專利名稱：包含硬化斑相關(guān)分子的組合物和用于預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動脈粥樣硬化斑相關(guān)分子用于預(yù)防和治療動脈粥樣硬化及相關(guān)疾病，更特別地，涉及采用有效誘導(dǎo)粘膜耐受并抑制那些引起動脈粥樣化血管疾病及后遺癥的炎癥過程的硬化斑相關(guān)分子的方法和組合物。
背景技術(shù)：
心血管疾病是整個(gè)工業(yè)化世界的一個(gè)主要的健康風(fēng)險(xiǎn)。動脈粥樣硬化作為最普遍的心血管疾病，是心臟病發(fā)作、中風(fēng)和肢體坯疽以及類似疾病的主要原因，在美國是首要的死因。動脈粥樣硬化是一種涉及許多細(xì)胞類型和分子因素的復(fù)雜疾病(詳細(xì)的綜述參見Ross，1993，Nature 362801-809)。這個(gè)過程發(fā)生于動脈管壁的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞(SMCs)損傷的應(yīng)答，包括纖維脂肪和纖維損傷或硬化斑的形成，其后伴隨炎癥。動脈粥樣硬化的進(jìn)一步損傷可能閉塞相關(guān)的動脈，可能是應(yīng)答大量不同形式損傷的過量炎癥性纖維增生引起的。例如，剪切應(yīng)力被認(rèn)為是循環(huán)系統(tǒng)血流湍急的區(qū)域，如分支點(diǎn)和不規(guī)則結(jié)構(gòu)頻繁發(fā)生動脈粥樣硬化斑的原因。
在動脈粥樣硬化斑形成中，首先可觀察到的事件發(fā)生在炎癥細(xì)胞例如單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮層以及轉(zhuǎn)移通過內(nèi)皮下空間的時(shí)候。血漿LDL水平的增高導(dǎo)致血管壁的充血，使鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化的低密度脂蛋白(LDL)。此外，胞外基質(zhì)對脂蛋白的滯留導(dǎo)致脂肪氧化酶、活性氧成分、過氧亞硝酸鹽和/或髓過氧化物酶以及其它氧化性化合物對LDL的漸進(jìn)性氧化。這些LDL的氧化形式隨后被血管細(xì)胞通過表達(dá)在其表面的清除受體而大量吸收。
充滿脂肪的單核細(xì)胞和平滑肌衍生細(xì)胞被稱為泡沫細(xì)胞(foamcell)，是脂肪紋的主要成分。泡沫細(xì)胞與它們周圍的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的相互作用產(chǎn)生一種慢性局部炎癥狀態(tài)，其可能最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化、增加的巨噬細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞的擴(kuò)增與遷移、以及纖維硬化斑的形成(Hajjar，DP與Haberland，ME，J.Biol.Chem1997年9月12日；272(37)22975-78)。這樣的硬化斑閉塞了相關(guān)的血管并因此限制了血液的流動，導(dǎo)致缺血，這是一種以由于灌注不足的器官組織供氧缺乏為特征的病癥。當(dāng)相關(guān)的動脈阻塞血液流向心臟時(shí)，病人將受到“心臟病發(fā)作”的折磨；當(dāng)腦動脈阻塞時(shí)，病人將會中風(fēng)。當(dāng)?shù)剿闹膭用}變窄時(shí)，結(jié)果是劇痛、身體靈活性降低并可能需要截肢。
在動脈粥樣硬化和動脈粥樣化血栓形成的發(fā)病機(jī)理中，氧化的LDL已經(jīng)被暗示通過其作用于單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，以及通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞內(nèi)皮抗凝血平衡。氧化的LDL也抑制與抗動脈粥樣化HDL相關(guān)的氧化磷脂分解(Mertens，A和Holvoet，P，F(xiàn)ASEB J 2001年10月；15(12)2073-84)。這個(gè)關(guān)聯(lián)性也得到許多研究的支持，它們證明在動物模型的各種動脈粥樣化形成硬化斑中存在氧化LDL；通過藥學(xué)和/或遺傳操作抑制氧化可延遲動脈粥樣化形成；以及證明用抗氧化的維生素的一些干擾實(shí)驗(yàn)的可能結(jié)果(參見，例如，Witztum J和Steinberg，D，Trends Cardiovasc Med 2001年四-五月；11(3-4)93-102作為現(xiàn)有文獻(xiàn)的綜述)。實(shí)際上，氧化LDL和丙醛(MDA)-修飾的LDL最近已經(jīng)被建議作為冠狀動脈疾病的第一和第二階段合適的血液標(biāo)記物(美國專利，授予Holvoet等的6,309,888和授予Witztum等的6,255,070)。
降低LDL的氧化和活性已經(jīng)是許多用于治療和預(yù)防心血管疾病的建議臨床應(yīng)用目標(biāo)。Bucala等(美國專利5869534)披露了通過降低高級糖基化末端產(chǎn)物調(diào)節(jié)脂過氧化的方法，其中脂是以年齡-、疾病-和糖尿病-相關(guān)的泡沫細(xì)胞形成為特征的脂。Incyte Pharmaceuticals，Inc.的Tang等(美國專利5,945,308)已經(jīng)披露了人氧化LDL受體在心血管和自身免疫疾病以及癌癥治療上的證據(jù)和建議的臨床應(yīng)用。
另一個(gè)豐富的與動脈粥樣化形成相關(guān)的硬化斑成分是β2-糖蛋白I。β2-糖蛋白I(β2GPI)是一種50-kDa的分子，在體外分析中作為抗凝血劑。盡管β2GPI在動脈粥樣化形成中的確切作用還有待闡明，但是已經(jīng)觀察到幾個(gè)相關(guān)的特征1)它能夠結(jié)合帶負(fù)電荷的磷脂或表達(dá)磷脂的細(xì)胞(凋亡細(xì)胞，活化的血小板)；2)它能夠結(jié)合修飾的細(xì)胞表面，通過清除性巨噬細(xì)胞來增強(qiáng)這些細(xì)胞的清除(Chonn A等，J Biol Chem 1995；27025845-49；以及Thiagarajan P等，Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999；192807-11)；3)它是結(jié)合自身免疫的抗磷脂抗體(aPLs)的重要靶標(biāo)。β2GPI要被aPLs識別，需要經(jīng)過結(jié)構(gòu)改變。這種改變的觸發(fā)可以通過，例如，結(jié)合到負(fù)電性磷脂或高結(jié)合性血小板，但是也可通過體外結(jié)合表達(dá)磷脂酰絲氨酸的凋亡細(xì)胞。
研究抗β2GPI抗體在改善促凝血狀態(tài)中的重要性的近期研究集中于這些抗體對凝血系統(tǒng)的細(xì)胞和蛋白質(zhì)成分(內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞；組織因子和凝血因子)的效應(yīng)上。這些研究說明，抗β2GPI抗體抑制血小板失活，保持其巨噬細(xì)胞清除；與人內(nèi)皮細(xì)胞晚期吞飲泡相互作用；以及阻抑組織因子途徑抑制劑的抑制活性。與凝血事件的這種關(guān)聯(lián)性是與β2GPI在促血栓形成的抗磷脂綜合癥(APLS)中的潛在功能相一致的。美國專利5998223和5344758(分別授予Matsuura等和Krilis等)都披露了抗β2GPI抗體的應(yīng)用(一些是針對隱藏表位的)，用于診斷APLS和SLE。然而，作者沒有披露治療性的應(yīng)用。
與動脈粥樣化形成相關(guān)的第三種重要的硬化斑相關(guān)成分是60/65kDa熱休克蛋白(HSP)。這種線粒體蛋白是HSP家族的一個(gè)成員，該家族由近24種蛋白構(gòu)成，在不同物種之間顯示高度的序列同源性。這些蛋白，正如它們的名字意指的，是在應(yīng)答應(yīng)激反應(yīng)時(shí)表達(dá)的，應(yīng)激反應(yīng)包括施用于自由基、熱、機(jī)械剪切力、感染和細(xì)胞因子，以及保護(hù)細(xì)胞蛋白不被解折疊和變性。這導(dǎo)致它們被稱為分子“伴侶”。然而，HSP的功能可能具有不期望的結(jié)果，因?yàn)镠SP的過量表達(dá)在某些條件下可能增加自身免疫反應(yīng)，結(jié)果帶來組織損傷。造成HSP免疫介導(dǎo)損傷的機(jī)制仍不清楚據(jù)認(rèn)為是在它們上調(diào)后施用了隱藏的、“非自身的”新表位。可選擇地，據(jù)認(rèn)為在可能觸發(fā)抗天然HSP的病源性自身免疫反應(yīng)的感染之后，在自身HSP和引入的“外源”HSP表位之間存在交叉反應(yīng)。HSP參與自身免疫得到了研究的支持，這些研究證明在幾種自身免疫疾病中增加了自身抗體以及對HSP 60/65的細(xì)胞應(yīng)答(Schoenfeld，Y等Autoimmunity 2000年9月；15(2)199-202；授予Covacci等的美國專利6130059；以及Gromadza G等，Cerebrovascul Dis 2001年10月；12(3)235-39)。
HSP 65與動脈粥樣硬化之間的聯(lián)系最早被George Wick的小組認(rèn)識到，他們發(fā)現(xiàn)用不同抗原免疫的正常膽固醇血癥的兔產(chǎn)生了動脈粥樣硬化，只要用于免疫的制劑包含完全弗氏佐劑(CFA)(Xu，Q等，Arterioscler Thromb 1992；12789-99)。因?yàn)镃FA的主要組分是熱滅活的肺結(jié)核分枝桿菌，其主要成分是HSP-65，他們推論對該成分的免疫反應(yīng)導(dǎo)致動脈粥樣硬化的產(chǎn)生。當(dāng)這些作者證明用HSP 65對動物免疫產(chǎn)生顯著的動脈粥樣硬化時(shí)，這一點(diǎn)得到確證，來自實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化的兔的T細(xì)胞過量表達(dá)HSP-65，表明局部免疫反應(yīng)限于應(yīng)激反應(yīng)后的動脈血管。內(nèi)源HSP-65在動脈粥樣硬化中的重要性進(jìn)一步被HSP-65(或肺結(jié)核分枝桿菌)免疫未試驗(yàn)過的老鼠后，脂肪紋形成的加速所證實(shí)(George J等，Arerioscler Thromb Vasc Biol 1999；19505-10)。
對HSP-65應(yīng)答的體液免疫機(jī)制的參與在動脈粥樣硬化中被觀察到了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在抗-HSP65的高水平抗體和根據(jù)健康人群聲譜估測的頸動脈狹窄掃描程度之間有顯著的關(guān)聯(lián)(Xu Q等，Lancet 1993；341255-9；Xu Q等，Circulation 1999；100(11)1169-74)。此外，用培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明在用HSP 65孵育后，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞粘附到單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的濃度和時(shí)間的依賴性。
