養(yǎng)物產(chǎn)生的內(nèi)源性MIF已經(jīng)刺激細(xì)胞反應(yīng)達(dá)到最大值(＞30ng/ml)(圖1A)。
一些細(xì)胞因子對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞毒性的表達(dá)有重要作用，本實(shí)驗(yàn)還研究了在體外MIF免疫中和對(duì)這些細(xì)胞因子的表達(dá)的影響。用特異性ELISA檢測(cè)培養(yǎng)物上清中的IFNγ、TNFα、IL-2、IL-12的水平。與對(duì)照mAb處理的培養(yǎng)物相比，當(dāng)抗MIF mAb發(fā)揮增強(qiáng)CTL的最大活性時(shí)，這些細(xì)胞因子中只有IFNγ在兩天的共培養(yǎng)階段表現(xiàn)出明顯的濃度增加現(xiàn)象(圖2B)。與此相反，與對(duì)照IgG處理的培養(yǎng)物相比，EG.7腫瘤小鼠的脾細(xì)胞在抗MIF mAb存在的情況下和輻射的EG.7細(xì)胞共同孵育后沒(méi)有顯著增加IL-2、IL-12或者TNFα蛋白質(zhì)的表達(dá)。單獨(dú)培養(yǎng)的EG.7細(xì)胞不能產(chǎn)生可檢測(cè)水平的MIF、IFNγ、TNFα、IL-2或者IL-12。用流式細(xì)胞儀分析后發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是rMIF還是抗MIF處理都沒(méi)有影響共培養(yǎng)物中表面有CD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD44high標(biāo)記物的細(xì)胞的百分比。
體內(nèi)抗MIF mAb處理增強(qiáng)CTL活性。在體內(nèi)EG.7腫瘤引發(fā)期，與IgG1處理的對(duì)照組相比較，研究了從抗MIF mAb處理的小鼠中收集得到的脾細(xì)胞的CTL反應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)表明，用EG.7細(xì)胞引發(fā)后(在第0天)，每天進(jìn)行抗MIF mAb處理，連續(xù)處理1周能以E∶T比為30和10顯著增強(qiáng)CTL活性(圖3A)。和單獨(dú)加入PBS或不添加任何試劑的對(duì)照組相比，在該實(shí)驗(yàn)體系中單獨(dú)加入對(duì)照IgG不能增強(qiáng)CTL活性。
最近的研究已經(jīng)證明抗MIF mAb對(duì)帶有38C13B細(xì)胞淋巴瘤(9)和G361黑色素瘤(10)的小鼠有顯著的抗腫瘤活性。根據(jù)這些數(shù)據(jù)和我們發(fā)現(xiàn)的抗MIF抗體能夠使CTL活性增強(qiáng)2倍的數(shù)據(jù)(如上)，我們還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照IgG或者PBS處理小鼠相比，對(duì)帶有EG.7淋巴瘤的小鼠進(jìn)行抗MIF抗體處理一周能使腫瘤體積減小2倍(圖3B)。另外，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗MIF mAb處理后，腫瘤中滲透的CD8+和CD4+細(xì)胞數(shù)目增加了近3倍(圖4)。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)凋亡(21)殺傷腫瘤靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，和抗MIF處理增加宿主CTL活性相一致，和對(duì)照IgG處理小鼠(圖5B)相比，抗MIF抗體處理能使腫瘤塊中凋亡細(xì)胞的數(shù)目顯著增加(4-5倍)(圖5A)。用抗MIF抗體和用對(duì)照IgG處理的小鼠的腫瘤切片的高能量視野的平均凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析比較凋亡差異，前者為194±63個(gè)細(xì)胞/100x視野，后者為43±22個(gè)細(xì)胞/100x視野，該結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.01)。
以前曾經(jīng)報(bào)道過(guò)rMIF能夠在體外抑制NK細(xì)胞活性(22)。因此，抗MIF mAb在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果可能是因?yàn)樵鰪?qiáng)了NK細(xì)胞活性的緣故。雖然與對(duì)照(無(wú)腫瘤小鼠)相比，EG.7腫瘤小鼠制備的全脾細(xì)胞的NK活性得到增強(qiáng)，但是用抗MIF抗體處理小鼠后NK活性沒(méi)有發(fā)生變化。
以前的研究表明，在體內(nèi)抗原驅(qū)動(dòng)的CD4+T細(xì)胞激活期間的MIF表達(dá)在免疫反應(yīng)中具有重要作用(8)。因此，需要確定抗MIF mAb處理引起的細(xì)胞裂解活性增強(qiáng)是否與增強(qiáng)的抗原誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增殖相關(guān)。根據(jù)Bacher等人(8)的報(bào)道，體內(nèi)抗MIF mAb處理不會(huì)引起T細(xì)胞增殖增強(qiáng)。
