專利名稱：多價腦膜炎球菌多糖－蛋白質(zhì)綴合疫苗的制作方法
本申請要求美國臨時專利申請?zhí)?0/263,435(2001年1月23日提交)的權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來說涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且更具體地，本發(fā)明涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)、疫苗以及通過免疫對細(xì)菌病原體感染的預(yù)防。
相關(guān)領(lǐng)域概述腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)是全球細(xì)菌性腦膜炎和膿毒癥的主要原因。在最近的30年中，地方性腦膜炎球菌疾病的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家為每100,000人中有1到5人，而在發(fā)展中國家為每100,000人中10到25人(Reido，F(xiàn).X.等人，1995)。流行期間腦膜炎球菌疾病的發(fā)病率可達(dá)每1000,000人中1,000人。在美國每年大約有2,600例細(xì)菌性腦膜炎病例，而在發(fā)展中國家平均有330,000例。病例致死率在10到20％之間。
病原腦膜炎球菌被多糖莢膜所包被，附著在生物體外膜表面?；谇v膜多糖的免疫學(xué)特異性，已經(jīng)鑒定出13種不同的腦膜炎球菌血清型(Frasch，C.E.等人，1985)。這13個血清型中的5個引起了大部分腦膜炎球菌疾??；它們包括血清型A、B、C、W135和Y。血清型A引起大部分流行性疾病。血清型B、C和Y引起大多數(shù)地方性疾病和疾病的區(qū)域性爆發(fā)。
人類鼻口咽粘膜是唯一已知的腦膜炎奈瑟氏球菌的天然貯庫。細(xì)菌在粘膜細(xì)胞的外表面以及鼻咽的上皮下組織定居。腦膜炎球菌可被持續(xù)攜帶幾個月，腦膜炎球菌通過直接接觸或通過空氣飛沫傳播。腦膜炎球菌是以吞噬泡的形式通過胞吞作用經(jīng)由粘膜上皮侵入的。對入侵的腦膜炎球菌的宿主防御依賴于補體介導(dǎo)的溶菌作用。在補體介導(dǎo)的溶菌作用中發(fā)揮作用的血清抗體相當(dāng)大部分直接針對外部莢膜多糖。
基于腦膜炎球菌多糖的疫苗已經(jīng)被描述，其引起針對莢膜多糖的免疫應(yīng)答。這些抗體可以對血清型特異性腦膜炎球菌引起補體介導(dǎo)的溶菌作用。腦膜炎球菌多糖疫苗顯示對兒童和成人有效(Peltola，H.等人，1977以及Artenstein，M.S.等人，1970)，但對于嬰兒和幼兒其效能有限(Reingold，A.L.等人，1985)。對年幼群體，此多糖的后繼給藥產(chǎn)生弱加強(qiáng)應(yīng)答或無加強(qiáng)應(yīng)答(Goldschneider，I.等人，1973以及Gold，R.等人，1977)。腦膜炎球菌多糖疫苗的保護(hù)期不能持續(xù)很長，并且據(jù)估計對成人和大于4歲的兒童而言為3到5年(Brandt，B.等人，1975，Kyhty，H.等人，1980以及Ceesay，S.J.等人，1993)。對1至4歲的兒童而言保護(hù)期少于3年(Reingold，A.L.等人，1985)。
多糖不能與主要組織相容性復(fù)合體分子結(jié)合，而這是抗原呈遞和刺激T-輔助淋巴細(xì)胞的前提條件，也即它們是非T-細(xì)胞依賴性抗原。多糖能夠不需T-輔助淋巴細(xì)胞的輔助而刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。由于對B淋巴細(xì)胞的非T-細(xì)胞依賴性刺激，這些抗原免疫后缺乏記憶誘導(dǎo)。在成人體內(nèi)，多糖抗原可以產(chǎn)生非常有效的非T-細(xì)胞依賴性應(yīng)答，但在嬰兒和幼兒的不成熟免疫系統(tǒng)中這些非T-細(xì)胞依賴性應(yīng)答卻很弱。
非T-細(xì)胞依賴性多糖抗原可以通過將多糖共價連接至蛋白質(zhì)分子(“載體”或“載體蛋白質(zhì)”)上而轉(zhuǎn)變?yōu)門-細(xì)胞依賴性抗原。與綴合疫苗的多糖組分結(jié)合的B細(xì)胞可以被肽特異的T輔助細(xì)胞激活，所述肽為綴合的載體蛋白質(zhì)的一部分。對載體蛋白質(zhì)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答可以增加針對多糖的抗體的產(chǎn)生。
已證明，血清型B多糖在人群中具有極弱的免疫原性至無免疫原性(Wyle，F(xiàn).A.等人，1972)。這一血清型多糖與蛋白質(zhì)的化學(xué)連接在實驗動物中沒有顯著改變免疫應(yīng)答(Jennings，H.J.等人，1981)。據(jù)認(rèn)為，對這一血清型多糖缺乏免疫應(yīng)答的原因是血清型B多糖與多唾液酸化的宿主糖蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性，所述宿主糖蛋白例如神經(jīng)細(xì)胞粘附分子。
一種基于血清型C多糖的腦膜炎球菌綴合疫苗已有敘述。這種單價疫苗可引起針對相應(yīng)于血清型C的腦膜炎奈瑟氏球菌株系上存在的莢膜多糖的強(qiáng)功能性抗體應(yīng)答。這種疫苗僅僅能夠防止由血清型C細(xì)菌引起的疾病。
現(xiàn)有的基于腦膜炎球菌多糖的疫苗對幼兒的用途有限，而且不能為成人提供長時間保護(hù)。已被證實能夠?qū)λ杏形ｋU感染腦膜炎球菌的群體(包括兒童)產(chǎn)生長時間保護(hù)的唯一腦膜炎球菌疫苗是基于來源于單一腦膜炎奈瑟氏球菌血清型的多糖的疫苗，其不能提供針對其它血清型感染的保護(hù)。因此，就需要一種能夠在腦膜炎球菌感染的易感兒童和成人中對腦膜炎球菌疾病產(chǎn)生廣譜、長效保護(hù)的腦膜炎球菌綴合疫苗。本發(fā)明的多價腦膜炎球菌多糖通過提供疫苗制劑解決了這一需要，其中在所述制劑中來源于腦膜炎奈瑟氏球菌主要致病血清型的免疫原性多糖通過與載體蛋白質(zhì)綴合而轉(zhuǎn)變成T-細(xì)胞依賴性抗原。
發(fā)明概述本發(fā)明提供由病原性腦膜炎奈瑟氏球菌制備的腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)綴合物的免疫學(xué)組合物，其可用于治療疾病。
本發(fā)明提供包含有兩種或多種蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫學(xué)組合物，其中每一綴合物各包含有連接至載體蛋白質(zhì)的來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
本發(fā)明提供包含有兩種或多種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫學(xué)組合物，其中每一綴合物各包含有連接至載體蛋白質(zhì)的來源于腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清型的莢膜多糖。
本發(fā)明提供由病原性腦膜炎奈瑟氏球菌制備的腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)綴合物的疫苗。本發(fā)明提供多價腦膜炎球菌疫苗，其由免疫學(xué)有效量的2到4種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物組成，其中每一綴合物各包含有不同的連接至載體蛋白質(zhì)的莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y的莢膜多糖。