HSP 65與動脈粥樣硬化的聯(lián)系導(dǎo)致大量建議的治療應(yīng)用。在觀察到對HSP 65的免疫反應(yīng)與微生物(例如H.pylori)感染和動脈粥樣硬化都有關(guān)聯(lián)后，Bernie等(Eur Heart J 1998；19366-7)提議了降低感染和抗-HSP抗體的抗生素治療。類似地，Covacci等(美國專利6130059)披露了H.pylori HSPs以及相關(guān)的肽的用途，用于動脈粥樣硬化的診斷和治療應(yīng)用。
動脈粥樣硬化和自身免疫疾病因?yàn)檫^量炎癥-纖維增生應(yīng)答在動脈粥樣硬化和缺血中的推測作用，越來越多的研究人員試圖確定血管損傷中的自身免疫成分。在自身免疫疾病中，免疫系統(tǒng)除了攻擊入侵的外來抗原外，還識別并攻擊正常的非抗原性身體成分(自身抗原)。自身免疫疾病分為自身-(或自我)抗體介導(dǎo)的或細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。典型的自身抗體介導(dǎo)的自身免疫疾病是重癥肌無力和先天性血小板減少性紫癜(ITP)，而典型的細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是Hashimoto甲狀腺炎和I型(幼年)糖尿病。
認(rèn)識到在動脈粥樣硬化的損傷中大多數(shù)有免疫介導(dǎo)過程是源自最早期淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中一致的觀察結(jié)果，即脂肪紋。與更晚期的損傷相比，在早期損傷中，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞(包括主要的CD4+細(xì)胞群(剩下的是CD8+細(xì)胞))比巨噬細(xì)胞更多，在更晚期的損傷中這個(gè)比例趨于相反。這些發(fā)現(xiàn)提出了相關(guān)疑問，它們是否反映了對可能抗原的基本免疫敏感性，或者可選擇地，來自以前誘導(dǎo)的局部組織損傷。不考慮負(fù)責(zé)將這些炎癥細(xì)胞動員到早期硬化斑的因素，它們看起來表現(xiàn)出一種活化的狀態(tài)，表現(xiàn)為伴隨表達(dá)MHC II型HLA-DR和白介素(IL)受體以及淋巴細(xì)胞普通抗原(CD45R0)和極晚期抗原1(VLA-1)整合蛋白。這樣，動脈粥樣硬化損傷的早期炎癥反應(yīng)可能是原始觸發(fā)事件，導(dǎo)致局部細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，或者是免疫系統(tǒng)對危害過程的一種應(yīng)答形式。已經(jīng)顯示被滯留細(xì)胞上調(diào)的一些細(xì)胞因子包括TNF-α，IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IFN-γ和單核細(xì)胞化學(xué)引誘肽-1(MCP-1)。在動脈粥樣硬化斑中由所有細(xì)胞成分表達(dá)的血小板衍生生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子(ILGF)也顯示為過量表達(dá)，這樣可能強(qiáng)化了由促有絲分裂因子和趨化性因子形式的輔刺激支持而引起的先存在的炎癥反應(yīng)。最近，Uyemura等(J Clin Invest 1996；972130-2138)已經(jīng)闡明在人動脈粥樣硬化損傷中的1型T細(xì)胞因子模式，這個(gè)例子說明與正常動脈相比，是IFN-γ而不是IL-4mRNA的強(qiáng)表達(dá)。進(jìn)一步，主要由活化單核細(xì)胞和Th1細(xì)胞因子模式的選擇誘導(dǎo)物產(chǎn)生的IL-12—一種T細(xì)胞生長因子，在損傷中過量表達(dá)，表現(xiàn)為其主要的異二聚體形式p70和p40(其主要的可誘導(dǎo)蛋白)mRNA豐富。
類似于動脈粥樣硬化斑中細(xì)胞免疫體系占優(yōu)勢的有力證據(jù)，也有充足的數(shù)據(jù)證明局部體液免疫體系的參與。這樣，除了在滯留巨噬細(xì)胞中C3b和C3Bi受體的增強(qiáng)表達(dá)外，免疫球蛋白和補(bǔ)體成分的沉積已經(jīng)顯示在硬化斑中。
關(guān)于免疫介導(dǎo)的炎癥對動脈粥樣硬化發(fā)展的影響的有價(jià)值線索來自動物模型。免疫缺陷老鼠(I型MHC缺陷)與免疫足夠的老鼠相比，更容易發(fā)生動脈粥樣硬化的加快。此外，用環(huán)孢霉素A，一種潛在的IL-2轉(zhuǎn)錄抑制劑治療C57BL/6鼠(Emeson EE和Shen ML，Am J Pathol1993；1421906-1915)和新西蘭白兔(Roselaar SE等，J ClinInvest 1995；961389-1394)，導(dǎo)致在“正?！敝鞍住皦毫Α毕旅黠@增強(qiáng)的動脈粥樣硬化。后面的這些研究可能提供了對免疫體系阻礙動脈粥樣硬化斑中自身維持的炎癥過程的深入理解。
動脈粥樣硬化并不是典型的自身免疫疾病，盡管它的一些表現(xiàn)，例如產(chǎn)生阻塞血管系統(tǒng)的硬化斑，可能與異常免疫應(yīng)答有關(guān)。在典型的自身免疫疾病中，人們經(jīng)常能夠非常清楚地確定被免疫系統(tǒng)攻擊的敏感性自身抗原和識別自身抗原的免疫系統(tǒng)組分(例如體液的，即自身抗體，或者細(xì)胞的，即淋巴細(xì)胞)。首先，人們能夠表明，通過被動轉(zhuǎn)移這些免疫系統(tǒng)組分可以在健康動物中誘導(dǎo)疾病，或者就人來說，疾病可以從患病的懷孕母體被轉(zhuǎn)移到她的后代。上述許多特點(diǎn)在動脈粥樣硬化中都不是常見的。其次，該疾病有明確的共同危險(xiǎn)因素，例如高血壓、糖尿病、缺乏體力、抽煙以及其它，該疾病影響老年人并具有與典型自身免疫疾病不同的遺傳優(yōu)勢。
炎癥疾病的治療可涉及抑制或反轉(zhuǎn)通用的和/或疾病特異的免疫反應(yīng)。這樣，例如Aiello(美國專利6,034,102和6,114,395)披露了使用雌激素樣化合物通過抑制炎癥細(xì)胞動員來治療和預(yù)防動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化損傷的發(fā)展。類似地，Medford等(美國專利5,846,959)披露了用于預(yù)防氧化PUFA形成的方法，用于治療由細(xì)胞粘附分子VCAM-1介導(dǎo)的心血管和非心血管炎癥疾病的方法。進(jìn)一步，F(xiàn)alb(美國專利6,156,500)確定了許多在動脈粥樣硬化斑以及作為抗炎癥治療的潛在目標(biāo)的疾病中富含的細(xì)胞信號和粘附分子。
因?yàn)橐呀?jīng)清楚地暗示氧化LDL、β2GPI和HSP 65是動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理(見上)，所以已經(jīng)研究了這些主要的硬化斑組分對動脈粥樣硬化疾病中自身免疫性的影響。
對硬化斑相關(guān)分子的免疫應(yīng)答公知Ox LDL對于T細(xì)胞和單核細(xì)胞是趨化性的。Ox LDL及其副產(chǎn)物也公知誘導(dǎo)因子例如單核細(xì)胞趨化因子1表達(dá)，分泌集落刺激因子和血小板活化物，所有這些都是潛在的生長刺激物。細(xì)胞免疫應(yīng)答積極參與動脈粥樣硬化最近已經(jīng)被證實(shí)(Stemme S等，Proc Natl AcadSci USA 1995；923893-97)，其中在作為刺激物以應(yīng)答Ox LDL的硬化斑克隆中分離了CD4+。對應(yīng)Ox LDL的克隆(27個(gè)中有4個(gè))主要產(chǎn)生干擾素-γ而不是IL-4。尚需了解的是上述T細(xì)胞克隆是否僅僅以刺激性強(qiáng)免疫原(Ox LDL)與細(xì)胞免疫系統(tǒng)接觸，還是該反應(yīng)提供了對抗明顯惰性的動脈粥樣硬化過程的方法。
關(guān)于體液機(jī)制參與及其重要性的數(shù)據(jù)更加有爭議。一項(xiàng)最近的研究報(bào)導(dǎo)了在遭受心臟疾病和/或糖尿病的婦女中抗MDA-LDL抗體水平的增加，LDL氧化代謝水平的增加(Dotevall等，Clin Sci 2001年十一月；101(5)523-31)。其它研究人員已經(jīng)證實(shí)識別氧化LDL上多表位的抗體，對動脈粥樣硬化和其它疾病例如糖尿病、腎血管性綜合癥、尿毒癥、風(fēng)濕熱和紅斑狼瘡中的脂和載脂蛋白組分(SteinerovaA等，Physiol Res 2001；50(2)131-41)的免疫反應(yīng)性。一些報(bào)導(dǎo)已經(jīng)將抗Ox LDL抗體水平的增加與動脈粥樣硬化的發(fā)展相關(guān)聯(lián)(表示為頸動脈狹窄程度、外周血管疾病的嚴(yán)重性等)。更為近來的，Sherer等(Cardiology 2001；95(1)20-4)證實(shí)在冠心病中抗心磷脂、β-2GPI和Ox LDL的抗體的水平增加，而不是磷脂酰膽堿或內(nèi)皮細(xì)胞。這樣，看起來關(guān)于動脈粥樣硬化斑中抗硬化斑組分的抗體以免疫復(fù)合物形式存在是一致的意見。
在正常和病理性的脂蛋白代謝中已經(jīng)涉及抗Ox LDL抗體。這樣，公知Ox LDL免疫復(fù)合物及其相應(yīng)的抗體與Ox LDL相比，更能被巨噬細(xì)胞有效吸收。不能從動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理上的這個(gè)一致發(fā)現(xiàn)得出結(jié)論，因?yàn)镺x LDL被巨噬細(xì)胞加速吸收是有利還是有害的問題尚待解決。
關(guān)于體液免疫系統(tǒng)在動脈粥樣硬化中的意義的重要數(shù)據(jù)來自動物模型用同源性氧化LDL對LDL受體缺乏的兔超免疫導(dǎo)致了產(chǎn)生高水平的抗Ox LDL抗體，并與動脈粥樣硬化損傷程度的明顯降低相關(guān)。同樣地，在用富含膽固醇的脂質(zhì)體免疫兔并且刺激抗膽固醇抗體的產(chǎn)生后，伴隨硬化斑形成的降低；然而，這個(gè)效果伴隨著不期望的極低密度脂蛋白膽固醇水平降低35％。
關(guān)于β-2GPI的免疫原性，已經(jīng)表明β-2GPI是作為免疫介導(dǎo)攻擊的靶抗原起作用，影響人和鼠中動脈粥樣硬化的發(fā)展。George J等用β-2GPI免疫LDL受體缺乏的鼠，與對照相比，產(chǎn)生了對人β-2GPI的顯著體液免疫應(yīng)答，以及更早期的動脈粥樣硬化損傷(George J等，Circulation 1998；151108-15)。Afek A等用人β-2GPI免疫有動脈粥樣硬化傾向的載脂蛋白-E敲除的鼠一次，并喂食高脂肪食物5周后獲得了類似的結(jié)果(Afek A等，Pathobiology 1999；6719-25)。
進(jìn)一步，盡管在患有促血栓形成的抗磷脂綜合癥的病人中對β-2GPI的免疫反應(yīng)性在傳統(tǒng)上被歸于抗β-2GPI自身抗體的存在，但最近的觀察已經(jīng)表明對β-2GPI的細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要性。T細(xì)胞與β-2GPI的反應(yīng)已經(jīng)在患有抗磷脂綜合癥的病人外周血中得到證實(shí)。這些T細(xì)胞顯示為一種1型輔助T細(xì)胞(分泌促炎癥(以及促動脈粥樣硬化)細(xì)胞因子干擾素)并還能誘導(dǎo)組織因子的產(chǎn)生(Visvanathan S和Mc Niel HP.J Immunolog 1999；1626919-25)。綜合起來，關(guān)于抗β-2GPI的充足數(shù)據(jù)(綜述參見Roubey RA，Curr OpinionRheumatol 2000；12374-378)表明對該硬化斑相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答可能在影響動脈粥樣硬化斑的大小和組成中起著重要的作用。
