專利名稱：蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來自哺乳動物的具有蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶活性的多肽、此多肽的抗體和編碼具有蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶活性的多肽的mRNA的互補DNA或RNA序列的用途，用于調(diào)節(jié)ATP-檸檬酸裂合酶和治療相關病理生理功能。
背景技術：
翻譯后修飾如蛋白質(zhì)磷酸化提供了一個重要的機制，通過它可以控制蛋白質(zhì)的功能活性，繼而調(diào)節(jié)生物過程。蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶參與各種細胞功能的調(diào)節(jié)，這些細胞功能包括分化、生長控制、腫瘤啟動、細胞周期和細胞死亡。新陳代謝或合成代謝途徑中關鍵酶的特定殘基的磷酸化/去磷酸化已顯示出是上調(diào)或下調(diào)這些酶的主要機制。
ATP-檸檬酸裂合酶(ACL；EC 4.1.3.8)，提供胞質(zhì)乙酰輔酶A的關鍵酶，是由四個明顯一樣的亞基組成的四聚體(Singh，M.等(1976)J.Biol.Chem.，251，5242-5250)，在肝臟、腦和腎中活性最高(Srere，P.A.(1959)J.Biol.Chem.234，2544-2547)。熱量的攝入和胰島素可引起ACL基因表達和蛋白含量在轉錄水平上提高，而饑餓和糖尿病卻使其降低(Towle，H.C.等(1997)Annu.Rev.Nutr.17，405-433；Rosiers，S.D.等(1995)J.Biol.Chem.，270，10027-10033)。該酶有三個磷酸化調(diào)節(jié)位點，體內(nèi)ACL的這些位點的磷酸化能改變它對營養(yǎng)物、激素環(huán)境和在分化期間的反應(Benjamin，W.B.等(1994)Biochem.J.，300，477-482)。
ACL在胞質(zhì)中催化檸檬酸和輔酶A生成乙酰輔酶A和草酰乙酸，同時，ATP水解成ADP和磷酸。這一步是胞質(zhì)乙酰輔酶A的主要來源，乙酰輔酶A用于碳水化合物、脂肪酸、膽固醇和乙酰膽堿的生物合成途徑。該酶遵從的機制為形成磷酸化酶中間產(chǎn)物(Plowman，K.M.等，(1967)J.Biol.Chem.242，4239-4247；Wells，T.N.C.(1991)Eur.J.Biochem.199，163-168)，該中間產(chǎn)物在總反應的第一步時，由底物ATP對該酶的催化位點磷酸化得到。該磷酸化位點在His 760(Williams，S.P.等(1985)Biochem.，24，5527-5531)。
最近的發(fā)現(xiàn)表明ACL可能在糖原異生作用中也起重要的作用，因為它催化形成大部分的胞質(zhì)草酰乙酸——主要的糖原異生前體(Rosiers，S.D.等(1995)J.Biol.Chem.，270，10027-10033)。此外，通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)中檸檬酸的濃度，使ACL的活性發(fā)生改變，不但能通過抑制磷酸果糖激酶的活性調(diào)節(jié)糖酵解(Comte，B.等(1997)J.Biol.Chem.，272，26117-26124)，而且能通過變構活化乙酰輔酶A羧化酶調(diào)節(jié)脂肪酸的生物合成(Reilly，D.I.等(1997)Prog.Lipid Res.，35，371-385)。
ACL催化的反應是用于脂肪生成和膽固醇生成的乙酰輔酶A的關鍵供給者。研究表明，抑制該酶導致膽固醇和脂肪酸的合成減少以及低密度脂蛋白受體的活性增加，這暗示ACL抑制劑具有作為低脂血癥藥物(Berkout，T.A.等(1990)Biochem.J.，272，181-186)、誘導體重降低的藥物(WO 97/18806)或肥胖癥治療藥物的潛力。
此外，ACL參與的一個重要途徑是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的合成。由ACL轉化檸檬酸生成的乙酰輔酶A受胞質(zhì)中膽堿乙酰轉移酶的作用而和膽堿結合。因為乙酰膽堿的缺乏是阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease)的一個特征，且用乙酰膽堿酯酶抑制劑可改善臨床癥狀(Bartus，R.T.等(1982)Science，217，408-414)，故ACL可能在阿爾茨海默氏病和其他類型癡呆癥中起重要的作用。在不同器官的癌中，發(fā)現(xiàn)脂肪酸合酶的表達水平很高(Kuhajda，F(xiàn).P.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，91，6379-6383；Rashid，A.等(1997)Am.J.Pathol.，150，201-208；Pizer，E.S.等(1998)Cancer 83，528-537)。因此假設可通過抑制脂肪酸合成而抑制高水平合成脂肪酸的腫瘤細胞的生長(Pizer，E.S.等(2000)Cancer Res.，60，213-218；Kuhajda，F(xiàn).P.等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97，3450-3454)。在WO 94/02108中報道，抑制脂肪酸合成可抑制腫瘤細胞的生長，這意味著ACL抑制劑可作為潛在的抗腫瘤藥物。在US 5,143,907中有相似的發(fā)現(xiàn)，在此亞磷酸鹽-硼烷化合物的抗腫瘤和消炎作用被認為與抑制細胞質(zhì)中脂肪酸和膽固醇的合成有關。而且，慢性代謝酸中毒的低檸檬酸尿癥和腎皮質(zhì)組織中ACL酶活性的升高有關，且通過抑制該酶活性可部分逆轉(Melnick，J.Z.等(1996)J.Clin.Invest.，98，2381-2387)。這些結果表明，該酶在近端小管檸檬酸代謝中起重要作用，調(diào)節(jié)ACL酶活性可能是治療低檸檬酸尿癥的一個途徑。