本發(fā)明也提供制備多價腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)組合物的方法，其包括從病原性腦膜炎奈瑟氏球菌中純化兩種或多種莢膜多糖；將純化的多糖與一種或多種載體蛋白質(zhì)綴合，以及混合這些綴合物以產(chǎn)生多價腦膜炎球菌多糖-蛋白質(zhì)組合物。
本發(fā)明還提供誘導(dǎo)對腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫學(xué)應(yīng)答的方法，其包括給人類或動物施用免疫學(xué)有效量的本發(fā)明免疫學(xué)組合物。
本發(fā)明提供多價腦膜炎球菌疫苗，其由免疫學(xué)有效量的2到4種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物組成，其中每一綴合物各含有不同的連接至載體蛋白質(zhì)的莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y的莢膜多糖。
本發(fā)明提供保護(hù)腦膜炎奈瑟氏球菌易感人群或動物的方法，其包括向人類或動物施用免疫學(xué)有效劑量的本發(fā)明疫苗。
于此引用的所有專利、專利申請以及其它出版物特此全面引入作為參考。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括具有兩種或多種不同的蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫學(xué)組合物，其中每一綴合物各包含有一種連接至載體蛋白質(zhì)的莢膜多糖。因此，本發(fā)明包括含有兩種或多種不同莢膜多糖的組合物，其中所述英膜多糖被連接至一種或多種載體蛋白質(zhì)上。
莢膜多糖可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備(參考文獻(xiàn))。在本發(fā)明中莢膜多糖優(yōu)選制備自腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y。
在優(yōu)選的實施方案中，這些腦膜炎球菌血清型綴合物分別制備然后配制成單一劑量形式。例如，從腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y分別純化莢膜多糖。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，純化的多糖在連接至載體蛋白質(zhì)前被解聚并活化。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中利用溫和氧化條件將來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y的英膜多糖部分解聚。
在解聚或部分解聚多糖后可以接著進(jìn)行活化步驟，“活化”是指對多糖進(jìn)行化學(xué)處理以提供能夠與載體蛋白質(zhì)反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。優(yōu)選的活化方法包括在15到30℃、pH 5.0±0.1下于生理鹽水中利用己二酸二酰肼處理約2小時。在美國專利5,965,714中描述了一種活化方法。
一經(jīng)活化，莢膜多糖就可以被連接至一種或多種載體蛋白質(zhì)上。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，每一種莢膜多糖分別與單一載體蛋白質(zhì)種類連接。在優(yōu)選的實施方案中將來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y的莢膜多糖分別連接至同一種載體蛋白質(zhì)上。
載體蛋白質(zhì)可以包括失活的細(xì)菌毒素，例如白喉類毒素、CRM197、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST以及來源于銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。也可以使用細(xì)菌外膜蛋白，例如外膜復(fù)合體c(OMPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)。其它蛋白質(zhì)如卵清蛋白、匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白或純化的結(jié)核菌素蛋白質(zhì)衍生物(PPD)也可以作為載體蛋白質(zhì)使用。載體蛋白質(zhì)優(yōu)選無毒、無反應(yīng)原性，并且可得到足夠的量和純度。載體蛋白質(zhì)應(yīng)易于接受標(biāo)準(zhǔn)連接程序的處理。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，純化自白喉棒桿菌(Corynebacteria diphtheriae)培養(yǎng)物并利用甲醛化學(xué)去毒的白喉毒素被用作載體蛋白質(zhì)。
莢膜多糖與載體蛋白質(zhì)綴合后，可以利用多種技術(shù)對多糖-蛋白質(zhì)綴合物進(jìn)行純化(富集，就多糖-蛋白質(zhì)綴合物的量而言)。純化步驟的一個目的是從多糖-蛋白質(zhì)綴合物中去除未結(jié)合的多糖。美國專利6,146,902上描述了一種涉及在硫酸銨存在下進(jìn)行超濾的純化方法?；蛘?，可以通過任意數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從未反應(yīng)的蛋白質(zhì)和多糖中將綴合物純化出來，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括大小排阻層析、密度梯度離心、疏水相互作用層析或硫酸銨分級分離等。參見，例如P.W.Anderson等人(1986)，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1371181-1186。也見于H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1271011-1018。
在將多糖與載體蛋白質(zhì)綴合后，本發(fā)明免疫學(xué)組合物可以通過混合多種多糖-蛋白質(zhì)綴合物而制成。本發(fā)明免疫學(xué)組合物包含兩種或多種連接至1種或多種載體蛋白質(zhì)上的不同莢膜多糖。本發(fā)明優(yōu)選實施方案為二價免疫學(xué)組合物，其包含分別連接至白喉類毒素上的來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A和C的英膜多糖。更優(yōu)選地，本發(fā)明為四價免疫學(xué)組合物，其包含分別連接至白喉類毒素上的來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
載體蛋白質(zhì)的制備和使用，以及多種潛在連接方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。本發(fā)明綴合物可以通過這些技術(shù)人員利用本發(fā)明所講授以及在一般文獻(xiàn)上可輕易得到的信息來制備。也可自以下任一或全部美國專利中獲得指導(dǎo)，其中這些專利的教導(dǎo)在此全部引用作為參考U.S.4,356,170；U.S.4,619,828；U.S.5,153,312；U.S.5,422,427和U.S.5,445,817。