最后，在抗原性以及氧化磷脂和β-2GPI的致病機(jī)理中存在明顯的依賴性。如上所述，與最低限度修飾的LDL和β-2GPI相關(guān)的一些自身免疫表位是隱蔽的。Kyobashi等(J Lipid Res 2001；42697-709)以及Koike等(Ann Med 2000；32Suppl I 27-31)已經(jīng)識別了一種活化巨噬細(xì)胞的oxLDL特異性配體，其僅與β-2GPI-OXLDL復(fù)合物的形成而存在。該配體被APLS特異的自身抗體識別。這樣，氧化LDL和其它硬化斑組分的致病作用以及在動脈粥樣硬化和其它疾病中作為自身抗原的重要性都已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室和臨床研究中被廣泛證實(shí)。
在自身免疫疾病治療中的粘膜耐受最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)適用于治療自身免疫疾病(以及相關(guān)的T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性紊亂，例如同種異體移植排斥和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的神經(jīng)性疾病)的新方法和藥學(xué)配方。這些治療誘導(dǎo)口服或粘膜途徑的耐受，例如通過吸入，用作耐受者自身抗原、旁觀者抗原、或者自身抗原或旁觀者抗原的疾病抑制性片斷或類似物。這樣的治療披露于例如授予Weiner等的美國專利5,935,577。自身抗原和旁觀者抗原在下面定義(粘膜耐受的綜述參見Nagler-Anderson，C.，Crit Rev Immunol2000；20(2)103-20)。靜脈內(nèi)施加自身抗原(以及包含它們分子免疫顯性表位區(qū)的片斷)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)通過稱為克隆性免疫脫敏(clonalanergy)的機(jī)制誘導(dǎo)免疫抑制?？寺⌒悦庖呙撁粢饍H對特定抗原特異的免疫攻擊T細(xì)胞的失活，結(jié)果是對該抗原的免疫應(yīng)答明顯降低。這樣，特異于一種抗原的促自身免疫應(yīng)答的T細(xì)胞，一旦免疫脫敏，就不再應(yīng)答那種抗原而增生。這種增生降低也降低了造成自身免疫疾病癥狀的免疫反應(yīng)(例如在多發(fā)性硬化MS中觀察到的神經(jīng)組織損傷)。也有證據(jù)表明以單劑量和實(shí)質(zhì)上比觸發(fā)“活性抑制”更大量口服自身抗原(或者免疫顯性片斷)也可通過脫敏(或者克隆刪除)誘導(dǎo)耐受。
也已經(jīng)披露一種通過活性抑制進(jìn)行的治療方法。活性抑制通過不同于克隆性免疫脫敏的機(jī)制起作用。該方法在PCT申請PCT/US93/01705中深入討論，涉及口服或粘膜施加特異于受到自身免疫攻擊的組織的抗原。這些抗原稱為“旁觀者抗原”。該治療引起在腸道淋巴組織(GALT)、或者支氣管淋巴組織(BALT)、或者更通常的粘膜淋巴組織(MALT)(MALT包括GALT和BALT)中誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性(抑制物)T細(xì)胞。這些調(diào)節(jié)性細(xì)胞在血液或淋巴組織中被釋放，然后遷移到自身免疫疾病發(fā)生的器官或組織，并抑制發(fā)病器官或組織的自身免疫攻擊。這些由旁觀者抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞(其識別至少一個(gè)用來誘導(dǎo)它們的旁觀者抗原的抗原決定簇)被定向到自身免疫攻擊的地方，在此它們介導(dǎo)一些免疫調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子的局部釋放，例如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、白介素-4(IL-4)、和/或白介素-10(IL-10)。其中，TGFβ是一種抗原非特異性的免疫抑制因子，因?yàn)樗豢紤]觸發(fā)攻擊的抗原而抑制免疫攻擊。(然而，因?yàn)橛门杂^者抗原口服或粘膜耐受僅在自身免疫攻擊的鄰近區(qū)域引起TGFβ的釋放，不會隨之發(fā)生全身性免疫抑制)。IL-4和IL-10也是抗原非特異性的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。IL-4特別增強(qiáng)(T輔助細(xì)胞2)Th2應(yīng)答，即作用于T細(xì)胞前體并促使它們以Th1為代價(jià)優(yōu)先分化為Th2細(xì)胞。IL-4也間接抑制Th1增加。IL-10是Th1應(yīng)答的直接抑制劑。在患自身免疫疾病的哺乳動物用旁觀者抗原口服后，在自身免疫攻擊的部位觀察到TGFβ、IL-4和IL-10的水平增加(Chen，Y等，Science，2651237-1240，1994)。旁觀者抑制機(jī)制已經(jīng)被von Herreth等證實(shí)(J.Clin.Invest.，961324-1331，1996年9月)。
更為最近的，口服耐受已經(jīng)被有效地用于通過喂食益生菌來治療發(fā)炎性腸疾病的動物模型中(Dunne，C等，Antonie Van Leeuwenhoek，1999年7-11月；76(1-4)279-92)，通過喂食腎小球基底膜治療自身免疫腎小球腎炎(Reynolds，J等，J Am Soc Nephrol，2001年1月；12(1)61-70)，分別通過喂食髓磷脂堿性蛋白(MBP)治療實(shí)驗(yàn)性過敏腦脊髓炎(EAE，是多發(fā)性硬化或MS的等同物)，通過用膠原和HSP 65喂食患者來治療佐劑關(guān)節(jié)炎和膠原關(guān)節(jié)炎。一家基地在波士頓的名為Autoimmune的公司進(jìn)行了一些人體實(shí)驗(yàn)來預(yù)防糖尿病、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和眼色素層炎。臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比哺乳動物實(shí)驗(yàn)差一些，但是已經(jīng)有了一些預(yù)防關(guān)節(jié)炎的成功。
在動脈粥樣硬化斑損傷中發(fā)現(xiàn)的對自身抗原的口服耐受也已經(jīng)進(jìn)行研究。在動脈粥樣硬化臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑細(xì)胞和Ig滴定識別的表位研究顯示了三種候選的抑制動脈粥樣硬化損傷炎癥的抗原氧化LDL、與應(yīng)激相關(guān)的熱休克蛋白HSP 65和心磷脂結(jié)合蛋白β-2GPI。Shoenfeld等的美國專利申請09/806,400(申請日1999年9月30日)，將其全文引入在此，披露了喂食氧化的人LDL的遺傳上易感的LDL受體缺乏鼠(LDL-RD)的動脈中，動脈粥樣硬化形成降低了約30％。盡管通過口服耐受可以推測獲得了動脈粥樣硬化形成的明顯抑制，但是沒有識別出特定的脂抗原或者免疫原性LDL組分。遇到的另一個(gè)問題是口服抗原在體內(nèi)固有的不穩(wěn)定性，這是由于消化分解，以及氧化LDL被肝臟和細(xì)胞免疫機(jī)制吸收。除了喂食(口服)，粘膜施用途徑將提供更有效的耐受。
免疫耐受的誘導(dǎo)和隨后的自身免疫炎癥過程的預(yù)防或抑制已經(jīng)利用在除腸道外的粘膜部位施用抑制性抗原而被證實(shí)。眼周膜組織、中耳、呼吸道和其它粘膜，特別是鼻腔粘膜，被施用給許多侵入的以及自身的抗原，并且進(jìn)行免疫反應(yīng)的機(jī)制。這樣，Rossi等(Scand JImmunol，1999年8月；50(2)177-82)發(fā)現(xiàn)在乳糜瀉的鼠模型中鼻腔施用麥醇溶蛋白與靜脈內(nèi)施用同樣可以有效地下調(diào)對抗原的免疫反應(yīng)。類似地，在重癥肌無力鼠模型中鼻腔施用乙酰膽堿受體抗原比口腔施用更有效地延遲和降低肌無力和特定淋巴細(xì)胞的增殖(Shi，F(xiàn)D等，J Immunol，1999年5月15日；162(10)5757-63)。因此，供粘膜以及靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用的免疫原性化合物應(yīng)該適合于鼻腔和其它膜途徑的施用。
因此，明顯需要采用與硬化斑相關(guān)的分子的新方法以及包含該分子的組合物，該分子能夠有效耐受在粘膜特別是鼻腔施用的免疫原。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化、心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病、狹窄、再狹窄和/或支架內(nèi)狹窄的藥物組合物，包含治療有效量的至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分作為活性組分，或者其藥學(xué)上的鹽，該組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體，該藥物組合物設(shè)計(jì)用于粘膜給藥。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)另外的方面，提供了一種分析方法，用于確定粘膜施用硬化斑組分對動脈粥樣硬化相關(guān)疾病或病癥的效果，包括向患有動脈粥樣硬化相關(guān)疾病或病癥的患者粘膜給藥至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分、并測量患者中至少一種動脈粥樣硬化的指標(biāo)，據(jù)此確定粘膜施加至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分對動脈粥樣硬化相關(guān)疾病或病癥的效果。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化、心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病、狹窄、再狹窄和/或支架內(nèi)狹窄的方法，該方法包括向患者粘膜給藥治療有效量的至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的進(jìn)一步特征，硬化斑相關(guān)分子選自由氧化LDL、β-2-GPI、HSP及其衍生物組成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的進(jìn)一步特征，至少一種硬化斑相關(guān)分子的抗原性部分是天然產(chǎn)生的分子或合成的分子。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的進(jìn)一步特征，該藥物組合物配制為用于鼻、呼吸道、耳和/或結(jié)膜給藥。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的進(jìn)一步特征，至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分選擇為降低所述患者對硬化斑組分的免疫反應(yīng)。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的進(jìn)一步特征，該藥物組合物被包裝并標(biāo)識，用于預(yù)防和/或治療至少一種病癥，選自動脈粥樣硬化、心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病、狹窄、再狹窄和/或支架內(nèi)狹窄。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的進(jìn)一步特征，該藥物組合物進(jìn)一步包含治療有效量的至少一種額外的化合物，選自HMGCoA還原酶抑制劑(抑制素)、粘膜佐劑、皮質(zhì)醇、抗炎癥化合物、鎮(zhèn)痛劑、生長因子、毒素、以及額外的耐受化抗原。
