專利名稱：作為蛋白激酶抑制劑的3-(4-酰氨基吡咯-2-基亞甲基)-2-二氫吲哚酮衍生物的制作方法
優(yōu)先權(quán)申請本申請要求2001年8月15日提交的臨時申請60/312,361和2001年2月15日提交的60/268,683的優(yōu)先權(quán)，這兩份申請的全部內(nèi)容引用在此作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及某些3-(4-酰氨基吡咯-2-基亞甲基)-2-二氫吲哚酮衍生物，它們調(diào)制蛋白激酶(PKs)的活性。本發(fā)明的化合物因此可用于治療涉及異常PK活性的功能障礙。還公開了包含這些化合物的藥物組合物、利用包含這些化合物的藥物組合物治療疾病的方法和制備它們的方法。
技術(shù)現(xiàn)狀PKs是催化蛋白質(zhì)酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基上羥基磷酸化作用的酶。這種看來似乎簡單的活性的后果是驚人的；細胞生長、分化和增殖、也就是事實上細胞生命的所有方面都在一種或另一種方式上依賴于PK活性。此外，異常的PK活性已經(jīng)涉及功能障礙的主體，從相對無生命威脅的疾病、例如牛皮癬一直到極為惡性的疾病、例如成膠質(zhì)細胞瘤(腦癌)。
PKs適宜分為兩類，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTKs)和絲氨酸-蘇氨酸激酶(STKs)。
PTK活性的一個主要方面是它們牽涉生長因子受體。生長因子受體是細胞表面蛋白。當(dāng)通過生長因子配體結(jié)合時，生長因子受體轉(zhuǎn)化為活性形式，與細胞膜內(nèi)表面上的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。這引起受體和其他蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化作用，和在細胞內(nèi)部與各種胞質(zhì)發(fā)信號分子生成復(fù)合體，繼而影響大量細胞反應(yīng)，例如細胞分裂(增殖)、細胞分化、細胞生長、代謝效應(yīng)對細胞外微環(huán)境的表達等。關(guān)于更完全的討論，參見Schlessinger和Ullrich，Neuron，9303-391(1992)，引用在此作為參考，包括所有的附圖
，仿佛完整描述在這里一樣。
具有PTK活性的生長因子受體已知稱為受體酪氨酸激酶(RTKs)。它們包含一大家族具有多變的生物活性的跨膜受體。目前，已經(jīng)鑒別了至少十九(19)種不同的RTKs亞家族。一個實例是被稱為“HER”的RTK亞家族，它包括EGFR(表皮生長因子受體)、HER2、HER3和HER4。這些RTKs由一個細胞外葡糖基化配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個細胞內(nèi)胞質(zhì)催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其能夠磷酸化蛋白質(zhì)上的酪氨酸殘基。
另一種RTK亞家族由胰島素受體(IR)、胰島素樣生長因子I受體(IGF-1R)和胰島素受體相關(guān)性受體(IRR)組成。IR和IGF-1R與胰島素、IGF-I和IGF-II發(fā)生相互作用，生成由兩個完全細胞外的葡糖基化α亞單位與兩個跨越細胞膜并且含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的β亞單位構(gòu)成的雜四聚物。
第三種RTK亞家族被認為血小板類生長因子受體(PDGFR)組，它包括PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、c-kit和c-fms。這些受體由葡糖基化細胞外結(jié)構(gòu)域組成，后者由不定數(shù)量的免疫球蛋白樣環(huán)和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被不相關(guān)的氨基酸序列所中斷。
由于與PDGFR亞家族的相似性，另有一組有時也被歸入這一類，它是胚胎肝激酶(flk)受體亞家族。這一組據(jù)信由激酶插入片段結(jié)構(gòu)域-受體胚胎肝激酶-1(KDR/FLK-1，VEGF-R2)、flk-1R、flk-4和fms樣酪氨酸激酶-1(flt-1)組成。
酪氨酸激酶生長因子受體家族的另一個成員是成纖維細胞生長因子(FGF)受體亞組。這一組由四種受體FGFR 1-4和七種配體FGF 1-7組成。盡管尚無確切的定義，不過似乎這些受體由葡糖基化細胞外結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，前者含有不定數(shù)量的免疫球蛋白樣環(huán)，后者的酪氨酸激酶序列被不相關(guān)的氨基酸序列所中斷。
酪氨酸激酶生長因子受體家族的另一個成員是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體亞組。VEGF是二聚的糖蛋白，與PDGF相似，但是具有不同的體內(nèi)生物功能和靶細胞特異性。確切而言，VEGF目前被認為在血管發(fā)生和血管生成中扮演不可缺少的角色。
更完全的已知RTK亞家族列表描述在Plowman等，DN & P，7(6)334-339(1994)中，引用在此作為參考，包括所有的附圖，仿佛完整描述在這里一樣。
除了RTKs以外，還存在一個完全細胞內(nèi)的PTKs家族，被稱為“非受體酪氨酸激酶”或“細胞酪氨酸激酶”。本文將使用后者命名，簡稱CTK。CTKs不含細胞外與跨膜結(jié)構(gòu)域。目前，已經(jīng)鑒別了11種亞家族(Src，F(xiàn)rk，Btk，Csk，Abl，Zap70，F(xiàn)es，F(xiàn)ps，F(xiàn)ak，Jak和Ack)中的24種以上CTK。Src亞家族迄今為止似乎是最大一組的CTK，包括Src，Yes，F(xiàn)yn，Lyn，Lck，Blk，Hck，F(xiàn)gr和Yrk。關(guān)于更詳細的CTK討論，參見Bolen，Oncogene，82025-2031(1993)，引用在此作為參考，包括所有的附圖，仿佛完整描述在這里一樣。
絲氨酸/蘇氨酸激酶STK象CTK一樣，主要是細胞內(nèi)的，不過也有一些STK類型的受體激酶。STK是最普遍的cytosol激酶；也就是在除胞質(zhì)細胞器和細胞支架以外的那部分細胞質(zhì)中發(fā)揮其功能的激酶。cytosol是細胞內(nèi)這樣一種區(qū)域，在那里發(fā)生很多細胞的中間代謝和生物合成活動；例如，正是在cytosol中蛋白質(zhì)是在核糖體上被合成的。
RTK、CTK和STK都已牽涉病原性條件的主體，尤其包括癌癥。其他與PTK有關(guān)的病原性條件非限制性地包括牛皮癬、肝硬化、糖尿病、血管生成、再狹窄、眼疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與其他炎癥、免疫功能障礙(例如自體免疫疾病)、心血管疾病(例如動脈粥樣硬化)和各種腎功能障礙。
關(guān)于癌癥，為了解釋驅(qū)使腫瘤發(fā)育的過度細胞增殖而形成了兩種主要的假說，涉及已知受PK調(diào)制的功能。也就是說，有人已經(jīng)提出惡性細胞生長是由控制細胞分裂和/或分化的機理發(fā)生故障所導(dǎo)致的。有人已經(jīng)指出大量原致癌基因的蛋白產(chǎn)物參與調(diào)制細胞生長與分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這些原致癌基因的蛋白產(chǎn)物包括細胞外生長因子、跨膜生長因子PTK受體(RTK)、胞質(zhì)PTK(CTK)和cytosol STK，見上討論。
鑒于PK相關(guān)性細胞活動與多種人類功能障礙之間的明顯聯(lián)系，人們?yōu)榱髓b別調(diào)制PK活性的方式而付出巨大努力也就不足為奇了。有些努力牽涉仿生化學(xué)方法，使用大分子模仿參與實際細胞過程的那些(例如突變配體(U.S.App.No.4,966,849)；可溶性受體和抗體(App.No.WO 94/10202，Kendall和Thomas，Proc.Nat′1 Acad.Sci.，9010705-09(1994)，Kim等，Nature，362841-844(1993))；RNA配體(Jelinek等，Biochemistry，3310450-56)；Takano等，Mol.Bio.Cell4358A(1993)；Kinsella等，Exp.Cell Res.19956-62(1992)；Wright等，J.Cellular Phys，15244857)和酪氨酸激酶抑制劑(WO 94/03427；WO92/21660；WO 91/15495；WO 94/14808；U.S.Pat.No.5,330,992；Mariani等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，352268(1994))。
除此以外，人們?yōu)榱髓b別充當(dāng)PK抑制劑的小分子也已進行了嘗試。例如，雙-單環(huán)、二環(huán)與雜環(huán)的芳基化合物(PCT WO 92/20642)、亞乙烯基氮雜吲哚衍生物(PCT WO 94/14808)和1-環(huán)丙基-4-吡啶基喹諾酮(U.S.Pat.No.5,330,992)已被描述為酪氨酸激酶抑制劑。苯乙烯基化合物(U.S.Pat.No.5,217,999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(U.S.Pat.No.5,302,606)、喹唑啉衍生物(EP App.No.0 566 266 A1)、硒雜吲哚與硒化物(PCT WO 94/03427)、三環(huán)多羥基化合物(PCT WO92/21660)和芐基次膦酸化合物(PCT WO 91/15495)都已被描述為PTK抑制劑，可用于癌癥的治療。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及某些3-(4-酰氨基吡咯-2-基亞甲基)-2-二氫吲哚酮衍生物，它們表現(xiàn)出PK調(diào)制能力，因此可用于治療涉及異常PK活性的功能障礙。
本發(fā)明的一種實施方式是式(I)化合物
其中R1選自由氫、鹵素、烷基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13組成的組；R2選自由氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基)組成的組；R3、R4和R5獨立地是氫或烷基；Z是芳基、雜芳基、雜環(huán)或-NR15R16，其中R15和R16獨立地是氫或烷基，或者R15和R16與它們所連接的氮原子一起構(gòu)成雜環(huán)氨基；R6選自由氫或烷基組成的組；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組；R8選自由羥基、烷氧基和芳氧基組成的組；R9和R10獨立地選自由氫、烷基、氰基烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組，或者R9和R10聯(lián)合形成雜環(huán)氨基；R12和R13獨立地選自由氫、烷基、羥基烷基和芳基組成的組，或者R12和R13與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R17選自由羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
另一種實施方式是式I化合物，其中R1選自由氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13組成的組；R2選自由氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基)組成的組；R3、R4和R5獨立地是氫或烷基；Z是芳基、雜芳基、雜環(huán)或-NR15R16，其中R15和R16獨立地是氫或烷基，或者R15和R16與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R6選自由氫或烷基組成的組；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組；R8選自由羥基、烷氧基和芳氧基組成的組；R9和R10獨立地選自由氫、烷基、氰基烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組，或者R9和R10聯(lián)合形成雜環(huán)基；R12和R13獨立地選自由氫、烷基和芳基組成的組，或者R12和R13與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)；R17選自由羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
另一種實施方式是式(Ia)化合物 其中R1、R3、R4和R5是氫；R2是氟，并且位于二氫吲哚環(huán)的5位；
Z是嗎啉-4-基；R6和R7是甲基。
優(yōu)選地，*C的立體化學(xué)是(S)。
另一種實施方式是式(II)化合物 其中R是氫或烷基；R1選自由氫、鹵素、烷基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13組成的組；R2選自由氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基)組成的組；R3、R4和R5獨立地是氫或烷基；Z是芳基、雜芳基、雜環(huán)或-NR15R16，其中R15和R16獨立地是氫或烷基，或者R15和R16與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R6選自由氫或烷基組成的組；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組；R8選自由羥基、烷氧基和芳氧基組成的組；R9和R10獨立地選自由氫、烷基、氰基烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組，或者R9和R10聯(lián)合形成雜環(huán)氨基；R12和R13獨立地選自由氫、烷基、羥基烷基和芳基組成的組，或者R12和R13與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R17選自由羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
另一種實施方式是藥物組合物，包含式I、Ia或II的化合物或鹽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
另一種實施方式是蛋白激酶催化活性的調(diào)制方法，包含使蛋白激酶與式I、Ia或II化合物或鹽接觸。用于這種方法的蛋白激酶可以是受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶。
另一種實施方式是治療或預(yù)防生物體蛋白激酶相關(guān)性功能障礙的方法，包含對該生物體給以治療有效量的藥物組合物，該組合物包含式I、Ia或II的化合物或鹽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。用于這種方法的蛋白激酶可以是受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶。蛋白激酶相關(guān)性功能障礙可以是EGFR相關(guān)性功能障礙、PDGFR相關(guān)性功能障礙、IGFR相關(guān)性功能障礙和flk相關(guān)性功能障礙。蛋白激酶功能障礙還可以是鱗狀上皮細胞癌、星形細胞瘤、卡波濟氏肉瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸直腸癌、泌尿生殖癌和胃腸癌。而且，蛋白激酶功能障礙還可以是糖尿病、自體免疫疾病、過度增殖癥、再狹窄、纖維變性、牛皮癬、林-希氏病、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管生成、炎癥、免疫功能障礙和心血管功能障礙。這些方法可以用于治療人。
另一種實施方式中，本發(fā)明涉及制備式(I)化合物的方法。
最后，本發(fā)明涉及鑒別調(diào)制蛋白激酶催化活性的化合物，使表達該蛋白激酶的細胞與本發(fā)明化合物或鹽接觸，然后監(jiān)測對細胞的效果。
發(fā)明的詳細說明定義除非有相反陳述，下列用在說明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語具有下述含義。
“烷基”表示飽和的脂族烴基團，包括1至20個碳原子的直鏈和支鏈基團(本文所述數(shù)字范圍、例如1-20無論何時都意味著該基團、在這種情況下的烷基，可以含有1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子等，直至包括20個碳原子)。更優(yōu)選地，它是具有1至10個碳原子的中等大小烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基等。最優(yōu)選地，它是具有1至4個碳原子的低級烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、異丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的，當(dāng)被取代時取代基優(yōu)選為鹵素、羥基、低級烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜脂環(huán)基、C(O)R8、NR9R10和C(O)NR9R10。
“環(huán)烷基”表示3至8元全碳單環(huán)、全碳5元/6元或6元/6元稠合二環(huán)或多環(huán)稠合環(huán)(“稠合”環(huán)系意味著系統(tǒng)中的每個環(huán)與系統(tǒng)中的其它環(huán)共享毗鄰的一對碳原子)基團，其中一個或多個環(huán)可以含有一條或多條雙鍵，但是沒有一個環(huán)具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。環(huán)烷基的非限制性實例有環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烷、環(huán)己二烯、金剛烷、環(huán)庚烷、環(huán)庚三烯等。環(huán)烷基可以是取代的或未取代的。當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個、更優(yōu)選一個或兩個取代基，獨立地選自由低級烷基、三鹵烷基、鹵素、羥基、低級烷氧基、芳基(可選地被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個基團取代，取代基彼此獨立地是鹵素、羥基、低級烷基或低級烷氧基)、芳氧基(可選地被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個基團取代，取代基彼此獨立地是鹵素、羥基、低級烷基或低級烷氧基)、6元雜芳基(環(huán)中具有1至3個氮原子，環(huán)中的碳可選地被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個基團取代，取代基彼此獨立地是鹵素、羥基、低級烷基或低級烷氧基)、5元雜芳基(具有1至3個選自氮、氧和硫的雜原子，該基團的碳和氮原子可選地被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個基團取代，取代基彼此獨立地是鹵素、羥基、低級烷基或低級烷氧基)、5或6元雜脂環(huán)基(具有1至3個選自氮、氧和硫的雜原子，該基團的碳和氮原子(如果有的話)可選地被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個基團取代，取代基彼此獨立地是鹵素、羥基、低級烷基或低級烷氧基)、巰基、(低級烷基)硫基、芳硫基(可選地被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個基團取代，取代基彼此獨立地是鹵素、羥基、低級烷基或低級烷氧基)、氰基、?；?、硫代?；?、O-氨基甲?；?、N-氨基甲?；-硫代氨基甲?；-硫代氨基甲?；?、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10組成的組，R9和R10定義同上。