本發(fā)明免疫學(xué)組合物通過從不同的腦膜炎球菌血清型分別制備多糖-蛋白質(zhì)綴合物然后將綴合物混合而制得。本發(fā)明免疫學(xué)組合物可以作為疫苗使用。本發(fā)明疫苗的配制可以利用本領(lǐng)域已知方法完成。本發(fā)明疫苗組合物還可以包含一種或多種佐劑。佐劑包括(作為例子而不限于此)鋁佐劑、弗氏佐劑、BAY、DC-chol、pcpp、單磷酰脂A、CpG、QS-21、霍亂毒素和甲酰甲硫氨酰肽。參見例如疫苗設(shè)計，亞單位與佐劑方法(Vaccine Design，the Subunit and Adjuvant Approach)，1995(M.F.Powell和M.J.Newman編輯，Plenum出版社，紐約)。佐劑優(yōu)選為鋁佐劑，如氫氧化鋁或磷酸鋁。
如下所述，本發(fā)明疫苗和免疫學(xué)組合物在多種動物模型中引起類似T-細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答，而多糖疫苗引起類似非T-細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明組合物也可用于研究在類似T-細(xì)胞依賴性的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原免疫應(yīng)答中涉及的生物學(xué)路徑和過程。
施用于人或動物的本發(fā)明疫苗的量以及施用方案可以按照藥學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定，并在確定時考慮到諸如所用具體抗原、佐劑(如果存在)、年齡、性別、體重、物種和特定動物或患者的狀況以及施用路徑等因素。在本發(fā)明中，對于接種以對抗腦膜炎奈瑟氏球菌，可提供有效劑量的多糖-蛋白質(zhì)載體量可以從每公斤體重約0.02μg到約5μg。在本發(fā)明優(yōu)選的組合物和方法中，劑量為每公斤體重約0.1μg到3μg。例如，如果感染后時間不長，由于細(xì)菌增殖時間較短，有效劑量可以需要較少的抗體。同樣，有效劑量依賴于診斷時的細(xì)菌負(fù)載量。對于治療使用，可考慮在一段時期內(nèi)施與多次注射。
本發(fā)明的多價綴合物可以以單一劑量或以系列(即以“加強(qiáng)”或“幾次加強(qiáng)”)形式施用。例如，就象目前針對預(yù)防兒童疾病的其它疫苗所推薦的那樣，兒童可以在生命早期接受單一劑量，此后不超過10年接受加強(qiáng)劑量。
加強(qiáng)劑量可使致敏B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，即回憶應(yīng)答。也就是說，多價綴合物疫苗與得到批準(zhǔn)的多糖疫苗相比，可在年幼群體中引起高的初次(即在疫苗的單次施用后)功能抗體應(yīng)答，而且還能夠引起回憶應(yīng)答(即在加強(qiáng)施用后)，這表明由本發(fā)明的多價綴合疫苗所引起的保護(hù)性免疫應(yīng)答具長效性。
本發(fā)明組合物包括經(jīng)孔道例如口腔、鼻腔、肛門、陰道、經(jīng)口、胃內(nèi)、粘膜(包括經(jīng)舌、肺泡、牙齦、鼻或呼吸道粘膜)等等施用的液體制劑，諸如混懸液、糖漿或酏劑；以及經(jīng)腸胃外、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈施用(例如注射施用)的制劑，諸如無菌混懸劑或乳劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)和腸胃外施用。這些組合物可以與適當(dāng)?shù)妮d體、稀釋劑或賦形劑諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等等混和。組合物也可以被凍干。按照所期望的施用路徑和制劑形式，組合物可以包含諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、膠凝劑或粘度增強(qiáng)添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、色素等等輔料?？梢栽诓恍柽^多實驗的前提下參考標(biāo)準(zhǔn)教科書(例如在此引用作為參考的Remington藥物科學(xué)，17版，1985)來制備適宜的制劑。
本發(fā)明組合物可以以液體制劑的形式方便地提供，所述液體制劑例如等滲水溶液、混懸液、乳液或粘性組合物，其可以被緩沖至選定的pH。如果優(yōu)選消化道吸收，本發(fā)明組合物可以為藥丸、片劑、膠囊、囊片等等“固體”形式，包括緩釋或液體填充型“固體”制劑(例如以明膠包裹液體，由此明膠在胃中溶解用于在消化道中實現(xiàn)遞送)。如果希望鼻腔或呼吸道(粘膜)施用，組合物可以通過壓力噴霧給藥器、泵給藥器或氣霧給藥器施用。氣溶膠通常借助碳?xì)浠衔镌趬毫ο滦纬?。泵給藥器優(yōu)選按計量分配劑量或分配具有特定微粒大小的劑量。
液體制劑通常較凝膠、其它粘性組合物和固體組合物更易制備。另外，液體組合物多少可以更方便地在動物、兒童(尤其是幼兒)和其它可能在吞咽藥丸、片劑、膠囊等等方面有困難的個體上施用，尤其是通過注射或口服方式。在多劑量給藥情況下液體組合物也更方便。另一方面，可以將粘性組合物配制在適當(dāng)?shù)恼承苑秶鷥?nèi)以提供與粘膜(諸如胃或鼻粘膜的內(nèi)襯)的更長接觸時間。
明顯地，適當(dāng)?shù)妮d體和其它添加劑的選擇依賴于確切的施用路徑和特定劑型的性質(zhì)，例如液體劑型(例如是否組合物被配制成溶液、懸液、凝膠或其它液體形式)或固體劑型(例如是否組合物被配制成藥丸、片劑、膠囊、囊片、緩釋劑或液體填充形式)。
溶液、懸液和凝膠除含有活性成分之外通常含有大量的水(優(yōu)選純化的水)。也可以存在小量的其它成分，如pH調(diào)節(jié)劑(例如堿，諸如NaOH)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、膠凝劑(例如甲基纖維素)、色素和/或調(diào)味劑。組合物可以為等滲的，即它可以具有與血液和淚液相同的滲透壓。
本發(fā)明組合物所期望的等滲性可以利用酒石酸鈉、丙二醇或其它無機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)實現(xiàn)。尤其對含有鈉離子的緩沖劑而言，優(yōu)選使用氯化鈉。
組合物粘度可以利用藥學(xué)可接受的增稠劑來維持選定水平。優(yōu)選甲基纖維素，因為其可以容易并經(jīng)濟(jì)的得到，而且應(yīng)用簡單。其它合適的增稠劑包括，例如黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等等。增稠劑的優(yōu)選濃度依賴于所選試劑。要點是使用可達(dá)到所選粘度的量。粘性組合物通常通過向溶液中添加這些增稠劑制備。
藥學(xué)可接受防腐劑可被利用以延長組合物的保存期。苯甲醇是適宜的，但也可以使用各種防腐劑，包括例如對羥苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨。防腐劑的合適濃度為基于總重的0.02％到2％，但根據(jù)所選試劑可以有明顯變動。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本組合物所選組分與腦膜炎奈瑟氏球菌多糖-蛋白質(zhì)載體綴合物之間必須為化學(xué)惰性的。