本發(fā)明通過提供一種新的誘導(dǎo)免疫耐受的方法，成功解決了目前本領(lǐng)域的不足，其通過粘膜施加硬化斑相關(guān)分子從而抑制動脈粥樣硬化和其它與硬化斑相關(guān)的疾病。
附圖簡述這里僅通過舉例的方式，參照附圖描述本發(fā)明?，F(xiàn)在參照特別詳細(xì)的附圖，要強(qiáng)調(diào)的是，顯示的細(xì)節(jié)是舉例的方式，僅用于說明性地討論本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，提供據(jù)信是本發(fā)明的原理和概念性方面最有用和最容易理解的說明。在這點(diǎn)上，沒有試圖顯示比為基本理解本發(fā)明所需的更詳細(xì)的本發(fā)明細(xì)節(jié)，對附圖的說明使本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，本發(fā)明的幾種形式是如何在實(shí)踐中被實(shí)施的。
在附圖中

圖1說明通過由施加低劑量硬化斑相關(guān)分子誘導(dǎo)的鼻腔耐受而抑制apo-E缺乏的鼠的早期動脈粥樣硬化形成。在溫和鎮(zhèn)靜下，9-13周大的apo-E缺乏的鼠經(jīng)鼻腔內(nèi)施用3劑量的10μg/鼠每份HSP 65(HSP-65)(n＝12)、人氧化LDL(H-oxLDL)(n＝14)、人β-2GPI(B2gpi)(n＝13)、牛血清白蛋白(BSA)或者陰性對照施用鹽水(PBS)(n＝12)。在最后施用后，所有的鼠接受形成動脈粥樣硬化的“Western”飲食。動脈粥樣硬化表示為在第3次施用后5周主動脈竇中的動脈粥樣硬化損傷的面積。
圖2說明通過鼻內(nèi)施用極低劑量HSP 65誘導(dǎo)的粘膜耐受而抑制apo-E缺乏的鼠的早期動脈粥樣硬化形成。12-16周大的apo-E缺乏的鼠在5天內(nèi)每隔一天通過鼻內(nèi)施加3劑量的1μg/鼠HSP65(HSP-65低)(n＝16)或10μg/鼠HSP 65(HSP-65高)(n＝14)誘導(dǎo)鼻腔耐受。對照的鼠經(jīng)鼻內(nèi)施用等體積(10μl)的牛血清白蛋白，10μg/鼠(BSA)(n＝14)，或者陰性對照施用PBS(PBS)(n＝14)。在最后施用后，所有的鼠接受形成動脈粥樣硬化的“Western”飲食。動脈粥樣硬化表示為在最后的鼻腔施用后5周主動脈竇中的動脈粥樣硬化損傷的面積。
圖3說明通過鼻內(nèi)施用人β-2GPI誘導(dǎo)的對動脈粥樣硬化斑抗原的免疫應(yīng)答的抑制。5周大的apo-E缺乏的雄性鼠在5天內(nèi)每隔一天通過鼻內(nèi)施用10μg/鼠人β-2GPI(H-b2-nt)(n＝3)；或者可選擇地，通過管飼法喂食溶于0.2ml PBS中的100μg/鼠人β-2GPI(H-b2-ot)(n＝3)；或者僅喂食PBS(PBS)(n＝3)。在最后一次喂食后一周，這些鼠通過皮下注射一次0.1ml體積的10μg/鼠人β-2GPI而敏化。十天后，如“材料和方法”部分所述從腹股溝淋巴結(jié)制備T細(xì)胞，然后施用敏化的人β-2GPI抗原用于體外增殖測試。顯示免疫活性的增殖表示為存在和不存在人β-2GPI抗原時(shí)標(biāo)記胸苷摻入T細(xì)胞DNA之間的比值(刺激指數(shù)，S.I.)。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及使用硬化斑相關(guān)分子的方法和組合物，這些分子有效誘導(dǎo)對動脈粥樣硬化相關(guān)抗原的粘膜耐受，從而抑制引起動脈粥樣化血管疾病及后遺癥的炎癥過程。
本發(fā)明的原理和實(shí)施可以參考附圖和隨后的描述而被更好地理解。
在詳細(xì)說明本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)施方案之前，要明白的是本發(fā)明并不將其應(yīng)用限定在后面說明書中描述的細(xì)節(jié)或者實(shí)施例的例證。本發(fā)明能夠具有其它的實(shí)施方案或者以不同的方式實(shí)施或完成。也要明白的是，這里采用的措詞和術(shù)語是用于說明目的，不應(yīng)當(dāng)作為限定。
實(shí)驗(yàn)室的和臨床的證據(jù)顯示了硬化斑相關(guān)抗原在動脈粥樣硬化中過量炎癥反應(yīng)的病因中的作用。對硬化斑相關(guān)分子即氧化LDL、β-2GPI和HSP 65的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)都已經(jīng)被證實(shí)，暗示了動脈粥樣硬化中一種重要的抗-氧化LDL的自身免疫組分。因此，氧化LDL、β-2GPI和HSP 65及其配合劑已經(jīng)成為許多用于預(yù)防和治療心臟病、腦血管疾病和外周血管疾病的治療方法的目標(biāo)。
現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了將硬化斑相關(guān)抗原應(yīng)用于檢測和診斷動脈粥樣硬化和其它硬化斑及血栓相關(guān)疾病。例如，Holvoet(美國專利6,309,888)教導(dǎo)了將階段特異性硬化斑相關(guān)抗原oxLDL和MDA-LDL用于篩選冠狀動脈疾病。類似地，其他人(美國專利5,998,223和5,344,758，分別屬于Matsuura等人和Krilis等人)已經(jīng)披露了抗-β-2GPI抗體用于篩選APLS、SLE和動脈粥樣硬化的血清標(biāo)記物。上述公開內(nèi)容僅僅提到診斷應(yīng)用，而沒有認(rèn)識到這些硬化斑相關(guān)分子的治療潛力。
盡管免疫應(yīng)答在動脈粥樣硬化和其它硬化斑相關(guān)疾病的病因和發(fā)展中的作用仍然是有爭議的(參見Meir，K等，InternationalAtherosclerosis Soc.2001，評論)，但許多基于免疫的治療方法已經(jīng)提出用于動脈粥樣硬化。降低炎癥和反應(yīng)過度病癥的免疫應(yīng)答的通用方法披露于例如美國專利Le等的6,277,969；5,698,195和5,656,272，和Alving等的6,224,902，Shurkovitz等的國際專利申請001 001 2514和Zeng的20010051156 A1。然而，提出來的降低或去除免疫反應(yīng)介質(zhì)，例如細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子(TNF)和其它病原性因子，需要進(jìn)行昂貴的和有潛在危險(xiǎn)的方法例如血的免疫吸附和延長的抗細(xì)胞因子施用。而且，沒有披露用于治療動脈粥樣硬化或與硬化斑相關(guān)的疾病。
使用硬化斑相關(guān)抗原的具體免疫治療方法也已經(jīng)提出。Bumol等、Calenoff等和Takano等(分別是美國專利5,196,324；6,025,477和5,110,738)披露了使用天然的、未充分確定的分離硬化斑制劑用于免疫、單克隆抗體制備、動脈粥樣硬化診斷和治療。這些動脈粥樣化組織的抗原、蛋白和脂成分沒有充分確定，用于治療用途是不切實(shí)際的，并在長期治療中是有潛在危害性的。
現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了涉及對抗氧化LDL的免疫治療用于治療和預(yù)防動脈粥樣硬化。Witztum等的美國專利6,225,070披露了對mAb使用氧化LDL來抑制氧化LDL結(jié)合巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞形成。類似地，Mc Gregor等(國際專利申請EP1162458A1)披露了通過巨噬細(xì)胞具體調(diào)節(jié)氧化LDL吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的方法。Bucala等的美國專利5,733,524和5,733,933披露了通過減少高級糖基化末端產(chǎn)物脂(AGE-脂)來降低特定的抗-氧化LDL免疫應(yīng)答。提出的這些治療方法沒有教導(dǎo)抗氧化LDL的活性免疫，并且需要延長的治療方案。
Zhou等(Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001；21108)在用均質(zhì)硬化斑或同源MDL LDL進(jìn)行爪墊(footpad)免疫后獲得了鼠早期硬化斑形成的明顯降低。Palinski等(PNAS USA 1995；92821-25)在用氧化LDL免疫的兔中產(chǎn)生了類似的保護(hù)水平。然而，將常規(guī)免疫技術(shù)應(yīng)用于氧化LDL是有問題的，因?yàn)槊庖咚璧妮o助制劑和激發(fā)劑在免疫類似的狀況下會產(chǎn)生加速的硬化斑形成。而且，需要相當(dāng)高劑量(100微克/鼠/注射)的硬化斑抗原用于免疫。粘膜給藥和耐受誘導(dǎo)沒有被提到。
使用其它硬化斑抗原的免疫治療也已經(jīng)被提出。最近用β-2GPI進(jìn)行的動物和體外研究(參見George J等，Rheum Dis Clin North Am2001；27603-10；Brey等，Stroke 2001；321701-06；Kyobashi等，J Lipid Res 2001；42697-709；Koike T等，Ann Med 2000；32，Suppl.I27-31以及Cabral AR等，Am J Med 1996；101472-81)已經(jīng)證實(shí)β-2GPI與中風(fēng)、APLS、動脈粥樣硬化和心肌梗死的關(guān)聯(lián)。盡管在對氧化LDL的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答中清楚地暗示了該蛋白的隱藏表位，但上述研究沒有證實(shí)使用該蛋白的保護(hù)性免疫。類似地，用HSP 65進(jìn)行的研究(Birnie DH Eur Heart J 1998；19366-67；Xu Q等，Circulation 1999；1001169-74；以及GromadzkaG等，Cerebrovasc Dis 2001；12235-39)已經(jīng)暗示了中風(fēng)和心臟病中的該硬化斑相關(guān)抗原，暗示體液免疫可能是觸發(fā)因素。
在動脈粥樣硬化中，硬化斑抗原免疫的復(fù)雜性被Schoenfeld Y等證實(shí)(Autoimmunity 2000；15199-202)，他們用HSP 65和β-2GPI免疫LDL受體缺乏(KO)的鼠，產(chǎn)生了很強(qiáng)的細(xì)胞和體液反應(yīng)，以及增強(qiáng)的硬化斑形成。類似的動脈粥樣化形成的增加在用硬化斑抗原被動轉(zhuǎn)移活化的淋巴細(xì)胞中觀察到了。上述研究沒有證實(shí)免疫耐受對動脈粥樣化形成過程的抑制。