“鏈烯基”表示由至少兩個碳原子和至少一條碳-碳雙鍵組成的如上所定義的烷基。代表性實例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等。
“炔基”表示由至少兩個碳原子和至少一條碳-碳叁鍵組成的如上所定義的烷基。代表性實例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等。
“芳基”表示1至12個碳原子的全碳單環(huán)或稠合多環(huán)(也就是共享毗鄰碳原子對的環(huán))基團，具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。芳基的非限制性實例有苯基、萘基和蒽基。芳基可以是取代的或未取代的。當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個、更優(yōu)選一個、兩個或三個、進而更優(yōu)選一個或兩個，獨立地選自由低級烷基、三鹵烷基、鹵素、羥基、低級烷氧基、巰基、(低級烷基)硫基、氰基、?；?、硫代?；-氨基甲?；?、N-氨基甲?；?、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲?；-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10組成的組，R9和R10定義同上。優(yōu)選地，芳基可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自鹵素、低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、N-酰氨基、單或二烷基氨基、羧基或N-磺酰氨基。
“雜芳基”表示5至12個環(huán)原子的單環(huán)或稠合環(huán)(也就是共享毗鄰原子對的環(huán))基團，含有一個、兩個、三個或四個選自N、O或S的環(huán)雜原子，其余環(huán)原子是C，另外具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。未取代的雜芳基的非限制性實例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、異喹啉、嘌呤、四唑、三嗪和咔唑。雜芳基可以是取代的或未取代的。當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個、更優(yōu)選一個、兩個或三個、進而更優(yōu)選一個或兩個，獨立地選自由低級烷基、三鹵烷基、鹵素、羥基、低級烷氧基、巰基、(低級烷基)硫基、氰基、?；?、硫代?；?、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲?；-硫代氨基甲?；-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10組成的組，R9和R10定義同上。優(yōu)選地，雜芳基可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自鹵素、低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、N-酰氨基、單或二烷基氨基、羧基或N-磺酰氨基。
“雜脂環(huán)基”表示單環(huán)或稠合環(huán)基團，在環(huán)中具有5至9個環(huán)原子，其中一個或兩個環(huán)原子是選自N、O或S(O)n(其中n是整數(shù)0至2)的雜原子，其余環(huán)原子是C。這些環(huán)還可以具有一條或多條雙鍵。不過，這些環(huán)不具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。未取代的雜脂環(huán)基的非限制性實例有吡咯烷基、哌啶子基、哌嗪子基、嗎啉代基、硫代嗎啉代基、高哌嗪子基等。雜脂環(huán)基可以是取代的或未取代的。當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個、更優(yōu)選一個、兩個或三個、進而更優(yōu)選一個或兩個，獨立地選自由低級烷基、三鹵烷基、鹵素、羥基、低級烷氧基、巰基、(低級烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲?；-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲?；?、N-硫代氨基甲?；?、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10組成的組，R9和R10定義同上。優(yōu)選地，雜脂環(huán)基可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自鹵素、低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、N-酰氨基、單或二烷基氨基、羧基或N-磺酰氨基。
“雜環(huán)”表示3至8個環(huán)原子的飽和環(huán)狀基團，其中一個或兩個環(huán)原子是選自N、O或S(O)n(其中n是整數(shù)0至2)的雜原子，其余環(huán)原子是C，其中一個或兩個C原子可以可選地被羰基代替。雜環(huán)基的環(huán)可以可選地獨立地被一個、兩個或三個取代基取代，取代基選自低級烷基(可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自羧基或酯基)、鹵代烷基、氰基烷基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、芳烷基、雜芳烷基和-COR(其中R是烷基)。更具體地，術(shù)語雜環(huán)基包括但不限于四氫吡喃基、2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)、哌啶子基、N-甲基哌啶-3-基、哌嗪子基、N-甲基吡咯烷-3-基、吡咯烷基、嗎啉代基、硫代嗎啉代基、硫代嗎啉代-1-氧化物、硫代嗎啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧羰基哌嗪子基、3-氧代哌嗪子基、2-咪唑啉酮、2-吡咯烷酮、2-氧代高哌嗪子基、四氫嘧啶-2-酮及其衍生物。優(yōu)選地，雜環(huán)基團可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自鹵素、低級烷基、被羧基或酯基取代的低級烷基、羥基、單或二烷基氨基。
“雜環(huán)氨基”表示3至8個環(huán)原子的飽和環(huán)狀基團，其中至少一個環(huán)原子是氮，可選地其中另外一個或兩個環(huán)原子是選自N、O或S(O)n(其中n是整數(shù)0至2)的雜原子，其余環(huán)原子是C，其中一個或兩個C原子可以可選地被羰基代替。雜環(huán)氨基可以可選地獨立地被一個、兩個或三個取代基取代，取代基選自低級烷基(可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自羧基或酯基)、鹵代烷基、氰基烷基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、芳烷基、雜芳烷基和-COR(其中R是烷基)。更具體地，術(shù)語雜環(huán)氨基包括但不限于哌啶-1-基、哌嗪-1-基、吡咯烷-1-基、嗎啉-4-基、硫代嗎啉-4-基、硫代嗎啉代-1-氧化物、硫代嗎啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧羰基哌嗪-1-基、3-氧代哌嗪-1-基、2-咪唑啉酮-1-基、2-吡咯烷酮-1-基、2-氧代高哌嗪子基、四氫嘧啶-2-酮及其衍生物。優(yōu)選地，雜環(huán)氨基可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自鹵素、低級烷基、被羧基或酯基取代的低級烷基、羥基、單或二烷基氨基。雜環(huán)氨基是上述雜環(huán)基團的子集。
“羥基”表示-OH基團。
“烷氧基”表示-O-(烷基)和-O-(未取代的環(huán)烷基)。代表性實例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基、環(huán)戊氧基、環(huán)己氧基等。
“鹵代烷氧基”表示-O-(鹵代烷基)。代表性實例包括但不限于三氟甲氧基、三溴甲氧基等。
“芳氧基”表示-O-芳基和-O-雜芳基，芳基和雜芳基定義同上。代表性實例包括但不限于苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡嗪氧基等及其衍生物。
“巰基”表示-SH基團。
“烷硫基”表示-S-(烷基)和-S-(未取代的環(huán)烷基)。代表性實例包括但不限于甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、環(huán)丙硫基、環(huán)丁硫基、環(huán)戊硫基、環(huán)己硫基等。
“芳硫基”表示-S-芳基和-S-雜芳基，芳基和雜芳基定義同上。代表性實例包括但不限于苯硫基、吡啶硫基、呋喃硫基、噻吩硫基、嘧啶硫基等及其衍生物。
“?；北硎?C(O)-R″基團，其中R″選自由氫、低級烷基、三鹵甲基、未取代的環(huán)烷基、芳基(可選地被一個或多個、優(yōu)選一個、兩個或三個取代基取代，取代基選自由低級烷基、三鹵甲基、低級烷氧基、鹵素和-NR9R10組成的組)、雜芳基(通過環(huán)碳鍵合的)(可選地被一個或多個、優(yōu)選一個、兩個或三個取代基取代，取代基選自由低級烷基、三鹵烷基、低級烷氧基、鹵素和-NR9R10組成的組)和雜脂環(huán)基(通過環(huán)碳鍵合的)(可選地被一個或多個、優(yōu)選一個、兩個或三個取代基取代，取代基選自由低級烷基、三鹵烷基、低級烷氧基、鹵素和-NR9R10組成的組)。代表性?；ǖ幌抻谝阴；?、三氟乙酰基、苯甲?；取?br> “醛”表示其中R″是氫的?；?。
“硫代酰基”表示-C(S)-R″基團，其中R″定義同上。
“酯”表示-C(O)O-R″基團，其中R″定義同上，但是R″不能是氫。
“乙?；北硎?C(O)CH3基團。
“鹵素”表示氟、氯、溴或碘，優(yōu)選氟或氯。
“三鹵甲基”表示-CX3基團，其中X是如上所定義的鹵素。
“三鹵甲磺?；北硎綳3CS(＝O)2基團，其中X定義同上。
“氰基”表示-C≡N基團。
“S-磺酰氨基”表示-S(O)2NR9R10基團，其中R9和R10定義同上。
“N-磺酰氨基”表示-NR9S(O)2R10基團，其中R9和R10定義同上。
“O-氨基甲?；北硎?OC(O)NR12R13基團，其中R12和R13定義同上。
“N-氨基甲?；北硎綬9OC(O)NR10-基團，其中R9和R10定義同上。
“O-硫代氨基甲?；北硎?OC(S)NR12R13基團，其中R12和R13定義同上。
“N-硫代氨基甲?；北硎綬9OC(S)NR10-基團，其中R9和R10定義同上。
“氨基”表示-NR9R10基團，其中R9和R10都是氫。
“C-酰氨基”表示-C(O)NR9R10基團，其中R9和R10定義同上。
“N-酰氨基”表示R9C(O)NR10-基團，其中R9和R10定義同上。
“硝基”表示-NO2基團。
“鹵代烷基”表示烷基，優(yōu)選如上所定義的低級烷基，它被一個或多個相同或不同的鹵原子取代，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“羥基烷基”表示烷基，優(yōu)選如上所定義的低級烷基，它被一個、兩個或三個羥基取代，例如羥甲基、1-或2-羥基乙基、1，2-、1，3-或2，3-二羥基丙基等。
“芳烷基”表示烷基，優(yōu)選如上所定義的低級烷基，它被如上所定義的芳基取代，例如-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基等及其衍生物。
“雜芳烷基”表示烷基，優(yōu)選如上所定義的低級烷基，它被雜芳基取代，例如-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等及其衍生物。
“單烷基氨基”表示基團-NHR，其中R是如上所定義的烷基或未取代的環(huán)烷基，例如甲氨基、(1-甲基乙基)氨基、環(huán)己氨基等。
“二烷基氨基”表示基團-NRR，其中每個R獨立地是如上所定義的烷基或未取代的環(huán)烷基，例如二甲氨基、二乙氨基、(1-甲基乙基)-乙氨基、環(huán)己基甲氨基、環(huán)戊基甲氨基等。
“可選”或“可選地”意味著隨后所描述的事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生，該說明包括該事件或環(huán)境發(fā)生和不發(fā)生的場合。例如，“可選被烷基取代的雜環(huán)基團”意味著烷基可以但不必存在，該說明包括雜環(huán)基團被烷基取代的情形和雜環(huán)基團不被烷基取代的情形。
術(shù)語“2-二氫吲哚酮”、“二氫吲哚-2-酮”和“2-氧代吲哚”在本文中是可互換使用的，表示具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子 術(shù)語“吡咯”表示具有下列結(jié)構(gòu)的分子 具有相同分子式但是原子鍵合性質(zhì)或順序或者原子空間排列不同的化合物被稱為“異構(gòu)體”。原子空間排列不同的異構(gòu)體被稱為“立體異構(gòu)體”。彼此不是鏡像的立體異構(gòu)體被稱為“非對映體”，彼此是不可疊加鏡像的立體異構(gòu)體被稱為“對映體”。當(dāng)化合物具有不對稱中心時，例如它與四個不同的基團鍵合，有一對對映體是可能的。對映體可以以它的不對稱中心的絕對構(gòu)型為特征，可以用R-與S-順序規(guī)則加以描述，或者通過這類方式加以描述，其中分子圍繞偏振光的平面旋轉(zhuǎn)，被命名為右旋或左旋(也就是分別為(+)或(-)異構(gòu)體)。手性化合物可以存在單個的對映體或其混合物。含有等比例對映體的混合物被稱為“外消旋混合物”。
本發(fā)明的化合物可以具有一個或多個不對稱中心；這類化合物因此可以被制成單個的(R)-或(S)-立體異構(gòu)體或其混合物。例如，在式(I)化合物的-CONHCHR3-CR4(OH)CR5Z中攜帶羥基的碳原子是不對稱中心，因此式(I)化合物可以存在(R)-或(S)-立體異構(gòu)體。除非有相反指示，說明書和權(quán)利要求書中對特定化合物的說明或命名打算包括單個的對映體及其混合物，其外消旋體或其它。立體化學(xué)的測定方法和立體異構(gòu)體的分離方法是本領(lǐng)域熟知的(參見″Advanced OrganicChemistry″第4版第4章的討論，J.March，John Wiley and Sons，NewYork，1992)。
式(I)化合物可以表現(xiàn)互變異構(gòu)現(xiàn)象和結(jié)構(gòu)異構(gòu)現(xiàn)象。例如，本文所述化合物可以在連接2-二氫吲哚酮部分與吡咯部分的雙鍵采取E或Z構(gòu)型，或者它們可以是E與Z的混合物。本發(fā)明涵蓋所有互變異構(gòu)或結(jié)構(gòu)異構(gòu)形式及其混合物，它們具有調(diào)制RTK、CTK和/或STK活性的能力，并不限于任意一種互變異構(gòu)或結(jié)構(gòu)異構(gòu)形式。
“藥物組合物”表示一種或多種本文所述化合物或其生理學(xué)上/藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物與其他化學(xué)組分的混合物，其他組分例如生理學(xué)上/藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進化合物對生物體的給藥。
式(I)化合物還可以充當(dāng)前體藥物。“前體藥物”表示體內(nèi)轉(zhuǎn)化為母體藥物的成分。前體藥物也經(jīng)常是有用的，因為在有些情形中，它們可能比母體藥物更容易給藥。例如，它們通過口服給藥可以是生物可利用的，而母體藥物則不然。前體藥物還可以提高母體藥物在藥物組合物中的溶解性。前體藥物的非限制性實例將是以酯形式給藥的本發(fā)明化合物(“前體藥物”)，以促進跨越細胞膜的傳輸，在那里水溶性不利于移動，但是一旦進入細胞之后被水解代謝為羧酸、即活性實體，在那里水溶性是有益的。
前體藥物的另一個實例也許是短多肽，非限制性地例如2-10個氨基酸的多肽，通過末端氨基與本發(fā)明化合物的羧基鍵合，其中該多肽被體內(nèi)水解或代謝，釋放活性分子。式(I)化合物的前體藥物屬于本發(fā)明的范圍。
另外，式(I)化合物將被生物(例如人)體內(nèi)的酶代謝生成能夠調(diào)制蛋白激酶活性的代謝產(chǎn)物。這類代謝產(chǎn)物屬于本發(fā)明的范圍。
本文所用的“生理學(xué)上/藥學(xué)上可接受的載體”表示載體或稀釋劑，它不會對生物體導(dǎo)致顯著的刺激作用，并且不會抵消給藥化合物的生物活性和性質(zhì)。
“藥學(xué)上可接受的賦形劑”表示加入到藥物組合物中以進一步促進化合物給藥的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖與各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。
本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”表示保留母體化合物的生物有效性和性質(zhì)的那些鹽。這類鹽包括(1)酸加成鹽，通過母體化合物的游離堿與無機酸或有機酸的反應(yīng)而得，無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等，有機酸例如乙酸、草酸、(D)或(L)蘋果酸、馬來酸、甲磺酸、乙磺酸、對-甲苯磺酸、水楊酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸等，優(yōu)選鹽酸或(L)蘋果酸；或(2)存在于母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子代替或者與有機堿配位化合所生成的鹽，金屬離子例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子，有機堿例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