實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了抗MIF抗體對(duì)IL-2受體表達(dá)的作用。IL-2受體是多亞基的，由可調(diào)節(jié)IL-2親和性的可變表達(dá)鏈(CD25)、及2個(gè)信號(hào)亞基β(CD122)和γc(CD132)鏈組成(見(jiàn)23綜述)。其中γc亞基(又稱為普通γ鏈)是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15受體共有的亞基。募集γc在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中是必須的(24，25)，而且γc的表達(dá)在體內(nèi)對(duì)于成熟CD8+T細(xì)胞的生存具有重要作用(26)。因此，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了抗MIF抗體處理對(duì)γc表達(dá)的影響。抗MIF mAb處理有腫瘤的小鼠能夠顯著提高γc鏈的表達(dá)，不過(guò)，與用對(duì)照IgG處理的腫瘤動(dòng)物相比，抗MIF mAb處理對(duì)CD8+T細(xì)胞的IL-2受體的α或β亞基的表達(dá)沒(méi)有影響(圖6)。
抗MIF抗體促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向腫瘤組織遷移并且增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞特異性的抗腫瘤活性。為了進(jìn)一步證明抗MIF mAb在體內(nèi)的抗腫瘤效果歸因于T細(xì)胞的特異性效果，實(shí)驗(yàn)研究了抗MIF抗體處理對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤的影響。對(duì)照或者EG.7腫瘤小鼠用抗MIF抗體或者對(duì)照IgG處理7天，收集未分級(jí)的脾細(xì)胞或者純化的CD8+T細(xì)胞，并用PKH-26標(biāo)記。標(biāo)記的未分級(jí)的脾細(xì)胞或者純化的CD8+T細(xì)胞遷移到EG.7腫瘤受體鼠中。24小時(shí)后切取腫瘤組織并進(jìn)行冷凍切片處理，用熒光顯微鏡對(duì)進(jìn)入到受體鼠腫瘤中的PKH-26標(biāo)記供體細(xì)胞進(jìn)行定量(分別為圖7A和7B)。實(shí)驗(yàn)表明，從抗MIF mAb處理的小鼠得到的脾細(xì)胞或者純化的CD8+T細(xì)胞進(jìn)入荷瘤小鼠腫瘤組織中的數(shù)量大于(增加了≥2倍)對(duì)照mAb處理的腫瘤小鼠。
最后，檢測(cè)了繼承性遷移的CD8+細(xì)胞(來(lái)自于抗MIF mAb處理的動(dòng)物)在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。從抗MIF mAb或者對(duì)照IgG處理的EG.7腫瘤供體小鼠中分離得到的5百萬(wàn)個(gè)未分級(jí)脾細(xì)胞或者純化的CD8+脾T細(xì)胞(圖7C)，將這些細(xì)胞遷移到24小時(shí)前用EG.7腫瘤細(xì)胞s.c.注射過(guò)的小鼠中。連續(xù)2周檢測(cè)腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀況。如圖7C所示，從用抗MIF抗體處理的有腫瘤小鼠中得到CD8+T細(xì)胞并繼承性遷移到未經(jīng)處理的有腫瘤小鼠中后，受體小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制。與此相反，和用對(duì)照IgG處理的腫瘤小鼠相比，用抗MIF處理的腫瘤小鼠中得到未分級(jí)脾細(xì)胞(5×106個(gè)細(xì)胞，含有CD4+和CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞)遷移后腫瘤重量沒(méi)有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明在繼承性遷移實(shí)驗(yàn)中，需要從抗MIF抗體處理的腫瘤動(dòng)物中得到的一定數(shù)量的CD8+T細(xì)胞對(duì)有效介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用具有重要性。
至此，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和細(xì)節(jié)進(jìn)行了完全描述(附參考文獻(xiàn))，只要未偏離本發(fā)明的精神和范圍任何改變和修正都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
參考文獻(xiàn)1.Metz等，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)方面的作用，(Adv.Immunol.)，66，197-223(1997)。