根據(jù)上述，很顯然ACL是許多生物化學途徑中的關鍵酶，調(diào)節(jié)ACL的活性對治療各種疾病非常重要。
因此，本發(fā)明的目的就是提供ACL酶活性調(diào)節(jié)劑的用途、調(diào)節(jié)ACL酶活性的新方法和藥物以及使用這些化合物生產(chǎn)治療和ACL酶的活性提高或降低相關的病理生理功能的藥物，這些病理生理功能如高脂血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、肥胖癥、炎癥、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和低檸檬酸尿癥。
基于下面詳細描述，本發(fā)明的其他目的對本領域技術人員是顯而易見的。
這些目的可基于下面意外的發(fā)現(xiàn)而實現(xiàn)ACL是最近報道的蛋白——人蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶(hPHP)和它的同源變體的底物，而且hPHP通過使ACL磷酸化的組氨酸殘基脫磷酸而調(diào)節(jié)ACL的活性。
因此，本發(fā)明提供了具有hPHP活性的多肽的用途，用于調(diào)節(jié)ACL酶活性。
此外，本發(fā)明提供了抑制hPHP活性的化合物，如hPHP或其片斷的抗體或者編碼具有hPHP活性的多肽的mRNA序列的互補DNA序列的用途，用于調(diào)節(jié)ACL的酶活性。
本發(fā)明還提供了具有hPHP活性或可抑制hPHP活性的化合物的用途，用于生產(chǎn)調(diào)節(jié)ACL酶活性的藥物。
本發(fā)明也提供了具有hPHP活性的多肽或可抑制hPHP活性的化合物或包含這些化合物的藥物的用途，用于治療和ACL酶活性升高或降低相關的病理生理狀況如高脂血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、肥胖癥、炎癥、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和低檸檬酸尿癥。
本發(fā)明也提供治療和ACL酶活性升高或降低相關的病理生理狀況如高脂血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、肥胖癥、微生物感染、炎癥、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和低檸檬酸尿癥的方法，包括給病人服用有效治療量的有hPHP活性的多肽或者能抑制hPHP活性的化合物或者包含這些化合物的藥物。
哺乳動物蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶(hPHP)和其同源變體見WO00/52175(Seq.NO.2-8)。該蛋白表觀分子量為14,000且N-末端封閉。
分離、純化、鑒定(第7頁第10行到第10頁第10行)以及制備抗體(第7頁第13-30行)的方法也在該申請中講述。
由于ACL是hPHP的脫磷酸化活性的底物，該磷酸酶可用于調(diào)節(jié)ACL的活性，因此，hPHP或具有hPHP活性的多肽和含有該多肽的藥物組合物可用于治療和ACL酶活性升高或降低有關的病理生理功能，這些病理生理功能如高脂血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、肥胖癥、炎癥、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和低檸檬酸尿癥。
本發(fā)明同樣包括hPHP的片斷、變體和突變體，這些片斷、變體和突變體的抗體和所述片斷、變體和突變體的mRNA序列的互補DNA或RNA序列在調(diào)節(jié)ACL酶活性中的用途。這些hPHP的片斷、變體和突變體可通過在基本保持生物學活性的情況下，如隨機或受控的替換，不同的剪切，刪除或加入一個或多個核苷酸或氨基酸得到。
這樣，本發(fā)明涉及使用具有hPHP活性的多肽以調(diào)節(jié)ACL酶活性，該多肽至少含有下列的氨基酸序列基元DCECLGGGRISHQSQD另外一個優(yōu)選的調(diào)節(jié)ACL酶活性的具有hPHP活性的多肽至少含有下列氨基酸序列基元
DCECLGGGRISHQSQDX1KIHVYGYSMX2YGX3AQH其中，X1＝K或R，X2＝A或G，X3＝P或R。
另外一個優(yōu)選的調(diào)節(jié)ACL酶活性的具有hPHP活性的多肽至少含有下列氨基酸序列基元YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.
