專利名稱：血小板糖蛋白IBα融合多肽和其利用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及治療或預(yù)防與血管相關(guān)的紊亂的組合物和方法，更具體地說涉及含有起源于血小板糖蛋白IBα的多肽的組合物和利用它們的方法。
背景技術(shù)：
與血管有關(guān)的紊亂的不利后果如休克，心臟病發(fā)作，和動脈硬化被認(rèn)為至少部分是不合適地引發(fā)了血管炎癥和修復(fù)應(yīng)答引起的。血管炎癥和修復(fù)應(yīng)答包括在血液自由循環(huán)中正常發(fā)現(xiàn)的各種類型的細(xì)胞之間的黏連相互反應(yīng)。這樣的相互反應(yīng)的例子有，可以在血小板，白細(xì)胞和血管的內(nèi)壁(即，血管內(nèi)皮)之間可以發(fā)生的相互反應(yīng)。在高的液體剪切力條件下，血小板通過在它們表面的糖蛋白(GP)Ib-IX-V復(fù)合物與存在于暴露的血管內(nèi)皮上存在的von Willebrand因子(vWF)之間的相互作用黏附于內(nèi)皮上。相反，白細(xì)胞可以直接或間接地通過開始黏附到vWF固定的血小板來黏附于激活的內(nèi)皮。在兩種情況中，結(jié)合黏附受體的選擇素或整合素類別的白細(xì)胞表面分子介導(dǎo)了這些黏附事件。白細(xì)胞-血小板黏附認(rèn)為部分是通過白細(xì)胞表面整合素分子，血小板表面GPIb-IX-V復(fù)合物的MacI和GP1b成分的相互反應(yīng)來進(jìn)行的。
在對血管紊亂如，動脈硬化斑捕獲或機(jī)械損傷，例如，如氣球成形術(shù)，stent植入，缺血損傷或狹窄的應(yīng)答中，白細(xì)胞和血小板可以在血管損傷位點(diǎn)積累，并且相互提供多個(gè)黏附底物。白細(xì)胞和血小板的這一積累導(dǎo)致局部因子的產(chǎn)生，包括例如，有絲分裂素，細(xì)胞因子，和趨化因子，引起其他不必要的血管疾病的發(fā)展。
發(fā)明概要本發(fā)明部分是基于發(fā)現(xiàn)了抑制血小板與白細(xì)胞的黏附的糖蛋白-Ibα-起源的融合蛋白質(zhì)。因此，糖蛋白-Ibα-起源的融合蛋白質(zhì)可以用于治療與血管炎癥，凝血，動脈硬化，和氣球成形術(shù)相關(guān)的再狹窄相關(guān)的血管癥狀。該多肽，本文稱為糖蛋白Ibα融合多肽。
在一方面，本發(fā)明提供了包括第一個(gè)多肽的糖蛋白Ibα融合多肽，其中至少包括一個(gè)糖蛋白Ibα多肽的區(qū)域，該區(qū)域與第二個(gè)多肽可操作地連接。第二個(gè)多肽優(yōu)選地形成了多體，例如，二體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二個(gè)多肽至少包括一個(gè)免疫球蛋白多肽的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)包括GP1b302-Ig(SEQ ID NO1)，Gp1b302A-Ig(SEQ ID NO2)，GP1b302/4X-Ig(SEQ ID NO3)，GP1b209Ig(SEQ ID NO4)，GP1b290/2V-Ig(SEQ ID NO5)，或GP1b290/1A-Ig(SEQ ID NO6)的序列，或其片段，同源物，類似物或衍生物。這些多肽的序列如下
GP1b302/IgMPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTVVKFPTKARPHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO1)GP1b302/2A-IgMPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVAATATVVKFPTKARPHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO2)GP1b302/4X-IgMPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQVVDVKAVTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVAATATVVKFPTKARPHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO3)
GP1b290-IgMPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRPHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO4)GP1b290/2V-IgMPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQVVDVKAVTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRPHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO5)GP1b290-1A-IgMPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVAAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRPHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO6)同時(shí)本發(fā)明提供了抑制白細(xì)胞與生物組織的黏附的方法，包括將白細(xì)胞與本發(fā)明的糖蛋白Ibα融合多肽接觸，白細(xì)胞的接觸量是足以抑制白細(xì)胞和生物組織的黏附的量。
在另一方面，本發(fā)明提供了治療與血小板激活相關(guān)的紊亂的方法。該方法包括對受試者給藥有效量的糖蛋白Ibα融合多肽。
同時(shí)包括在本發(fā)明中的是編碼糖蛋白Ibα融合多肽的核酸，以及含有糖蛋白Ibα融合多肽-編碼核酸的載體，和含有本文所述的載體或核酸的細(xì)胞。
同時(shí)包括在本發(fā)明中的有包括糖蛋白Ibα融合多肽的藥物組合物，以及特異地識別糖蛋白Ibα融合多肽的抗體。
除非特別定義，本文利用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的技術(shù)人員一般理解的相同的意義，雖然與本文所述的相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡梢杂糜诒景l(fā)明的實(shí)踐或?qū)嶒?yàn)中，適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡梢匀缦滤觥Ｋ械墓_物，專利申請，專利，和其他本文提到的參考文獻(xiàn)以全文引入作為參考。在有矛盾的情況中，本申請書，包括其中的定義，將作為參照。另外，材料，方法，和實(shí)施例僅僅作為說明，不打算用來限制，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將可以從下面的詳細(xì)說明中和權(quán)利要求中明了。
附圖的簡要說明

圖1是顯示從用含有GP1b302-Ig編碼區(qū)的哺乳動物表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞分泌的GP1b302-Ig融合蛋白質(zhì)的純化的考馬斯亮蘭染色的凝膠的圖解。
圖2是用凝膠過濾柱(GFC)洗脫的GP1b302-Ig融合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)A的純化的凝膠的圖解。GFC能夠從下面的帶(胰蛋白酶裂解片段，帶7)中分離上面的帶(完整的融合蛋白質(zhì)，帶4)。
圖3是證實(shí)從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞分泌的各種GP1b-Ig融合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解程度的已調(diào)節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)基的western影印的圖解。
圖4是描述測量血小板聚集的UV光譜的圖解。
圖5是顯示在體內(nèi)的Folts模型實(shí)驗(yàn)中，在平均LCX流動方式上單個(gè)大丸劑注射各種濃度的GPIb290/2V-Ig融合蛋白的效果的圖。箭頭顯示了藥物注射的時(shí)間。
圖6是描述具有高液體剪切血流的損傷的冠狀動脈的圖解。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了用于抑制血小板和白細(xì)胞與生物組織如血管內(nèi)皮的黏附的糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)或編碼融合蛋白質(zhì)的核酸可以摻入藥物組合物，并且可以對受試者給藥抑制糖蛋白Ibα配體(如，Von Willebrand因子，Mac-1，P-選擇或凝血素)和糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)在細(xì)胞如血小板表面上的相互反應(yīng)。抑制結(jié)合也抑制了糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)介導(dǎo)的血小板聚集，并且與體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。
糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)可以用于調(diào)節(jié)糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)同質(zhì)配體的生物可得性。糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)配體/糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)相互反應(yīng)的抑制特別可用于治療血管炎癥和其他與血小板激活相關(guān)的血管紊亂。
糖蛋白Ibα融合多肽在各個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括至少含有與第二個(gè)多肽可操作地連接的一部分糖蛋白Ibα多肽的第一個(gè)多肽。如本文所用，糖蛋白Ibα“融合蛋白質(zhì)”或“嵌合蛋白質(zhì)”至少包括一部分糖蛋白Ibα多肽，它們與非糖蛋白Ibα多肽可操作地連接?！疤堑鞍譏bα多肽”指具有與至少一部分糖蛋白Ibα多肽對應(yīng)的氨基酸序列，而“非糖蛋白Ibα多肽”指具有與糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)基本不同源的蛋白質(zhì)對應(yīng)的氨基酸序列的多肽，這些蛋白質(zhì)例如與糖蛋白Ibα多肽或片段不同并且起源于同一或不同的生物體的蛋白質(zhì)。在糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)內(nèi)，糖蛋白Ibα多肽可以與Ibα蛋白質(zhì)的所有或部分相對應(yīng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)至少包括糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)的一個(gè)生物活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)至少包括糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)的兩個(gè)生物活性部分。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)至少包括糖蛋白Ibα蛋白質(zhì)的三個(gè)生物活性部分。在融合蛋白質(zhì)內(nèi)，術(shù)語“可操作地連接”打算表示化學(xué)地連接的第一個(gè)和第二個(gè)多肽(最通常是通過共價(jià)鍵如肽鍵)，連接的方式是允許至少一個(gè)官能團(tuán)與糖蛋白Ibα多肽連接。當(dāng)用于指編碼糖蛋白Ibα融合多肽的核酸時(shí)，術(shù)語可操作地連接指編碼糖蛋白Ibα多肽和非糖蛋白Ibα多肽的核酸在閱讀框架內(nèi)相互融合。非糖蛋白Ibα多肽可以與糖蛋白Ibα多肽的N末端或C末端融合。
在其他實(shí)施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)可以連接到一個(gè)或多個(gè)其他成分上。例如，糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)可以另外連接GST融合蛋白質(zhì)，其中糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)序列是與GST(即，谷硫氨酸S-轉(zhuǎn)移酶)序列的C末端融合。這樣的融合蛋白質(zhì)可以簡化糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)的純化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)包括在異源的信號序列的5‘末端中(即，多肽序列不存在于糖蛋白Ibα核酸編碼的多肽中)。例如，可以除去天然的糖蛋白Ibα信號序列，并且可以用來自另一個(gè)蛋白質(zhì)的信號序列來取代。在一些寄主細(xì)胞(例如，哺乳動物寄主細(xì)胞)中，糖蛋白Ibα的表達(dá)和/分泌可以通過利用異源信號序列來增強(qiáng)。
本發(fā)明的嵌合或融合蛋白質(zhì)可以用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。例如，編碼不同的多肽序列的DNA片段是根據(jù)常規(guī)的技術(shù)在閱讀框架內(nèi)連接的，這些技術(shù)例如利用末端鈍化或末端交錯(cuò)切口的末端來連接，限制酶消化；來提供適當(dāng)?shù)哪┒?，如果恰?dāng)填充在粘合的末端，堿性磷酸酶處理來避免不需要的連接，和酶連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合基因可以通過常規(guī)技術(shù)來合成，包括自動DNA合成儀?；蛘?，可以利用隨后退火和再擴(kuò)增產(chǎn)生嵌合基因序列的兩個(gè)連續(xù)的基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)突出的錨引物堿性基因片段的PCR擴(kuò)增(參見例如，Ausubel et al(eds)，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，1992)。另外，許多表達(dá)載體是商業(yè)可得的，編碼融合成分(例如，免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域)。編碼核酸的糖蛋白Ibα可以克隆進(jìn)這樣一個(gè)表達(dá)載體，以致融合成分與免疫球蛋白在框架內(nèi)連接。
在各種實(shí)施方案中，糖蛋白Ibα融合多肽包括SEQ ID NO1-6的一個(gè)或多個(gè)序列的氨基酸序列。
糖蛋白Ibα融合多肽可以作為寡聚物存在，如二體或三體。優(yōu)選地，糖蛋白Ibα融合多肽是二體。
編碼第一個(gè)多肽的第一個(gè)多肽和/或核酸可以利用GPIbα編碼序列構(gòu)建，這是本領(lǐng)域已知的，并且在例如歐洲專利申請公開物No.0317 278 A2和Lopez et al.845615-19，1987中有敘述。GPIbα多肽的其他來源和編碼GPIbα多肽的核酸包括基因庫登記號BAB12038和AB038516，D85894和BA12911(人序列)，和基因庫登記號AAC53320和U91967，并且以全文引入作為參考。
在一些實(shí)施方案中，GPIbα多肽成分作為變異體GPIbα多肽提供，GPIbα多肽在天然存在的GPIbα序列(野生型)中具有一個(gè)突變，導(dǎo)致GPIβα多肽與白細(xì)胞表面分子的高親和力(相對于非突變序列)的結(jié)合。例如，突變的多肽可以高親和力結(jié)合VonWillebrand因子(vWF)。這一增強(qiáng)的反應(yīng)性，或超應(yīng)答性可以來源低濃度的瑞斯托菌素可以獲得的。或者，確定多肽與vWF的反應(yīng)性的任何其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ部梢杂糜阼b定與vWF具有“更多”反應(yīng)性的多肽，即比天然存在的野生型GPIbα具有更多的反應(yīng)性。高親和力結(jié)合vWF的GPIbα多肽變異體的例子包括在GPIbα多肽的鉸合區(qū)具有序列變化的GPIbα變異體。鉸合區(qū)定義為包括殘基220-310的區(qū)域，并且報(bào)道是GPIbα多肽內(nèi)的大的結(jié)合位點(diǎn)。在結(jié)合區(qū)的突變包括在殘基233的那些，它在野生型GPIbα中編碼甘氨酸。纈氨酸取代甘氨酸233是優(yōu)選的，但其他氨基酸也可以被取代。在鉸合區(qū)的第二個(gè)突變位點(diǎn)是殘基239，它在野生型GPIbα中編碼甲硫氨酸。纈氨酸取代甘氨酸239是優(yōu)選的，其他氨基酸也可以被取代。適于在本發(fā)明的融合多肽中利用的GPIbα多肽的鉸合區(qū)域突變體在位置233和239具有突變燕麥殘基(參見例如，Dong et al.，JBC 2753627663-27670(2000))。所以，本發(fā)明包括在位置239具有取代的融合蛋白，例如突變體GPIbα多肽的M239V取代。同樣包括在本發(fā)明內(nèi)得失在位置233具有取代的融合蛋白，例如G233V，同樣包括在本發(fā)明內(nèi)的是在233和239的位置上的突變體GPIbα多肽，例如G233V和M239V取代。
在一些實(shí)施方案中，GPIbα多肽成分提供作為在天然存在的GPIbα序列(野生型)中具有突變的變異體GPIbα多肽，導(dǎo)致GPIbα序列對蛋白質(zhì)水解更具抗性(相對于非突變序列)。在天然存在的GPIbα序列中的胰蛋白酶位點(diǎn)已經(jīng)有敘述(參見例如，Titani et al，PNAS 845610-5614(1987))。
在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)多肽包括全長GPIbα多肽，或者第一個(gè)多肽具有比全長GPIbα多肽小的序列。例如，在長度上小于600個(gè)氨基酸的第一個(gè)多肽，例如小于或等于500，250，150，100，50或25個(gè)氨基酸長度。
第一個(gè)多肽的例子包括具有GPIbα多肽序列GP1b302(SEQID NO7)，GP1b302/2A(SEQ ID NO8)，GP1b/4X(SEQ ID NO9)，GP1b290(SEQ ID NO10)，GB1b290/2V(SEQ ID NO11)和GB1b290/1A(SEQ ID NO12)的任何一個(gè)的氨基酸序列.