在動脈粥樣硬化和相關(guān)疾病中對自身抗原免疫應(yīng)答的抑制已經(jīng)在最近得到研究。Victoria等(美國專利6,207,160和5,844,409)披露了缺少T細(xì)胞表位的特異非免疫原性β-2GPI肽用于降低免疫細(xì)胞的抗體結(jié)合并誘導(dǎo)APLS、SLE和其它疾病的B細(xì)胞耐受。然而，沒有證實(shí)獲得了真正的保護(hù)，而且公開的內(nèi)容強(qiáng)調(diào)的是非免疫原性肽的診斷用途。George J等(Atherosclerosis 1998；138147-52)證實(shí)了通過用MDA LDL的超免疫進(jìn)行免疫抑制并降低鼠動脈粥樣化形成是可行的。然而，需要不切實(shí)際的大劑量抗原，而且對用硬化斑抗原進(jìn)行免疫的反常應(yīng)答消除了這種治療方法的臨床功效。而且，上述研究沒有披露粘膜耐受的誘導(dǎo)用于治療動脈粥樣硬化。
口腔和粘膜耐受用于抑制和預(yù)防炎癥是本領(lǐng)域公知的。候選病癥、抗原和治療模式的例子可發(fā)現(xiàn)于例如Weiner等的美國專利5,935,577；5,397,771；4,690,683，以及Haas等的國際專利申請EP0886471 A1和WO 01821951。Shoenfeld等于1999年9月30日申請的美國專利申請09/806,400，在此全文引入，其中教導(dǎo)了口服硬化斑相關(guān)抗原用于在LDL受體缺乏鼠中誘導(dǎo)耐受。測定動脈脂肪紋損傷密度，發(fā)明者證實(shí)口服來自動物源的氧化LDL、β-2GPI和HSP 65每一種都能使動脈粥樣化的形成降低約30％。然而，通常，口服抗原存在許多障礙以獲得耐受和準(zhǔn)確劑量抗原通過消化起作用，在它們進(jìn)入淋巴集結(jié)的淋巴組織之前，濃度和分子結(jié)構(gòu)都改變了。而且，作者未能研究誘導(dǎo)耐受的其它施用途徑的效果，例如粘膜和鼻耐受。由于上述公開內(nèi)容清楚地表明，誘導(dǎo)口腔和粘膜耐受的參數(shù)不能從常規(guī)免疫的抗原活性或者甚至體外結(jié)果中推導(dǎo)出來，必須由深入的經(jīng)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)得出。實(shí)際上，許多研究已經(jīng)證實(shí)復(fù)雜性是免疫系統(tǒng)在處理“起反應(yīng)的和不起反應(yīng)的之間的平衡”中所固有的。Zivny等(Clin Immunol2001；101150-68)清楚的聲稱“一般而言，對一種(耐受誘導(dǎo))抗原的應(yīng)答并不必然預(yù)示對另一種的應(yīng)答”。同樣地，Hannihen等(Diabetes 2001；50771-75)觀察到，口腔、鼻腔和呼吸道施用抗原引起疾病癥狀(糖尿病)的出現(xiàn)，而不是誘導(dǎo)耐受。在粘膜耐受中的類似矛盾已經(jīng)被Fujihashi等(Acta Odontol Scand2001；59301-08)、Jiang HR等(Br J Ophthalmol 2001；85739-44)所報(bào)導(dǎo)。在粘膜接種策略中的問題已經(jīng)在最近得到回顧(Ogra PL等，Clin Microbiol Rev 2001；14430-45；Chen H等，J ControlRelease 2000；67117-28；以及Lehner T等，J Infect Dis 1999；179Suppl 3S489-92)。
在使本發(fā)明成為可實(shí)施的同時(shí)，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，鼻腔施加硬化斑相關(guān)分子引起了粘膜耐受的誘導(dǎo)、抗-硬化斑相關(guān)抗原免疫活性的抑制以及保護(hù)免于動脈粥樣硬化。粘膜耐受是有優(yōu)勢的，因?yàn)樗鼘?shí)施的更容易、劑量的精確性以及大大降低了由消化和代謝過程改變耐受分子的幾率(特別是非口服施用途徑)。這些優(yōu)勢提供了保護(hù)免于形成動脈粥樣化、改善了病人的順從性并降低了治療費(fèi)用。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種在患者例如人體內(nèi)誘導(dǎo)對硬化斑相關(guān)分子的免疫耐受的方法。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，該方法通過向患者(例如人體)施加治療有效量的至少一種硬化斑相關(guān)分子的一個(gè)抗原性部分而實(shí)現(xiàn)。
如這里使用的，術(shù)語“粘膜給藥”定義為將任何和所有的化合物和/或組合物施加到具有粘膜相關(guān)淋巴組織的成分的粘膜上。粘膜給藥的非限制性例子是口腔、鼻內(nèi)、耳(中耳)、結(jié)膜、陰道、直腸等。粘膜給藥不包括，例如，靜脈內(nèi)、皮下和硬膜外給藥。
如這里使用的，術(shù)語“硬化斑相關(guān)分子”被定義為與硬化斑相關(guān)病癥或疾病的病因、發(fā)病機(jī)理、癥狀和/或治療在物理或功能上相關(guān)的任何和所有的蛋白質(zhì)、糖類、脂和核酸分子，它們的一部分(抗原性部分)，它們的衍生物，或者其組合。這樣的分子可以是，例如，硬化斑成分例如氧化LDL、泡沫細(xì)胞組分等，但是也可包括體液和細(xì)胞實(shí)體，例如抗體、細(xì)胞因子、生長因子和T細(xì)胞受體。
如這里使用的，術(shù)語“抗原性部分”意指一種分子中能夠引起免疫反應(yīng)的部分。例如，在分子是一種蛋白質(zhì)(例如HSP 65，β-2GPI)的情況下，這樣的部分可以包含構(gòu)成抗原性表位的6-8個(gè)氨基酸片段。預(yù)測抗原性部分的方法是本領(lǐng)域公知的，例如，DNASTAR’S PROTEAN序列分析和預(yù)測模型(DNAStar，Madison，WI)。如此來說，確定適用于本發(fā)明的硬化斑相關(guān)分子的抗原性部分充分地落在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
硬化斑相關(guān)分子(及其片斷、類似物、部分和衍生物)可以從天然來源(它們通常發(fā)生的組織或器官)純化，也可使用重組DNA技術(shù)在細(xì)菌、酵母、昆蟲(例如桿狀病毒)和哺乳動物細(xì)胞中使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)獲得。許多潛在的和現(xiàn)實(shí)的硬化斑相關(guān)分子的氨基酸序列是已知的，例如人β-2GPI(Matsuura等，AccessionNo AAB21330)、HSP 65(Oliviera等，Accession No AF65546)以及人巨噬細(xì)胞LDL清除受體(NCBI Annotation Project，AccessionNo XP_008489)。
使用本方法建立的免疫耐受可被用于預(yù)防和/或治療與硬化斑形成相關(guān)的病癥，包括但不限于動脈粥樣硬化、動脈粥樣化心血管病、腦血管病、外周血管病、狹窄、再狹窄和支架內(nèi)狹窄。動脈粥樣化心血管病的一些非限制性的例子是心肌梗死、冠狀動脈病、急性冠狀綜合癥、充血性心力衰竭、心絞痛和心肌缺血。外周血管病的一些非限制性的例子是壞疽、糖尿病性血管病、缺血性腸病、血栓癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性腎病。腦血管病的非限制性的例子是中風(fēng)、腦血管炎癥、腦溢血和脊椎動脈不足。狹窄是血管系統(tǒng)閉塞疾病，通常由動脈粥樣化硬化斑和增強(qiáng)的血小板活性引起，最危急地影響冠狀血管系統(tǒng)。再狹窄是漸進(jìn)性的再次閉塞，經(jīng)常伴隨在狹窄的血管系統(tǒng)閉塞減少之后。在血管系統(tǒng)明顯需要支架機(jī)械支持的情況下，支架內(nèi)狹窄可能發(fā)生，重新閉塞治療過的血管。
幾種硬化斑相關(guān)分子適合用于本方法。例子包括但不限于修飾后的脂、磷脂和脂蛋白、載脂蛋白-脂復(fù)合體例如LDL-心磷脂，蛋白分子例如HSP和β-2GPI的特定表位，泡沫細(xì)胞表面抗原例如LDL受體以及平滑肌組分例如肌鈣蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的方法采用的硬化斑相關(guān)分子是氧化LDL、β-2GPI、HSP 65和/或其衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，至少兩種上述分子的組合被施加給患者。
本發(fā)明的方法可被用于預(yù)防和/或治療非動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病。例如，磷脂、磷脂代謝物和HSP 65已經(jīng)清楚地包括在發(fā)病機(jī)理中，因此潛在地可治療額外的、非動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病。這樣的疾病和綜合征包括老年氧化應(yīng)激(Onorato JM等，Annal N Y Acad Sci，1998年11月20；854277-90)，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(Paimela L等，Ann Rheum Dis，1996年8月；55(8)558-9)，早期風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Savolainen A等，1995；24(4)209-11)，炎癥性腸病(IBD)(Sawai T等，Pediatr Surg Int，2001年5月；17(4)269-74)，腎癌(Noguchi S等，Biochem Biophys Res Commun，1992年1月31；182(2)544-50)，靜脈和動脈血栓(Cabral AR等，Am J Med1996；101472-81)，抗磷脂綜合征(APLS或APS)(Koike T等，Ann Med 2000；32 Supp I27-31)，全身性紅斑狼瘡(分別為Krilis等和Victoria等的美國專利5,344,758和6,207,160)。因此，本發(fā)明的方法可用于預(yù)防和/或治療非動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病例如老年化、RA、早期RA、IBD、SLE、APLS、血栓和癌癥。
上述免疫耐受誘導(dǎo)的分子或分子組合可以本身施用，或者將它們與合適載體或賦形劑混合后以藥物組合物施用。
如這里使用的，“藥物組合物”意指所述的一種或多種活性組分與其它化學(xué)成分如生理適用的載體和賦形劑的制劑。本發(fā)明藥物組合物的目的是為了方便免疫耐受誘導(dǎo)的分子通過粘膜施加到生物體。
這里的術(shù)語“活性組分”意指硬化斑相關(guān)分子(例如氧化LDL、HSP65和β-2GPI)或其組合的產(chǎn)生生物效應(yīng)(免疫耐受)的至少一個(gè)抗原性部分。
在下文中，詞語“生理上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”可以互換使用，意指一種不會引起對生物體的明顯刺激以及不會消除所施加的化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。佐劑包括在這些詞語內(nèi)。
此處的術(shù)語“賦形劑”意指一種加入到藥物組合物的惰性物質(zhì)，以進(jìn)一步方便活性組分的施用。賦形劑的例子不限制性地包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和淀粉、纖維素衍生物、白明膠、植物油和聚乙二醇。