2.Bloom等，體外與延遲型高敏感性相關(guān)的反應(yīng)機(jī)制，科學(xué)(Science)，111，524(1966)。
3.David，體外延遲型高敏反應(yīng)淋巴細(xì)胞-抗原相互作用形成的無(wú)細(xì)胞物質(zhì)介導(dǎo)的作用，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，56，72(1966)。
4.Bernbagen等，MEP是Pituitaxy-Derived細(xì)胞因子，該因子可導(dǎo)致潛在致死性內(nèi)毒素血癥，自然雜志(Nature)365，756(1993)[出版排版錯(cuò)誤，Nature 1995 Nov 23，378(6555)419]。
5.Calandra等，巨噬細(xì)胞是一種重要的以前沒(méi)有認(rèn)識(shí)到的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子來(lái)源，J.Exp.Med 179，1895(1994)。
6.Calandra等，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子是一種重要的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌外毒素免疫細(xì)胞激活介導(dǎo)物，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A)，95，11383(1998)。
7.Calandra等，中和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子防止發(fā)生敗血性休克，自然雜志醫(yī)學(xué)刊(Nat.Med.)，6，164(2000)。
8.Bacher等，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在T細(xì)胞激活中的重要調(diào)節(jié)作用，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，93，7849(1996)。
9.Chesney等，巨噬細(xì)胞遷移因子(MIF)在血管生成和鼠淋巴瘤生長(zhǎng)方面的重要作用，分子醫(yī)學(xué)(Mol.Med.)，5，181(1999)。
10.Shimizu等，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在人黑色素瘤中的高表達(dá)和它在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成方面的作用，Biochem.Biophys.Rss.Commun.，264，751(1999)。
11.Moore等，抗原加工和遞呈中可溶性蛋白進(jìn)入I型通路，細(xì)胞(Cell)，54，777(1988)。
12.Bendrat等，酶激活巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的生物化學(xué)和突變研究，生物化學(xué)(Biochemistry)，36，15356(1997)。
13.Bernhagen等，鼠和人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的(MIF)的純化、生物活性和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，生物化學(xué)，33，14144(1994)。
14.Calandra等，MIF作為glueocorticoid誘導(dǎo)的產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑，自然雜志，377，68(1995)。
15.Ke等，用完全免疫弗氏佐劑和卵清白蛋白刺激細(xì)胞裂解反應(yīng)，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunal.)，25，549(1995)。
16.Hashimoto等，F(xiàn)as-Fas配體和穿孔素誘導(dǎo)的腫瘤凋亡主要介導(dǎo)了重組IL-18或者重組IL-12給藥的抗腫瘤效果差異，免疫學(xué)雜志(J.Immunol)，163583(1999)。
17.Taetle等，用異種移植裸鼠進(jìn)行臨床前藥物篩選檢測(cè)化學(xué)治療藥物對(duì)黑色素瘤和卵巢癌異種移植物的體內(nèi)活性，癌癥治療(cancer Treat Rep.，)，71，297(1987)18.Zou等，荷瘤小鼠中腫瘤抗原遞呈細(xì)胞功能累計(jì)性增加和腫瘤抗原反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞活性對(duì)應(yīng)性遞減，免疫學(xué)雜志，148648(1992)。
19.Rosenblatt-Velin等，在嵌和人皮膚/SCID鼠模型中，轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化人T淋巴細(xì)胞的皮膚遷移，(J.Invest.Dermatol.)，109，744(1997)。