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTVVKFPTKA (SEQ ID NO7)HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVAATATVVKFPTKA (SEQ ID NO8)
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQVVDVKAVTSNVASVQCDNSDKFPVKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVAATATVVKFPTKA (SEQ ID NO9)HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR (SEQ ID NO10)HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQVVDVKAVTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR (SEQ ID NO11)HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVAAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR (SEQ ID NO12)
可以包括在融合蛋白中的信號肽是MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO13)。如果需要，在具有GPIbα成分的多肽成分和第二個(gè)多肽成分之間另外插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
第二個(gè)多肽優(yōu)選地是可溶的。在一些實(shí)施方案中，第二個(gè)多肽增長了連接多肽的半衰期(例如，血清的半衰期)。在一些實(shí)施方案中，第二個(gè)多肽包括簡化融合多肽與第二個(gè)GPIbα多肽的結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二個(gè)多肽至少包括免疫球蛋白多肽的區(qū)域。免疫球蛋白融合多肽是本領(lǐng)域已知的，并且在例如美國專利號5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和5,455,165中有敘述。
在一些實(shí)施方案中，第二個(gè)多肽包括全長免疫球蛋白多肽?；蛘?，第二個(gè)多肽包括比全長免疫球蛋白多肽小的序列，例如重鏈，輕鏈，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab2，F(xiàn)v，或Fc。優(yōu)選地，第二個(gè)多肽包括免疫球蛋白多肽的重鏈。更優(yōu)選地，第二個(gè)多肽包括免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)域。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，第二個(gè)多肽具有較小的效應(yīng)器功能，即野生型免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域的效應(yīng)器功能。Fc效應(yīng)器功能包括例如，F(xiàn)c受體結(jié)合，互補(bǔ)固定和T細(xì)胞消耗活性。(參見例如，美國專利號6,136,310)，測試T細(xì)胞消耗活性，F(xiàn)c效應(yīng)器功能，和抗體穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二個(gè)多肽具有低的或沒有Fc受體的親和力。在或選的實(shí)施方案中，第二個(gè)多肽具有低的或沒有互補(bǔ)的蛋白質(zhì)Clq的親和力。
優(yōu)選的第二個(gè)多肽序列包括SEQ ID NO12的氨基酸序列。這一序列包括Fc區(qū)域。下面劃線的氨基酸是與野生型免疫球蛋白序列的對應(yīng)位置中發(fā)現(xiàn)的氨基酸不同的那些HTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO14)編碼SEQ ID NO1-6的DNA序列公開在下面，是SEQ IDNO15-20各個(gè)序列GP1b302-Ig核苷酸序列atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtgaggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgcctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttctccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagctcaccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatcagctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctccttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagctctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagctggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatgggctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggcttttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtgagatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaaggtgtggacgtcaaggccatgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaagtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacagacctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtgcgtgccacaaggactgtggtcaagttccccaccaaagcgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO15)
GP1b302/2A-Ig核苷酸序列atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtgaggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgcctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttctccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagctcaccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatcagctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctccttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagctctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagctggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatgggctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggcttttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtgagatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaaggtgtggacgtcaaggccatgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaagtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacagacctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtggctgccacagcgactgtggtcaagttccccaccaaagcgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO16)GP1b302/4X-Ig核苷酸序列atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtgaggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgcctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttctccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagctcaccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatcagctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctccttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagctctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagctggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatgggctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggcttttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtgagatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaagtggtggacgtcaaggccgtgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaagtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacagacctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtggctgccacagcgactgtggtcaagttccccaccaaagcgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctccc
ggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO17)GP1b290-Ig核苷酸序列atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtgaggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgcctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttctccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagctcaccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatcagctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctccttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagctctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagctggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatgggctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggcttttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtgagatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaaggtgtggacgtcaaggccatgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaagtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacagacctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO18)