“PK”表示受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(RTK)、非受體或“細胞”酪氨酸激酶(CTK)和絲氨酸-蘇氨酸激酶(STK)。
“方法”表示完成既定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和工藝，包括但不限于化學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域人員已知的或者容易從已知方式、手段、技術(shù)和工藝開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和工藝。
“調(diào)制作用”或“調(diào)制”表示RTK、CTK和STK的催化活性的改變。確切而言，調(diào)制表示RTK、CTK和STK的催化活性的活化，優(yōu)選RTK、CTK和STK的催化活性的活化或抑制，這依賴于暴露于RTK、CTK或STK的化合物或鹽的濃度，或者更優(yōu)選為RTK、CTK和STK的催化活性的抑制。
“催化活性”表示在RTK和/或CTK的直接或間接影響下，酪氨酸的磷酸化作用速率，或者表示在STK的直接或間接影響下，絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化作用速率。
“接觸”表示以這樣一種方式使本發(fā)明化合物與靶PK在一起，該化合物能夠影響PK的催化活性，這種影響是直接的，也就是與激酶本身發(fā)生相互作用，或者是間接的，也就是與另一種分子發(fā)生相互作用，激酶的催化活性依賴于該分子。這類“接觸”可以是“體外”完成的，也就是在試管、陪替氏皿等中。在試管中，接觸可以僅牽涉化合物和有關(guān)PK，或者可以牽涉全細胞。還可以將細胞供養(yǎng)或生長在細胞培養(yǎng)皿中，再與該環(huán)境中的化合物接觸。在本文中，特定化合物影響PK相關(guān)性功能障礙的能力、也就是如下所定義的化合物的IC50可以在將化合物嘗試體內(nèi)用于更復(fù)雜的活生物體之前加以測定。關(guān)于生物體外部的細胞，存在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法使PK與化合物接觸，包括但不限于直接的細胞微量注射和大量的跨膜載體技術(shù)。
“體外”表示在人工環(huán)境中進行的過程，非限制性地例如在試管或培養(yǎng)基中。
“體內(nèi)”表示在活生物體內(nèi)進行的過程，非限制性地例如小鼠、大鼠或兔。
“PK相關(guān)性功能障礙”、“受PK驅(qū)使的功能障礙”和“異常的PK活性”都表示以不適當(dāng)?shù)?、也就是過低或更普遍為過高的PK催化活性為特征的條件，其中特定的PK可以是一種RTK、CTK或STK。不適當(dāng)?shù)拇呋钚钥梢杂上铝薪Y(jié)果引起(1)在正常情況下不表達PK的細胞表達PK，(2)PK表達上升，引起所不希望的細胞增殖、分化和/或生長，或(3)PK表達下降，引起所不希望的細胞增殖、分化和/或生長減少。PK活性過高表示編碼特定PK的基因擴增或者產(chǎn)生與細胞增殖、分化和/或生長功能障礙相關(guān)的PK活性水平(也就是說，隨著PK的水平上升，細胞功能障礙的一種或多種癥狀的嚴重性也增加)?；钚赃^低當(dāng)然是相反的，其中隨著PK活性水平下降，細胞功能障礙的一種或多種癥狀的嚴重性也增加。
動詞“治療”、名詞“治療”和“治療作用”表示減輕或抵消PK介導(dǎo)的細胞功能障礙和/或其伴隨癥狀的方法。尤其是，關(guān)于癌癥，這些術(shù)語簡單地意味著患有癌癥的個體的壽命預(yù)期將被延長或者疾病的一種或多種癥狀將被減少。
“生物體”表示包含至少一個細胞的所有活的實體?；钌矬w可以簡單到例如單一的真核細胞，或者復(fù)雜到例如哺乳動物，包括人類。
“治療有效量”表示化合物將在一定程度上緩解所治療功能障礙的一種或多種癥狀的給藥量。參照癌癥的治療，治療有效量表示具有下列效果的量(1)減少腫瘤的大?。?2)抑制(也就是在一定程度上延緩，優(yōu)選終止)腫瘤轉(zhuǎn)移；(3)在一定程度上抑制(也就是在一定程度上延緩，優(yōu)選終止)腫瘤生長；和/或(4)在一定程度上緩解(或者優(yōu)選消除)與癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀。
“監(jiān)測”表示觀察或檢測使化合物與表達特定PK的細胞接觸的效果。所觀察或檢測的效果可以是細胞表型、PK的催化活性或PK與天然結(jié)合配偶體的相互作用的變化。用于觀察或檢測這類效果的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
在本發(fā)明的最后一個方面，上述效果選自細胞表型的變化與否、所述蛋白激酶的催化活性的變化與否或者所述蛋白激酶與天然結(jié)合配偶體的相互作用的變化與否。
“細胞表型”表示細胞或組織的外觀或細胞或組織的生物功能。細胞表型的非限制性實例有細胞大小、細胞生長、細胞增殖、細胞分化、細胞存活、細胞程序死亡和營養(yǎng)物的攝取與利用。這類細胞表型特征是可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)測量的。
“天然結(jié)合配偶體”表示在細胞中與特定PK結(jié)合的多肽。天然結(jié)合配偶體可以在PK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演傳播信號的角色。天然結(jié)合配偶體與PK的相互作用變化本身可以表現(xiàn)為PK/天然結(jié)合配偶體復(fù)合體的濃度上升或下降，其結(jié)果是可觀察到的PK介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力變化。
本發(fā)明的代表性化合物如下表1a所示。
表1a
10 5-{(Z)-[4-(3-氯苯基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-N-(2-羥基-3-吡咯烷-1-基丙基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺11 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺12 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基}氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺13 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺14 N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{(Z)-[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺15 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺16 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺
17 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺18 (3Z)-3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺19 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-2-甲基-5-{(Z)-[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺20 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺21 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺22 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺23 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
24 N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺25 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺26 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺27 N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺28 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺29 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺30 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺31 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
32 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺33 N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺34 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺35 N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺36 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺37 N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-(2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺38 N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺39 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺40 5-[(Z)-(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
41 442.49 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺42 442.49 5-([(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺43 458.95 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺44 458.95 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺47 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺48 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺
49 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺50 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺51 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺52 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺本發(fā)明的其他代表性化合物如下表1b所示。
表1b化合物號 結(jié)構(gòu) 名稱1N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羥基-丙基)-酰胺2N5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺3N2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺4N5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺5N5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺6N 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺
7N 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺8N 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺9N 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺11N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺12N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺
13N (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺14N N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺15N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺16N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺
17N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺18N 3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺19N 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-2-甲基-5-{[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺20N 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺
21N 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺22N 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺23N 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺24N N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺25N 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
26N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺27N N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺28N N-{3-[2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺29N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺30N N-{3-[2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺
34N 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺35N N-[2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺36N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺37N N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-5-[(2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺38N N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺39N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
40N 5-[(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺47N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺48N 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3 ]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺49N 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3 ]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺50N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-51N 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺
52N 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺本發(fā)明的其他代表性化合物如下表1c所示。
表1c化合物號 結(jié)構(gòu) 名稱45N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-甲基-酰胺；45S 5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((S)-2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺；和46S5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((R)-2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺表1a-1c所列化合物僅供例證，決不被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