所有這些部分序列在全酶氨基酸序列中都高度保守，而且認為它們參與了所述酶的活性位點或者在哺乳動物中具有其他生物的或藥物的相關性。
一個特別優(yōu)選的調(diào)節(jié)ACL酶活性的具有hPHP活性的多肽含有下列氨基酸序列(M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY序列N-末端的甲硫氨酸殘基不是必需的。
本發(fā)明的另外一個目的是提供針對上述任何一個氨基酸序列的抗體，優(yōu)選人源化單克隆抗體的用途，用于抑制hPHP磷酸酶活性，并因此間接調(diào)節(jié)ACL。這些抗體可以用本領域所熟知的技術制得。
針對hPHP的抗體，如針對具有氨基酸序列CLGGGRISHQDK的hPHP活性位點的抗體(見WO 00/52175第13頁18行，Seq.No.10)或針對上面提到的氨基酸序列之一的抗體可以用來抑制hPHP磷酸酶活性，從而間接調(diào)節(jié)ACL。
本發(fā)明的另外一個目的是提供編碼hPHP的mRNA的互補DNA序列或化學修飾過的DNA序列的用途，用于抑制hPHP的翻譯并因此間接調(diào)節(jié)ACL。這個DNA序列可容易的從WO 00/52175中所描述的hPHP DNA序列(Seq.No.1)得到，且可能具有下列序列之一I)TACCGCCACC GCCTGGAGCG AGAGTAAGGA CTACACCTGT AGCTGAGGCTGCCGCAGAAG TTCATACACG ACTAGGCTCA GGTGAGCCGA GGGGCGAGGCCCCGAGGCCG ACGTCTCTCG TTCCTCTAGC ACGCGCCGAT GTTCACCCGACTCATGGTAC GCCTGTAGAT GCTGTTTCAC AGCCCGCTGT ACGTCTTCGTTCCGACGCTG ACACTCACAG ACCCGCCGCC CGCGTAGAGG GTGGTCTCAGTCCTGTTCTT CTAAGTGCAC ATGCCGATAA GGTACCGGAT ACCAGGACGGGTCGTGCGGT AAAGTTGACT CTTTTAGTTTC GGTTCATGGG GCTGATGCTCCAGTGGACCC GATTGCTGCC GATGII) CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTGIII)CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTGTTCTTCTAAGTG CACATGCCGA TAAGGTACCG GATACCAGGA CGGGTCGTGIV)ATGGTACGCC TGTAGATGCT GTTTCACAGC CCGCTGTACG TCTTCGTTCCGACGCTGACA CTCACAGACC CGCCGCCCGC GTAGAGGGTG GTCTCAGTCCTGTTCTTCTA AGTGCACATG CCGATAAGGT AC這些DNA序列可用本領域中所熟知的技術得到。
上面提到的天然的以及重組的多肽、抗體或DNA序列可以用于患有和ACL酶活性提高或降低相關的病理生理功能的病人，這些病理生理功能如高脂血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、肥胖癥、微生物感染、炎癥、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和低檸檬酸尿癥，這些化合物可以直接使用，也可以在包含所述化合物和藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥物組合物中使用。
此處的術語“藥學上可接受的載體”是指惰性的、無毒的固體或液體填充劑，稀釋劑或包囊材料，它們不和活性化合物或病人發(fā)生有害的反應。本領域中熟知適宜的，優(yōu)選地液體載體，如無菌水、鹽水、右旋糖水溶液、糖溶液、醇、二醇和油，包括來自石油、動物、植物或合成的油，如花生油、大豆油和礦物油。
根據(jù)本發(fā)明的制劑可以以單位劑量形式施用，其中含常規(guī)的、無毒的、藥學上可接受的載體、稀釋劑、輔料和典型用于胃腸外給藥的賦形劑。