GP1b290/2V-Ig核苷酸序列atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtgaggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgcctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttctccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagctcaccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatcagctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctccttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagctctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagctggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatgggctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggcttttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtgagatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaagtggtggacgtcaaggccgtgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaagtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacagacctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO19)GP1b290/1A核苷酸序列atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtgaggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgcctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttctccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagctcaccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatcagctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctccttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagctctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagctggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatgggctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggcttttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtgagatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaaggtgtggacgtcgcggccatgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaagtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacagacctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag
acaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO20)本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及載體，優(yōu)選地是表達(dá)載體，含有編碼糖蛋白Ibα融合多肽，或衍生物，片段，類似物或其同源物的核酸。如本文所用，術(shù)語“載體”指能夠運(yùn)輸另一個(gè)已經(jīng)連接的核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，指環(huán)雙鏈DNA環(huán)，其中可以連接其他的DNA片段。另一類型的載體是病毒載體，其中其他的DNA片段可以連接進(jìn)病毒基因組。一些載體能夠在它們導(dǎo)入的寄主中自我復(fù)制(例如，具有復(fù)制的細(xì)菌原點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加的哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加哺乳動物載體)是在導(dǎo)入寄主細(xì)胞時(shí)導(dǎo)入寄主基因組中的，并且從而沿著寄主基因組復(fù)制。另外，一些載體能夠指導(dǎo)它們可操作連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在本文稱為“表達(dá)載體”。通常，在重組DNA技術(shù)中利用的表達(dá)載體經(jīng)常的形式是質(zhì)粒。在本申請書中，“質(zhì)粒”和“載體”可以相互變化地作為質(zhì)粒利用，這是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明打算包括這樣的其他的表達(dá)載體形式，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷逆病毒，腺病毒，和腺相關(guān)病毒)，具有相當(dāng)?shù)墓δ堋?br> 本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括適于在寄主細(xì)胞中表達(dá)該核酸的形式的本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)在帶用于表達(dá)的寄主細(xì)胞的基礎(chǔ)上選擇的調(diào)節(jié)序列，這是與帶表達(dá)的核酸序列可操作地連接的。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“可操作地連接”指需要的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式連接(例如，當(dāng)將載體導(dǎo)入寄主細(xì)胞中死在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或寄主細(xì)胞中)。
術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”打算包括啟動子，增強(qiáng)子和其他表達(dá)對照元素(例如，聚腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY 185，學(xué)術(shù)出版社，圣迭戈，加州(1990)中有敘述。調(diào)節(jié)序列包括那些指導(dǎo)許多類型的寄主細(xì)胞中構(gòu)成性第表達(dá)核苷酸序列的那些，呵指導(dǎo)僅僅在一些寄主比中核苷酸序列的表達(dá)的那些(例如，組織特異調(diào)節(jié)序列)。令本領(lǐng)域技術(shù)人員滿意的是，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以依賴于這樣的因子，如選擇帶轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，需要的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以導(dǎo)入寄主細(xì)胞，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)或肽，包括本文所述的核酸編碼的融合蛋白質(zhì)或肽，(例如，糖蛋白Ibα融合多肽，糖蛋白Ibα融合多肽的突變形式等等)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以設(shè)計(jì)成在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)糖蛋白Ibα融合多肽的。例如，糖蛋白Ibα融合多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，例如大腸桿菌，昆蟲細(xì)胞(利用桿狀病毒表達(dá)載體)，酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞進(jìn)一步在Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY 185，學(xué)術(shù)出版社，圣迭戈，加州(1990)中討論?；蛘撸梢赞D(zhuǎn)錄和在體外翻譯重組表達(dá)載體，例如利用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
在帶有含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白質(zhì)的表達(dá)的構(gòu)成性或可誘導(dǎo)啟動子的載體的大腸桿菌中經(jīng)常較小蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)。融合載體在其中編碼的蛋白質(zhì)的許多氨基酸到重組蛋白質(zhì)的氨基末端。這樣的融合載體通常是有三個(gè)目的(i)增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；(ii)增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的可溶性；和(iii)通過作為親和純化中的配體在重組蛋白質(zhì)的純化中輔助。通常，在融合表達(dá)載體中，將蛋白質(zhì)水解裂解位點(diǎn)導(dǎo)入融合成分和重組蛋白質(zhì)的接合處，能夠從隨后進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的純化的融合成分中分離重組蛋白質(zhì)。這樣的酶，和它們的同源識別序列，包括因子Xa，凝血素和腸激素酶。通常融合表達(dá)載體包括pGEX(藥學(xué)生物技術(shù)公司；Smith and Johnson，1988，Gene 6731-40)，pMAL(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，Beverly，Mass)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J)，其中融合了谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖E結(jié)合蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì)A和目標(biāo)重組蛋白質(zhì)。