優(yōu)選的實施方式盡管發(fā)明概述部分給出了最廣泛的定義，不過下列一些式(I)化合物是優(yōu)選的。
1、一組優(yōu)選的式(I)化合物是這樣的，其中R6選自由氫和烷基組成的組，優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、異丁基或正丁基，更優(yōu)選氫或甲基；和R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組，其中R17是羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基，更優(yōu)選地，R7是氫、甲基、乙基、異丙基、正、異或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，進而更優(yōu)選甲基、氫或苯基。
2、另一組優(yōu)選的式(I)化合物是這樣的，其中R6選自由氫和烷基組成的組，優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、異丁基或正丁基，更優(yōu)選氫或甲基，最優(yōu)選甲基；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組，其中R17是羥基、烷基或芳基，R7更優(yōu)選為氫、甲基、乙基、異丙基、正、異或叔丁基、苯基、苯甲?；?、乙?；螋然?，進而更優(yōu)選甲基、氫或苯基；和R3、R4和R5是氫；和Z是芳基。
3、另一組優(yōu)選的式(I)化合物是這樣的，其中R6選自由氫和烷基組成的組，優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、異丁基或正丁基，更優(yōu)選氫或甲基，最優(yōu)選甲基；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組，其中R17是羥基、烷基或芳基，R7更優(yōu)選為氫、甲基、乙基、異丙基、正、異或叔丁基、苯基、苯甲?；?、乙?；螋然?，進而更優(yōu)選甲基、氫或苯基，最優(yōu)選甲基；和R3、R4和R5是氫；和
Z是雜芳基，優(yōu)選三嗪基、四唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基。
4、另一組優(yōu)選的式(I)化合物是這樣的，其中R6選自由氫和烷基組成的組，優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、異丁基或正丁基，更優(yōu)選氫或甲基，最優(yōu)選甲基；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組，其中R17是羥基、烷基或芳基，R7更優(yōu)選為氫、甲基、乙基、異丙基、正、異或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙?；螋然?，進而更優(yōu)選甲基、氫或苯基；和R3、R4和R5是氫；和Z是雜環(huán)。
5、另一組優(yōu)選的式(I)化合物是這樣的，其中R6選自由氫和烷基組成的組，優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、異丁基或正丁基，更優(yōu)選氫或甲基，最優(yōu)選甲基；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組，其中R17是羥基、烷基或芳基，R7更優(yōu)選為氫、甲基、乙基、異丙基、正、異或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙?；螋然?，進而更優(yōu)選甲基、氫或苯基，最優(yōu)選甲基；和R3、R4和R5是氫；和Z是-NR15R16，其中R15和R16聯(lián)合形成雜環(huán)氨基，優(yōu)選哌啶-1-基、N-甲基哌啶-1-基、哌嗪-1-基、N-甲基吡咯烷-1-基、吡咯烷-1-基、嗎啉-4-基、硫代嗎啉-4-基、硫代嗎啉代-1-氧化物、硫代嗎啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧羰基甲基哌嗪-1-基、3-氧代哌嗪-1-基、咪唑烷-1-基-2-酮、吡咯烷-1-基-2-酮、2-氧代高哌嗪-1-基或四氫嘧啶-1-基-2-酮，更優(yōu)選嗎啉-4-基。
6、另一組優(yōu)選的式(I)化合物是這樣的，其中R6選自由氫和烷基組成的組，優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、異丁基或正丁基，更優(yōu)選氫或甲基；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組，其中R17是羥基、烷基或芳基，R7更優(yōu)選為氫、甲基、乙基、異丙基、正、異或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙?；螋然?，進而更優(yōu)選甲基、氫或苯基；和R3、R4和R5是氫；和Z是-NR15R16，其中R15和R16是烷基，優(yōu)選二乙氨基、二甲氨基或乙氨基。
7、在上述優(yōu)選的和更優(yōu)選的第(1)-(6)組中，進而更優(yōu)選的一組化合物是這樣的，其中R1是氫、烷基、-C(O)NR12R13、未取代的環(huán)烷基，優(yōu)選氫、3，4-二甲氧基苯氨基羰基、4-甲氧基-3-氯苯氨基羰基，進而更優(yōu)選氫或甲基，最優(yōu)選氫；和R2是氫、氰基、鹵素、低級烷氧基或-S(O)2NR9R10，其中R9是氫，R10是氫、芳基或烷基，并且位于氧代吲哚環(huán)的5位，優(yōu)選地，R2是氫、氯、溴、氟、甲氧基、乙氧基、苯基、二甲氨基磺酰基、3-氯苯氨基磺?；?、羧基、甲氧基、氨基磺酰基、甲氨基磺酰基、苯氨基磺酰基、吡啶-3-基氨基磺酰基、二甲氨基磺酰基、異丙氨基磺酰基，更優(yōu)選氫、氟或溴。最優(yōu)選地，R2是氟，并且位于二氫吲哚酮環(huán)的5位。
在上述優(yōu)選的、更優(yōu)選的和進而更優(yōu)選的化合物中，在-CONHCH(R3)*CR4(OH)CR5Z鏈中攜帶羥基并且用*表示的碳原子的立體化學(xué)是RS、R或S，更優(yōu)選S。
實用性催化活性受本發(fā)明化合物調(diào)制的PK包括蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶(STK)，前者有兩種類型受體酪氨酸激酶(RTK)和細胞酪氨酸激酶(CTK)。RTK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開始于與特異性生長因子(配體)的細胞外相互作用，繼之以受體二聚化作用、內(nèi)在蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的瞬時刺激作用和磷酸化作用。由此產(chǎn)生細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的結(jié)合位點，與一系列胞質(zhì)發(fā)信號分子生成復(fù)合體，促進適當(dāng)?shù)募毎磻?yīng)(例如細胞分裂、對細胞外微環(huán)境的代謝效應(yīng)等)。參見Schlessinger和Ullrich，1992，Neuron9303-391。
有人已經(jīng)指出，生長因子受體上的酪氨酸磷酸化位點充當(dāng)發(fā)信號分子SH2(src同源性)結(jié)構(gòu)域的高親合性結(jié)合位點。Fantl等，1992，Cell69413-423，Songyang等，1994，Mol.Cell.Biol.142777-2785)，Songyang等，1993，Cell72767-778和Koch等，1991，Science252668-678。已經(jīng)鑒別了若干與RTK締合的細胞內(nèi)底物蛋白。它們可以分為主要的兩組(1)具有催化結(jié)構(gòu)域的底物，和(2)缺乏這類結(jié)構(gòu)域、但是充當(dāng)銜接物并且與催化活性分子締合的底物。Songyang等，1993，Cell72767-778。受體與其底物SH2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的特異性取決于磷酸化酪氨酸殘基周圍的氨基酸殘基。SH2結(jié)構(gòu)域與特定受體上圍繞磷酸酪氨酸殘基的氨基酸序列之間的結(jié)合親合性差異與所觀察到的其底物磷酸化作用差異是一致的。Songyang等，1993，Cell72767-778。這些觀察結(jié)果提示，每種RTK的功能不僅取決于它的表達模式和配體的可利用性，而且取決于下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的排列，這些途徑是由特定受體激活的。因而，磷酸化作用提供了重要的調(diào)節(jié)步驟，它決定了發(fā)信號途徑的選擇性，這些途徑得到特異性生長因子受體以及分化因子受體的補充。
STK主要是cytosol，影響細胞的內(nèi)部生物化學(xué)，經(jīng)常作為對PTK事件的下行反應(yīng)。STK已經(jīng)參與發(fā)信號過程，后者引發(fā)DNA合成和隨后引起細胞增殖的有絲分裂。
因而，PK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致細胞增殖、分化、生長和代謝，而非其他反應(yīng)。異常的細胞增殖可能導(dǎo)致廣泛的功能障礙和疾病，包括瘤形成，例如癌、肉瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和血管瘤，白血病、牛皮癬、動脈硬化、關(guān)節(jié)炎和糖尿病性視網(wǎng)膜病等功能障礙，和其他涉及血管生成和/或血管發(fā)生失控的功能障礙。
為了實施本發(fā)明，并不需要精確地理解本發(fā)明化合物抑制PK的機理。不過，不局限于任何特定的機理或理論，據(jù)信這些化合物與PK催化區(qū)中的氨基酸發(fā)生相互作用。PK通常具有雙葉結(jié)構(gòu)，其中ATP似乎結(jié)合在兩葉之間的裂口中，在氨基酸被保存在PK內(nèi)的區(qū)域中。PK的抑制劑據(jù)信通過非共價的相互作用(例如氫鍵、范德華力和離子相互作用)結(jié)合在相同的通用區(qū)域中，在那里上述ATP與PK結(jié)合。更具體地，據(jù)認為本發(fā)明化合物的2-二氫吲哚酮組分結(jié)合在通常被ATP的腺嘌呤環(huán)所占據(jù)的通用空間中。特定分子對特定PK的特異性可能是另外在2-二氫吲哚酮核上各種取代基與對特定PK而言特異性氨基酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的結(jié)果。因而，不同的二氫吲哚酮取代基可以有助于優(yōu)先與特定PK結(jié)合。選擇對不同ATP(或其他核苷酸)結(jié)合位點有活性的化合物的能力使本發(fā)明化合物可用于利用這樣一種位點定向任意蛋白質(zhì)。本文所公開的化合物因而在這類蛋白質(zhì)的體外測定法中具有實用性，以及通過與這類蛋白質(zhì)的相互作用表現(xiàn)體內(nèi)治療作用。
另外，本發(fā)明的化合物提供了多種實體腫瘤的治療方法，包括但不限于癌、肉瘤，包括卡波濟氏肉瘤、成紅細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、腦脊膜瘤、星形細胞瘤、黑素瘤和成肌細胞瘤。非實體腫瘤癌癥的治療或預(yù)防也是本發(fā)明所關(guān)注的，例如白血病。適應(yīng)癥可以包括但不限于腦癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、血癌、肺癌和骨癌。
進一步涉及不適當(dāng)PK活性的功能障礙類型的非限制性實例有細胞增殖功能障礙、纖維變性癥和代謝功能障礙，本文所述化合物可以用于預(yù)防、治療和研究它們。
可以被本發(fā)明預(yù)防、治療或進一步研究的細胞增殖功能障礙包括癌癥、血管增生功能障礙和腎小球膜細胞增殖功能障礙。
血管增生功能障礙表示涉及異常的血管發(fā)生(血管形成)和血管生成(血管的蔓延)的功能障礙。盡管血管發(fā)生和血管生成在各種正常生理過程中扮演重要角色，例如胚胎發(fā)育、黃體形成、傷口愈合和器官再生，不過它們也在癌癥形成中扮演關(guān)鍵角色，其中它們會導(dǎo)致保持腫瘤存活所需的新毛細血管的形成。血管增生功能障礙的其他實例包括關(guān)節(jié)炎，其中新的毛細血管侵入關(guān)節(jié)，破壞軟骨，和眼疾病，象糖尿病性視網(wǎng)膜病，其中視網(wǎng)膜中的新毛細血管侵入玻璃體，出血，導(dǎo)致失明。
有人已經(jīng)鑒別了兩種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的RTK，它們結(jié)合VEGF的親合性很高fms樣酪氨酸1(flt-1)受體(Shibuya等，1990，Oneogene，5519-524；De Vries等，1992，Science，255989-991)和KDR/FLK-1受體，也已知為VEGF-R2。有人已經(jīng)報道血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原，具有體外內(nèi)皮細胞生長促進活性。Ferrara & Henzel，1989，Biochein.Biophys.Res.Comm.，161851-858；Vaisman等，1990，J.Biol.Chem.，26519461-19566。美國專利申請Ser.Nos.08/193,829、08/038,596和07/975,750中的信息明確提示了VEGF不僅負責(zé)內(nèi)皮細胞的增殖，而且是正常的與病理性血管生成的基本調(diào)節(jié)劑。一般參見Klagsburn & Soker，1993，Current Biology，3(10)699-702；Houck等，1992，J.Biol.Chem.，26726031-26037。
正常的血管發(fā)生和血管生成在各種生理過程中扮演重要角色，例如胚胎發(fā)育、傷口愈合、器官再生和女性生殖過程，例如排卵期間的黃體卵泡發(fā)育和妊娠之后的胎盤生長。Folkman & Shing，1992，J.Biological Chem.，267(16)10931-34。失控的血管發(fā)生和/或血管生成與糖尿病等疾病以及惡性實體腫瘤有關(guān)，后者依靠血管形成進行生長。Klagsburn & Soker，1993，Current Biology，3(10)699-702；Folkham，1991，J.Natl.Cancer Inst.，824-6；Weidner等，1991，New Engl.J.Med.，3241-5。
據(jù)推測的VEGF在血管生成和血管發(fā)生期間的內(nèi)皮細胞增殖和移行中的角色表明了KDR/FLK-1受體在這些過程中的重要角色。糖尿病(Folkman，198，XIthCongress of Thrombosis and Haemostasis(Verstraeta等，eds.)，pp.583-596，Leuven University Press，Leuven)和關(guān)節(jié)炎等疾病以及惡性腫瘤生長可以是由失控的血管生成所導(dǎo)致的。例如參見Folkman，1971，N.Engl.J.Med.，2851182-1186。與VEGF特異性結(jié)合的受體是重要的和強大的治療目標，用于調(diào)節(jié)和調(diào)制血管發(fā)生和/或血管生成和各種牽涉由這類過程導(dǎo)致的異常細胞生長的嚴重疾病。Plowman等，1994，DN & P，7(6)334-339。更確切地，KDR/FLK-1受體在新血管形成中的特殊角色使其成為治療方法的選擇目標，以治療癌癥和其他牽涉血管形成失控的疾病。
因而，本發(fā)明提供能夠調(diào)節(jié)和/或調(diào)制酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、包括KDR/FLK-1受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，目的是抑制或促進血管生成和/或血管發(fā)生，也就是抑制、防止或干擾在被配體、例如VEGF激活時被KDR/FLK-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號的化合物。盡管據(jù)信本發(fā)明化合物作用于受體或其他沿行酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組分，不過它們也可以直接作用于由失控的血管生成所產(chǎn)生的腫瘤細胞。
盡管人與鼠的對應(yīng)“flk-I”屬受體的命名法是不同的，不過它們在很多方面是可互換的。鼠受體Flk-1及其人對應(yīng)物KDR在細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域內(nèi)共享93.4％的序列同源性。同樣，鼠FLK-I結(jié)合人VEGF的親合性與小鼠VEGF相同，因此被來自這兩種受體的配體激活。Millauer等，1993，Cell，72835-846；Quinn等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907533-7537。當(dāng)在293細胞(人胚胎腎成纖維細胞)中被共同表達時，F(xiàn)LK-1還與酪氨酸締合，并隨后磷酸化人RTK底物(例如PLC-γ或p85)。
依賴于FLK-1受體的模型因此可直接用于了解KDR受體。例如，鼠FLK-1受體在鑒別調(diào)節(jié)鼠信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的化合物的方法中的用途可直接用于可以用于鑒別調(diào)節(jié)人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的化合物，也就是調(diào)節(jié)涉及KDR受體的活性的化合物。因而，被鑒別為體外KDR/FLK-1抑制劑的化合物也能被確認為適合于體內(nèi)模型。體內(nèi)小鼠和大鼠模型都已被證明對作用于KDR/FLK-1誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分的臨床潛力檢查具有優(yōu)異的價值。
因而，本發(fā)明提供這樣的化合物，它們通過影響KDR/FLK-1受體的酶活性和干擾受KDR/FLK-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號來調(diào)節(jié)、調(diào)制和/或抑制血管發(fā)生和/或血管生成。因而，本發(fā)明提供多種實體腫瘤的治療方法，包括但不限于成膠質(zhì)細胞瘤、黑紊瘤、卡波濟氏肉瘤、和卵巢、肺、乳腺、前列腺、胰腺、結(jié)腸與表皮樣癌。另外，有數(shù)據(jù)提示抑制KDR/Flk-1介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的化合物給藥還可以用于血管瘤、再狹窄和糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療。