這里術語“胃腸外的”包括皮下的、靜脈的、關節(jié)內(nèi)的和氣管內(nèi)的注射和輸液技術。同時，其他給藥方式如口服給藥和局部用藥也是合適的。胃腸外組合物和組合最優(yōu)選通過靜脈給藥，以快速濃注(bolus)的形式或者以恒定輸注形式根據(jù)已知方式進行。
當本發(fā)明的化合物配制成片劑、膠囊或粉末時，可使用通常的載體和賦形劑如碳酸鎂、碳酸鈣、碳酸氫鈉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉、乳糖、微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素淀粉鈉和無水硅石；潤滑劑如水化蓖麻油、硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和糖、果膠、糊精、黃蓍膠、低熔點蠟、可可油、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、季銨化合物等以及粘合劑如淀粉、葡萄糖、阿拉伯樹膠和甘露醇?？砂凑毡绢I域熟知的方法給片劑或膠囊加包衣。
口服液體制劑可以呈水性或油性懸浮液、溶液、乳液、糖漿或酏劑形式，或者也可以是干藥，用前用水或其他合適的載體重構。這種液體制劑可以含有常規(guī)添加劑如懸浮劑、乳化劑、非水性載體和防腐劑。
局部用藥可以為水性或油性懸浮液、溶液、乳液、凝膠或優(yōu)選為乳膏。
根據(jù)本發(fā)明，單位劑量可以包含每天所需量的本發(fā)明化合物，或含有其多個亞劑量以構成所需劑量。對于特定病人(哺乳動物，包括人)，最佳治療可接受劑量和給藥速度取決于多種因素，比如所用特定活性化合物的活力、病人年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時間和途徑、清除率、酶活性(單位/毫克蛋白)、治療目的(即治療或預防)以及待治療疾病的性質(zhì)，這些因素是本領域技術人員已知的。
因此，在用于(體內(nèi))治療病人的組合物或組合中，本發(fā)明活性化合物的藥物有效日劑量在約0.01和100毫克/千克體重之間，優(yōu)選為0.1至10毫克/千克體重。根據(jù)本申請，形成的一個單劑量可以含有0.01到10毫克活性化合物。
本發(fā)明的ACL酶活性調(diào)節(jié)劑可以用于治療癌癥病人，所述癌的脂肪酸合成水平上升或者依賴于內(nèi)源性脂肪酸。適于治療的典型的癌包括膀胱、唾液腺、皮膚附件、膽管、子宮頸內(nèi)膜、子宮頸陰道部和陰道、食道、鼻咽以及口咽的癌，或者來自生殖細胞的癌，以及間皮瘤。特別的，胃、子宮內(nèi)膜、腎、肝和肺的癌或腺癌以及黑色素瘤可以根據(jù)本發(fā)明治療。乳腺、結腸和直腸、前列腺和卵巢的腺癌特別適用于該療法。
這些細胞的內(nèi)源性脂肪酸的合成速度優(yōu)選為每分鐘每200,000個細胞引入大于10f摩爾的乙酰輔酶A到?；视椭?。可鑒定出優(yōu)選的病人，因為他們的腫瘤含有的細胞表達ACL或別的脂肪酸合成途徑酶，如乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的水平比周圍正常(如非瘤的)組織中的水平要高。這些細胞是攻擊性腫瘤細胞，可導致存活降低、轉移增加、臨床復發(fā)率升高和總的預后變壞。由于許多腫瘤細胞非常依賴內(nèi)源性脂肪酸的合成，故對于降低脂肪酸合成的活性水平而言無需將特定腫瘤排除在本發(fā)明活性化合物的治療候選對象外。ACL抑制劑將使脂肪酸的合成降低或停止。其結果是剝奪膜脂而導致細胞死亡。然而，正常細胞由于能夠引入循環(huán)的脂肪而存活下來。
癌細胞中ACL的存在可通過任何合適的方法檢測，包括活性測定或染色，利用抗-ACL抗體的免疫分析、測定ACL mRNA的分析等等。
可以直接測定通過如活組織檢查、切除術或針吸引術得到的腫瘤組織樣品中ACL的表達，可用的測定法如免疫組織化學、細胞質(zhì)酶免疫測定或放射免疫測定、具有ACL序列的靶mRNA與核酸探針的原位雜交，或者直接測定酶的活性?？捎煤线m的測定方法在來自病人的液體生物樣品中間接測定腫瘤的ACL表達，這些生物樣品如血、尿、血清、淋巴、唾液、精液、腹水或特別是血漿。