20.Berngagen等，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在結(jié)核菌素延遲型高敏反應(yīng)中的重要作用，J.Exp.Med 183277(1996)。
21.Berke，G.等，CTL的死亡之吻，細(xì)胞，81，9(1995)。
22.Apte等，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子在抑制NK細(xì)胞活性和保留免疫特權(quán)中的作用，免疫學(xué)雜志。，160，5693(1998)。
23.Nelson等，白介素2受體的生物學(xué)，Adv.Immunol.，70，1-81，1(1998)。
24.Nelson等，白介素2受體的γC鏈膜近端區(qū)域足以激活Jak激酶活性和誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，細(xì)胞分子生物學(xué)(Mol.Cell.Biol)，16，309(1996)。
25.Nelson等，白介素2受體β和γ鏈細(xì)胞漿區(qū)域介導(dǎo)T細(xì)胞增殖信號(hào)。自然雜志，369，333(1994)。
26.Dai等，普通細(xì)胞因子受體γ鏈在IL1-2依賴性激活誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞死亡中的作用，免疫學(xué)雜志，163，3131(1999)。
27.Jager，E等，CTL定義的癌癥疫苗在激活微小殘余疾病干預(yù)免疫治療方面的前景，癌癥遷移研究(cancer Metastasis Rev)18，143(1999)。
28.Dunbar等，前沿適用于黑色素瘤收養(yǎng)性免疫治療的腫瘤特異性CTL快速克隆，免疫學(xué)雜志，162，6959(1999)。
29.Thurner，B等，用Mage-3A1肽脈沖成熟的疫苗，單核細(xì)胞來(lái)源的枝狀細(xì)胞擴(kuò)展特異細(xì)胞毒性T細(xì)胞和誘導(dǎo)IV黑色素瘤晚期某些代謝消退，J.Exp.Med.，1901669(1999)。
30.Yamasaki等，白介素2和干擾素對(duì)小鼠惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的協(xié)同免疫調(diào)節(jié)效果，癌癥研究(Cancer Res)，48，2981(1988)。
31.Renauld等，接受信號(hào)免疫細(xì)胞裂解性T細(xì)胞反應(yīng)要求白介素1和白介素6雙調(diào)節(jié)，免疫學(xué)雜志，143，1894(1989)。
32.Smyth等，白介素2和白介素6協(xié)同提高孔形成蛋白基因表達(dá)和人外周血T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，免疫學(xué)雜志，145，1159(1990)。
33.Kasper等，白介素7刺激小鼠針對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體、鼠弓形蟲(chóng)產(chǎn)生保護(hù)性免疫，免疫學(xué)雜志，155，4798(1995)。
34.Chen等，白介素10一種新型的細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化因子，免疫學(xué)雜志，147，528(1991)。
35.Gately等，對(duì)正常小鼠進(jìn)行重組白介素給藥，在體內(nèi)提高細(xì)胞裂解淋巴細(xì)胞活性并且誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ，Int.Inmunol，6，157(1994)。
36.Gately等，用白介素12調(diào)節(jié)人細(xì)胞裂解性淋巴細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞免疫學(xué)(Cell Immunol)，143；127(1992)。
37.Mehrotra等，白介素12激活人CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，免疫學(xué)雜志，151，2444(1993)。
38.Ciolli等，對(duì)高遷移Friend白血病細(xì)胞注射小鼠進(jìn)行白介素1和白介素2聯(lián)合給藥治療宿主抗腫瘤機(jī)制和確定遷移的標(biāo)記作用，J.Exp.Med，173313(1991)。
39.Rosenberg等，系統(tǒng)性高劑量重組白介素2給藥介導(dǎo)的肺遷移和皮下腫瘤的消退，J.Exp.Med，161，1169(1985)。
40.Nastala等，重組白介素2給藥影響IFNγ產(chǎn)生并誘導(dǎo)腫瘤消退，免疫學(xué)雜志，1531697(1994)。
41.Hashimoto等，在小鼠肝中白介素2介導(dǎo)TCR誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性NK1.1Ag+αβT細(xì)胞，免疫學(xué)雜志，1544333(1995)。