此外，本發(fā)明涉及通過其他受體介導(dǎo)途徑抑制血管發(fā)生和血管生成，包括包含flt-1受體的途徑。
受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開始于與特異性生長因子(配體)的細胞外相互作用，繼之以受體二聚化作用、內(nèi)在蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的瞬時刺激作用和自磷酸化作用。由此產(chǎn)生細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的結(jié)合位點，與一系列胞質(zhì)發(fā)信號分子生成復(fù)合體，促進適當(dāng)?shù)募毎磻?yīng)，例如細胞分裂、對細胞外微環(huán)境的代謝效應(yīng)等。參見Schlessinger和Ullrich，1992，Neuron91-20。
KDR/FLK-1的細胞內(nèi)區(qū)域與PDGF-P受體和/或相關(guān)性flt-1受體的密切同源性(50.3％同源性)說明了重疊信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的誘導(dǎo)作用。例如，對PDGF-P受體而言，已知有src家族成員(Twamley等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907696-7700)、磷脂酰肌醇-3′-激酶(Hu等，1992，Mol.Cell.Biol.，12981-990)、磷脂酶cγ(Kashishian & Cooper，1993，Mol.Cell.Biol.，449-51)、ras-GTP酶-活化蛋白(Kashishian等，1992，EMBO J.，111373-1382)、PTP-lD/syp(Kazlauskas等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，10 906939-6943)、Grb2(Arvidsson等，1994，Mol.Cell.Biol.，146715-6726)和銜接分子Shc與Nck(Nishimura等，1993，Mol.Cell.Biol.，136889-6896)結(jié)合牽涉不同自磷酸化位點的區(qū)域。一般參見Claesson-Welsh，1994，Prog.GrowthFactor Res.，537-54。因而，有可能被KDR/FLK-1激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括ras途徑(Rozakis等，1992，Nature，360689-692)、PI-3′-激酶、src-介導(dǎo)的和plcγ-介導(dǎo)的途徑。每種這些途徑都可能在內(nèi)皮細胞中KDR/FLK-1的血管生成和/或血管發(fā)生效應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色。所以，本發(fā)明的進一方面涉及本文所述有機化合物調(diào)制血管生成和血管發(fā)生的用途，因為這類過程是受這些途徑控制的。
相反，涉及血管皺縮、收縮或閉合的功能障礙(例如再狹窄)也受到牽連，可以用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防。
纖維變性癥表示細胞外基質(zhì)的異常生成。纖維變性癥的實例包括肝硬化和腎小球膜細胞增殖功能障礙。肝硬化是以導(dǎo)致肝瘢痕形成的細胞外基質(zhì)成分增加為特征的。導(dǎo)致肝瘢痕的細胞外基質(zhì)增加還可以是由病毒感染所致，例如肝炎。脂肪細胞似乎在肝硬化中扮演主要角色。其他所牽連的纖維變性癥包括動脈粥樣硬化。
腎小球膜細胞增殖功能障礙表示由腎小球膜細胞的異常增殖所引起的功能障礙。腎小球膜增殖功能障礙包括各種人類腎疾病，例如腎小球性腎炎、糖尿病性腎病和惡性腎硬化以及諸如血栓性微血管病綜合征、移植排斥和腎小球病。RTK PDGFR參與腎小球膜細胞增殖的維持。Floege等，1993，Kidney International4347S-54S。
很多癌癥是細胞增殖功能障礙，如前面所述，PK與細胞增殖功能障礙有關(guān)。因而，PK、例如RTK家族成員與癌癥的形成有關(guān)也就不足為奇了。有些受體，象EGFR(Tuzi等，1991，Br.J.Cancer63227-233，Torp等，1992，APMIS100713-719)、HER2/neu(Slamon等，1989，Science244707-712)和PDGF-R(Kumabe等，1992，Oncogene，7627-633)在很多腫瘤中被過度表達，和/或持續(xù)被自分泌環(huán)激活。事實上，在大多數(shù)常見的和嚴重的癌癥中，已經(jīng)證實了這些受體的過度表達(Akbasak和Suner-Akbasak等，1992，J.Neurol.Sci.，111119-133，Dickson等，1992，Cancer Treatment Res.61249-273，Korc等，1992，J.Clin.Invest.901352-1360)和自分泌環(huán)(Lee和Donoghue，1992，J.Cell.Biol.，1181057-1070，Korc等，supra，Akbasak和Suner-Akbasak等，supra)。例如，EGFR與鱗狀上皮細胞癌、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、頭頸癌、肺癌和膀胱癌有關(guān)。HER2與乳腺、卵巢、胃、肺、胰腺和膀胱癌有關(guān)。PDGFR與成膠質(zhì)細胞瘤和黑素瘤以及肺、卵巢與前列腺癌有關(guān)。RTK c-met也與惡性腫瘤形成有關(guān)。例如，c-met尤其與結(jié)腸直腸、甲狀腺、胰腺、胃與肝細胞癌和淋巴瘤有關(guān)。另外，c-met還與白血病有關(guān)。在何杰金氏病和布吉特氏病患者中也檢測到c-met基因的過度表達。
IGF-IR除了與營養(yǎng)物供養(yǎng)和II型糖尿病有牽連以外，還與若干癌癥類型有關(guān)。例如，IGF-I是若干腫瘤類型的自分泌生長刺激劑，例如人乳腺癌細胞(Arteaga等，1989，J.Clin.Invest.841418-1423)和小細胞肺腫瘤細胞(Macauley等，1990，Cancer Res.，502511-2517)。另外，IGF-I盡管整體而言參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長和分化，不過也似乎是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的自分泌刺激劑。Sandberg-Nordqvist等，1993，Cancer Res.532475-2478。IGF-IR及其配體在細胞增殖中的重要性進一步得到這樣一個事實的支持，即很多細胞類型培養(yǎng)物(成纖維細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、T淋巴細胞、骨髓細胞、軟骨細胞和成骨細胞(骨髓干細胞))都被IGF-I刺激生長。Goldring和Goldring，1991，Eukaryotic Gene Expression，1301-326。Baserga和Coppola提出IGF-IR在轉(zhuǎn)化作用機理中扮演核心角色，它可能成為廣譜人類惡性腫瘤的治療干預(yù)的優(yōu)選目標。Baserga，1995，Cancer Res.，55249-252，Baserga，1994，Cell79927-930，Coppola等，1994，Mol.Cell.Biol.，144588-4595。
STK在很多癌癥類型中都有牽連，尤其包括乳腺癌(Cance等，Int.J.Cancer，54571-77(1993))。
異常PK活性與疾病之間的關(guān)系并不限于癌癥。例如，RTK與諸如牛皮癬、糖尿病、子宮內(nèi)膜異位、血管生成、動脈粥樣化斑形成、阿爾茨海默氏病、再狹窄、林-希氏病、表皮過度增生、神經(jīng)變性疾病、衰老相關(guān)性黃斑變性和血管瘤等疾病有關(guān)。例如，在角膜和皮膚傷口愈合中顯示有EGFR。在II型糖尿病中顯示有胰島素-R和IGF-1R缺乏。更完全的特定RTK與它們的治療適應(yīng)癥之間的相互關(guān)系參見Plowman等，1994，DN & P7334-339。
如前面所述，不僅RTK，而且CTK、包括但不限于src，abl，fps，yes，fyn，lyn，lck，blk，hck，fgr和yrk(Bolen等，1992，F(xiàn)ASEB J.，63403-3409)都參與增殖性和代謝性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，因而能夠預(yù)期、并且已經(jīng)顯示參與本發(fā)明所涉及的很多PTK介導(dǎo)功能障礙。例如突變的src(v-src)已經(jīng)顯示是雞中的一種致癌蛋白(pp60v-src)。而且，它的細胞同系物原致癌基因pp60c-src傳送很多受體的致癌基因信號。EGFR或HER2/neu在腫瘤中的過度表達引起PP60c-src的結(jié)構(gòu)活化，這是惡性腫瘤細胞所特有的，但是在正常細胞中則不存在。另一方面，缺乏c-src表達的小鼠表現(xiàn)骨硬化表型，說明了c-src參與破骨細胞功能，并且可能牽涉相關(guān)的功能障礙。
類似地，Zap70在可能涉及自體免疫疾病的T細胞發(fā)信號。
STK與炎癥、自體免疫疾病、免疫應(yīng)答、和諸如再狹窄、纖維變性、牛皮癬、骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等過度增殖癥有關(guān)。
PK在胚胎植入中有牽連。因而，本發(fā)明的化合物可以提供預(yù)防這類胚胎植入的有效方法，由此可用作分娩控制劑。另外可以用本發(fā)明化合物治療或預(yù)防的功能障礙有免疫功能障礙，例如自體免疫疾??；AIDS；和心血管功能障礙，例如動脈粥樣硬化。
最后，RTK和CTK在目前都被懷疑牽涉超免疫功能障礙。
所列舉的化合物和數(shù)據(jù)無論如何也決不被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
給藥和藥物組合物本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可以直接對人類患者給藥，或者可以在藥物組合物中給藥，其中上述物質(zhì)是與適合的載體或賦形劑混合的。藥物的配制與給藥工藝可以參見″Remington′sPharmacological Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA.最新版。
本文所用的“給以”或“給藥”表示本發(fā)明的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、或含有式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物對生物體的釋放，目的是PK相關(guān)性功能障礙的預(yù)防或治療。
適合的給藥途徑可以非限制性地包括口服、直腸、透粘膜或腸道給藥，或者肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、脈絡(luò)膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。優(yōu)選的給藥途徑是口服和腸胃外。
作為替代選擇，可以以局部而非全身的方式給以化合物，例如化合物直接注射到實體腫瘤內(nèi)，經(jīng)常是藥庫或緩釋制劑。
此外，可以在定向藥物釋放系統(tǒng)中給以藥物，例如在涂有腫瘤特異性抗體的脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體將被定向于腫瘤，并且被腫瘤選擇性吸收。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域熟知的過程加以制造，例如借助常規(guī)的混合、溶解、造粒、包糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冷凍干燥過程。
按照本發(fā)明所使用的藥物組合物可以按常規(guī)方式加以配制，其中使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體，包含賦形劑和助劑，它們有利于活性化合物加工為可以藥用的制劑。恰當(dāng)?shù)闹苿┮蕾囉谒x擇的給藥途徑。
關(guān)于注射，本發(fā)明化合物可以被配制成水溶液，優(yōu)選地在生理學(xué)上可相容的緩沖液中，例如漢克氏溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液。關(guān)于透粘膜給藥，在制劑中使用適合于所要滲透的屏障的滲透劑。這類滲透劑是本領(lǐng)域公知的。
關(guān)于口服給藥，化合物可以這樣配制，將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的、藥學(xué)上可接受的載體混合。這類載體使本發(fā)明化合物能夠配制成片劑、丸劑、錠劑、糖錠劑、膠囊劑、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸液等，以被患者口服攝取?？谟盟幬镏苿┛梢赃@樣制備，使用一種固體賦形劑，可選地研磨所得混合物，如果需要的話加入其他適合的助劑后，加工顆?；旌衔?，得到片劑或糖錠劑藥芯。有用的賦形劑確切地有填充劑，例如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉和馬鈴薯淀粉，和其他材料，例如明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的話，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸。還可以使用一種鹽，例如藻酸鈉。
為糖錠劑藥芯提供適合的包衣。為此，可以使用濃的糖溶液，它可以可選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、聚乙二醇和或二氧化鈦；漆溶液；和適合的有機溶劑或溶劑混合物?？梢韵蚱瑒┗蛱清V劑包衣加入染劑或色素，用于鑒別或區(qū)分活性化合物劑量的不同組合。
可以口用的藥物組合物包括由明膠制成的推入配合式膠囊、以及由明膠和增塑劑制成的軟密封膠囊，增塑劑例如甘油或山梨糖醇。推入配合式膠囊可以含有活性成分與下列成分的混合物填充劑，例如乳糖；粘合劑，例如淀粉；和/或潤滑劑，例如滑石或硬脂酸鎂；和可選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸浮在適合的液體中，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。在這些制劑中還可以加入穩(wěn)定劑。
還可以使用的藥物組合物包括硬明膠膠囊。作為非限制性實例，活性化合物膠囊口用藥物產(chǎn)品制劑可以是50和200mg劑量強度的。這兩種劑量強度是從相同的顆粒制成的，填充在不同大小的硬明膠膠囊中，3號膠囊填充50mg，0號膠囊填充200mg。制劑的組成例如可以如表2所示。
表2
可以將膠囊包裝在褐色玻璃或塑料瓶內(nèi)，以保護活性化合物避光。含有活性化合物膠囊制劑的容器必須貯存在受控制的室溫下(15-30℃)。
關(guān)于通過吸入給藥，按照本發(fā)明所使用的化合物適宜以氣霧噴霧劑的形式釋放，其中使用加壓包裝或霧化器和適合的推進劑，非限制性地例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加壓氣霧劑的情況下，提供計量釋放的閥門可以控制劑量單元?？梢耘渲颇z囊和藥筒，例如由明膠制成，用在吸入器或吹入器內(nèi)，含有化合物與適合的粉劑基質(zhì)的混合物，例如乳糖或淀粉。
化合物還可以被配制成腸胃外給藥的形式，例如通過大丸劑注射或連續(xù)輸注。注射制劑可以是單元劑量形式，例如在安瓿或多劑溶劑內(nèi)，其中加入一種防腐劑。組合物可以采取諸如在油性或水性載體中的懸液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制材料，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于腸胃外給藥的藥物組合物包括活性化合物的水溶性形式的水溶液，非限制性地例如鹽形式。另外，可以在親脂性載體中制備活性化合物的懸液。適合的親脂性載體包括脂肪油，例如芝麻油；合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯和甘油三酯；或諸如脂質(zhì)體等材料。水性注射懸液可以含有增加懸液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。可選地，懸液還可以含有適合的穩(wěn)定劑和/或增加化合物的溶解度以便制備高濃度溶液的試劑。
作為替代選擇，活性成分可以是粉末的形式，用于在使用前與適合的載體再生，例如無菌無熱原的水。
化合物還可以被配制在直腸組合物中，例如栓劑或保留灌腸劑，例如使用常規(guī)的栓劑基質(zhì)，例如可可脂或其他甘油酯。
除了前面所述制劑以外，化合物還可以被配制成藥庫制劑。這類長效制劑可以通過植入(例如皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射給藥。本發(fā)明的化合物可以與下列成分被配制成用于這種給藥途徑的形式適合的聚合材料或疏水性材料(例如在乳液中與藥理學(xué)上可接受的油)、離子交換樹脂、或微溶性衍生物，非限制性地例如微溶性鹽。
疏水性本發(fā)明化合物的藥物載體的非限制性實例有助溶劑系統(tǒng)，包含苯甲醇、非極性表面活性劑、水可混溶性有機聚合物和含水相，例如VPD助溶劑系統(tǒng)。VPD是3％w/v苯甲醇、8％w/v非極性表面活性劑聚山梨醇酯80與65％w/v聚乙二醇300的溶液，在絕對乙醇中補足體積。VPD助溶劑系統(tǒng)(VPD∶D5W)由被5％葡萄糖水溶液稀釋1∶1的VPD組成。這種助溶劑系統(tǒng)良好地溶解疏水性化合物，本身在全身給藥后僅產(chǎn)生低毒性。自然，這樣一種助溶劑系統(tǒng)的比例可以各不相同，而不破壞它的溶解度和毒性特征。此外，助溶劑組分的特性可以各不相同例如，可以使用其他低毒性非極性表面活性劑代替聚山梨醇酯80，可以改變聚乙二醇的成分大小，其他生物可相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮，其他糖或多糖可以取代葡萄糖。
作為替代選擇，可以采用疏水性藥物化合物的其他釋放系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是熟知的疏水性藥物的釋放載體實例。另外，還可以采用某些有機溶劑，例如二甲基亞砜，盡管經(jīng)常是以更大的毒性為代價的。