在癌，特別是最為惡性的癌中廣泛存在需要內(nèi)源性合成脂肪酸的細胞。盡管最好在治療前測定ACL的存在，但熟練的臨床醫(yī)生將明了這種測定并不總是需要。用ACL抑制劑治療癌癥病人導致腫瘤負擔的減少，說明腫瘤中存在ACL。這種癌癥的經(jīng)驗性治療也在本發(fā)明的期望之內(nèi)。
將本發(fā)明的ACL酶活性的調(diào)節(jié)劑和其他化療藥物聯(lián)合使用也是有用的。因為現(xiàn)今還沒有可用的特別有效針對脂肪酸合酶途徑的癌癥化療藥，本發(fā)明的化合物可作為已有抗癌藥物，特別是針對其他合成代謝或分解代謝途徑的抗代謝藥物的補充。
根據(jù)本發(fā)明，可以和本發(fā)明化合物一起使用的化療藥物包括具有抗瘤作用即，防止瘤細胞發(fā)展、成熟或擴散的藥物，這些藥物可以直接地如通過抑制細胞生長或細胞毒效應作用于腫瘤細胞，及間接地如通過生物應答修飾等機制起作用。根據(jù)本發(fā)明，化療藥物優(yōu)選為天然或合成的化合物，但不排除生物分子，如蛋白質(zhì)、抗體、趨化因子、細胞因子、多肽等。大量處于商業(yè)應用、臨床評估和臨床前開發(fā)狀況的化療藥物也包含在本發(fā)明中。
化療藥物的例子包括，烷化劑，如氮芥、氮丙啶化合物、烷基磺酸酯和具有烷化作用的其他化合物，如亞硝基脲、順鉑、甲氮咪胺；抗代謝物，如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，如，長春花生物堿和鬼臼毒素衍生物；細胞毒性抗生素和喜樹堿衍生物。優(yōu)選的化療藥物或化療包括阿米斯丁(ethyol)、順鉑、甲氮咪胺(DTIC)、放線菌素、甲二氯三乙胺(氮芥)、鏈脲霉素、環(huán)磷酰胺、carrnustine(BCNU)、環(huán)己亞硝脲(CCNU)、阿霉素(adriamycin)、阿霉素脂(doxil)、吉西他濱(gemzar)、柔紅霉素、柔紅霉素脂(daunoxome)、甲基芐肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊甙、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、長春花堿、長春新堿、爭光霉素、紫杉醇(taxol)、多烯紫杉醇(taxotere)、阿地流津、天冬酰胺酶、二甲磺酸丁酯、卡鉑、克拉屈濱、喜樹堿、CPT-11，10-羥基-7-乙基-喜樹堿(SN38)、甲氮咪胺、氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、伊達比星、美司鈉、α-干擾素、β-干擾素、伊立替康、二羥基蒽酮、托泊替堪、亮丙瑞林、甲地孕酮、左旋苯丙氨酸氮芥、硫基嘌呤、光輝霉素、鄰對二氯苯二氯乙烷、培加帕酶、噴司他丁、哌泊溴烷、光輝霉素、鏈脲霉素、他莫昔芬、替尼泊甙、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、三胺硫磷、尿嘧啶氮芥、維諾利賓、苯丁酸氮芥和它們的組合物。
本發(fā)明的ACL酶活性調(diào)節(jié)劑還可能用于治療高膽固醇脂血癥和/或高脂血癥病人，并防止病情進一步發(fā)展成如動脈粥樣硬化和胰腺炎，還可用于治療代謝性疾病如肥胖癥。
甚至治療中度II型高膽固醇脂血癥也能夠減少冠心病的死亡率和發(fā)病率，這已被廣泛認可。
血漿中低密度脂蛋白濃度升高是II型高膽固醇脂血癥的標志，該癥由很多遺傳和環(huán)境的因素引起，這些因素導致LDL合成增加、LDL代謝減少或者兩者都有?，F(xiàn)今對高膽固醇脂血癥的療法是刺激LDL的代謝(膽酸螯合劑和HMG-CoA還原酶抑制劑)和抑制LDL的合成(煙酸和maxepa魚油)。
本發(fā)明的化合物通過調(diào)節(jié)ACL酶活性而抑制膽固醇的合成和脂肪酸的合成，從而降低血漿膽固醇和甘油三酯的水平。因此，本發(fā)明提供使用ACL酶活性抑制劑在治療中的用途，特別是在治療混合型高脂血癥(IIb型)中用來降低血清甘油三酯和膽固醇的水平。而且，預期本發(fā)明化合物的使用可能在防止病情進一步發(fā)展成如動脈粥樣硬化和胰腺炎以及治療代謝性疾病如肥胖癥中有好的效果。