42.Brunda等，白介素12抗腫瘤藥物的鼠模型，Ann.N.Y Acad.Sci.，795，266-274，266(1996)。
43.Brunda等，腫瘤定位(TumorLlocation)對(duì)重組干擾素α或者γ抗腫瘤效果的影響，Int.J.Cancer，40，807(1987)。
44.Sayers等，干擾素α和干擾素γ體內(nèi)體外對(duì)鼠腎癌(Renca)的抗腫瘤效果，癌癥研究，50，5414(1990)。
45.Giovarelli等，干擾素激活體內(nèi)腫瘤抑制，低量干擾素γ通過(guò)誘導(dǎo)宿主系統(tǒng)性免疫反應(yīng)抑制腫瘤生長(zhǎng)，Int.J.Cancet，37，141(1986)。
46.Mule等，重組腫瘤壞死因子α對(duì)小鼠內(nèi)臟部位肉瘤的抗腫瘤效果腫瘤大小影響治對(duì)治療藥物的反應(yīng)，Cancer ImmunolImmunother，26，202(1988)。
47.Good等，白介素2和白介素4通過(guò)CD8-CD4脾淋巴細(xì)胞能夠共調(diào)節(jié)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞，免疫學(xué)(Immunology)，67225(1989)。
48.Yamashita等，白介素4對(duì)人抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞緊密誘導(dǎo)的抑制活性，Jpn.J.Cancer Res.，82，585(1991)。
49.Jin等，TGfβ下調(diào)TLiSA1表達(dá)并抑制前體淋巴細(xì)胞分化成CTL和LAK細(xì)胞，免疫學(xué)，66，570(1989)。
50.Erard等，CD8T細(xì)胞轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生TH2細(xì)胞因子和輔助B細(xì)胞的非細(xì)胞裂解CD8-CD4細(xì)胞，科學(xué)(Science)，260，1802(1993)。
51.Croft等，極化抗原特異性CD8效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生白介素4和白介素12相互作用相對(duì)1型促進(jìn)2型細(xì)胞因子的活性，J.Exp.Med.，180，1715(1994)。
52.Noble等，IFNγ和白介素4調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞生長(zhǎng)和分化成產(chǎn)生不同細(xì)胞因子的亞群，免疫學(xué)雜志，155，2928(1995)。
53.Takahashi等，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)和腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制的關(guān)系，分子醫(yī)學(xué)(Mol.Med).，4，707(1998)。
54.Meyer-Siegler等，在前列腺癌遷移中巨噬細(xì)胞遷移抑制因子表達(dá)提高，泌尿?qū)W(Urology)，48，448(1996)。
55.Rees等，腫瘤調(diào)節(jié)適應(yīng)性和天然抗腫瘤反應(yīng)中MHC的選擇性表達(dá)(見(jiàn)評(píng)論)，癌癥免疫學(xué)治療(CancerImmunol.Immunother)，48，374(1999)。
56.Hahne等，F(xiàn)as(Apo-1/CD95)配體在黑色素瘤中的表達(dá)與腫瘤免疫逃避的關(guān)系，(見(jiàn)評(píng)論，)科學(xué)，274，1363(1996)。
57.Strand等，免疫逃避的一種機(jī)制CD95(APO-I/Fas)配體表達(dá)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，(見(jiàn)評(píng)論)Nat.Med.，2，1361(1996)。
58.Chappell等，人黑色素瘤細(xì)胞不能表達(dá)Fas(Apo-I/CD95配體)，癌癥研究，59，59(1999)。
59.Arai等，F(xiàn)as配體基因轉(zhuǎn)化導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤消退，美國(guó)科學(xué)院院刊，94，13862(1997)。
60.Kang等，胰島和多細(xì)胞系表達(dá)Fas表達(dá)配體造成嗜中性排斥加速，移植進(jìn)展(Transplant.Proc.)，30，538(1998)。
61.Seino等，F(xiàn)as配體對(duì)心臟異體移植的排斥，Int.Immunol.，8，1347(1996)。
62.Seino等，F(xiàn)as配體表達(dá)對(duì)移植物的排斥反應(yīng)，移植進(jìn)展，29，1092(1997)。