另外，化合物可以利用緩釋系統(tǒng)加以釋放，例如含有治療劑的固體疏水性聚合物的半滲透性基質(zhì)。已有各種緩釋材料，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。緩釋膠囊可以釋放化合物達幾周至100天以上，這依賴于它們的化學(xué)性質(zhì)。根據(jù)治療劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，可以采用另外的使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的策略。
本文的藥物組合物還可以包含適合的固體或凝膠相載體或賦形劑。這類載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、淀粉、纖維素衍生物、明膠、和聚合物，例如聚乙二醇。
很多調(diào)制PK的本發(fā)明化合物可以被提供為生理學(xué)上可接受的鹽，其中所要求保護的化合物可以構(gòu)成帶負電或帶正電的部分。其中化合物構(gòu)成帶正電部分的鹽的實例非限制性地包括季銨(本文另有定義)，諸如鹽酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽等鹽，其中季銨基團的氮原子是所選擇的本發(fā)明化合物已經(jīng)與適當(dāng)?shù)乃岱磻?yīng)的氮。其中本發(fā)明化合物構(gòu)成帶負電部分的鹽非限制性地包括鈉、鉀、鈣和鎂鹽，由化合物的羧酸基團與適當(dāng)?shù)膲A(例如氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈣(Ca(OH)2)等)的反應(yīng)所生成。
適合用在本發(fā)明中的藥物組合物包括這樣的組合物，其中活性成分的含量足以達到預(yù)期的目的，例如PK活性的調(diào)制或PK相關(guān)性功能障礙的治療或預(yù)防。
更具體而言，治療有效量表示化合物有效預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀或者延長受治療者存活期的量。
治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，尤其按照本文所提供的詳細公開內(nèi)容。
關(guān)于任何用在本發(fā)明方法中的化合物，首先可以從細胞培養(yǎng)測定法估計治療有效量或劑量。然后，可以制訂用于動物模型的劑量，以便達到包括如細胞培養(yǎng)所測定的IC50(也就是供試化合物達到PK活性的半數(shù)最大抑制作用的濃度)的循環(huán)濃度范圍。這類信息然后可以用于更精確地確定對人有用的劑量。
本文所述化合物的毒性和治療功效可以通過標準的藥學(xué)程序在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏屑右詼y定，例如測定主體化合物的IC50和LD50(本文另有對二者的討論)。從這些細胞培養(yǎng)測定法和動物研究所得數(shù)據(jù)可以用于制訂用于人的劑量范圍。劑量可以因所采用的劑型和所利用的給藥途徑而異。各醫(yī)師可以根據(jù)患者條件選擇確切的制劑、給藥途徑和劑量(例如參見Fingl等，1975，″The Pharmacological Basis ofTherapeutics″，Ch.1 p.1)。
可以個別調(diào)整給藥量和間隔，以提供活性成分足以維持激酶調(diào)制效應(yīng)的血漿水平。這些血漿水平被稱為最低有效濃度(MEC)。MEC將因每種化合物而異，但是可以從體外數(shù)據(jù)估計出來，例如利用本文所述測定法可以確定達到50-90％激酶抑制作用所需的濃度。達到MEC所需的劑量將依賴于個別特征和給藥途徑。HPLC測定法或生物測定法可以用于測定血漿濃度。
給藥間隔也可以用MEC值確定?；衔飸?yīng)當(dāng)采用這樣一種制度給藥，維持血漿水平在MEC以上的時間占10-90％，優(yōu)選在30-90％之間，最優(yōu)選在50-90％之間。
目前，式I、Ia或II化合物的治療有效量從大約25mg/m2至1500mg/m2每天；優(yōu)選約3mg/m2/天。進而更優(yōu)選50mg/qm qd至400mg/qd。
在局部給藥或選擇性攝取的情況下，藥物的有效局部濃度可以不涉及血漿濃度，可以采用本領(lǐng)域已知的其他方法確定正確的給藥量和間隔。
組合物的給藥量當(dāng)然將依賴于受治療者、病痛的嚴重性、給藥的方式、醫(yī)師的判斷等。
如果需要的話，組合物可以存在于包裝或分散裝置內(nèi)，例如FDA批準的試劑盒，它可以含有一種或多種含有活性成分的單元劑型。包裝例如可以包含金屬或塑料箔，例如泡眼包裝。包裝或分散裝置可以附帶有給藥指導(dǎo)。包裝或分散器還可以在容器內(nèi)附帶有由調(diào)節(jié)藥品制造、使用或銷售的政府機構(gòu)發(fā)布的通告，證明該組合物或者對人或獸給藥已經(jīng)得到該機構(gòu)的批準。這類通告例如可以是由美國食品與藥品管理局批準的處方藥標簽或產(chǎn)品插件。還可以制備配制在相容性藥物載體中的、包含本發(fā)明化合物的組合物，置于適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，標示所治療的適應(yīng)癥。標簽上適合的適應(yīng)癥可以包括腫瘤的治療、血管生成的抑制、纖維變性、糖尿病的治療等。
本發(fā)明可以與CMC懸液載體一起給藥。例證性CMC懸液列在下表3中。
表3
*依賴于所需濃度(日期)。
1.0升CMC懸液載體的方案如下。計算利用表格制備載體制劑所需賦形劑的適當(dāng)?shù)牧?，表格顯示載體制劑的組成和批量大小。稱重適合的空容器，例如清潔的廣口玻璃瓶或聚乙烯瓶。向容器加入約600ml水。稱重羧甲基纖維素鈉(5mg)，轉(zhuǎn)移至容器內(nèi)。利用磁攪拌棒或帶有葉片的實驗室攪拌器攪拌至均勻(約2-3小時)。稱重NaCl，加入到容器內(nèi)。繼續(xù)混合至溶解(約10分鐘)。加入聚山梨醇酯80?；旌现寥芤壕鶆?約20分鐘)。加入苯甲醇?；旌现寥芤壕鶆?約10分鐘)。加入其余的水，使溶液的重量達到所需重量或體積(1010mg或1000ml，22℃下的密度為1.01)。貯存在2-8℃下(在冷卻下)。
懸液制劑可以制造如下。利用研缽和研棒研磨API，得到看起來均勻的粉末，粒徑很小(沒有大塊或大的顆?！硐氲貞?yīng)當(dāng)通過美國標準篩＞80，也就是歷經(jīng)＜180μm)。稱重計算量的API，放入容器。向容器加入約90％總需求量的CMC懸液載體。利用帶有葉片的實驗室攪拌器或等價物將化合物懸浮在載體中。葉片的直徑應(yīng)當(dāng)匹配容器底部的直徑，以確?；旌铣浞?。在50rpm下攪拌30分鐘，或者直至藥物充分懸浮。加入載體制劑至“qs”(適量)，即對應(yīng)于批量大小的適當(dāng)重量。在50rpm下攪拌另外30分鐘。立即等分懸液至琥珀色玻璃或聚乙烯容器內(nèi)。保護容器避光。在2-8℃下攪拌(在冷卻下，不凍結(jié))。
本發(fā)明還有一個方面，本文所述化合物或其鹽或前體藥物可能與其他化療劑聯(lián)合用于上述疾病和功能障礙的治療。例如，本發(fā)明的化合物、鹽或前體藥物可以與單獨的烷基化劑聯(lián)合，例如氟尿嘧啶(5-FU)，或者進一步與葉酸聯(lián)合；或其他烷基化劑，非限制性地例如其他嘧啶類似物，例如UFT、capecitabine、吉西他濱和阿糖胞苷，烷基磺酸酯，例如白消安(用于慢性粒細胞性白血病的治療)、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶類，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和烏瑞替派；環(huán)乙亞胺類和甲基三聚氰胺類，例如六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲蜜胺；和氮芥類，例如苯丁酸氮芥(用于慢性淋巴細胞性白血病、原發(fā)性巨球蛋白血癥和非何杰金氏淋巴瘤的治療)、環(huán)磷酰胺(用于何杰金氏病、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、維耳姆斯氏瘤和橫紋肌肉瘤的治療)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、新氮芥、潑尼莫司汀和尿嘧啶氮芥(用于原發(fā)性血小板增多、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病和卵巢癌的治療)；和三嗪類，例如達卡巴嗪(用于軟組織肉瘤的治療)。
本發(fā)明的化合物、鹽或前體藥物還可以與其他抗代謝化療劑聯(lián)合使用，非限制性地例如葉酸類似物，例如甲氨蝶呤(用于急性淋巴細胞性白血病、絨膜癌、蕈樣真菌病、乳腺癌、頭頸癌和骨原性肉瘤的治療)和蝶羅呤；和嘌呤類似物，例如巰基嘌呤和硫代鳥嘌呤(用于急性粒細胞性、急性淋巴細胞性和慢性粒細胞性白血病的治療)。
受到關(guān)注的是本發(fā)明的化合物、鹽或前體藥物還可以與天然產(chǎn)物類化療劑聯(lián)合使用，非限制性地例如長春花屬生物堿，例如長春花堿(用于乳腺癌和睪丸癌的治療)、長春新堿和長春地辛；表鬼臼毒素類，例如依托泊苷和替尼泊苷，二者都可用于睪丸癌和卡波濟氏肉瘤的治療；抗生素化療劑，例如柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、絲裂霉素(用于治療胃、宮頸、結(jié)腸、乳腺、膀胱和胰腺癌癥)、放線菌素、替莫唑胺、普卡霉素、博萊霉素(用于皮膚、食管和泌尿生殖道癌癥的治療)；和酶化療劑，例如L-天冬酰胺酶。
除了上述以外，本發(fā)明的化合物、鹽或前體藥物還可以與下列藥物聯(lián)合使用鉑配合物(順鉑等)；取代的脲，例如羥基脲；甲基肼衍生物，例如丙卡巴肼；腎上腺皮質(zhì)抑制劑，例如米托坦、氨魯米特；激素和激素拮抗劑，例如腎上腺皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松)、孕激素(例如羥孕酮己酸酯)、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄性激素(例如丙酸睪酮)；和芳化酶抑制劑，例如anastrozole。
最后，還受到關(guān)注的是本發(fā)明化合物與下列藥物的組合也是有效的米托蒽醌；紫杉醇；本領(lǐng)域已知的環(huán)加氧酶-2抑制劑，確切為Celebrex、Paracoxib、Vioxx、公開在PCT公報No.WO 99/11605中的Abbott′s Cox-189；拓撲異構(gòu)酶抑制劑，例如Camptosar；Her-2受體拮抗劑，例如Herceptin、endostatin、Gleevac；ImClone VEGF受體拮抗劑IMC C225，用于實體腫瘤癌癥或白血病的治療，非限制性地例如急性骨髓性(非淋巴細胞性)白血病。
一般合成方法下列一般方法可以用于制備本發(fā)明化合物將適當(dāng)取代的2-氧代吲哚(1eq.)、適當(dāng)取代的3-羧基-5-甲?；量?1.2eq.)和堿(0.1eq.)混合在溶劑(1-2ml/mmol 2-氧代吲哚)中，然后將混合物加熱約2至約12小時。冷卻后，將所生成的沉淀過濾，用冷乙醇或乙醚洗滌，真空干燥，得到對應(yīng)的5-(2-氧代-1，2-二氫亞吲哚-(3Z)-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸。如果沒有沉淀生成，濃縮反應(yīng)混合物，將殘余物用二氯甲烷/乙醚研制，過濾收集所得固體，然后干燥。產(chǎn)物可以可選地用色譜法進一步純化。
堿可以是有機或無機堿。如果使用有機堿，優(yōu)選地它是含氮堿。有機含氮堿的實例包括但不限于二異丙胺、三甲胺、三乙胺、苯胺、吡啶、1，8-二氮雜二環(huán)并[5.4.1]十一碳-7-烯、吡咯烷和哌啶。
無機堿的實例非限制性地有氨、堿金屬或堿土金屬的氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽和酰胺。堿金屬包括鋰、鈉和鉀，堿土金屬包括鈣、鎂和鋇。
在目前優(yōu)選的本發(fā)明實施方式中，當(dāng)溶劑是質(zhì)子性溶劑時，例如水或醇，堿是堿金屬或堿土金屬無機堿，優(yōu)選堿金屬或堿土金屬氫氧化物。
將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的是，基于已知的有機合成的一般原理和本文的公開內(nèi)容，該堿將是最適合于所關(guān)注的反應(yīng)的。
進行反應(yīng)的溶劑可以是質(zhì)子性溶劑或質(zhì)子惰性溶劑，優(yōu)選地它是質(zhì)子性溶劑。“質(zhì)子性溶劑”是這樣一種溶劑，氫原子與氧或氮原子共價鍵合，賦予氫原子相當(dāng)?shù)乃嵝?，因而能夠通過氫鍵被溶質(zhì)“共享”。質(zhì)子性溶劑的實例非限制性地包括水和醇。
“質(zhì)子惰性溶劑”可以是極性的或非極性的，但是在兩種情況下都不含有酸性氫，因此不能與溶質(zhì)形成氫鍵。非極性質(zhì)子惰性溶劑的實例非限制性地有戊烷、己烷、苯、甲苯、二氯甲烷和四氯化碳。極性質(zhì)子惰性溶劑的實例有氯仿、四氫呋喃、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺。
在目前優(yōu)選的本發(fā)明實施方式中，溶劑是質(zhì)子性溶劑，優(yōu)選水或醇，例如乙醇。
反應(yīng)是在高于室溫的溫度下進行的。溫度一般從大約30℃至大約150℃，優(yōu)選大約80℃至大約100℃，最優(yōu)選大約60℃至大約85℃，后者大約是乙醇的沸點。“大約”意味著溫度范圍優(yōu)選地在所示溫度的10攝氏度以內(nèi)，更優(yōu)選地在所示溫度的5攝氏度以內(nèi)，最優(yōu)選地在所示溫度的2攝氏度以內(nèi)。因而，例如，“大約75℃”表示75℃±10℃，優(yōu)選75℃±5℃，最優(yōu)選75℃±2℃。
使用容易獲得的原料，利用化學(xué)領(lǐng)域熟知的方法，可以容易地合成2-氧代吲哚和3-羧基-5-甲?；量?。
在有機溶劑中，例如二甲基甲酰胺、四氫呋喃等，在適合的偶聯(lián)劑的存在下，例如二環(huán)己基碳二亞胺、DEAD、EDC和HOBt，5-(2-氧代-1，2-二氫亞吲哚-(3Z)-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸與式ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2胺的偶聯(lián)得到式(I)化合物。式ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2胺是商業(yè)上可得到的，或者它們可以用本領(lǐng)域熟知的方法制備。一些這類方法在下文中有所描述。
將為本領(lǐng)域技術(shù)人員領(lǐng)會到的是，用于生成本發(fā)明化合物的其他合成途徑也是可利用的，下列實施例僅供舉例而非限制。
實施例給出下列制備例和實施例，使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更清楚地理解和實施本發(fā)明。它們不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍，僅僅是其例證和代表。
合成實施例實施例15-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸的合成步驟1將二甲基甲酰胺(25ml，3eq.)在冰浴中冷卻，同時攪拌。向其中加入POCl3(1.1eq.，10.8ml)。30分鐘后，向反應(yīng)加入3，5-二甲基-4-乙基酯吡咯(17.7g，105.8mmol)的DMF溶液(2M，40ml)，繼續(xù)攪拌。2小時后，將反應(yīng)用水(250ml)稀釋，用1N NaOH水溶液堿化至pH＝11。過濾除去白色固體，用水和己烷沖洗，干燥，得到5-甲?；?2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯(19.75g，95％)，為黃褐色固體。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.11(br s，1H，NH)，9.59(s，1H，CHO)，4.17(q，J＝6.7Hz，2H，OCH2CH3)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.26(d，J＝6.7Hz，3H，OCH2CH3).
步驟2向氫氧化鉀(3g，53mmol)的甲醇(3ml)與水(10ml)溶液加入5-甲?；?2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯(2g，10mmol)。將混合物回流3小時，冷卻至室溫，用6N鹽酸酸化至pH 3。過濾收集固體，用水洗滌，在真空烘箱內(nèi)干燥過夜，得到5-甲?；?2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(1.6g，93％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ12.09(s，br，2H，NH & COOH)，9.59(s，1H，CHO)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3).
步驟3將5-氟靛紅(8.2g，49.7mmol)溶于50ml水合肼，回流1小時。然后將反應(yīng)混合物倒入冰水中。然后將沉淀過濾，用水洗滌，在真空烘箱內(nèi)干燥，得到5-氟-2-氧代吲哚(7.5g)。
步驟4將5-氟氧代吲哚(100mg，0.66mmol)、5-甲?；?2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(133mg，0.79mmol)與10滴哌啶在乙醇(3ml)中的反應(yīng)混合物在60℃下攪拌過夜，過濾。將固體用1M鹽酸水溶液、水洗滌，干燥，得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(201mg，定量)，為黃色固體。MS m/z(相對強度，％)299([M-1]+，100).
實施例25-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羥基-丙基)-酰胺的合成步驟1在30℃下，向2-氯甲基環(huán)氧乙烷(95g，1.03mol)加入水(3.08g，0.17mol)與二乙胺(106.2ml，1.03mol)的混合物。然后將反應(yīng)混合物在28-35℃下攪拌6小時，冷卻至20-25℃，得到1-氯-3-二乙氨基-丙-2-醇。
步驟2向氫氧化鈉(47.9g，1.2mol)的78ml水溶液加入1-氯-3-二乙氨基-丙-2-醇。將所得混合物在20-25℃下攪拌1小時，用178ml水稀釋，用乙醚萃取兩次。合并乙醚溶液，用固體氫氧化鉀干燥，蒸發(fā)，得到135g粗產(chǎn)物，經(jīng)過分布蒸餾純化，得到純的縮水甘油基二乙胺(98g，76％)，為一種油。
步驟3歷經(jīng)10分鐘向冰冷卻的25％(w/w)氫氧化銨溶液(25ml，159mmol)滴加縮水甘油基二乙胺(3.2g，24.8mmol)。將反應(yīng)混合物在0-5℃下攪拌1小時，然后在室溫下攪拌14小時。將所得反應(yīng)混合物蒸發(fā)和蒸餾(84-90℃，500-600mT)，得到1-氨基-3-二乙氨基-丙-2-醇(3.3g，92％)。MS m/z 147([M+1]+).