適當(dāng)?shù)目烧T導(dǎo)的非融合大腸桿菌表達(dá)載體的例子包括pTrc(Amrann et al.，(1988)Gene 69301-315)和pET 11d(Studier etal.，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY；METHODS INENZYMOLOGY 185，學(xué)術(shù)出版社，圣迭戈，加州(1990)60-89)。
使大腸桿菌中的重組蛋白質(zhì)表達(dá)的最大的一個(gè)方案是在蛋白質(zhì)水解重組蛋白質(zhì)的能力受損傷的寄主細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)。參見例如，Gottesman，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS IN ENZYMOLOGY 185，學(xué)術(shù)出版社，圣迭戈，加州(1990)119-128。另一個(gè)方案是，改變待插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，以致各個(gè)氨基酸的各個(gè)密碼子是那些優(yōu)選在大腸桿菌中利用的(參見例如，Wada，et al.，1992.Nucl.Acids Res.202111-2118)。本發(fā)明的核酸序列的這樣的變化可以通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)來進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖蛋白Ibα融合多肽表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。在啤酒酵母中表達(dá)的載體的例子包括pYepSec1(Baldari，et al.，1987.EMBO J.6229-234)，pMFa(Kurjan and Herskowitz，1982，Cell 30933-943)，pJRY88(Schultz et al.，1987. Gene54113-123)，pYES2(Invitrogen公司，圣迭戈，加州)和picZ(InVitrogen公司，圣迭戈，加州)。
或者，利用桿狀病毒表達(dá)載體，在昆蟲細(xì)胞中可以表達(dá)糖蛋白Ibα融合多肽。在培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞中(例如，SF9細(xì)胞)中可以表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀載體包括pAc系列(Smith，et al.，1983，Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers，1989.Virology 17031-39)。
仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸是利用哺乳動物表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的。哺乳動物表達(dá)載體的例子包括pCDM8(Seed，1987，自然329840)和pMT2PC(Kaufman，et al.，1987.EMBO J.6187-195)。當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中利用時(shí)，經(jīng)常由病毒調(diào)節(jié)元素提供表達(dá)載體的控制功能。例如，通常利用的啟動子是從多形瘤，腺病毒2，巨細(xì)胞瘤病毒和猴的病毒40中起源的。對于其他適當(dāng)?shù)脑思?xì)胞和真核細(xì)胞中的表達(dá)系統(tǒng)都可以參見例如Sambrook，et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社，冷泉港，紐約，1989的第16章和17章。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組的哺乳動物表達(dá)載體能夠優(yōu)選地指導(dǎo)特別細(xì)胞類型中的核酸的表達(dá)(例如，組織特異調(diào)節(jié)元素可用于表達(dá)核酸)。組織特異調(diào)節(jié)元素是本領(lǐng)域已知的。適當(dāng)?shù)慕M織特異啟動子的非限制例子包括白蛋白啟動子(肝特異；Pinkert，et al.，1987，Gene Dev.1268-277)，淋巴特異啟動子(Calame andEaton，1988.Adv.Immunol.43235-275)，特別是T細(xì)胞受體啟動子(Winoto and Baltimore，1989.EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白啟動子(Banerji，et al.，1983，Cell 33729-740；Queen andBaltimore，1983.Cell 33741-748)，神經(jīng)元特異啟動子(例如，神經(jīng)絲啟動子，Byrne and Ruddle，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA865473-5477)，胰臟特異啟動子(Edlund，et al.，1985.Science230912-916)，和乳腺特異啟動子(例如，奶乳啟動子，美國專利號4,873,316和歐洲申請公開號264,166)。發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子也包括在其中，例如小鼠賀克啟動子(Kessel and Gruss，1990.Science 249374-379)和α-胎兒蛋白質(zhì)啟動子(Campes andTilghman，1989.Gene Dev.3537-546)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有在反義方向克隆進(jìn)表達(dá)載體的本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體。即，DNA分子以允許表達(dá)與NOV糖蛋白Ibα融合多肽mRNA反義的RNA分子(通過轉(zhuǎn)錄DNA分子)的方式操作性地連接調(diào)節(jié)序列?？梢赃x擇操作性地連接反義方向克隆的核酸的調(diào)節(jié)序列，指導(dǎo)許多細(xì)胞類型中反義RNA分子的連續(xù)表達(dá)，例如，病毒啟動子和/或增強(qiáng)子，或可以選擇調(diào)節(jié)序列，指導(dǎo)構(gòu)成性的組織特異的或特異細(xì)胞類型的反義RNA的表達(dá)。反義表達(dá)載體可以是重組質(zhì)粒，噬菌體質(zhì)?；驕p毒病毒，其中反義核酸是在高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制下產(chǎn)生的，其活性可以通過載體導(dǎo)入的細(xì)胞類型來確定。為了利用反義基因討論基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，參見例如Weintraub，et al.，“作為基因分析的分子工具的反義RNA“，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986。
本發(fā)明的另一方面涉及已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的寄主細(xì)胞。術(shù)語“寄主細(xì)胞“和”重組寄主細(xì)胞“在本文中可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解這樣的術(shù)語不僅指特別的受試者細(xì)胞而且指這樣的細(xì)胞的子代或潛在的子代。因?yàn)樵陔S后的子代中由于突變或環(huán)境的影響可以發(fā)生一些修飾，這樣的子代事實(shí)上不可能與親本細(xì)胞相同，但仍然包括在本文所用的術(shù)語的范圍內(nèi)。
寄主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，糖蛋白Ibα融合多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞，酵母或哺乳動物細(xì)胞(如人，中國倉鼠細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
載體DNA可以通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化“和”轉(zhuǎn)染“是指在寄主細(xì)胞中導(dǎo)入外源核酸(例如，DNA)的各種本領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)識到的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染，或電穿孔。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞的方法可以在Sambrook，et al(MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL.第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)中找到，和其他實(shí)驗(yàn)室手冊。
對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，已知根據(jù)利用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅小部分細(xì)胞可以整合外源DNA到它們的基因組。為了鑒定和選擇這些整合體，編碼可選擇的標(biāo)記(例如，抗性或抗生素)的基因通常是導(dǎo)入具有需要的基因的寄主細(xì)胞中。各種可選擇的標(biāo)記包括給予藥物抗性的那些，如G418，潮霉素和氨甲喋呤。編碼可選擇標(biāo)記的核酸可以在同一載體上導(dǎo)入寄主細(xì)胞中，因?yàn)樗幋a糖蛋白Ibα融合多肽，或可以在分開的載體上導(dǎo)入。用導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過藥物選擇來鑒定(例如，已經(jīng)摻入可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將生存，而其他細(xì)胞將死亡)。
本發(fā)明的寄主細(xì)胞如培養(yǎng)物中的原核或真核寄主細(xì)胞可以用于生產(chǎn)(即表達(dá))糖蛋白Ibα融合多肽。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用本發(fā)明的寄主細(xì)胞生產(chǎn)糖蛋白Ibα融合多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的寄主細(xì)胞(其中編碼糖蛋白Ibα融合多肽的重組表達(dá)載體已經(jīng)導(dǎo)入)，以致產(chǎn)生糖蛋白Ibα融合多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基或寄主細(xì)胞中分離糖蛋白Ibα融合多肽。