此外，本發(fā)明的化合物可以用于通過刺激脂肪氧化而促進脂肪消耗，因為通過抑制ACL酶活性可使到達細胞質(zhì)的乙酰輔酶A很少，這就限制了丙二酸單酰輔酶A的獲得，丙二酸單酰輔酶A是肉堿酯酰轉移酶——線粒體中脂肪燃燒的必需酶——的抑制劑。低水平的丙二酸單酰輔酶A促進了脂肪酸的降解，因此，本發(fā)明的化合物能促進脂肪消耗。該效果可由下面的事實支持肝臟中脂肪酸氧化的活化也傾向于刺激糖原異生，糖原異生轉而補充肝臟中貯存的肝糖原并向大腦中樞發(fā)送飽滿感信息。因此，本發(fā)明提供了ACL酶活性抑制劑的用途，以促進脂肪消耗和作為食欲抑制劑。
而且，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物的用途，用于治療神經(jīng)退行性疾病。比如，阿爾茨海默氏病是一組遺傳異質(zhì)型漸進性致死神經(jīng)疾病，其特征是在病理上表現(xiàn)為在大腦中積累淀粉狀斑塊，在臨床上為近記憶受損而導致癡呆和死亡。除了和遺傳相關的阿爾茨海默氏病，還有一些沒有明顯家族病史的散發(fā)病例。比如，頭部創(chuàng)傷后或刺激細胞因子白細胞介素-1產(chǎn)生的炎癥疾病后會發(fā)生典型阿爾茨海默氏病的病理變化。該疾病早期癥狀是近記憶的喪失，伴隨著可解釋此早期近記憶受損的海馬細胞受損和死亡。利用磁共振成像技術測定海馬體積表明，在臨床記憶缺失發(fā)作之前海馬萎縮就已經(jīng)開始，且在兩年(癥狀在此期間首次出現(xiàn))里進行性發(fā)展，海馬體積每年減少大約8％。臨床上診斷阿爾茨海默氏病就是以近記憶的損傷和顳頁中海馬部分的病變?yōu)橐罁?jù)的。
盡管家族性或散發(fā)性阿爾茨海默氏病是老齡人群中主要的癡呆癥，但是也發(fā)現(xiàn)了其他類型的癡呆癥。這些包括但不限于伴隨著Pick病的額顳的退化，血管性癡呆癥、路易斯小體老年性癡呆癥、引起額萎縮的帕金森老年癡呆癥、進行性核上麻痹和皮質(zhì)基底變性和阿爾茨海默氏病相關的唐氏綜合癥。在海綿狀腦病如CJD、瘙癢病和BSE中也有斑塊的形成。
除了淀粉樣斑塊，腦中乙酰膽堿水平的降低是阿爾茨海默氏病的另一個病理特征。用乙酰膽堿酯酶抑制劑治療對癥狀有一定的改善，推測該抑制劑可能增加了在大腦邊緣系統(tǒng)前面部分中起源于隔核并穿過布羅卡斜角帶而進入海馬的膽堿能傳出。
通過刺激ACL酶活性可能達到相同效果，因為形成乙酰膽堿所必需的乙酰輔酶A來自檸檬酸向乙酰輔酶A和草酰乙酸的酶轉化。
由于觀察到亞磷酸鹽-硼烷化合物的消炎效果可能是和抑制細胞質(zhì)脂肪酸和膽固醇的合成有關(US 5,143,907)，本發(fā)明因此還提供了本發(fā)明的化合物在治療炎癥中的用途。
根據(jù)本發(fā)明，非限制性的炎癥例子有急性腎小球腎炎、急性滑膜炎、成人呼吸窘迫綜合癥、動脈粥樣硬化、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性溶血性貧血、支氣管炎、惡病體質(zhì)、結膜炎、伴有急性炎性成分的皮膚病、痛風性關節(jié)炎、移植物抗宿主疾病、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、血液透析、炎性腸病如局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎、胰島素依賴型糖尿病、白細胞去除術、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、壞死性小腸結腸炎、器官/組織移植排斥、骨關節(jié)炎、皮炎、銀屑病關節(jié)炎、牛皮癬、賴特爾綜合癥、反應性關節(jié)炎、Raynaud綜合癥、風濕熱、風濕性關節(jié)炎、鼻炎、風疹性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、創(chuàng)傷性關節(jié)炎、血管炎和眼色素層炎。
而且，本發(fā)明的化合物還可用于治療低檸檬酸尿癥，因為已證實慢性代謝酸中毒可提高腎皮質(zhì)ACL的活性和蛋白豐度，且該酶的上調(diào)在低檸檬酸尿癥的形成中起重要的作用。因此，本發(fā)明的化合物可用于治療低檸檬酸尿癥。
附圖簡述

圖1對底物ACL的hPHP依賴型去磷酸化；無和有hPHP的去磷酸化；道1對照(無hPHP)，2280納克hPHP，3210納克hPHP，4140納克hPHP，570納克hPHP，628納克hPHP。該蛋白表觀分子量為約120kDa，以hPHP濃度依賴型方式去磷酸化。