步驟4向5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3羧酸(100mg，0.43mmol)、EDC(122.7mg，0.64mmol)與HOBt(86.5mg，0.64mmol)的1.0ml DMF溶液加入1-氨基-3-二乙氨基-丙-2-醇(93.2mg，0.64mmol)。將所得反應(yīng)溶液在室溫下攪拌過夜，蒸發(fā)。將殘余物溶于10ml水，過濾。將固體用飽和碳酸氫鈉和水洗滌，在高真空烘箱內(nèi)干燥過夜，得到粗產(chǎn)物，經(jīng)過柱色譜純化，用含有三乙胺的6％甲醇-二氯甲烷(2滴/100ml 6％甲醇-二氯甲烷)洗脫，得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羥基-丙基)-酰胺(62mg，34％)，為黃色固體。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.70(s，1H，NH-1′)，10.90(s，1H，NH-1)，7.76(dd，J＝2.38，9.33Hz，1H，H-4)，7.72(s，1H，烯屬的-H)，7.60(m，br.，1H，CONHCH2CH(OH)-CH2N(C2H5)2-4′)，6.93(dt，J＝2.38，8.99Hz，1H，H-5)，6.85(dd，J＝4.55，8.99Hz，1H，H-6)，3.83(m，br，1H，OH)，3.33(m，4H)，2.67(m，br，5H)，2.46(s，3H，CH3)，2.44(s，3H，CH3)，1.04(m，br，6H，CH3x2).MS m/z(相對強度，％)427([M+1]+.，100).
實施例35-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺的合成步驟1將嗎啉(2.6ml，30mmol)與表氯醇(2.35ml，30mmol)在乙醇(50ml)中的混合物在70℃下攪拌過夜。除去溶劑后，將殘余物用二氯甲烷(50ml)稀釋。通過真空過濾收集所沉淀的澄清固體，得到1-氯-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇(2.0g，37％)。1HNMR(DMSO-d6)δ3.49(t，J＝4.8Hz，2H)，3.60(t，J＝4.6Hz，2H)，3.75(m，4H，2xCH2)，4.20(dd，J＝5.2，12Hz，2H)，4.54(m，2H)，4.62(m，1H，CH)，6.64(d，J＝6.4Hz，1H，OH).MS(m/z)180.2(M+1).
步驟2在室溫下，將1-氯-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇(2.0g，11mmol)用NH3的甲醇溶液(25重量％，20ml)處理。向反應(yīng)混合物通入氮，除去氨。蒸發(fā)溶劑，得到1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇的氯化氫鹽(2.0g，91％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.30(d，J＝6.0Hz，2H)，2.36(m，4H，NCH2)，2.65(dd，J＝8.4，12.8Hz，1H)，2.91(dd，J＝3.6，12.8Hz，1H)，3.52(m，4H，OCH2)，3.87(m，1H，CH)，5.32(s，1H，OH)，8.02(brs.，3H，NH3+).MS(m/z)161.1(M+1).
步驟3使5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(120mg，0.4mmol)與1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)縮合，以沉淀出5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺(65mg，36％)。蒸發(fā)母液至干，殘余物經(jīng)過快速色譜純化，得到另外2N(70mg，39％)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.28(m，1H)，2.32(m，1H)，2.40(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.31(m，1H)，3.55(m，4H)，3.78(m，1H)，4.73(brs，1H，OH)，6.82(dd，J＝4.5，8.4Hz，1H)，6.90(td，2J＝2.8，3J＝10.0Hz，1H)，7.53(m，1H)，7.70(s，1H)，7.74(dd，J＝2.0，9.6Hz，1H)(芳香和烯屬的)，10.87(s，1H，CONH)，13.66(s，1H，NH).LC-MS(m/z)441.4(M-1).
氯化2-羥基-7-氧雜-4-氮雜螺[3.5]壬烷的合成 向裝有熱電偶、氮入口和250ml加液漏斗的1L 3頸圓底燒瓶內(nèi)裝入嗎啉(91.5g，91.5ml，1.05mol，1.0eq.)和100ml乙醇。將溶液迅速攪拌，同時歷經(jīng)約30分鐘從加液漏斗加入表氯醇(100g，84.5ml，1.08mol，1.03eq.)。監(jiān)測溫度，當(dāng)罐溫達到27℃時，用冰水浴冷卻反應(yīng)。將澄清的溶液攪拌18小時。用GC測定反應(yīng)(將5滴反應(yīng)混合物稀釋在1ml乙醇中，注射到15m DB-5毛細GC柱上，運行參數(shù)如下注射器250℃，檢測器250℃，初始烘箱溫度28℃，加熱至250℃，每分鐘升10℃)。反應(yīng)完全后，剩余少于3％嗎啉。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮反應(yīng)，直至不再有蒸餾物凝結(jié)，條件為50℃全真空室。將所得油在室溫下貯存24-48小時，或者直至觀察到大量晶體(接種將加速該過程)。將漿液用250ml丙酮稀釋，過濾。將固體在60℃真空烘箱內(nèi)干燥18-24小時。得到84g結(jié)晶性產(chǎn)物。濃縮母液，重復(fù)結(jié)晶過程，可增加收率。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ6.55(d，1H)，4.64(m，1H)，4.53(m，2H)，4.18(m，2H)，3.74(m，4H)，3.60(m，2H)，3.48(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.9，61.39，61.04，60.25，58.54，57.80.
1-氨基-3-(4-嗎啉基)-2-丙醇(外消旋)的合成
向帶有磁攪拌棒的3L 1頸圓底燒瓶內(nèi)裝入氯化2-羥基-7-氧雜-4-氮雜螺[3.5]壬烷(150g，835mmol)，然后裝入23wt.％無水氨的甲醇溶液(2120ml)。將燒瓶用塞子塞住，將所得澄清溶液在20-23℃下攪拌18小時。在上述條件下進行GC，顯示沒有剩余的原料。除去塞子，使氨從溶液中冒出達30分鐘。然后將燒瓶轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，濃縮至白色固體，條件為45℃浴和全室真空。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13C NMR(100MHz DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1.
遵照上述實施例3所述方法，但是用如下制備的2-(S)-1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇代替2-(RS)-1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇，得到所需化合物5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-(S)-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺。
1-氨基-3-(4-嗎啉基)-2-丙醇(非外消旋)的合成 向裝有機械攪拌器、熱電偶和加液漏斗的1L 3頸圓底燒瓶內(nèi)裝入嗎啉(91.5g，91.5ml，1.05mol，1.0eq.)和45ml叔丁醇。將溶液迅速攪拌，同時歷經(jīng)約30分鐘從加液漏斗加入R-表氯醇(100g，84.5ml，1.08mol，1.03eq.)。監(jiān)測溫度，當(dāng)罐溫達到27℃時，用冰水浴冷卻反應(yīng)。將澄清的溶液攪拌18小時。用GC測定反應(yīng)(將5滴反應(yīng)混合物稀釋在1ml乙醇中，注射到15m DB-5毛細GC柱上，運行參數(shù)如下注射器250℃，檢測器250℃，初始烘箱溫度28℃，加熱至250℃，每分鐘升10℃)。反應(yīng)完全后，剩余少于3％嗎啉。將溶液冷卻至10℃，滴加20wt％叔丁醇鉀的THF溶液(576g)，同時保持溫度低于15℃。將所得白色漿液在10-15℃下攪拌2小時，在上述條件下用GC檢查?？梢杂^察到?jīng)]有氯醇。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物，條件為50℃全室真空。將所得混合物用水(500ml)和二氯甲烷稀釋。分離各相，含水相用二氯甲烷(500ml)洗滌。合并有機層，經(jīng)硫酸鈉干燥，濃縮至澄清無色的油。得到145g，97％環(huán)氧化物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.3(dd，4H)，3.1(m，1H)，2.6(dd，1H)，2.5(dd，1H)，2.4(m，4H)，2.2(dd，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ65.4，60.1，53.1，48.9，43.4.
將上述粗的環(huán)氧化物裝入帶有磁攪拌棒的3L 1頸圓底燒瓶內(nèi)。加入無水氨的甲醇溶液(24％w/w，2.5L)，將燒瓶用塞子塞住，將混合物在室溫下攪拌24小時。在上述條件下進行GC，顯示沒有剩余的原料。除去塞子，使氨從溶液中冒出達30分鐘。然后將燒瓶轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，濃縮至澄清無色的油，條件為45℃浴和全室真空。得到124g產(chǎn)物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1.
1-氨基-3-(4-嗎啉基)-2-(S)-丙醇的合成向裝有機械攪拌器、熱電偶和加液漏斗的1L 3頸圓底燒瓶內(nèi)裝入嗎啉(91.5g，91.5ml，1.05mol，1.0eq.)和200ml甲醇。將溶液迅速攪拌，同時歷經(jīng)約30分鐘從加液漏斗加入R-表氯醇(100g，84.5ml，1.08mol，1.03eq.)。監(jiān)測溫度，當(dāng)罐溫達到27℃時，用冰水浴冷卻反應(yīng)。將澄清的溶液攪拌18小時。用GC測定反應(yīng)(將5滴反應(yīng)混合物稀釋在1ml乙醇中，注射到15m DB-5毛細GC柱上，運行參數(shù)如下注射器250℃，檢測器250℃，初始烘箱溫度28℃，加熱至250℃，每分鐘升10℃)。反應(yīng)完全后，剩余少于3％嗎啉。將溶液冷卻至10℃，滴加25wt％甲醇鈉的甲醇溶液(233g，1.08mol，247ml)，同時保持溫度低于15℃。將所得白色漿液在10-15℃下攪拌2小時，在上述條件下用GC檢查?？梢杂^察到?jīng)]有氯醇。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物，條件為50℃全室真空。將所得混合物用水(500ml)和二氯甲烷稀釋。分離各相，含水相用二氯甲烷(500ml)洗滌。合并有機層，經(jīng)硫酸鈉干燥，濃縮至澄清無色的油。得到145g，97％1，2-環(huán)氧-3-嗎啉-4-基丙烷。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.3(dd，4H)，3.1(m，1H)，2.6(dd，1H)，2.5(dd，1H)，2.4(m，4H)，2.2(dd，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ65.4，60.1，53.1，48.9，43.4.
將上述粗的1，2-環(huán)氧-3-嗎啉-4-基丙烷裝入帶有磁攪拌棒的3L 1頸圓底燒瓶內(nèi)。加入無水氨的甲醇溶液(24％w/w，2.5L)，將燒瓶用塞子塞住，將混合物在室溫下攪拌24小時。在上述條件下進行GC，顯示沒有剩余的原料。除去塞子，使氨從溶液中冒出達30分鐘。然后將燒瓶轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，濃縮至澄清無色的油，條件為45℃浴和全室真空。得到124g 1-氨基-3-(4-嗎啉基)-2-(S)-丙醇。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1.
將咪唑酰胺(7.0g，32.3mmol)、胺(15.0g，64.6mmol)、5-氟氧代吲哚(4.93g，32.6mmol)、三乙胺(9.79g，96.9mmol)和THF(88ml)混合，加熱至60℃。形成褐色溶液。在60℃下攪拌24小時后，將黃色漿液冷卻至rt(室溫)，過濾。將濾餅用80ml THF洗滌，在50℃真空下干燥過夜。得到褐色固體(23.2g)。將固體懸浮在350ml水中，在rt下5小時后過濾。將濾餅用100ml水洗滌，在50℃真空下干燥過夜。得到8.31g，化學(xué)收率56％。

向裝有溫度計、冷凝器、磁攪拌器和氮入口的0.25L燒瓶內(nèi)裝入4.92g 5-氟氧代吲哚、7.0g咪唑酰胺、15.5g(R)-1-氨基-3-(4-嗎啉基)-2-丙醇、9.78g三乙胺和88ml四氫呋喃。將混合物加熱至60℃達16.5小時。將反應(yīng)冷卻至環(huán)境溫度，過濾。將所得固體懸浮在乙腈中，連續(xù)三次，濃度11ml/g，在真空中干燥，得到3.6g(25.25％)。[HPLC，Hypersil BDS，C-18，5p，(6∶4)，乙腈0.1M氯化銨，PHA-571437＝4.05min.]H1NMR(DMSO)δ10.86(1H，bs)；7.75(1H，d)；7.70(1H，s)；7.50(1H，m)；6.88(2H，m)；4.72(1H，bs)；3.78(1H，bs)；3.56(4H，m)；3.32(6H，m)；3.15(1H，m)； 2.43(8H，bm).
實施例42，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺的合成使5-(2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(113mg，0.4mmol)與1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)縮合，沉淀出2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺(77mg，45.3％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.27(m，1H)，2.32(m，1H)，2.40(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.32(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.8Hz，1H，OH)，6.86(d，J＝7.6Hz，1H)，6.96(t，J＝7.2Hz，1H)，7.10(t，J＝7.6Hz，1H)，7.49(t，J＝5.6Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)(芳香和烯屬的)，10.88(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)425.4(M+1).
實施例55-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(126.6mg，0.4mmol)與1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)縮合，沉淀出5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺(107mg，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.29(m，1H)，2.33(m，1H)，2.39(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.37(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.8Hz，1H，OH)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.53(t，J＝5.6Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)(芳香和烯屬的)，10.99(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)457.4(M-1).
R和S立體異構(gòu)體可以如下制備。
將咪唑酰胺(7.0g，32.3mmol)、胺(15.5g，96.9mmol)、5-氯氧代吲哚(5.48g，32.6mmol)、三乙胺(14ml)和THF(88ml)混合，加熱至60℃。形成紅色溶液。在60℃下攪拌16小時后，將黃色漿液冷卻至rt，過濾。將濾餅用2×50ml THF洗滌，在50℃真空下干燥過夜。得到4.36g，化學(xué)收率29％。
將咪唑酰胺(6.8g，31.3mmol)、胺(10.0g，62.5mmol)、5-氯氧代吲哚(5.3g，31.6mmol)和THF(100ml)混合，加熱至60℃。形成紅色溶液。在60℃下攪拌68小時后，加入三乙胺(14ml)，在60℃下攪拌5小時。反應(yīng)不完全。加入4.6g胺側(cè)鏈，在60℃下攪拌20小時。將黃色漿液冷卻至rt，過濾。將濾餅用2×50ml THF洗滌，在50℃真空下干燥過夜。得到5.48g，化學(xué)收率38％。
實施例65-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(72.2mg，0.2mmol)與1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇(38mg，0.24mmol)縮合，沉淀出5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺(55mg，55％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.27(m，1H)，2.32(m，1H)，2.39(m，4H)，2.41，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.13(s，1H)，3.35(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.4Hz，1H，OH)，6.80(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.51(t，J＝5.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，8.09(d，J＝2.0Hz，1H)(芳香和烯屬的)，10.99(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)503.4(M-1).