利用常規(guī)技術(shù)如萃取，沉淀，層析，親和層析，電泳或等等可以分離或純化融合多肽。例如，將溶液通過含有固定蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G的柱可以純化免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，這些柱上的蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合融合蛋白質(zhì)的Fc部分，參見例如，Reis，K.J.，et al.，免疫學(xué)雜志，1323098-3102(1984)；PCT申請，公開號WO87/00329。融合多肽可以通過用離液序列高的鹽處理或通過用乙酸水溶液(1M)來洗脫。
或者，本發(fā)明的融合多肽可以利用本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)地合成。多肽的化學(xué)合成如下有敘述，如本領(lǐng)域常用的各種蛋白質(zhì)合成的方法，包括利用肽合成儀的合成，參見例如肽化學(xué)，APractical Textbook，Bodasnasky，Ed. Springer-Verlag，1988；Merrifield，Science232241-247(1986)；Barany，et al.，Intl.J.Peptide Protein Res.30705-739(1987)；Kent，Ann.Rev.Biochem.57957-989(1988)，和Kaiser，et al.，Science 243187-198(1989)。利用標(biāo)準(zhǔn)肽純化技術(shù)純化多肽以致它們基本無化學(xué)前體，或其他化學(xué)物。術(shù)語“基本無化學(xué)前體或其他化學(xué)物”包括制備肽，其中肽是從化學(xué)前體或前體參與肽的合成的化學(xué)物中分離的。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“基本無化學(xué)前體或其他化學(xué)物”包括制備的肽少于約30％(干重)化學(xué)物或非肽化學(xué)物，更優(yōu)選地少于20％化學(xué)前體或非肽化學(xué)物，更優(yōu)選地少于10％的化學(xué)前體或非肽化學(xué)物，最優(yōu)選地少于5％的化學(xué)前體或非肽化學(xué)物。
肽的化學(xué)合成簡化了修飾的或非天然的氨基酸的摻入，包括D氨基酸和其他小的有機(jī)分子。在具有對應(yīng)的D氨基酸同工型的肽中的一個(gè)或多個(gè)L氨基酸的取代可以用于增強(qiáng)肽對酶水解的抗性，和增強(qiáng)一個(gè)或多個(gè)生物活性肽的特性，即受體結(jié)合，功能潛力或作用的持久性。參見例如，Doherty，et al.，1993，J.Med.Chem.362585-2594；Kirby，et al.，1993，J.Med.Chem.363802-3808；Morita，et al.，1994，F(xiàn)EBS Lett.35384-88；Wang，etal.，1993，Int.J.Pept.Protein Res.42392-399；Fauchere andThiumieau，1992.Adv.Drug Res.23127-159。
在肽序列中導(dǎo)入共價(jià)交聯(lián)鍵可以在構(gòu)型上和在幾何學(xué)上約束多肽骨架。這一方法可以用于開發(fā)具有增強(qiáng)的勢，選擇性和穩(wěn)定性的融合多肽的肽類似物。因?yàn)榄h(huán)肽的構(gòu)型熵是比它的線性部分低，采用特異的構(gòu)型可以與采用比環(huán)類似物更小的降低的環(huán)類似的熵同時(shí)進(jìn)行，從兒產(chǎn)生結(jié)合可容易的自由能。大的環(huán)化經(jīng)常通過在肽N和C末端之間，在側(cè)鏈和N或C末端之間形成酰胺鍵來完成[例如，K3Fe(CN)6的pH8.5](Samson et al.，內(nèi)分泌學(xué)，1375182-5185(1966))，或在兩個(gè)氨基酸側(cè)鏈之間形成酰胺鍵。參見例如，DeGrado，Adv Protein Chem，3951-124(1988)。也將二硫鍵導(dǎo)入線性序列中降低它們的靈活性。參見例如，Rose，et al.，Adv Protein Chem，371-109(1985)；Mosberg et al.，Biochem Biophys Res Commun，106505-512(`1982)。另外，用青霉胺(Pen，3-巰基-(D)纈氨酸)代替半胱氨酸殘基已經(jīng)用于增強(qiáng)一些阿片樣物質(zhì)受體相互作用的選擇性。Lipkowski and Carr，肽合成，結(jié)構(gòu)和應(yīng)用，Gutte，ed.，學(xué)術(shù)出版社，287-320頁(1995)。
包括糖蛋白Ibα融合多肽或編碼其的核酸的藥物組合物本發(fā)明的糖蛋白Ibα融合蛋白質(zhì)，或編碼這些融合蛋白質(zhì)(在本文中也稱為“治療”或“活性化合物”)的核酸分子和其衍生物，片段，類似物和同源物可以摻入適于給藥的藥物組合物。
這樣的組合物通常包括核酸分子，蛋白質(zhì)或抗體和藥物可接受載體。如本文所用，“藥物可接受載體”包括與藥物的給藥方法可相適應(yīng)的任何或所有溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細(xì)菌和抗真菌試劑，等滲和吸收延遲劑，等等。適當(dāng)?shù)妮d體在最近編輯的Remington藥物科學(xué)，本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中有敘述，該文獻(xiàn)引入作為參考。這樣的載體的優(yōu)選的例子包括，但不限于水，鹽水，finger溶液，葡聚糖溶液，和5％人血清白蛋白。脂質(zhì)體和非水溶液載體如固定油也可以利用。藥物活性物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和試劑的利用是本領(lǐng)域已知的。除了與活性化合物不兼容的常規(guī)介質(zhì)或試劑，它們在組合物中的用途都應(yīng)該受到關(guān)注。補(bǔ)充的活性化合物也可以摻入這些組合物。
本文公開的活性試劑也可以作為脂質(zhì)體配制。脂質(zhì)體是用本領(lǐng)域已知的方法制備的，方法如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；和美國專利號4,485,045和4,544,545中有敘述。循環(huán)時(shí)間增加的脂質(zhì)體在美國專利號5,013,556中有公開。
利用逆相蒸發(fā)方法可以生產(chǎn)特別利用的脂質(zhì)體，脂組合物含有磷脂酰膽堿，膽固醇，和PEG派生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂質(zhì)體是通過確定孔大小的濾紙來產(chǎn)生的，產(chǎn)生需要直徑的脂質(zhì)體。
本發(fā)明的藥物組合物是配制成與它的需要的給藥途徑相容的形式的。給藥的途徑的例子包括腸胃外的，例如，靜脈內(nèi)的，皮內(nèi)的，皮下的，口服的(例如，吸入)，經(jīng)皮的(例如，局部的)，經(jīng)粘膜的和直腸給藥。用于腸胃外的，皮內(nèi)的，或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括下面的成分無菌稀釋液如用于注射的水，鹽溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇，或其他合成溶劑；抗細(xì)菌試劑如苯乙醇或甲基對甲基苯甲酸；抗氧化劑如抗壞血酸或二硫酸鈉，螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖液如乙酸，檸檬酸或磷酸，和用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或葡聚糖?？梢杂盟峄驂A調(diào)節(jié)pH，如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外制劑可以包容在安瓿中，可處置針筒或玻璃或塑料制造的多倍劑量小瓶。
適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(水可溶)或分散液呵無菌粉末，用于制備無菌可注射溶液或分散液。對于靜脈內(nèi)給藥，適當(dāng)?shù)妮d體包括生理鹽，無細(xì)菌的水，CremophorELTM(BASF，Parsippany，N.J.)，或磷酸緩沖鹽(PBS)。在所有情況中，組合物必須是無菌的，并且應(yīng)該是液體，容易用針筒。必須在制造和儲存條件下穩(wěn)定，并且必須對微生物如細(xì)菌和真菌的污染是可防腐的。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水，乙醇，聚醇(例如，甘油，丙二醇，和液體聚乙二醇等等)，它們的適當(dāng)?shù)幕旌衔??？梢员３诌m當(dāng)?shù)囊后w性，例如利用包衣如卵磷脂，在分散液的情況中維持需要的顆粒大小，和利用表面活性劑。防止微生物的作用可以用各種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，例如，對甲基苯甲酸，氯丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳汞，等等。在許多情況中，在組合物中包括等滲劑，例如糖，聚乙醇如甘露醇，山梨醇，氯化鈉是優(yōu)選的?？勺⑸涞慕M合物的延長吸收可以在組合物中包括延長吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來達(dá)到。
無菌可注射溶液可以在適當(dāng)?shù)娜軇┲袚饺胄枰康幕钚曰衔锖腿绻枰谶^濾滅菌后與上面的成分的一種或聯(lián)合來混合制備。通常，在無菌載體中摻入需要的化合物來制備分散劑，其中含有基本的分散介質(zhì)和來自上面的那些中的需要的其他成分。
口服組合物通常包括在惰性稀釋劑或可食載體中。它們可以包括在明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了口服治療給藥的目的，活性化合物可以與賦形劑一起摻入，并且以片劑，錠劑，或膠囊的形式使用?？诜M合物也可以利用液體載體來制備，用作口洗劑，其中在液體載體中的化合物是口服利用的，并且洗，咳出或咽下。藥物兼容結(jié)合劑和/或佐劑物質(zhì)可以作為組合物部分包括在內(nèi)。片劑，丸劑，膠囊，錠劑等等可以含有任何下面的成分，或相同特性的化合物結(jié)合劑如微結(jié)晶纖維素，黃氏膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，離解劑如褐藻酸，Primogel，或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；滑移劑如膠質(zhì)二氧化硅；調(diào)味劑如蔗糖或糖精；調(diào)味劑如胡椒粉，甲基唾液酸或橙味調(diào)味劑。
對于吸入給藥，化合物是以從壓力容器中或含有適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑例如二氧化碳的氣體的配出器或噴霧器中氣霧噴灑的形式來遞送的。
系統(tǒng)給藥也可以是經(jīng)粘膜或經(jīng)皮的方法。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮的給藥，適于待滲透的屏障的滲透劑使用在配方中。這樣的滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，并且對于經(jīng)粘膜的給藥包括例如去垢劑，膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜的給藥可以通過利用鼻噴灑或栓劑來完成。對于經(jīng)皮的給藥，活性化合物配制成油膏，藥膏，凝膠或奶液，如通常本領(lǐng)域已知的那些。