本發(fā)明將通過參考下列舉例說明性但非限制性實施例進(jìn)一步描述，所述實施例詳細(xì)闡明本發(fā)明概念的幾個優(yōu)選實施方案。本發(fā)明的其它實施例在不背離本發(fā)明精神的前提下為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯見。
實施例實施例1腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y的純化莢膜多糖粉末的制備制備粗糊狀物分別地，將腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y的凍存濕種子培養(yǎng)物融化并在液體Watson Scherp培養(yǎng)基的幫助下重構(gòu)，而后接種至含有Mueller Hinton瓊脂培養(yǎng)基的Blake瓶中。將Blake在CO2氣氛中35至37℃孵育15至19小時。孵育后，將生長物從Blake瓶中移出并加至4L含有Watson Scherp培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶在水平搖床上35至37℃孵育3至7小時。將4L瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至含有Watson Scherp培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中。發(fā)酵容器在35至37℃孵育7至12小時，其間加入補料和消泡劑并控制溶解氧含量和pH。孵育后，將發(fā)酵容器內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至500L大罐中，加入塞太弗倫(Cetavlon)，并且混和1小時。將塞太弗倫處理的生長物以每小時約30至70升的流速以約15,000至17,000g離心。利用第二次塞太弗倫沉淀將多糖粗品從上清中沉淀出來。向上清中加入塞太弗倫并將材料在室溫下混和至少1小時。將材料在1至5℃貯存8至12小時。以每分鐘300至400ml的流速，以約45,000至50,000g離心收集沉淀的多糖。收集的糊狀物在-60℃或更低的溫度下貯存直至進(jìn)一步處理。
純化多糖粉末的制備將未活化的糊狀物融化并轉(zhuǎn)移至攪拌器中。將糊狀物于0.9M氯化鈣中攪拌以產(chǎn)生均一懸液。將懸液以約10,000g離心15分鐘。將上清通過無棉絨墊潷析入容器作為第一提取物。向糊狀物加入第二體積的0.9M氯化鈣，并攪拌以產(chǎn)生均一懸液。懸液如上所述離心，且將上清與來自第一次提取的上清混和?？偣策M(jìn)行4次提取，并匯集上清。匯集的提取物通過利用10-30kDA MWCO螺旋形超濾裝置進(jìn)行超濾濃縮。
向濃縮液中加入氯化鎂，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2到7.5之間。向濃縮物中加入DNase和RNase，并于25到28℃混合孵育4小時。加乙醇至濃度為30到50％。通過10,000g離心2小時除去沉淀的核酸和蛋白質(zhì)。回收上清并通過將乙醇加至80％且于1-5℃靜置過夜使多糖沉淀。虹吸除去乙醇，并將沉淀的多糖10,000g離心5分鐘。用乙醇洗滌沉淀的多糖。用丙酮洗滌多糖，10,000g離心15至20分鐘。將多糖真空干燥。將初始多糖粉末溶入乙酸鈉溶液。向其中加入氯化鎂，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2到7.5之間。向溶液中加入DNase和RNase，并于25到28℃混合孵育4小時以去除殘余的核酸。在與這些酶孵育后，向多糖-酶混合物中加入等體積乙酸鈉-苯酚溶液，并置于1至5℃水平搖床中約30分鐘。混合物10,000g離心15至20分鐘。將上層水相回收并保存。向水相中加入等體積乙酸鈉-苯酚溶液，并按照如上所述提取。總共進(jìn)行4次提取以從多糖溶液中去除蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。合并的水相提取物用注射用水稀釋多達(dá)10倍，并對10倍體積注射用水超濾透析(diafilter)。向超濾透析后的多糖中加入氯化鈣。多糖通過加入乙醇至80％并于1至5℃過夜得以沉淀。棄掉乙醇上清，并通過10,000g離心15分鐘收集多糖。純化的多糖用乙醇洗滌兩次，并用丙酮洗滌一次。將洗滌后的粉末在干燥器中進(jìn)行真空干燥。干粉在-30℃或更低的溫度下貯存直至進(jìn)行綴合。
實施例2
從腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y中純化的莢膜多糖粉末的解聚本制備所用材料包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y的純化的莢膜多糖粉末(按照實施例1制備)、無菌50mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0)、無菌1N鹽酸、無菌1N氫氧化鈉、30％過氧化氫以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
對每一血清型多糖分別進(jìn)行反應(yīng)解聚。向一不銹鋼罐中裝入純化的莢膜多糖粉末多達(dá)60克。向多糖中加入無菌50mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0)至濃度為每升2.5g多糖。多糖溶液在1至5℃下混和12至24小時以實現(xiàn)溶解。將反應(yīng)罐與熱交換器相連。再加入一些50mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0)以稀釋多糖至每升1.25g的反應(yīng)濃度。將多糖溶液加熱至55℃±0.1。向反應(yīng)混合物中加入30％過氧化氫至其反應(yīng)濃度為1％。
反應(yīng)進(jìn)程通過隨反應(yīng)時間跟蹤多糖分子大小的變化來監(jiān)控。每隔15至20分鐘，取出等份反應(yīng)混和物試樣并注射至HPSEC柱以測量多糖的分子大小。當(dāng)多糖的分子大小到達(dá)目標(biāo)分子大小時，關(guān)閉加熱器并通過冰水浴循環(huán)將多糖溶液迅速冷卻至5℃。通過將反應(yīng)罐連接至裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器上，將解聚多糖溶液濃縮至每升15g。濃縮后的解聚多糖溶液對10倍體積無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)超濾透析。將解聚多糖在1至5℃貯存直至下一工序。