用于藥物配方和施用的技術(shù)可以見“Remington’sPharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，將其全文引入在此作為參考。
粘膜給藥的合適途徑可以包括例如直腸、口腔、陰道以及特別是經(jīng)鼻、耳、結(jié)膜和呼吸道的(包括輸尿管)給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備，例如通過傳統(tǒng)的混合、溶解、?；?、包糖衣、研磨、乳化、封入膠囊、包埋或者凍干加工的方式。
因此，用于本發(fā)明的藥物組合物可以傳統(tǒng)的方式配制，使用一種或多種生理上可接受的包含賦形劑和輔助劑的載體，其有助于將活性組分加工成可在藥學(xué)上使用的制劑。適當(dāng)?shù)呐浞揭蕾囉谒x擇的粘膜給藥途徑。
藥物組合物的活性組分可在水溶液中配制，優(yōu)選生理相容的緩沖液，例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液、或者生理鹽水緩沖液。與待滲透的載體相適應(yīng)的滲透劑可在配方中使用。這樣的滲透劑是本領(lǐng)域公知的。
為通過鼻吸入用藥，用于本發(fā)明的活性組分通過氣溶性噴霧的形式方便地輸送，該噴霧來自使用合適壓縮氣體的增壓包或噴霧器，壓縮氣體是例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或者二氧化碳。在增壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供一個(gè)輸送計(jì)量的閥門來確定。用于分配器的膠囊和藥筒，例如白明膠，可以配成包含化合物的粉劑混合物和合適的粉劑基質(zhì)例如乳糖或淀粉。
本發(fā)明的藥物組合物可以被施加到眼部的膜，例如結(jié)膜上。如此，組合物可以配成液態(tài)或半液態(tài)組合物，如上所述，用于使用例如滴藥器的應(yīng)用。無菌狀態(tài)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的滅菌方法來確保。
本發(fā)明的藥物組合物可以配成直腸和陰道組合物例如栓劑或者保留性灌腸劑，使用例如傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)，例如可可油或者其它甘油酯。
本發(fā)明的藥物組合物可通過吸入用藥。用于通過吸入用藥的耐受化試劑的配方例子提供于PCT/US90/07455，申請日1990年12月17日。用于吸入用藥的本發(fā)明的藥物配方可以包括，作為可選的成分，藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、穩(wěn)定劑和乳化劑、以及本領(lǐng)域公知類型的鹽。這樣的物質(zhì)的例子包括標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液，例如生理緩沖鹽溶液，以及水。
根據(jù)本發(fā)明的替換實(shí)施方案施用耐受化抗原的途徑是氣溶膠或吸入形式?？乖勺鳛楦煞垲w?；蜃鳛閼腋≡谳d體氣體(例如空氣或N2)中的噴霧狀水溶液。優(yōu)選的氣溶膠藥物配方可以包含例如生理上可接受的緩沖鹽溶液，其中含有約1mg到約300mg范圍之間的抗原。
精細(xì)分散的耐受化抗原固體粒子形式的干燥氣溶膠，其不溶于或懸浮于液體中，也可用于本發(fā)明的實(shí)施。耐受化抗原可以是噴粉的形式并包含精細(xì)分散的粒子，其平均粒徑大小在約1到5微米之間，優(yōu)選2到3微米之間。精細(xì)分散粒子可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過粉碎和篩選過濾而制備。粒子可以通過吸入預(yù)先確定量的精細(xì)分散物質(zhì)而使用，其可能是粉劑的形式。
在吸入用的藥物配方中有用的載體和/或稀釋劑的非限制性例子包括水和生理上可接受的緩沖鹽溶液例如磷酸鹽緩沖溶液pH7.0-8.0。用于本發(fā)明的吸入用的藥物配方或劑量形式的合適載體或稀釋劑的其它非限制性例子披露于Weiner等的美國專利5,935,577。
本發(fā)明的藥物配方可以氣溶膠噴霧的形式使用，例如噴霧器施用，例如由Weiner等披露的那些噴霧器(美國專利5,935,577)。該氣溶膠物質(zhì)由要治療的患者吸入。
其它氣溶膠輸送系統(tǒng)，例如增壓式配量劑量吸入器(MDI)和干粉吸入器，如披露于Newman，S.P.在Aerosols and the Lung，Clarke，S.W.和Davia，D.主編，197-224頁，Butterworths，倫敦，英國，1984，可用于實(shí)施本發(fā)明。這里披露的氣溶膠輸送系統(tǒng)類型可從許多商業(yè)來源獲得，包括Fiscons Corporation(Bedford，Mass.)，Schering Corp.(Kenilworth，N.J.)和American Pharmoseal Co.(Valencia，Calif.)。
在本發(fā)明上下文中使用的適當(dāng)藥物組合物包括這樣的組合物，其中包含的活性組分量要有效達(dá)到預(yù)期目的。更特別的，治療有效量意味著活性組分的量要有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)來預(yù)防、減輕或者改善疾病癥狀(例如動脈粥樣硬化)。
活性組分的最佳施用方法是根據(jù)這里披露的信息和公知的有關(guān)粘膜活性抗原和自身抗原施用的信息來確定的。治療劑量、組合和周期的途徑變化是在可測定動脈粥樣化發(fā)展嚴(yán)重性的條件下進(jìn)行的。有用的劑量和給藥參數(shù)是那些導(dǎo)致炎癥反應(yīng)降低的參數(shù)，包括自身反應(yīng)性T細(xì)胞數(shù)、或者疾病的至少一種臨床或組織的癥狀發(fā)生率或嚴(yán)重性的降低。
本發(fā)明的藥物組合物可配制成包含適用于治療或預(yù)防硬化斑相關(guān)疾病的治療有效量的額外化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，額外的化合物是HMGCoA還原酶抑制劑(抑制素)、粘膜佐劑(參見，例如Staats等的美國專利6,270,758)、皮質(zhì)醇、抗炎癥化合物(參見，例如Bandarage等的美國專利6,297,260)、鎮(zhèn)痛劑、生長因子、毒素以及額外的耐受化抗原。此外，可以理解的是，本發(fā)明的方法和組合物的使用不排除用于上述疾病或病癥的其它治療方法的初始或繼續(xù)治療，除非特別的相反暗示。
對用于本發(fā)明方法的任何制劑來說，治療有效量或劑量可從體外和細(xì)胞培養(yǎng)測試中初步估計(jì)。例如，劑量可在動物模型中配制來獲得期望的濃度或滴定量。這種信息可用于更確切地確定人體內(nèi)可用的劑量。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在治療中可結(jié)合細(xì)胞因子和非細(xì)胞因子增效劑來提高使用硬化斑相關(guān)分子的粘膜耐受效果。其它細(xì)胞因子增效劑(I型干擾素)的口服和非胃腸道給藥已經(jīng)描述于PCT/US95/04120，申請日1995年4月7日。Th2增強(qiáng)細(xì)胞因子的使用描述于PCT申請PCT/US95/04512，申請日1995年4月7日。例如，IL-4和IL-10可按照PCT/US95/04512中描述的方式使用。
這里描述的活性組分的毒性和治療功效可通過標(biāo)準(zhǔn)的體外藥學(xué)程序、在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中確定。劑量可隨使用的劑量形式和采用的用藥途徑而改變。精確的配方、用藥途徑和劑量可由每個(gè)醫(yī)師根據(jù)病人的情況選擇。(參見，例如，F(xiàn)ingl等，1975，于“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，第1章第1頁)。
服藥的量和時(shí)間間隔可個(gè)別調(diào)整以提供足以誘導(dǎo)耐受的活性組分的粘膜水平?！澳褪芑瘎┝俊睂⒃诿糠葜苿┲懈淖儯强赏ㄟ^體外數(shù)據(jù)估計(jì)。要獲得耐受化劑量的必要劑量將取決于個(gè)體特點(diǎn)和用藥途徑。檢測分析可用于確定血漿濃度。
取決于要治療的病癥的嚴(yán)重性和響應(yīng)性，服藥可以是一次或許多次，治療療程從幾天到幾周或者直到實(shí)現(xiàn)痊愈或獲得疾病狀態(tài)的減弱。
當(dāng)然，施用的組合物的量將依賴于受治療的患者、病癥的嚴(yán)重性、用藥的方式、開處方醫(yī)師的判斷等。
本發(fā)明的組合物可以，如果需要的話，以包裝袋或分配器的形式存在，例如FDA批準(zhǔn)的包裝，其可以包含含有活性組分的一個(gè)或多個(gè)單位劑量的形式。該包裝可以，例如，包含吸入器。該包裝或吸入器可附有用藥規(guī)程。該包裝或吸入器也可提供與內(nèi)容物相關(guān)的通告，其使用管理藥品生產(chǎn)、使用和銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式，該通告反映的是該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的組合物或者人或獸用的形式。這樣的通告，例如，可以是由美國食品與藥物局批準(zhǔn)的處方藥或者批準(zhǔn)的產(chǎn)品目錄標(biāo)簽。也可以制備包含配制在相容性藥物載體中的本發(fā)明制劑的組合物，置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校?biāo)記用于治療的病癥，如上面的進(jìn)一步詳述。
可以理解的是，本發(fā)明的耐受化組合物和方法的施用可以通過額外的非粘膜方法例如皮內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)應(yīng)用而實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種分析方法以用于確定硬化斑相關(guān)分子對動脈粥樣硬化相關(guān)疾病或病癥的粘膜給藥效果，該分析方法通過施加硬化斑相關(guān)分子或其組合物到患有這樣的疾病或病癥的患者、并測量動脈粥樣化形成或者發(fā)炎的至少一種指標(biāo)而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，硬化斑相關(guān)分子是氧化LDL、β-2GPI、HSP和/或其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分經(jīng)粘膜給藥，硬化斑相關(guān)分子是天然產(chǎn)生的或者合成的分子。
在本發(fā)明的分析方法中可被檢測的動脈粥樣化形成或發(fā)炎的指標(biāo)是本領(lǐng)域公知的。一些非限制性的例子是組織學(xué)方法例如脂肪紋損傷數(shù)，以及免疫學(xué)方法例如刺激指數(shù)，如在下面的實(shí)施例部分所述的。動脈粥樣硬化的發(fā)展可被檢測，例如，在以形成動脈粥樣化的食物維持的動脈粥樣硬化易感的鼠中(參見，例如，George J等，Circulation1999；992227-30)。發(fā)炎可通過本領(lǐng)域公知的細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子和遺傳技術(shù)檢測。