化合物也可以制備成栓劑(例如，與常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可油和氣體甘油)或直腸遞送的滯留灌腸液的形式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，制備的活性化合物中含有保護(hù)化合物使不從體內(nèi)快速消除的載體，如控制釋放的配方，包括植入劑和未包囊遞送系統(tǒng)?？缮锝到獾?，生物兼容的多聚物可以利用，如乙二烯乙酸，聚酸酐，聚乙醇酸，膠原，聚正酯，和聚乙酸。制備這樣的配劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些物質(zhì)也可以從Alza公司和Nova藥物公司商業(yè)得到。脂質(zhì)體懸浮液(包括目標(biāo)用病毒抗原的單克隆抗體感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥物可接受載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備，如美國專利號4,522,811中所述。
在一些實(shí)施方案中，口服或腸胃外組合物配制成容易給藥的劑量單位形式和均一的劑量形式。如本文所用的劑量單位形式對于待治療的受試者是指適于作為聯(lián)合劑量的物理分散單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的計(jì)算產(chǎn)生需要的治療效果的活性化合物和需要的藥物載體。本發(fā)明的劑量單位形式的特異性是由直接依賴獨(dú)特的活性化合物的特征和待達(dá)到的特別的治療效果和本化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)在的限制如用于治療個(gè)體的活性化合物來支配的。
本發(fā)明的核酸分子可以插入載體中，并且用作基因治療載體?；蛑委熭d體可以通過例如靜脈內(nèi)注射，局部給藥(參見例如，美國專利號5,328,470)或通過立體注射(參見例如，Chenet al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA913054-3057)遞送給受試者?；蛑委熭d體的藥物制備可以在可接受的稀釋劑中包括基因治療載體，并且可以含有慢釋放基質(zhì)，其中包埋了基因遞送載體?；蛘?，當(dāng)可以從重組細(xì)胞中完整地產(chǎn)生完全的基因遞送載體，如逆病毒載體，藥物制劑可以包括一個(gè)或幾個(gè)產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。
如果需要可以制備持續(xù)釋放的制劑。適當(dāng)?shù)某掷m(xù)釋放制劑的例子包括固體疏水多聚體的半可滲透基質(zhì)，含有抗體，基質(zhì)的形式是成形顆粒形式，如薄膜，或微膠囊。持續(xù)釋放的基質(zhì)的例子包括聚酯，水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基異丁烯酸鹽)，或聚(乙烯醇)，聚乳酸(美國專利號，3,773,919)，L谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，非可降解乙烷乙烯乙酸，可降解的乳酸-甘氨酸共聚物如LUPRON-DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide乙酸組成的可注射微球體)，和聚-D-(-)3-羥丁酸。當(dāng)多聚物如乙烷乙烯乙酸和乳酸-乙醇酸能夠在100天內(nèi)釋放分子，一些水凝膠在較短的時(shí)期釋放蛋白質(zhì)。
藥物組合物可以包括在容器，包裝，或配出器中，附帶有給藥的說明書。
在生物系統(tǒng)中抑制黏連的方法同時(shí)包括在本發(fā)明中的是抑制血液細(xì)胞與生物系統(tǒng)中的生物組織的黏連的方法。該方法包括在生物系統(tǒng)中加入足以抑制血液細(xì)胞與生物組織的黏連的量的融合多肽。
血液細(xì)胞例如可以是白細(xì)胞，血小板或紅血細(xì)胞。白細(xì)胞可以是任何白細(xì)胞，能夠黏連到生物組織。在各個(gè)方面來說，白細(xì)胞是粒細(xì)胞(即，嗜中性的，嗜堿性的或嗜紅性的)，單核細(xì)胞(即，巨噬細(xì)胞)或淋巴細(xì)胞(例如，T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，腫瘤滲濾淋巴細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，白細(xì)胞表達(dá)β2整合素，例如Mac-1?；蛘?，白細(xì)胞表達(dá)了選擇素配體。
同時(shí)包括在本發(fā)明中的是抑制生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)與生物組織的黏連的方法。該方法包括在生物系統(tǒng)中加入足以抑制蛋白質(zhì)與生物組織的黏連的量的融合多肽。
蛋白質(zhì)可以是與膜連接的(例如，共價(jià)地，非共價(jià)地，離子鍵地)?；蛘?，蛋白質(zhì)可以是可溶形式(即在溶液中)。蛋白質(zhì)是von Willibrand因子，凝血素，糖蛋白Ibα的P選擇素。
如本文所用，“生物組織”指包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，有或沒有細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(例如，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，聚多糖和蛋白糖)。生物組織也包括唯一的細(xì)胞外基質(zhì)物質(zhì)，如皮下結(jié)締組織基質(zhì)。在一些方面，生物組織是血管內(nèi)皮。生物組織可以是一個(gè)或多個(gè)血小板或白細(xì)胞。在各個(gè)方面來看，生物組織是與GPIb-IX-V復(fù)合物如糖蛋白Ibα，Mac-1，P-選擇素，凝血素或von Willibrand因子復(fù)合的。“復(fù)合”是指生物組織含有GPIb-IX-V復(fù)合物成分的可溶形式?；蛘摺皬?fù)合”指生物組織含有表達(dá)GPIb-IX-V復(fù)合物的成分的細(xì)胞。
如本文所用，生物系統(tǒng)指包括含有生物成分的任何系統(tǒng)，如細(xì)胞，蛋白質(zhì)，碳水化合物，脂或核酸。生物系統(tǒng)可以是體內(nèi)，來自體內(nèi)或體外的系統(tǒng)。
“黏連”指包括任何白細(xì)胞生物相互作用，例如，成卷，固定附著或特定的相互作用。
抑制血液細(xì)胞或蛋白質(zhì)與生物組織的黏連可以利用本領(lǐng)域已知的方法來測量。例如，檢測糖蛋白Ibα與生物組織的結(jié)合的實(shí)驗(yàn)如Simon et al.，J.Exp.Med.192193-204，2000中所述，文獻(xiàn)引入作為參考。在各個(gè)實(shí)施方案中，GPIbα融合蛋白質(zhì)的結(jié)合抑制了血液細(xì)胞或蛋白質(zhì)與生物組織的結(jié)合，至少有30％，50％，75％，90％，95％，99％或99.9％。
黏連也可以在更大或更小的生理流動條件下評價(jià)，包括靜止條件和系列應(yīng)用靜止和剪切條件。黏連可以例如用比色，熒光計(jì)，流動細(xì)胞計(jì)或利用平行平板流動室實(shí)驗(yàn)來確定。
同樣包括在本發(fā)明中的是通過對受試者給藥生物活性治療化合物(下文中“治療性”)在受試者治療血小板激活相關(guān)的紊亂的方法。或者受試者也給藥一種或多種下面的乙酰唾液酸，例如，阿斯片林肝素，例如，未分離的或低分子量的肝素，糖蛋白Iib/IIIa拮抗劑，氯吡哆，P-選擇素拮抗劑，凝血素抑制劑或溶栓酶。
受試者可以例如是任何哺乳動物，例如人，靈長類，小鼠，大鼠，狗，貓，牛，馬，豬。
治療劑包括例如(i)任何一種或多種糖蛋白Ibα融合多肽，和其衍生物，片段，類似物和同源物，(ii)直接抗糖蛋白Ibα融合多肽的抗體；和(iii)編碼糖蛋白Ibα融合多肽的核酸，和其衍生物，片段，類似物和同源物。
基本上，任何紊亂在病原學(xué)上與血小板激活相關(guān)，認(rèn)為是都可以預(yù)防或治療的。紊亂可以例如是血管炎癥，動脈硬化，再狹窄(例如，氣球成形術(shù)相關(guān)的再狹窄)和/或與血栓疾病相關(guān)的癥狀，例如咽痛(即，穩(wěn)定的咽痛和不穩(wěn)定的咽痛)，急性心肌梗死，休克，靜脈血栓或動脈血栓。
本發(fā)明將進(jìn)一步在下面的非限制性實(shí)施例中說明。
實(shí)施例1重組GP1B-IG融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和純化通過重組方法可以產(chǎn)生三個(gè)GP1b-Ig融合蛋白質(zhì)，GP1b302-Ig(SEQ ID NO1)，GP1b290Ig(SEQ ID NO4)，和GP1b290/2V-Ig(SEQ ID NO5)并且純化。用線性質(zhì)粒DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沒有二氫葉酸還原酶(DHFR)的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，質(zhì)粒DNA中含有指導(dǎo)含有DHFR可選擇標(biāo)記基因的GP1b-Ig編碼區(qū)中順反子方式的轉(zhuǎn)錄的哺乳動物表達(dá)載體。在含有氨甲喋呤(MTX)的培養(yǎng)基中選擇候選的表達(dá)細(xì)胞，方法基本如Kaufmanet al.Nucleic Acids Res.(1991)194485-90中所述。為了收集GP1b-Ig調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，CHO細(xì)胞在5-20培養(yǎng)盤(150mm直徑)中生長到接近融合水平，細(xì)胞單層用PBS洗滌兩次，培養(yǎng)細(xì)胞將近24小時(shí)，培養(yǎng)基中沒有胎牛血清。然后收集培養(yǎng)基，丟棄細(xì)胞。
將CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)調(diào)節(jié)到50mM Tris pH8.0，200mM NaCl，通過0.2uM濾紙過濾，加到Poros蛋白質(zhì)A柱上。用10個(gè)柱體積的50mM Tris pH8.0，200mM NaCl洗滌，并且用Pierce IgG洗脫緩沖液洗脫。接著在280nM處測量蛋白質(zhì)峰的吸光值。用0.1個(gè)體積的1M Tris，pH8.0調(diào)節(jié)洗脫物的pH。然后，濃縮蛋白質(zhì)，對TBS(10mM Tris，pH8.0，150mM NaCl)用手指分析(25kD MWCO)交換緩沖液。然后，通過在TBS中的TosoHaasG3000SW柱上凝膠過濾層析進(jìn)一步純化濃縮的蛋白質(zhì)。
通過Western印跡分析純化的蛋白質(zhì)。簡要地說，在4-20％還原SDS PAGE凝膠上的每道上加載13微升CHO細(xì)胞的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。利用Electroblot儀器和硝酸纖維素膜(Novex，SanDiego，CA)進(jìn)行Western轉(zhuǎn)移。最初檢測的抗體是單克隆AP1，次級抗體是HRP-共軛山羊抗小鼠IgG(GTI，Brookfield，WI)。HRP檢測是通過ECL系統(tǒng)的(Amersham-Pharmacia Biotech)。
實(shí)施例2體外抑制血小板聚集確定糖蛋白Ibα多肽-免疫球蛋白融合多肽體外抑制血小板聚集的能力。通過在900rpm分化離心10分鐘制備來自新鮮的檸檬酸血液的富血小板血漿(PRP)。在37℃和各個(gè)濃度的GP1b290/2v-Ig預(yù)溫育0.4ml的PRP(3×108/ml)5分鐘。將瑞斯托菌素加到1.5mg/ml降低血小板的聚集。利用Sienco DP247E聚集儀測量聚集。定量聚集，通過在1000rpm攪拌檢測光傳遞的增加，在圖象記錄儀上記錄。如圖4說明，GP1b290/2v-Ig抑制瑞斯托菌素誘導(dǎo)了血小板聚集。
實(shí)施例3體內(nèi)抑制重復(fù)冠狀動脈凝血糖蛋白IbαGPIb2902V-Ig多肽免疫球蛋白融合多肽抑制體內(nèi)冠狀動脈血栓的能力是利用Folts et al.，循環(huán)54365-70，1976中所述的方法來確定的。