解聚多糖的分子大小的確定利用凝膠過濾層析柱及利用多角度激光光散射來進(jìn)行，所述凝膠過濾層析柱的商品名為“UltahydrogelTM250”，其利用葡聚糖分子大小標(biāo)準(zhǔn)來校準(zhǔn)。多糖的量對于血清型A通過磷含量而對于血清型C、W135和Y通過唾液酸含量來確定，其中所述磷含量測定利用Bartlet，G.R.J(1959)生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)，234，466-468頁的方法進(jìn)行，所述唾液酸含量測定利用Svennerholm，L.(1955)生物化學(xué)生物物理學(xué)報(Biochimica Biophysica Acta)24，604-611頁的方法進(jìn)行。O-乙?；康拇_定利用Hesterin，S.(1949)生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)，180，249頁的方法進(jìn)行。還原活性利用Park，J.T.和Johnson，M.J.(1949)生物化學(xué)雜志(Journal ofBiological Chemistry)，181，149-151頁所述方法確定。解聚多糖的結(jié)構(gòu)完整性由質(zhì)子1H和13C NMR確定。解聚多糖的純度通過測量LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余過氧化氫含量來確定。
實施例3腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y解聚多糖的衍生化本制備所用材料包括來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的過氧化氫解聚的血清型A、C、W-135和Y莢膜多糖(按照實施例2制備)、己二酸二酰肼、僅用于血清型A的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)、氰基硼氫鈉、無菌1N鹽酸、無菌1N氫氧化鈉、無菌1M氯化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
每一血清型多糖在分開的反應(yīng)中進(jìn)行衍生。向一不銹鋼罐中裝入純化的解聚多糖，并用無菌0.85％生理鹽水稀釋至終濃度為每升6g多糖。向此溶液中加入溶于無菌0.85％生理鹽水的濃縮的己二酸二酰肼至其反應(yīng)濃度為每升1g。僅對血清型A而言，加入溶于無菌0.85％生理鹽水的濃縮EDAC至其反應(yīng)濃度為每升1g。調(diào)節(jié)pH值至5.0±0.1，并利用無菌1N鹽酸和無菌1N氫氧化鈉在室溫下(15-30℃)維持此pH值2小時。2小時后，向此反應(yīng)混合物中加入溶于無菌0.85％生理鹽水的濃縮氰基硼氫鈉至其反應(yīng)濃度為每升2g。反應(yīng)在室溫下(15-30℃)攪拌44小時±4小時，并維持pH值5.5±0.5。此反應(yīng)期后，將pH值調(diào)至6.0±0.1，并且通過將反應(yīng)罐連接至裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器上，將衍生的多糖濃縮至每升12g多糖。濃縮后的衍生多糖對30倍體積的1M氯化鈉超濾透析，并緊接著對10倍體積的0.15M氯化鈉超濾透析。將反應(yīng)罐與超濾器分離，并在1至5℃貯存7天。將反應(yīng)罐與裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器重新連接，并對30倍體積的1M氯化鈉超濾透析，并緊接著對10倍體積的0.15M氯化鈉超濾透析。
使用在解聚多糖中所用的相同方法對衍生多糖的分子大小、多糖的量以及O-乙?；窟M(jìn)行測定。酰肼含量測定利用Snyder，S.L.和Sobocinski，P.Z.(1975)分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry)64，282-288頁的2，4，6-三硝基苯磺酸方法進(jìn)行。衍生多糖的結(jié)構(gòu)完整性由質(zhì)子1H和13C NMR確定。衍生多糖的純度通過測量未結(jié)合的酰肼的水平、LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余氰基硼氫化物含量來確定。
實施例4載體蛋白質(zhì)的制備粗白喉類毒素蛋白質(zhì)的制備將凍干的種子培養(yǎng)物進(jìn)行重構(gòu)并孵育16到18小時。取一份培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的0.5升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上34.5-36.5℃孵育7至9小時，從培養(yǎng)瓶取一份培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的4升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上34.5-36.5℃孵育14至22小時。用此4升搖瓶的培養(yǎng)物接種含有生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。將發(fā)酵罐在34.5-36.5℃孵育70至144小時。發(fā)酵罐內(nèi)容物通過深層濾器過濾至收集器中。向收獲物中加入37％甲醛溶液至其終濃度為0.2％。調(diào)節(jié)pH值到7.4-7.6。將收獲物通過0.2微米芯形濾器過濾至無菌20升瓶中。將瓶子在34.5-36.5℃條件下孵育7天。向每一20升瓶中加入37％甲醛溶液至其終濃度為0.4％。調(diào)節(jié)混合物pH值到7.4-7.6。將瓶子在搖床上、34.5-36.5℃條件下孵育7天。向每一20升瓶子中加入37％甲醛溶液至其終濃度為0.5％。調(diào)節(jié)混合物pH值到7.4-7.6。將瓶子在34.5-36.5℃條件下孵育8周。對此類毒素粗品進(jìn)行去毒測試。在測試期間瓶子于1至5℃貯存。
粗白喉類毒素蛋白質(zhì)的純化將類毒素粗品升至室溫，并將這些20升瓶的內(nèi)容物合并裝入純化罐。調(diào)節(jié)類毒素pH值至7.2-7.4，并向類毒素粗品中加入活性炭并混和2分鐘。將活性炭類毒素混合物靜置1小時，然后用芯形濾器過濾至第二個純化罐中。向濾液中加入固體硫酸銨至70％飽和度。調(diào)節(jié)pH值到6.8-7.2，并將溶液靜置16小時。過濾收集沉淀的蛋白質(zhì)，并用70％飽和硫酸銨溶液(pH 7.0)洗滌。沉淀溶解于無菌蒸餾水，并將蛋白質(zhì)溶液過濾至不銹鋼收集器中。調(diào)節(jié)pH值到6.8-7.2，并加入硫酸銨至40％飽和度。調(diào)節(jié)pH值到7.0-7.2，并將溶液靜置16小時。通過過濾去除并丟棄沉淀。將硫酸銨加入濾液至60％飽和度，并調(diào)節(jié)pH值到7.0-7.2。將混合物靜置16小時，并利用過濾收集沉淀的蛋白質(zhì)。沉淀溶解于無菌蒸餾水，過濾去除不溶的蛋白質(zhì)，并對0.85％生理鹽水超濾透析。
純化的白喉類毒素蛋白質(zhì)的濃縮和無菌過濾利用10,000MWCO再生纖維素濾柱，將蛋白質(zhì)溶液濃縮至15克/升并對10倍體積0.85％生理鹽水超濾透析。濃縮的蛋白質(zhì)溶液通過0.2微米濾膜過濾。蛋白質(zhì)溶液在1至5℃貯存直至進(jìn)行綴合。
蛋白質(zhì)濃度通過Lowry，O.H.等人(1951)生物化學(xué)雜志(Journal ofBiological Chemistry)193，265-275頁的方法確定。蛋白質(zhì)純度通過測定無菌度、LAL(內(nèi)毒素)含量和殘余甲醛含量確定。
實施例5制備腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y多糖與白喉類毒素蛋白質(zhì)的單價綴合物本制備所用材料包括來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y的己二酸衍生多糖(按照實施例3制備)、無菌白喉類毒素蛋白質(zhì)(按照實施例4制備)、EDAC、硫酸銨、無菌1N鹽酸、無菌1N氫氧化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％)。