圖2鑒定ACL；左邊放射自顯影(灰色斑點)后和考馬斯亮藍染色的凝膠電泳后的重疊圖；1分子標記，2大鼠肝臟可溶提取物，3部分純化的ACL；右邊考馬斯亮藍染色的凝膠電泳；1分子標記，2大鼠肝臟可溶提取物。ACL用箭頭指示。
實施例實例1hPHP底物的鑒定為了鑒定脊椎動物hPHP1的底物，篩選了32P標記的兔肝臟提取物。兔肝臟提取物根據(jù)出版的操作方案標記，以選擇性的得到組氨酸殘基磷酸化的蛋白質(zhì)(FEBS Lett 1995；364，63-3)。這可通過用酸和堿處理印跡在PVDF膜上的蛋白質(zhì)后放射自顯影來證實。加入hPHP選擇性導致蛋白質(zhì)去磷酸化，該蛋白質(zhì)在SDS膠上遷移到110K處。將hPHP底物蛋白分離后鑒定為ATP-檸檬酸裂合酶(ACL)。已知ACL在催化過程中在組氨酸764處自磷酸化。
實例2PHP分析制備磷酸化的磷酸酶底物cheA。用Sephadex G-50柱除去未摻入的[γ-32P]ATP。將hPHP在含有0.6納克[32P]cheA(0.21皮摩爾[32P]/毫升)，25毫摩爾/升pH7.5的TEA，10毫摩爾/升MgCl2和0.1％β-巰基乙醇的40微升反應混合物中37℃孵育30分鐘。加入10微升0.5摩爾/升EDTA和150微升甲醇/丙酮(1∶1)中止反應，于15,000g離心5分鐘，上清液用于分析[32P]含量。將PHP稀釋以使磷酸的釋放保持在線性范圍(＜25％)。
包括110K的磷酸酶底物的兔肝臟可溶性提取物用上述方法磷酸化。15微升去磷酸化反應包括5-50納克PHP，25毫摩爾/升pH7.5的TEA，0.1％β-巰基乙醇和60微克磷酸化的提取物。37℃，30分鐘后通過加入樣品緩沖液終止反應。反應產(chǎn)物通過10％SDS-PAGE后放射自顯影分析。
實例3hPHP的純化及其底物兔肝臟可溶性提取物用作起始物質(zhì)。緩沖液A由20毫摩爾/升TEA，1毫摩爾/升EDTA，0.1％β-巰基乙醇，0.02％pH7.5的NaN3(其中補充有NaCl或Mg2+)組成。緩沖液A用于除Blue Sepharose 6 Fast Flow過程(此時含有0.1毫摩爾/升EDTA(緩沖液B))外的所有純化步驟中。
將提取物加到SOURCE 30Q上，用緩沖液A加0.2摩爾/升NaCl洗脫。含有hPHP活性的部分用90％(NH4)2SO4濃縮后用HiLoad 26/60Superdex 75層析，所用緩沖液為緩沖液A。將11-21K的洗脫體積合并，調(diào)節(jié)到10毫摩爾/升Mg2+，加到用含10毫摩爾/升Mg2+的緩沖液B平衡過的Blue Sepharose上。用補加0.2M NaCl的緩沖液B洗脫hPHP。
按照已描述的方法(Hoffmann，G.E.等(1979)Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.360，1445-51)用Source 30Q、Hiload 26/60 Superdex 200和MonoQ將ACL部分純化。
實例4抗組氨酸磷酸酶抗體制備針對蛋白質(zhì)不同區(qū)域的抗組氨酸磷酸酶抗體。用標準FMOC-化學合成肽。將每種肽注射(4次注射)到兩只兔體內(nèi)以進行免疫然后取四個血樣。最后一次取血是大約3個月后。所制備的抗體對組氨酸磷酸酶的檢測和定位很有用。
此外，可單獨分析分子中不同區(qū)域。特別是對于組氨酸磷酸酶中含有下列氨基酸序列的高度保守的中間部分DCECLGGGRISHQSQD該保守區(qū)域被認為含有負責體內(nèi)蛋白質(zhì)功能的活性位點。針對這個區(qū)域的抗肽抗體有抑制或中和的作用。
權利要求
1.對磷酸組氨酸高度專一的具有蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶(PHP)生物活性的多肽或同源變體的用途，用于調(diào)節(jié)ATP-檸檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)的活性。
2.根據(jù)權利要求1的多肽的用途，該多肽分子量為13,000-15,000。
3.根據(jù)權利要求1的多肽的用途，該多肽至少含有選自下面的氨基酸序列基元I)DCECLGGGRISHQSQDX1KIHVYGYSMX2YGX3AQH其中，X1＝K或R，X2＝A或G，X3＝P或R或者II)DCECLGGGRISHQSQD或III)(M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY
4.抗根據(jù)權利要求1到3任一項的具有蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶活性的多肽的抗體或其片斷的用途，用于調(diào)節(jié)ATP-檸檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)的活性。
5.和蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶的mRNA互補的DNA序列，其至少具有下列序列之一I)TACCGCCACC GCCTGGAGCG AGAGTAAGGA CTACACCTGT AGCTGAGGCTGCCGCAGAAG TTCATACACG ACTAGGCTCA GGTGAGCCGA GGGGCGAGGCCCCGAGGCCG ACGTCTCTCG TTCCTCTAGC ACGCGCCGAT GTTCACCCGACTCATGGTAC GCCTGTAGAT GCTGTTTCAC AGCCCGCTGT ACGTCTTCGTTCCGACGCTG ACACTCACAG ACCCGCCGCC CGCGTAGAGG GTGGTCTCAGTCCTGTTCTT CTAAGTGCAC ATGCCGATAA GGTACCGGAT ACCAGGACGGGTCGTGCGGT AAAGTTGACT CTTTTAGTTTC GGTTCATGGG GCTGATGCTCCAGTGGACCC GATTGCTGCC GATGII) CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTGIII)CTGACACTCA CAGACCCGCC GCCCGCGTAG AGGGTGGTCT CAGTCCTGTTCTTCTAAGTG CACATGCCGA TAAGGTACCG GATACCAGGA CGGGTCGTGIV) ATGGTACGCC TGTAGATGCT GTTTCACAGC CCGCTGTACG TCTTCGTTCCGACGCTGACA CTCACAGACC CGCCGCCCGC GTAGAGGGTG GTCTCAGTCCTGTTCTTCTA AGTGCACATG CCGATAAGGT AC
6.根據(jù)權利要求5的DNA序列的用途，用于抑制蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶的翻譯，以及調(diào)節(jié)ATP-檸檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)的活性。
7.根據(jù)權利要求1到5之任一項的化合物的用途，用于生產(chǎn)治療易受ATP-檸檬酸裂合酶(EC 4.1.3.8)活性調(diào)節(jié)影響的病理生理狀況的藥物。
8.根據(jù)權利要求7的化合物的用途，其中病理生理狀況選自高脂血癥、高膽固醇血癥、心血管疾病、肥胖癥、炎癥、腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和低檸檬酸尿癥。
9.根據(jù)權利要求1到5任何之一的化合物的用途，用于生產(chǎn)控制體重、促進脂肪消耗和抑制食欲的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自哺乳動物的具有蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶活性的多肽、此多肽的抗體和編碼具有蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶活性的多肽的mRNA的互補DNA或RNA序列的用途，用于調(diào)節(jié)ATP－檸檬酸裂合酶和治療相關病理生理功能。
文檔編號A61K38/00GK1494588SQ02806066
公開日2004年5月5日 申請日期2002年3月4日 優(yōu)先權日2001年3月8日
發(fā)明者R·克爾納, S·克隆普, ∑, R 克爾納 申請人:默克專利有限公司