在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員研究下面的實(shí)施例后，本發(fā)明另外的目的、優(yōu)點(diǎn)、以及新穎的特征將成為顯而易見的，這些實(shí)施例并不打算有限制性。此外，各個(gè)實(shí)施例和上述的本發(fā)明的各個(gè)方面以及如后面權(quán)利要求部分所要求的，每一個(gè)都能在下面的實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例現(xiàn)在參考下面實(shí)施例，它們與上面的說明書一起，以非限制性的方式解釋發(fā)明。
一般地，這里使用的術(shù)語和在本發(fā)明中采用的實(shí)驗(yàn)方法包括生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明。參見，例如，“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.主編(1994)；“Current Protocols in Immunology”VolumesI-III Coligan J.E.主編(1994)；Stites等(主編)，“Basic andClinical Immunogy”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(主編)，“Selected Methods in CellularImmunology”，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；提供的免疫分析廣泛披露于專利和科學(xué)文獻(xiàn)，參見，例如，美國專利3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；以及“Methods in Enzymology”Vol.1-317，AcademicPress；Marshak等，所有這些都作為參考文獻(xiàn)引入，如同完全在這里公布的一樣。其它提供的通用參考文獻(xiàn)貫穿本文。其中的方法據(jù)信是本領(lǐng)域公知的，是為了讀者方便而提供的。其中包括的所有信息在此作為參考文獻(xiàn)引入。
材料和實(shí)驗(yàn)方法動物這些實(shí)驗(yàn)中使用的Apo-E缺乏鼠來自動脈粥樣硬化易感品系C57B/6J-Apo-Etm lunc。純合Apo-Etm lunc突變鼠表現(xiàn)為總血漿膽固醇水平的明顯增加，其不受年齡或性別的影響。主動脈中的脂肪紋在3月齡時(shí)被發(fā)現(xiàn)。損傷隨年齡而增加，損傷的發(fā)展帶來更少的脂肪和更多的伸長細(xì)胞，這些在前動脈粥樣化損傷的更晚期階段是典型的。
品系發(fā)育Apo-Etm lunc突變品系在Chapel Hill的北卡羅萊納大學(xué)的Nobuyo Maeda博士的實(shí)驗(yàn)室成長。使用了129個(gè)源于E14Tg2aES的細(xì)胞系。使用的質(zhì)粒命名為pNMC109，基礎(chǔ)品系是T-89。C57BL/6J品系是通過將Apo-Etm lunc突變體回交C57BL/6J鼠10次而產(chǎn)生的(11，12)。
這些鼠培養(yǎng)在Sheba醫(yī)院動物設(shè)備(Tel-Hashomer，Israel)中，在22-24℃以12小時(shí)光照/黑暗進(jìn)行循環(huán)，喂食包含0.027％膽固醇、約4.5％總脂肪以及任意水的實(shí)驗(yàn)室固體食物型脂肪食物(PurinaRodent實(shí)驗(yàn)室食物No.5001)。“Western食物”(TD 96125，HarlanTeklad，42％卡路里來自脂肪，43％來自糖類以及15％來自蛋白質(zhì))描述了一種標(biāo)準(zhǔn)化的、高脂肪的引起動脈粥樣化的食物。
鼻耐受鼻耐受通過鼻內(nèi)施用10μl總體積PBS的氧化LDL、β-2GPI或者HSP 65。鼻內(nèi)施用在溫和鎮(zhèn)靜的鼠(12-16周大)中進(jìn)行，每只鼠接受3劑量抗原，每一劑量都是規(guī)定的濃度，每隔一天用一劑。從最后一次鼻內(nèi)施用后的那天開始，在施用Western食物5周后誘導(dǎo)了動脈粥樣化形成。對照鼠按規(guī)定以同樣的方式接受等量的BSA和/或PBS。按照下面所述，在Western喂食5周后，從所有鼠中獲得的血漿樣本用于檢測膽固醇和三酰甘油酯水平，并處死這些鼠用于檢測動脈粥樣硬化。
口服耐受作為對比，對硬化斑相關(guān)分子的口服耐受通過以鼻耐受相似的方式隔日喂食3劑量抗原進(jìn)行(口服耐受誘導(dǎo)的詳細(xì)說明，參見Shoenfeld的美國專利申請09/806,400，申請日1999年9月30日)。
抗原制備β-2GPI人β-2GPI按Gharavi等所述從健康成人血清純化(JClin Invest 1992；921105-09)。
氧化LDL人LDL(密度＝1.019-1.063g/l)從禁食個(gè)體的血漿中制備，通過制備性超速離心(50,000rpm/min，22min)、漂洗、對150mM EDTA pH7.4透析、過濾(0.22μm孔徑)去除聚集體，并貯于氮?dú)庀?。LDL的氧化通過將不含EDTA的透析的LDL與硫酸銅(10μm)在37℃孵育24小時(shí)進(jìn)行。脂蛋白氧化的確認(rèn)通過硫代巴比妥酸活性物質(zhì)(TBARS)的分析進(jìn)行，其測定丙醛(MDA)等價(jià)物。
HSP65重組分枝桿菌HSP-65，如所述制備(Prohaszka Z等，IhtImmunol，1999；111363-70)，由德國Braunschweig的M.Singh博士友好提供。
免疫用人β-2GPI皮下免疫人β-2GPI如上所述從人血漿中制備。人β-2GPI溶于PBS并與等體積的弗氏不完全佐劑混合以用于免疫。免疫的進(jìn)行通過一次性皮下注射0.1ml體積的10μg抗原/鼠。在最后一次粘膜施用硬化斑相關(guān)分子之后三天，鼠接受一次免疫，并在免疫后10天處死。
膽固醇水平的確定在實(shí)驗(yàn)完成時(shí)，通過心臟穿刺獲得1-1.5ml血，放入含EDTA的小瓶中，離心以分離血漿?？傃獫{膽固醇水平使用自動化酶技術(shù)確定(Boehringer，Mannheim，德國)。
FPLC分析脂蛋白的膽固醇和脂肪含量的快速蛋白質(zhì)液相層析分析(Fast Protein Liquid Chroma tography)使用FPLS系統(tǒng)(Pharmacia LKB.FRAC-200，Pharmacia，Peapack，NJ)上的superose 6 HR 10/30柱(Amersham Pharmacia Biotech，Inc，Peapack，NJ)進(jìn)行。在樣品小瓶中需要300μl最小樣品體積(匯合3只鼠的血，1∶2稀釋并在上柱前過濾)用于自動化樣品儀以完全充滿200μl的樣品回路。收集10-40小份，每份含0.5ml。從每份取250μl樣品分別與新鮮制備的膽固醇試劑或三酰甘油酯試劑混合，在37℃孵育5分鐘并在500nm分光光度分析。
動脈粥樣硬化的檢測動脈粥樣化脂肪紋損傷的量化通過計(jì)算如前所述的主動脈竇中的損傷尺寸(George J等，Circulation，1999；992227-30)并通過計(jì)算主動脈中損傷尺寸來進(jìn)行。簡單地說，在用Tris EDTA鹽溶液灌注后，從動物上割除心臟和主動脈并仔細(xì)清除周圍脂肪。心臟上部植入OCT培養(yǎng)基(10.24％w/w聚乙烯醇；4.26％w/w聚乙二醇；85.50％w/w非活性成分)并冰凍。貫穿主動脈竇(400μm)的每隔一個(gè)切片(10μm厚)用于分析。主動脈竇的遠(yuǎn)端通過連接主動脈和心臟的三個(gè)瓣尖來識別。切片用油紅O染色后估測脂肪紋損傷。每個(gè)切片的損傷由記錄未識別編號樣本的觀測者在表格上記錄。從心臟上切除主動脈并去除周圍的不定型組織。按前述進(jìn)行主動脈固定和血管的蘇丹染色(George J等，Circulation，1999；992227-30)。
增殖分析鼠服用所述測試抗原以用于檢測動脈粥樣硬化，然后用0.1ml PBS中的10μg β-2GPI皮下免疫(在最后的抗原施用后三天進(jìn)行一次)，β-2GPI是按上述從人β-2GPI純化的。
在用β-2GPI免疫十天后如下進(jìn)行增殖分析流動的腹股溝淋巴結(jié)通過在100孔的網(wǎng)篩上過篩組織來制備。紅血細(xì)胞用冷的無菌雙蒸水(6ml)溶解30秒，加入2ml 3.5％的NaCl。加入不完全培養(yǎng)基(10ml)，細(xì)胞在1,700rpm離心7min，懸浮于RPMI培養(yǎng)基并以1∶20稀釋(10μl細(xì)胞+190μl臺盼藍(lán))后在血球計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。增殖測定通過將[3H]胸苷摻入96孔微量滴定板中100μl充滿細(xì)胞(1×106細(xì)胞/ml)的三重測定樣品的DNA中進(jìn)行。加入β-2GPI(10μg/ml，100μl/孔)的三重測定樣品，細(xì)胞孵育72小時(shí)(37℃，5％CO2以及約98％的濕度)并加入10μl的[3H]胸苷。在又孵育一天后，收集細(xì)胞，用收集儀(Brandel)將其轉(zhuǎn)移到玻璃纖維過濾器，用β-計(jì)數(shù)儀(Lumitron)計(jì)數(shù)。通過將[3H]胸苷在孵育的最后12h摻入DNA測定增殖。結(jié)果表示為刺激指數(shù)(S.I.)抗原的平均放射性(cpm)與沒有抗原時(shí)獲得的平均背景值(cpm)的比值。標(biāo)準(zhǔn)偏差總是小于平均值的10％。
統(tǒng)計(jì)分析單向ANOVA測試用于比較獨(dú)立的數(shù)值。P＜0.05可以承認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
實(shí)施例1遺傳易感染(Apo-E缺乏)鼠動脈粥樣化形成的抑制，其通過用低劑量的硬化斑相關(guān)分子氧化LDL、人β-2GPI和HSP 65誘導(dǎo)鼻耐受本發(fā)明人在此首次證實(shí)，鼻施用低劑量硬化斑相關(guān)分子氧化LDL、人β-2GPI和HSP 65提供了對抗原耐受的誘導(dǎo)，并明顯抑制動脈粥樣化形成。因此，比較了鼻施用純化的氧化LDL、人β-2GPI和重組分枝桿菌HSP 65在抑制Apo-E缺乏鼠的動脈粥樣化形成上的效果。63只9-13周齡的Apo E/C 57鼠被分為5組。在A組(HSP-65)(n＝12)鼻耐受的誘導(dǎo)按照“材料和方法”中所述通過在5天中隔日施用懸浮于PBS中的重組分枝桿菌HSP 65(10μg/鼠/10μl)進(jìn)行。在B組(H-oxLDL)(n＝14)鼻耐受的誘導(dǎo)按照“材料和方法”中所述通過在5天中隔日施用懸浮于PBS中的氧化的純化人LDL 10μg/鼠/10μl進(jìn)行。在C組的鼠中(β-2GPI)(n＝13)，每只鼠接受10μg/鼠/10μl人β-2GPI，按照“材料和方法”中所述在5天中隔日通過鼻內(nèi)施用。在D組的鼠中(BSA)(n＝12)，每只鼠接受10μg/鼠/10μl牛血清白蛋白(BSA)，按照“材料和方法”中所述在5天中隔日通過鼻內(nèi)施用。在E組的鼠中(PBS)(n＝12)，每只鼠接受10μl PBS，通過鼻內(nèi)施用。鼠在喂食前(0時(shí)間)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束(結(jié)束)時(shí)放血來確定脂分布。在最后喂食8周后，如上所述檢測心臟和主動脈中的動脈粥樣硬化。在實(shí)驗(yàn)過程中，鼠每2周稱重。所有的鼠喂食任意的水以及包含4.5％重量脂肪(0.02％膽固醇)的正常固體食物，直到最后的抗原施用，然后喂食“Western食物”直到處死。
表1通過施用極低劑量硬化斑相關(guān)分子抑制Apo-E缺乏鼠的動脈粥樣化形成