每一血清型多糖綴合物分別通過反應(yīng)制備。所有的四種綴合物都通過下列方法制備。向一不銹鋼罐中裝入純化的己二酸衍生多糖(反應(yīng)濃度為700-1000μmol/L活性酰肼)以及純化的白喉類毒素蛋白質(zhì)(反應(yīng)濃度為3.8-4.0g/L蛋白質(zhì))。利用0.85％生理鹽水稀釋這些原料至目標(biāo)反應(yīng)濃度，并將pH調(diào)至5.0±0.1。向多糖蛋白質(zhì)混合物中加入EDAC至其反應(yīng)濃度為2.28-2.4g/L。反應(yīng)pH在15-30℃于5.0±0.1保持2小時。2小時后，利用無菌1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1，并將反應(yīng)物在1至5℃貯存16-20小時。
將反應(yīng)混合物升溫至15-30℃，并將反應(yīng)罐連接至裝備有30,000MWCO再生纖維素柱的超濾器上。加入固體硫酸銨至60％飽和度(對血清型A、W-135和Y而言)和50％飽和度(對血清型C而言)。綴合反應(yīng)混合物對20倍體積60％飽和度硫酸銨溶液(對血清型A、W-135和Y而言)和50％飽和度硫酸銨溶液(對血清型C而言)超濾透析，并緊接著對20倍體積0.85％生理鹽水超濾透析。超濾透析后的綴合物先通過含有1.2微米和0.45微米濾器的濾囊(filter capsule)過濾，然后再通過含有0.22微米濾器的濾囊過濾。
多糖的量和O-乙?；坷门c在解聚和衍生多糖中所用相同的方法測定。蛋白質(zhì)的量通過Lowry方法確定。綴合物的分子大小利用凝膠過濾層析柱來確定，所述凝膠過濾層析柱的商品名為“TSK6000PW”，其利用DNA作為空體積標(biāo)記物、ATP作為總體積標(biāo)記物以及牛甲狀腺球蛋白作為參考標(biāo)記物。另外，從TSK6000PW柱上洗脫的綴合物的分子大小通過多角度激光光散射測定。綴合物的抗原特性利用雙夾心ELISA方法，通過與抗多糖血清型特異性抗體的結(jié)合來測定。綴合物純度通過測定未結(jié)合(未綴合)多糖的量(通過在疏水相互作用層析柱上洗脫)、未綴合蛋白質(zhì)的量(利用毛細(xì)管電泳)、無菌度、LAL(內(nèi)毒素)含量、殘余EDAC含量以及殘余銨離子含量來確定。
實施例6多價腦膜炎球菌A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合疫苗的配制本制備所用材料包括血清型A、C、W-135和Y多糖-白喉類毒素綴合物(按照實施例5制備)、無菌100mM磷酸鈉緩沖的生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
向不銹鋼積聚罐(bulking tank)中的生理鹽水(0.85％)中加入一份無菌100-500mM磷酸鈉緩沖的生理鹽水以產(chǎn)生10mM磷酸鈉的最終疫苗濃度。向含有10mM無菌磷酸鈉生理鹽水的積聚罐中加入2到4種無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物各一份，生成每毫升緩沖液中含有每種血清型多糖各8μg的終濃度。將配制的四價綴合物混和并通過0.2μm濾器過濾至第二個積聚罐中。
多價制劑中每一種血清型多糖的量通過糖成分分析，使用脈沖電流檢測及高pH陰離子交換層析來確定。蛋白質(zhì)的量通過Lowry方法測定。疫苗的pH值利用連接至pH計的復(fù)合電極測定。多價綴合疫苗的抗原特性利用雙夾心ELISA方法，通過結(jié)合抗多糖血清型特異性抗體來測定。多價綴合疫苗的免疫原性通過測定在動物模型中疫苗的每一綴合物引起初次和加強(qiáng)抗多糖IgG免疫應(yīng)答的能力來確定。多價綴合疫苗的純度通過測定未結(jié)合(未綴合)多糖的量(利用脈沖電流檢測及高pH陰離子交換層析)，無菌度、LAL(內(nèi)毒素)含量、致熱原含量和一般安全性來確定。
實施例7氫氧化鋁佐劑輔助的多價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素蛋白質(zhì)綴合物的制備吸附至氫氧化鋁的綴合物的制備。本制備所用材料包括實施例5描述的血清型A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合物制備物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及無菌的溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的氫氧化鋁。
向含有生理鹽水的積聚罐中加入每一無菌單價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素綴合物各一份，生成每毫升緩沖液中每一血清型多糖各8μg的終濃度。向多價綴合疫苗中加入溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的氫氧化鋁，以獲得每毫升疫苗0.44mg鋁離子的終濃度。
實施例8磷酸鋁佐劑輔助的綴合物的制備本制備所用材料包括實施例5描述的血清型A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合物制備物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及無菌的溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的磷酸鋁。
向含有生理鹽水的積聚罐中加入每一無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物各一份，生成每毫升緩沖液中每一血清型多糖各8μg的終濃度。向多價綴合疫苗中加入溶于生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌磷酸鋁，以獲得每毫升疫苗0.44mg鋁離子的終濃度。
實施例9四價綴合疫苗的免疫原性在臨床評價之前，研究了四價綴合疫苗在小實驗動物上引起免疫應(yīng)答的能力。利用小鼠、大鼠和兔研究綴合疫苗相對于多糖疫苗的免疫原性。由于這些動物模型能夠通過免疫應(yīng)答模式區(qū)分綴合疫苗與相應(yīng)的多糖，因此它們是有用的。綴合疫苗引起類似T-細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答，而多糖疫苗引起類似非T-細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答。
在小鼠免疫原性研究中，將綴合物用生理鹽水(0.85％氯化鈉)稀釋，按人劑量的1/4到1/16施用。對小鼠施用1或2次疫苗，即綴合物或多糖疫苗，并在接種后2周采集其血液樣本。以一組小鼠作為未免疫對照組。利用ELISA方法測定每一血清型多糖的抗體。血清樣本與結(jié)合在ELISA微量滴定板孔上的過量的每一種莢膜多糖孵育。利用甲基化人血清白蛋白將每一血清型多糖連接至滴定孔上。孵育后，用緩沖液洗滌滴定孔，并將能夠結(jié)合抗腦膜炎球菌多糖抗體的二級抗體-酶綴合物加至抗體-多糖復(fù)合體中。洗滌滴定板，并將化學(xué)底物加至多糖-腦膜炎球菌抗體-二級抗體-酶綴合物中。經(jīng)酶水解化學(xué)底物的一部分后導(dǎo)致顏色形成。顏色形成的量與結(jié)合在滴定孔中的多糖-腦膜炎球菌抗體-二級抗體-酶綴合物的量成正比。疫苗的效價通過與針對每一血清型的參考抗血清作比較而確定，所述參考抗血清在同一滴定板上測定，其間使用4參數(shù)擬合進(jìn)行平行計算。小鼠參考抗血清由同一株系小鼠產(chǎn)生，所述小鼠分別用各血清型綴合疫苗進(jìn)行了3次免疫。小鼠參考抗血清基于產(chǎn)生1.0光密度的稀釋度的倒數(shù)來確定效價。