63.Allison等，胰島β細(xì)胞表達(dá)CD95配體轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)粒細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)，但未產(chǎn)生胰(同種)異基因移植物免疫特權(quán)(見(jiàn)評(píng)論)美國(guó)科學(xué)院院刊，94，3943(1997)。
64.Liu等，皮質(zhì)甾類對(duì)哮喘病中白介素5和嗜酸性粒細(xì)胞基因表達(dá)的抑制效果，Chung.Hua.Nei.Ko.Tsa.Chih.35，231(1996)。
65.Thor等，黑色素瘤T細(xì)胞原位雜交(見(jiàn)評(píng)論)，癌癥免疫治療，48，386(1999)。
66.Hudson等，一種proinflammatory細(xì)胞因子抑制p53腫瘤抑制活性(見(jiàn)評(píng)論)，J.Exp.Med.，190，1375(1999)。
67.Matsumura等，I類MHC分子對(duì)肽類抗體的識(shí)別表現(xiàn)出重要作用，(見(jiàn)評(píng)論)，科學(xué)，257，927(1992)。
權(quán)利要求
1.制備細(xì)胞的方法，該細(xì)胞可作為癌癥療法對(duì)癌癥患者給藥，該方法包括在MIF拮抗劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該MIF拮抗劑選自抗MIF抗體、MIF反義cDNA、和MIF配體受體結(jié)合的拮抗劑。
3.制備細(xì)胞的方法，該細(xì)胞可作為癌癥療法對(duì)癌癥患者給藥，該方法包括在MIF抗體存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中抗MIF抗體為單克隆抗體。
5.權(quán)利要求4的方法，中抗MIF單克隆抗體選自人單克隆抗體、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和單鏈單克隆抗體。
6.制備細(xì)胞組合物的方法，其包括在(a)至少一種腫瘤抗原和(b)抗MIF抗體存在的條件下孵育該組合物中的細(xì)胞，該細(xì)胞組合物可作為癌癥療法給癌癥患者給藥。
7.制備自體同源性細(xì)胞的方法，其包括在一種試劑存在的情況下孵育該細(xì)胞的步驟，所述試劑包括抗MIF抗體、其MIF結(jié)合片段或者這兩種試劑的混合物，該自體同源性細(xì)胞可作為癌癥療法對(duì)癌癥患者給藥。
8.制備自體同源性細(xì)胞的方法，其包括在(a)至少一種腫瘤抗原和(b)試劑存在的情況下孵育該細(xì)胞的步驟，所述試劑包括抗MIF抗體、其MIF結(jié)合片段或者這兩種試劑的混合物，該自體同源性細(xì)胞可作為癌癥療法對(duì)癌癥患者給藥。
9.權(quán)利要求7的方法，其中自體同源細(xì)胞包括免疫細(xì)胞。
10.權(quán)利要求7的方法，其中自體同源細(xì)胞包括T細(xì)胞。
11.權(quán)利要求7的方法，其中自體同源細(xì)胞包括CD8+細(xì)胞。
12.可作為癌癥療法對(duì)癌癥患者給藥的細(xì)胞組合物，其包括用抗MIF抗體孵育的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞組合物，其中用抗MIF抗體孵育的細(xì)胞也用至少一種腫瘤抗原孵育。
14.權(quán)利要求12的細(xì)胞組合物，其中用抗MIF抗體孵育是離體進(jìn)行的。
15.權(quán)利要求12的細(xì)胞組合物，其與未結(jié)合的抗MIF抗體相分離。
16.權(quán)利要求13的細(xì)胞組合物，其與未結(jié)合的抗MIF抗體及未結(jié)合的腫瘤抗原相分離。
17.權(quán)利要求13的細(xì)胞組合物，其中該細(xì)胞含有免疫細(xì)胞。
18.權(quán)利要求13的細(xì)胞組合物，其中該細(xì)胞含有T細(xì)胞。
19.權(quán)利要求13的細(xì)胞組合物。其中該細(xì)胞含有CD8+細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)調(diào)節(jié)CTL活性的表達(dá)。在EL4腫瘤鼠模型中，來(lái)自于原發(fā)腫瘤鼠的培養(yǎng)的脾細(xì)胞在體外經(jīng)抗原刺激后能夠高水平分泌MIF。與單克隆抗體處理的對(duì)照細(xì)胞組相比，用抗MIF單克隆抗體中和處理后，平行脾細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的CTL反應(yīng)顯著增強(qiáng)，同時(shí)IFNγ表達(dá)水平上調(diào)。腫瘤組織學(xué)研究表明，用抗MIF抗體處理動(dòng)物后，其CD文檔編號(hào)A61K48/00GK1842346SQ02805080
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2002年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月12日
發(fā)明者R·阿部, R·布卡拉, C·梅茨 申請(qǐng)人:塞托凱恩藥物科學(xué)公司