注“重量”是克重量；“Chol”是血清膽固醇以及“TG”是血清三酰甘油酯，表示為mg/dL。
從圖1可見，表1中描述的結(jié)果證實(shí)，與施用陰性對照抗原(BSA)或PBS的對照鼠相比，在接受鼻施用低劑量(10μg/鼠)硬化斑相關(guān)抗原的鼠組織中測得了動脈粥樣化形成的顯著有效抑制。而且，鼻耐受在其保護(hù)模式上是特別的明顯地，鼻耐受的誘導(dǎo)對其它測得的通用參數(shù)沒有明顯的效果，例如體重增加、三酰甘油酯或膽固醇的血水平。因此，抗原性硬化斑相關(guān)分子氧化LDL、β-2GPI和HSP 65是鼻耐受的極好的潛在誘導(dǎo)劑，具有令人驚訝的低劑量(10μg/鼠)并且短暫施用(3天)而獲得明顯抑制(超過65％)，并保護(hù)這些遺傳易感染的Apo-E缺乏鼠不形成動脈粥樣化。
實(shí)施例2用HSP 65誘導(dǎo)的鼻耐受對遺傳易感染的(Apo-E缺乏)鼠動脈粥樣化形成的抑制本發(fā)明人在此首次證實(shí)，鼻施用極低劑量硬化斑相關(guān)分子HSP 65提供了對抗原耐受的出色誘導(dǎo)，并抑制動脈粥樣化形成。因此，比較了鼻施用低劑量和極低劑量重組人HSP 65在抑制Apo-E缺乏鼠的動脈粥樣化形成上的效果。58只12-16周齡的Apo E/C 57鼠被分為4組。在A組(HSP-65高)(n＝14)鼻耐受的誘導(dǎo)按照“材料和方法”中所述通過在5天中隔日施用10μg/鼠/10μl懸浮于PBS中的重組人HSP65進(jìn)行。在B組(HSP-65低)(n＝16)鼻耐受的誘導(dǎo)按照“材料和方法”中所述通過在5天中隔日施用1μg/鼠/10μl懸浮于PBS中的重組人HSP 65進(jìn)行。在C組的鼠(BSA)(n＝14)每只鼠接受1μg/鼠/10μl BSA，在5天中隔日通過鼻內(nèi)施用。在D組的鼠(PBS)(n＝14)每只鼠接受10μl PBS，通過鼻內(nèi)施用。鼠在喂食前(0時(shí)間)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束(結(jié)束)時(shí)放血來確定脂分布。在最后喂食8周后，如上所述檢測心臟和主動脈中的動脈粥樣硬化。在實(shí)驗(yàn)過程中，鼠每2周稱重。所有的鼠喂食任意的水以及包含4.5％重量脂肪(0.02％膽固醇)的正常固體食物，直到最后的抗原施用，然后喂食“Western”食物直到處死。
表2通過鼻內(nèi)施用人HSP 65而抑制Apo-E缺乏鼠的動脈粥樣化形成
注“重量”是克重量；“Chol”是血清膽固醇以及“TG”是血清三酰甘油酯，表示為mg/dL。
從圖2可見，表2中描述的結(jié)果證實(shí)，與施用陰性對照抗原(BSA)或PBS的對照鼠相比，在接受鼻施用極低劑量(1μg/鼠)HSP 65的鼠組織中測得了動脈粥樣化形成的優(yōu)異抑制效果。而且，鼻耐受在其保護(hù)模式上是特別的明顯地，鼻耐受的誘導(dǎo)對其它測得的通用參數(shù)沒有明顯的效果，例如體重增加、三酰甘油酯或膽固醇的血水平。因此，抗原性硬化斑相關(guān)分子HSP 65是鼻耐受的極好的潛在誘導(dǎo)劑，具有甚至極低劑量而提供的明顯(大約70％)的保護(hù)這些遺傳易感染的Apo-E缺乏鼠不形成動脈粥樣化，比通過口服耐受誘導(dǎo)獲得的保護(hù)(30％；參見Shoenfeld等的美國專利申請09/806,400，申請日1999年9月30日)更加優(yōu)異。
實(shí)施例3通過鼻內(nèi)施用人β-2GPI對遺傳易感染的(Apo-E缺乏)鼠的特異抗-β-2GPI免疫反應(yīng)的抑制由粘膜施用硬化斑相關(guān)分子誘導(dǎo)的耐受可以通過對這些硬化斑相關(guān)分子抗原性部分的特異免疫應(yīng)答的抑制而被介導(dǎo)。在Apo-E缺乏鼠中測定應(yīng)答粘膜(鼻和口)施用人β-2GPI的淋巴細(xì)胞增殖。9只雄性的5周齡Apo E/C 57缺乏鼠被分為3組。在A組(n＝3)口服耐受的誘導(dǎo)如上所述通過在5天中隔日管飼法施用100μg/鼠懸浮于0.2mlPBS中的β-2GPI進(jìn)行。在B組(n＝3)鼻耐受的誘導(dǎo)如上所述通過在5天中隔日鼻內(nèi)施用10μg/鼠懸浮于10μl PBS中的β-2GPI進(jìn)行。在C組的鼠(n＝3)在5天中隔日接受口服200μl PBS。在最后喂食一天后，所有鼠的免疫反應(yīng)的刺激通過如上面“材料和方法”部分所述用人β-2GPI免疫來進(jìn)行。免疫后十天，收集淋巴結(jié)用于增殖分析。所有的鼠喂食包含4.5％重量脂肪(0.02％膽固醇)的正常固體食物以及任意的水。
表3用純化的人β-2GPI鼻內(nèi)預(yù)處理，抑制了Apo-E缺乏鼠中對人β-2GPI的免疫應(yīng)答
從圖3可見，表3中描述的結(jié)果證實(shí)了對人β-2GPI抗原免疫活性的明顯抑制，測量是通過對Apo-E缺乏鼠中淋巴結(jié)增殖抑制進(jìn)行的。接受鼻施用動脈粥樣化形成抑制低劑量(10μg/鼠)人β-2GPI的鼠的淋巴細(xì)胞在用β-2GPI免疫后，顯示了極度降低的刺激指數(shù)，這是與口服施用和對照(PBS)鼠相比來說的。因?yàn)榍懊娴挠帽悄褪苷T導(dǎo)的研究已經(jīng)表明，對測得的其它參數(shù)沒有明顯的影響，例如重量增加、三酰甘油酯或膽固醇的血水平、或者免疫能力(參見上述實(shí)施例)，這些結(jié)果顯示了抗-β-2GPI免疫活性的特別抑制。因此，鼻內(nèi)施用純化的硬化斑相關(guān)分子β-2GPI是一種更優(yōu)異的方法，來減弱這些遺傳易感染的Apo-E缺乏鼠中免疫原性的以及形成動脈粥樣化的硬化斑相關(guān)分子的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體的實(shí)施例作出了描述，顯然，許多替代、修飾和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，它打算包括所有落在所附權(quán)利要求的精神和范圍之內(nèi)的替代、修飾和改變。在本說明書中提到的所有出版物、專利、專利申請以及由登記號標(biāo)識的序列在此全文引入說明書作為參考文獻(xiàn)，就完全如同每個(gè)出版物、專利、專利申請或者由登記號標(biāo)識的序列都逐一地以及單獨(dú)地顯示為引入在此作為參考文獻(xiàn)。此外，本申請中任何參考文獻(xiàn)的引用或者標(biāo)識不應(yīng)該被解釋為承認(rèn)該參考文獻(xiàn)是提供來作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化、心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病、狹窄、再狹窄和/或支架內(nèi)狹窄的藥物組合物，包含治療有效量的至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分作為活性組分，或者其藥學(xué)上的鹽，該組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體，該藥物組合物設(shè)計(jì)用于粘膜給藥。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的硬化斑相關(guān)分子選自氧化LDL、β-2-GPI、HSP及其衍生物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的抗原性部分是天然產(chǎn)生的分子或合成的分子。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中藥物組合物配制為用于鼻、呼吸道、耳和/或結(jié)膜給藥。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分選擇為降低患者對硬化斑組分的免疫反應(yīng)。
6.權(quán)利要求1的組合物，其被包裝并標(biāo)識，用于預(yù)防和/或治療至少一種病癥，選自動脈粥樣硬化、心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病、狹窄、再狹窄和/或支架內(nèi)狹窄。
7.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含治療有效量的至少一種額外的化合物，選自HMGCoA還原酶抑制劑(抑制素)、粘膜佐劑、皮質(zhì)醇、抗炎癥化合物、鎮(zhèn)痛劑、生長因子、毒素、以及額外的耐受化抗原。
8.一種用于確定粘膜給藥硬化斑組分對動脈粥樣硬化相關(guān)疾病或病癥的效果的分析方法，該分析方法包括(a)向患有動脈粥樣硬化相關(guān)疾病或病癥的患者粘膜給藥至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分，以及(b)測量所述患者中至少一種動脈粥樣硬化的指標(biāo)，據(jù)此確定粘膜施加所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分對動脈粥樣硬化相關(guān)疾病或病癥的效果。
9.權(quán)利要求8的分析方法，其中所述的硬化斑相關(guān)分子選自氧化LDL、β-2-GPI、HSP及其衍生物。
10.權(quán)利要求8的分析方法，其中所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的抗原性部分是天然產(chǎn)生的分子或合成的分子。
11.一種預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化、心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病、狹窄、再狹窄和/或支架內(nèi)狹窄的方法，該方法包括向患者粘膜給藥治療有效量的至少一種硬化斑相關(guān)分子的至少一個(gè)抗原性部分。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的硬化斑相關(guān)分子選自氧化LDL、β-2-GPI、HSP及其衍生物。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的所述抗原性部分是天然產(chǎn)生的分子或合成的分子。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的所述抗原性部分的施用是通過鼻、呼吸道、耳和/或結(jié)膜途徑實(shí)現(xiàn)的。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的所述抗原性部分的施用，降低了所述患者對所述至少一種硬化斑相關(guān)分子的免疫反應(yīng)。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述的至少一種硬化斑相關(guān)分子的所述抗原性部分與治療有效量的化合物一起施用，該化合物選自HMGCoA還原酶抑制劑(抑制素)、粘膜佐劑、皮質(zhì)醇、抗炎癥化合物、鎮(zhèn)痛劑、生長因子、毒素、以及額外的耐受化抗原。
全文摘要
提供了方法和組合物，其采用有效誘導(dǎo)粘膜耐受并且抑制那些引起動脈粥樣化血管疾病和后遺癥的炎癥過程的硬化斑相關(guān)分子。
文檔編號A61P9/00GK1501810SQ02805950
公開日2004年6月2日 申請日期2002年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月4日
發(fā)明者D·哈拉特斯, J·喬治, D 哈拉特斯 申請人:脈管生物生長有限公司