表1總結(jié)了針對每一血清型的抗多糖IgG效價，所述效價從接種2次四價綴合疫苗(液體和氫氧化鋁制劑)或相應(yīng)四價多糖疫苗的Swiss-Webster小鼠獲得。此IgG效價在一組十只小鼠的合并血清上進(jìn)行測定。利用2組各十只小鼠來測定每一種疫苗制劑的免疫應(yīng)答。兩組都在第一天接種。在第15天(接種后兩周)從第一組十只小鼠采集血液樣本，而在第15天對第二組十只小鼠進(jìn)行第二次疫苗接種。至兩周后的第29天，從第二組十只小鼠以及未免疫對照組采集血液樣本。所有的抗體同時進(jìn)行滴定，即15天和29天血液樣本連同未免疫對照以及小鼠參考血清同時測定。
表1來自接種四價綴合物或多糖的Swiss-Webster小鼠的合并血清的抗多糖IgG效價
四價綴合疫苗(未用佐劑和以氫氧化鋁為佐劑)在這一小鼠模型中可以引起強(qiáng)的抗多糖IgG免疫應(yīng)答。氫氧化鋁佐劑能夠提高對這四種血清型多糖綴合物任一種的初次和加強(qiáng)應(yīng)答。與未免疫對照相比較，在這一小鼠模型中四價多糖疫苗引起微弱的對血清型A、C和W135的免疫應(yīng)答，而血清型Y雖引起可觀的免疫應(yīng)答，但無加強(qiáng)應(yīng)答。在此模型中四價多糖疫苗未能引起對所有四種血清型多糖的加強(qiáng)應(yīng)答。根據(jù)對每一血清型綴合疫苗的免疫應(yīng)答強(qiáng)度和加強(qiáng)應(yīng)答模式，這一模型可以很容易地區(qū)分多糖疫苗和綴合疫苗。
在年輕健康成人和健康幼兒中已經(jīng)臨床研究了未用佐劑的四價綴合疫苗的安全性和免疫原性。在成人研究中，給受試者接種單一劑量疫苗，所述疫苗經(jīng)配制含有四種綴合物各4μg(按多糖計)。血液樣本在恰好接種前和接種后28天采集。每一血清型綴合物的抗體通過ELISA測定法來測定，所述測定法可以確定抗多糖IgG的量。此ELISA方法與在小鼠血清中存在IgG抗體時測定其數(shù)量的方法非常相似。
簡言之，血清樣本在包被有過量腦膜炎球菌多糖的ELISA微量滴定孔中孵育，所述腦膜炎球菌多糖通過甲基化的人血清白蛋白結(jié)合至滴定板。結(jié)合的抗體的量通過與過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗人IgG特異性單克隆抗體反應(yīng)來確定。使用過氧化物酶底物在隨后的反應(yīng)中生成顯色產(chǎn)物，其可以通過分光光度法測定。產(chǎn)生的生色團(tuán)的光密度與血清中與微量滴定板上的腦膜炎球菌多糖結(jié)合的IgG抗體的量相關(guān)。抗體的量利用4-參數(shù)邏輯斯諦曲線方法，通過與具有指定值的人參考血清(CDC1922)進(jìn)行比較而計算。另外，還測定了抗體溶解血清型特異細(xì)菌的能力。血清樣本首先熱失活以破壞補體。將血清樣本在無菌96孔微量滴定板中進(jìn)行2倍系列稀釋。將血清型特異細(xì)菌連同幼兔補體加至血清稀釋物中并孵育。孵育后，向血清/補體/細(xì)菌混合物中加入瓊脂覆蓋培養(yǎng)基。待瓊脂覆蓋物變硬，而后在5％二氧化碳、37℃條件下孵育過夜。第二天，計數(shù)孔中出現(xiàn)的細(xì)菌菌落。終點效價通過與補體對照孔的平均值相比產(chǎn)生大于50％的殺死率的血清稀釋度的倒數(shù)來確定。
表2所示總結(jié)了四價綴合疫苗接種前后的成年人血清中針對每一血清型的抗多糖IgG平均濃度和血清殺菌抗體(SBA)平均效價，其中所述綴合疫苗配制成每劑量4μg多糖。對所有四種血清型綴合物的免疫應(yīng)答令人滿意，其在IgG抗體和功能性殺菌抗體應(yīng)答上比得上得到批準(zhǔn)的多糖疫苗引起的免疫應(yīng)答。疫苗對這一年齡組來說是安全的，并且發(fā)現(xiàn)其安全性曲線與得到批準(zhǔn)的多糖疫苗的相似。
表2接種配制成每劑量4μg多糖的四價腦膜炎球菌綴合疫苗的年輕健康成人的抗多糖IgG GMC(組平均濃度)和血清殺菌抗體GMT(組平均效價)
在幼年組(小于2歲的幼兒)，對多糖疫苗的免疫應(yīng)答很弱并且據(jù)估計免疫力在一年后消退。給12至15個月大小的幼兒施用單一劑量的配制成每劑量每一血清型多糖4μg的四價綴合疫苗，并且在第一次劑量后兩個月給他們施用第二劑的四價綴合疫苗。在第一次和第二次接種前以及第二次接種后一個月采集血液樣本。表3總結(jié)了對4種血清型綴合物的抗體應(yīng)答。在第二次給予四價綴合物后，觀察到對每一血清型的IgG抗體和殺菌功能性抗體的加強(qiáng)應(yīng)答。對本年齡組而言，由綴合疫苗引起的IgG抗體水平比得上由得到批準(zhǔn)的多糖引起的IgG抗體水平；對血清型C多糖而言，6周后的應(yīng)答為3.64μg/mg(2.96-4.49)IgG抗體應(yīng)答。然而，對本年齡組而言，由綴合疫苗引起的殺菌抗體水平大大高于由得到批準(zhǔn)的多糖疫苗所正常引起的水平；6周后SBA效價為7.2(5.0-10.4)。在年幼群體中這種IgG抗體和殺菌抗體之間不一致性的原因據(jù)認(rèn)為是年幼群體中多糖引起高比例低親合性抗體的結(jié)果。相反，綴合物似乎可引起更高比例的高親合性抗體。高親合性抗體被認(rèn)為負(fù)責(zé)此殺菌活性。
表3接種2次配制成每劑量4μg多糖的四價腦膜炎球菌綴合疫苗的健康幼兒的抗多糖IgG GMC(組平均濃度)和血清殺菌抗體GMT(組平均效價)
與得到批準(zhǔn)的多糖疫苗相比，四價綴合疫苗除能在幼小群體中引起高的功能性抗體應(yīng)答外，還能夠引起回憶應(yīng)答，這顯示由本發(fā)明四價綴合疫苗引起的保護(hù)是長效的。在四價綴合疫苗的研發(fā)中，首先進(jìn)行的是二價AC綴合制劑的研究。此疫苗比目前批準(zhǔn)的單價C綴合物有更廣的覆蓋度，但其并不對血清型W135和Y引起的疾病起保護(hù)作用。
一項比較二價AC多糖疫苗與二價AC綴合疫苗的免疫應(yīng)答的臨床研究在嬰兒受試者中進(jìn)行。在這項研究中，編入第三組嬰兒作為對照組并使他們接受流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)b型綴合物。所有三個疫苗組接受相同的兒科疫苗。二價AC綴合物組在第6、10和第14周齡接受三次綴合疫苗(每劑量4μg多糖)。二價AC多糖組在第10和第14周齡接受兩次二價AC多糖疫苗(每劑量50μg多糖)。流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)b型綴合物組在第6、10和第14周齡接受三次綴合疫苗。在第6周(接種前)以及在第18周(接種后4周)采集血液樣本。當(dāng)嬰兒到11至12月齡時采集血液樣本，并且已經(jīng)接受二價AC綴合疫苗或二價AC多糖疫苗的嬰兒再接受一次AC多糖的加強(qiáng)接種。加強(qiáng)接種多糖的原因是為了評價受試者是否可引起回憶應(yīng)答。