用巴比妥鈉麻醉稱重20-25kg的Mongrel狗。然后插管和利用呼吸器通入空氣。放置靜脈和動脈導(dǎo)管。通過左邊的胸廓切開術(shù)通過第五個(gè)肋骨空間接近心臟。打開心包膜，縫合到傷口邊緣，不替代心臟提供支架。分離約2cm的左旋冠狀動脈(LCX)。利用放置在動脈附近的周微管超聲波流動探針連續(xù)地檢測平均的和動力學(xué)LCX流。在穩(wěn)定期，用止血鉗夾住損傷LCX的內(nèi)皮。塑料壓縮器放置于遠(yuǎn)側(cè)，覆蓋損傷的內(nèi)皮區(qū)域提供約70％-80％的微管狹窄。當(dāng)血流降低到零，通過搖動壓縮器恢復(fù)血流，疏通聚集的血小板。這一血流的降低和再狹窄的術(shù)語是CFR。在給藥測試藥物之前記錄至少5個(gè)連續(xù)的CFR。
圖5中表示了代表性的結(jié)果。示蹤表明，糖蛋白IbαGPIb290/2V-Ig的量增加導(dǎo)致血流更強(qiáng)。這些結(jié)果證明，糖蛋白IbαGPIb290/2V-Ig在動物模型中抑制凝血。
圖6中表示了描述具有高液體剪切力血流的損傷的冠狀動脈的圖解。該圖描述了具有高液體剪切力血流的損傷的冠狀動脈。血管具有接觸內(nèi)皮基質(zhì)蛋白質(zhì)包括固定的vWF的損傷的內(nèi)皮的區(qū)段。在存在GP1bα融合多肽(GPIb-Ig)時(shí)，vWF結(jié)合位點(diǎn)阻塞了，從而防止了通過GPIb-V-IX復(fù)合物內(nèi)的GPIbα結(jié)合血小板防止血小板黏連。白細(xì)胞捕獲也消失了。
其他實(shí)施方案結(jié)合詳細(xì)的說明已經(jīng)敘述了本發(fā)明，前面的敘述解釋了，并且不限制本發(fā)明的范圍，該范圍也是附加的權(quán)利要求確定的。其他方面，優(yōu)點(diǎn)，和修改是在下面的權(quán)利要求的范圍內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.含有第一個(gè)多肽和可操作地連接的第二個(gè)多肽的融合多肽，其中第一個(gè)多肽至少含有糖蛋白Ibα多肽，第二個(gè)多肽至少含有免疫球蛋白多肽的區(qū)域。
2.權(quán)利要求1所述的融合多肽，其中所述的第一個(gè)多肽包括膜糖蛋白Ibα多肽的細(xì)胞外部分。
3.權(quán)利要求2所述的融合多肽，其中所述的第一個(gè)多肽結(jié)合選自包括白細(xì)胞整合素Mac-1多肽，von Willebrand因子，凝血素和P-選擇素的組的一個(gè)或多個(gè)多肽。
4.權(quán)利要求3所述的融合多肽，其中所述的多肽至少與SEQ IDNO1有85％的同源性。
5.權(quán)利要求1所述的融合多肽，其中所述的多肽含有SEQ IDNO1。
6.權(quán)利要求1所述的融合多肽，其中所述的第一個(gè)多肽是對蛋白質(zhì)水解比野生型GPIbα1多肽更有抗性。
7.權(quán)利要求1所述的融合多肽，其中所述的第一個(gè)多肽以比野生型糖蛋白Ibα多肽更高的親和力結(jié)合von Willibrand因子多肽。
8.權(quán)利要求7所述的融合多肽，其中所述的第一個(gè)多肽至少含有比較野生型GPIbα多肽有一個(gè)氨基酸取代的G233V或M239V。
9.權(quán)利要求7所述的融合多肽，其中所述的第一個(gè)多肽含有比較野生型GPIbα1多肽的氨基酸序列有氨基酸取代的G233V和M239V。
10.權(quán)利要求1所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽含有重鏈免疫球蛋白多肽的區(qū)域。
11.權(quán)利要求10的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽含有免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域。
12.權(quán)利要求11的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽具有的效應(yīng)器功能比野生型免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域的效應(yīng)器功能小。
13.權(quán)利要求12所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽結(jié)合Fc受體的親和力低甚至沒有。
14.權(quán)利要求12所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽結(jié)合補(bǔ)充蛋白質(zhì)C1q的親和力低甚至沒有。
15.權(quán)利要求2所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽含有重鏈免疫球蛋白多肽的區(qū)域。
16.權(quán)利要求15所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽含有免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域。
17.權(quán)利要求15所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽具有的效應(yīng)器功能比野生型免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域的效應(yīng)器功能小。
18.權(quán)利要求17所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽結(jié)合Fc受體的親和力低甚至沒有。
19.權(quán)利要求17所述的融合多肽，其中所述的第二個(gè)多肽結(jié)合補(bǔ)充的蛋白質(zhì)C1q的親和力低甚至沒有。
20.權(quán)利要求1所述的融合多肽，其中所述的融合多肽含有氨基酸序列GP1b302-Ig(SEQ ID NO1)，Gp1b302/2A-Ig(SEQ IDNO2)，GP1b302/4X-Ig(SEQ ID NO3)，GP1b290Ig(SEQ IDNO4)，GP1b290/2V-Ig(SEQ ID NO5)和GP1b290/1A-Ig(SEQID NO6)。
21.含有權(quán)利要求1的融合多肽的多體多肽。
22.權(quán)利要求21所述的多體多肽，其中所述的多體多肽是二體。
23.編碼權(quán)利要求1所述的融合多肽的DNA分子。
24.含有權(quán)利要求21所述的DNA的載體。
25.含有權(quán)利要求22所述的載體的細(xì)胞。
26.表達(dá)糖蛋白Ibα多肽免疫球蛋白融合多肽的方法，該方法包括在導(dǎo)致表達(dá)所述的糖蛋白Ibα多肽免疫球蛋白融合多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求25所述的細(xì)胞。
27.含有權(quán)利要求1所述的融合多肽的藥物組合物。
28.含有權(quán)利要求23所述的核酸的藥物組合物。
29.抑制血液細(xì)胞與生物系統(tǒng)中的生物組織黏連的方法，該方法包括在所述的生物系統(tǒng)中加入權(quán)利要求1的融合多肽，加入的量是足以抑制所述的血液細(xì)胞與所述的生物組織黏連。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的生物系統(tǒng)是體外系統(tǒng)。
31.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的生物系統(tǒng)是來自體內(nèi)的系統(tǒng)。
32.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的生物系統(tǒng)是體內(nèi)系統(tǒng)。
33.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的血液細(xì)胞是血小板。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的血小板表達(dá)糖蛋白Ibα，P-選擇素或凝血素。
35.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的血液細(xì)胞是白細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的白細(xì)胞表達(dá)Mac-1或選擇素配體。
37.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的生物組織是與vonWillibrand因子或凝血素，糖蛋白Ibα，或P-選擇素復(fù)合的。
38.抑制蛋白質(zhì)與生物系統(tǒng)中的生物組織的黏連的方法，該方法包括在所述的生物系統(tǒng)中加入權(quán)利要求1所述的融合多肽，加入的量是足以抑制所述的蛋白質(zhì)與所述的生物組織黏連的。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的生物系統(tǒng)是體內(nèi)系統(tǒng)。
40.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的生物系統(tǒng)是來自體內(nèi)的系統(tǒng)。
41.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的生物系統(tǒng)是體內(nèi)系統(tǒng)。
42.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是結(jié)合膜的。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是糖蛋白Ibα，P-選擇素，von Willibrand因子或凝血素。
44.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是在溶液中的。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是von Willbrand因子或凝血素。
46.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的生物組織是與選自包括糖蛋白Ibα，P-選擇素，von Willibrand因子或凝血素的組的蛋白質(zhì)復(fù)合。
47.治療與受試者中的血小板激活相關(guān)的紊亂的方法，該方法包括對受試者給藥需要的權(quán)利要求1的融合多肽。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的紊亂是與溶血疾病相關(guān)的。
49.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的紊亂是缺血性心臟疾病，咽痛，急性心肌梗死，休克，靜脈溶血，動脈硬化，或動脈溶血。
50.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的紊亂是咽痛。
51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的咽痛是不穩(wěn)定咽痛。
52.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的受試者是人。
53.權(quán)利要求47所述的方法，進(jìn)一步包括對所述的受試者給藥選自包括乙酰唾液酸，肝素，糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑，clopidogrel，P選擇素拮抗劑，凝血素抑制劑和溶血酶的組的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療或預(yù)防與血管相關(guān)的紊亂的組合物和方法。
文檔編號A61B17/34GK1553955SQ02806148
公開日2004年12月8日 申請日期2002年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月6日
發(fā)明者格雷·D·肖, 格雷 D 肖, 里 庫瑪, 雷文德里·庫瑪, S 薩科, 黛文妮·S·薩科, 湯姆·麥克唐納格, 麥克唐納格, 弗蘭西斯·X·薩利文, 斯 X 薩利文 申請人:遺傳學(xué)院有限責(zé)任公司