本研究的結(jié)果(包括初次和多糖加強(qiáng)免疫應(yīng)答)見于表4的IgG抗體應(yīng)答和表5的SBA抗體應(yīng)答。對多糖和綴合疫苗而言，初次系列免疫接種后的IgG抗體應(yīng)答大致相同。然而，綴合物接種的受試者的殺菌抗體應(yīng)答大大高于多糖接種的受試者。據(jù)觀察一歲受試者，接種多糖的嬰兒引起非常少的殺菌功能性抗體。據(jù)推測，接種多糖疫苗的嬰兒產(chǎn)生的抗體為低親合性抗體，而接種綴合疫苗似乎引起高親合性抗體，這樣即解釋了高得多的殺菌抗體效價。在初次接種系列中接受綴合疫苗的受試者中，由加強(qiáng)接種多糖疫苗引起高水平功能性抗體，這顯示這些受試者已經(jīng)被致敏而具有記憶或T-細(xì)胞依賴性抗體應(yīng)答。在初次接種系列中接受多糖疫苗的受試者中，由多糖加強(qiáng)接種產(chǎn)生了中等水平的應(yīng)答，這顯示其為非T-細(xì)胞依賴性應(yīng)答。
表4在初次系列免疫(6、10和14周齡)及利用二價AC多糖在第11至12月齡加強(qiáng)接種之前和之后嬰兒抗血清型A和C的抗多糖IgG GMC(組平均濃度)
表5在初次系列免疫(6、10和14周齡)及利用二價AC多糖在第11至12月齡加強(qiáng)接種之前和之后嬰兒抗血清型A和C的SBA抗體GMT(組平均效價)
本發(fā)明的益處除了為年幼群體提供了對抗腦膜炎球菌疾病的更好保護(hù)以及提供了對血清型A、C、W-135和Y的更為廣泛的保護(hù)外，四價綴合物還提供了對其它病原體的保護(hù)，這通過引起對載體蛋白質(zhì)的抗體應(yīng)答完成。當(dāng)使用與白喉類毒素綴合的四價綴合疫苗施用給嬰兒時，這些受試者也接受了常規(guī)的兒科免疫，包括白喉類毒素。因此，在這些受試者中對白喉類毒素的抗體應(yīng)答無明顯提高。但是，當(dāng)將此白喉類毒素綴合物施用給沒有相伴接受含白喉類毒素的疫苗的受試者時，觀察到對白喉類毒素產(chǎn)生強(qiáng)的加強(qiáng)應(yīng)答。這些受試者已經(jīng)在2、3和4月齡接受了3次DTP給藥方案。在本研究中，受試者在2至3歲接受單一劑量的二價AC綴合物或單一劑量的二價AC多糖疫苗。血清樣本在接種時和接種后30天采集。所述二價AC綴合物利用白喉類毒素作為載體蛋白質(zhì)。
兩個疫苗組的白喉類毒素免疫應(yīng)答見于表6。正如所預(yù)望的，多糖未在受試者中刺激產(chǎn)生抗白喉免疫應(yīng)答，然而在接受AC綴合物的受試者中觀察到了強(qiáng)的抗白喉免疫應(yīng)答。因此，腦膜炎球菌綴合疫苗可以提供額外的益處，即刺激產(chǎn)生對載體蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，這樣當(dāng)以白喉類毒素作為載體蛋白質(zhì)時就提供了對白喉棒桿菌(Corynebacteria diphtheriae)所致疾病的保護(hù)。
表6接種二價AC白喉類毒素綴合疫苗(配制成每劑量4μg多糖)或二價AC多糖疫苗(配制成每劑量50μg多糖)的健康幼兒中產(chǎn)生的抗白喉類毒素抗體GMT(組平均效價)(通過ELISA方法測定，單位IU/ml)
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權(quán)利要求
1.含有2、3或4種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物的免疫學(xué)組合物，其中每一綴合物各包含有一種莢膜多糖，所述莢膜多糖與一種或多種載體蛋白質(zhì)綴合并來源于兩種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌血清型。
2.權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)組合物，其中莢膜多糖選自來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
3.權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)組合物，其中莢膜多糖來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A和C。
4.權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)組合物，其中莢膜多糖來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y。
5.權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)組合物，其中載體蛋白質(zhì)為白喉類毒素。
6.權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)組合物，其還包含有佐劑。
7.權(quán)利要求5所述的免疫學(xué)組合物，其中佐劑為氫氧化鋁。
8.權(quán)利要求5所述的免疫學(xué)組合物，其中佐劑為磷酸鋁。
9.誘導(dǎo)對腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫學(xué)應(yīng)答的方法，所述方法包括向人或動物施用免疫學(xué)有效量的如權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)組合物。
10.由免疫學(xué)有效量的2到4種不同蛋白質(zhì)-多糖綴合物組成的多價腦膜炎球菌疫苗，其中每一綴合物各包含與載體蛋白質(zhì)綴合的一種不同的莢膜多糖，并且其中每一莢膜多糖選自來源于腦膜炎球菌血清型A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
11.如權(quán)利要求9所述的多價腦膜炎球菌疫苗，其中莢膜多糖制備自腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A和C。
12.如權(quán)利要求9所述的多價腦膜炎球菌疫苗，其中莢膜多糖制備自腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y。
13.如權(quán)利要求9所述的多價腦膜炎球菌疫苗，其中載體蛋白質(zhì)為白喉類毒素。
14.如權(quán)利要求9所述的多價腦膜炎球菌疫苗，其還包含有佐劑。
15.如權(quán)利要求13所述的多價腦膜炎球菌疫苗，其中佐劑為氫氧化鋁。
16.如權(quán)利要求13所述的多價腦膜炎球菌疫苗，其中佐劑為磷酸鋁。
17.保護(hù)腦膜炎球菌易感人群或動物的方法，其包括向人或動物施用免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求9的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明描述了可以對腦膜炎球菌疾病提供廣泛保護(hù)的聯(lián)合疫苗，所述腦膜炎球菌疾病由病原性細(xì)菌腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)所致。疫苗由4種不同的多糖－蛋白質(zhì)綴合物組成，這些綴合物被配制成單一劑量形式的疫苗。將來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W－135和Y的純化莢膜多糖化學(xué)活化，并通過共價化學(xué)鍵選擇性連接至載體蛋白質(zhì)上，形成多糖－蛋白質(zhì)綴合物，所述綴合物能夠在兒童以及成人中引起對多種腦膜炎奈瑟氏球菌株系的長效免疫。
文檔編號A61P43/00GK1610560SQ02805398
公開日2005年4月27日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月23日
發(fā)明者R·P·賴亞爾 申請人:安萬特巴斯德公司