實施例72，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成步驟1將3-[1，2，3]三唑(2.0g，29mmol)、表氯醇(3.4ml，43.5mmol)與N，N-二異丙基乙胺(2.6ml，15mmol)在乙醇(50ml)中的混合物在室溫下攪拌過夜。除去溶劑后，殘余物經(jīng)過快速色譜純化(CH2Cl2/CH3OH＝100/1-100/2-100/4)，得到1-氯-3-(1，2，3)三唑-2-基丙-2-醇(2.1g，45％)，1H NMR(CDCl3)δ3.52(m，2H，OH和CH2)，3.60(dd，J＝5.2，11.2Hz，1H)，4.36(m，1H，CH)，4.68(m，2H)，7.67(s，2H).MS(m/z)162.1(M+1)和1-氯-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇(2.3g，49％).1H NMR(CDCl3)δ3.56(s，1H)，3.57(s，1H)，4.35(m，1H)，4.53(dd，J＝7.2，14Hz，1H)，4.67(dd，J＝3.8，14Hz，1H)，7.67(s，1H)，7.71(s，1H).MS(m/z)162.1(M+1).
步驟2在60℃密封的壓力容器內(nèi)，將1-氯-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇(2.3g，13mmol)用NH3的甲醇溶液(25重量％，20ml)處理過夜。冷卻至室溫后，向反應(yīng)混合物通入氮，以除去氨。蒸發(fā)溶劑，得到1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇的氯化氫鹽(2.57g，100％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.68(dd，J＝8.8，12.8Hz，1H)，2.97(dd，J＝3.6，12.8Hz，1H)，4.15(m，1H)，4.44(dd，J＝6.4，14Hz，1H)，4.57(dd，J＝4.6，14Hz，1H)，5.95(d，J＝5.2Hz，1H，OH)，7.77(s，1H)，8.01(brs.，3H，NH3+)，8.12(s，1H).MS(m/z)143.1(M+1).
步驟3使5-(2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(113mg，0.4mmol)與1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)縮合，沉淀出2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3 ]三唑-1-基-丙基)-酰胺(70mg，41％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.45，2.48(2xs，6H，2xCH3)，3.35(m，2H)，4.02(m，1H)，4.32(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.53(dd，J＝3.4，14Hz，1H)，5.43(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.91(d，J＝7.6Hz，1H)，7.01(t，J＝7.6Hz，1H)，7.15(t，J＝8.0Hz，1H)，7.66(s，1H)，7.12(t，J＝5.6Hz，1H)，7.74(s，1H)，7.77(d，J＝7.6Hz，1H)，8.11(s，1H)，10.93(s，1H，CONH)，13.68(s，1H，NH).LC-MS(m/z)405.4(M-1).
實施例85-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(120mg，0.4mmol)與1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)縮合，沉淀出5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(100mg，62％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.98(m，1H)，4.27(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.50(dd，J＝3.4，13.6Hz，1H)，5.38(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.82(dd，J＝4.4，8.4Hz，1H)，6.91(td，2J＝2.4，3J＝9.0Hz，1H)，7.70(m，3H)，7.75(dd，J＝2.4，9.2Hz，1H)，8.11(s.1H)，10.93(s，1H，CONH)，13.73(s，1H，NH).LC-MS(m/z)423.4(M-1).
實施例95-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(126.6mg，0.4mmol)與1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)縮合，沉淀出5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(48mg，27％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.99(m，1H)，4.28(dd，J＝7.8，14Hz，1H)，4.51(dd，J＝3.2，14Hz，1H)，5.39(d，J＝6.0Hz，1H，OH)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，7.12(dd，J＝2.0，8.2Hz，1H)，7.70(m，2H)，7.74(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)，8.07(s，1H)，10.99(s，1H，CONH)，13.65(s，1H，NH).LC-MS(m/z)439.4(M-1).
實施例105-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(144.4mg，0.4mmol)與1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)縮合，沉淀出5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺(130mg，67％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.41，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.99(m，1H)，4.28(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.50(dd，J＝3.6，14Hz，1H)，5.40(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.70(m，2H)，7.77(s，1H)，8.07(s.1H)，8.10(d，J＝1.6Hz，1H)，11.0(s，1H，CONH)，13.64(s，1H，NH).LC-MS(m/z)485.4(M-1).
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸、5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸、5-(2-氧代-1，2-二氫亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸的合成描述在本申請人于2001年2月14日與本申請同時提交的專利申請中，發(fā)明名稱為“吡咯取代的2-二氫吲哚酮——蛋白激酶抑制劑”，系列號No.09/783,264，其公開內(nèi)容全文引用在此作為參考。
實施例111-氨基-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-丙-2-醇的合成 向硫代嗎啉(5.0g，48.7mmol)的HOCH3(200ml)溶液加入過硫酸氫鉀制劑oxone(36.0g，58.5mmol)的H2O(100ml)溶液。將混合物在40℃下充分攪拌48小時，然后冷卻至0℃。滴加NaOH水溶液，調(diào)節(jié)pH＝12。濾出固體，用HOCH3洗滌(3×40ml)。合并液體，冷凝，經(jīng)過硅膠快速色譜純化(CHCl3/CH3OH/NH3.H2O＝3/1/0.1-2/1/0.1)，得到硫代嗎啉1，1-二氧化物(6.2g)，收率93％。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.97(m，4H)，3.07(m，4H)，3.42(brs，1H)，MS(m/z)136(M+1).
將硫代嗎啉1，1-二氧化物(2.5g，18.5mmol)與(R)-(-)-表氯醇(1.55ml，20mmol)在混合溶劑乙醇(50ml)與H2O(5ml)中的混合物在25℃下攪拌24小時。除去溶劑后，殘余物經(jīng)過快速色譜純化，得到(R)-1-氯-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-丙-2-醇(4.0g，96％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.50(m，2H)，2.94(m，4H)，305(m，4H)，3.54(dd，J＝5.8，11.2，Hz，1H)，3.63(dd，J＝4.4，11.2Hz，1H)，3.78(m，H，CH)，5.10(d，J＝5.2Hz，1H，OH)，MS(m/z)228.2(M+1).
在50℃下，將(R)-1-氯-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-丙-2-醇(2.27g，10mmol)用NH3的甲醇溶液(25重量％，20ml)處理12小時。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物用陰離子交換樹脂(AG1×8，OH型)在水中處理，得到粗的(S)-1-氨基-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-丙-2-醇(2.0g)。它被約30％它的二聚物所污染，幾乎不能用柱色譜純化。MS(m/z)209.2(M+1)。使(S)-1-氨基-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-丙-2-醇與氧代吲哚縮合，得到所需的二氫吲哚酮(純化后的收率50-80％)。
(R)-5-(2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-2-羥基-丙基]-酰胺 1H NMR(DMSO-d6)δ2.39，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.49(m，1H)，2.56(m，1H)，2.97(m，4H)，3.07(m，4H)，3.16(m，1H)，3.34(m，1H)，3.74(m，1H)，4.83(d，J＝4.8Hz，IH，OH)，6.86(d，＝7.6Hz，1H)，6.97(t，J＝7.4Hz，1H)，7.11(t，J＝7.5Hz，1H)，7.50(t，J＝5.6Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.76(d，J＝7.6Hz，1H)(芳香和烯屬的)，10.88(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH)，LC-MS(m/z)473.4(M+1).
(R)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-2-羥基-丙基]-酰胺
1H NMR(DMSO-d6)δ2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.47(m，1H)，2.54(m，1H)，2.97(m，4H)，3.06(m，4H)，3.17(m，1H)，3.30(m，1H)，3.74(m，1H)，4.83(d，J＝4.4Hz，1H)，6.82(t，J＝4.0Hz，1H)6.91(td，2J＝2.8，3J＝9.0Hz，1H)，7.53(t，J＝5.8Hz，1H)，7.70(s，1H)7.75(dd，J＝2.4，9.2Hz，1H)，10.88(s，1H)，13.67(s，1H).LC-MS(m/z)491.4(M+1).
(R)-5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-2-羥基-丙基]-酰胺 1H NMR(DMSO-d6)δ2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.45(m，1H)，2.53(m，1H)，2.96(m，4H)，3.06(m，4H)，3.17(m，1H)，3.33(m，1H)，3.75(m，1H)，4.83(d，J＝4.4Hz，1H，OH)，6.85(t，J＝8.4Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.2，8.2Hz，1H)，7.53(t，J＝5.5Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)，10.98(s，1H)，13.62(s，1H)，LC-MS(m/z)507.2(M+1).
(R)-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代嗎啉-4-基)-2-羥基-丙基]-酰胺
1H NMR(DMSO-d6)δ2.41，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.47(m，1H)，2.54(m，1H)，2.97(m，4H)，3.06(m，4H)，3.18(m，1H)，3.30(m，1H)，3.74(m，1H)，4.83(d，J＝4.8Hz，1H)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝1.8，8.2Hz，1H)，7.53(t，J＝5.8，1H)，7.76(s，1H)，8.09(d，J＝2.0Hz，1H)，10.98(s，1H)13.62(s，1H)，LC-MS(m/z)553.6(M+1).
實施例12(S)或(R)-1-甲氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇的合成 將嗎啉(1.74ml，20mmol)與(R)-表氯醇(1.56ml，20mmol)在乙醇(10ml)中的混合物在rt下攪拌48小時。除去溶劑后，在rt下將殘余物用CH3NH2的水溶液(40重量％，20ml)處理14小時。除去溶劑，得到粗的(S)-1-甲氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇，可以經(jīng)過真空蒸餾或柱色譜純化(2.4g，70％)。(R)-1-甲氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇是從(S)-表氯醇制備的，收率76％。
1H NMR(CDCl3)δ2.33(dd，J＝3.6，12.4Hz，1H)，2.42(m，1H)，2.44(dd，J＝2.8，9.8Hz，2H)，2.45(s，3H)，2.53(dd，J＝7.6，11.8Hz，1H)，2.62(m，2H)，2.65(dd，J＝3.6，12.0Hz，1H)，3.71(m，4H)，3.85(m，1H)，13CNMR(CDCl3)δ67.06，65.58，62.80，55.87，53.94，36.72，MS(m/z)175(M+1).
使(S)-1-甲氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇與5-氟氧代吲哚縮合，得到(R)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺
1H NMR(DMSO-d6)δ2.0(s，3H)，2.15(m，1H)，2.25(m，6H)，2.28(m，2H)，2.42(s，1H)，2.95(s，1H)，3.0(s，3H)，3.25(m，2H)，3.57(m，2H)，3.97&3.68(2xbrs，1H)，4.80&4.74(2xbrs，1H)，6.82(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H)，6.90(td，2J＝2.3，3J＝8.7Hz，1H)，7.67(s，1H)，7.71(dd，J＝2.2，9.0Hz，1H)，10.86(s，1H)，13.57(s，1H)，LC-MS(m/z)457.2(M+1).
從(R)-1-氨基-3-嗎啉-4-基-丙-2-醇得到(S)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺 1H NMR(DMSO-d6)δ2.0(m，3H)，2.10(m，1H)，2.22(m，6H)，2.25(m，2H)，2.38(m，1H)，2.90(s，1H)，2.96(s，3H)，3.27(m，2H)，3.52(m，2H)，3.93&3.64(2xbrs，1H)，4.75&4.70(2xbrs，1H)，6.77(dd，J＝4.6，8.2Hz，1H)，6.85(td，2J＝2.5，3J＝8.8Hz，1H)，7.62(s，1H)，767(dd，J＝2.0，9.6Hz，1H)，10.81(s，1H)13.52(s，1H)，LC-MS(m/z)457.2(M+1).
實施例13胺側(cè)鏈制備3-(1-H-四唑-1-基)-2-羥基-1-氯丙烷和3-(2-H-四唑-2-基)-2-羥基-1-氯丙烷將6.905g四唑(100mmol)、1.75ml二異丙基乙胺(10mmol)與11.73ml表氯醇(150mmol)在無水乙腈(30ml)中的混合物在60℃下攪拌4小時。將所得溶液蒸發(fā)，在highvac上干燥，經(jīng)過硅膠柱純化，用氯仿-甲醇100∶8洗脫。第一部分得到純的3-(2-H-四唑-2-基)-2-羥基-1-氯丙烷6.215g(無色的油，38％Y)，第二部分得到9.208g純的3-(1-H-四唑-1-基)-2-羥基-1-氯丙烷(粘性膠狀物，57％Y)。
3-(1H-四唑-1-基)-2-羥基-1-氨基丙烷將9.110g 3-(1-H-四唑-1-基)-2-羥基-1-氯丙烷、15g碳酸鉀和130ml飽和氨的甲醇溶液攪拌21小時，然后過濾，蒸發(fā)。殘余物經(jīng)過硅膠柱純化，用氯仿-甲醇-氨水80∶35∶4洗脫。Y＝7.326g白色粘性膠(91.5％th)。
3-(2-H-四唑-2-基)-2-羥基-1-氨基丙烷將6.105g 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羥基-1-氯丙烷、10g碳酸鉀和95ml飽和氨的甲醇溶液攪拌21小時，然后過濾，蒸發(fā)。殘余物經(jīng)過硅膠柱純化，用氯仿-甲醇-氨水60∶25∶2洗脫。Y＝3.726g白色結(jié)晶性固體(69.5％th)。
3-[(2R，6S)-2，6-二甲基-嗎啉-4-基]-2-羥基-1-氨基丙烷向冰冷卻的順式-2，6-二甲基嗎啉(4.607g，40mmol)的三氟乙醇(5ml)溶液加入4.7ml表氯醇(60mmol)。將溶液在0-5℃下攪拌1小時，除去冷卻浴，在RT下攪拌另外5小時。將混合物在highvac上蒸發(fā)，將所得油性殘余物溶于無水乙醇(50ml)，將溶液在冰浴上冷卻，分兩批加入固體甲醇鈉(2.27g)，將混合物在0-5℃下攪拌2小時。然后過濾反應(yīng)混合物，將鹽用乙醇(30ml)洗滌，合并濾液，加入到冰冷卻的濃氨水(200ml)中。將混合物在RT下攪拌12小時，然后在highvac上蒸發(fā)。殘余物經(jīng)過硅膠柱純化，用氯仿-甲醇-7M氨的甲醇溶液80∶15∶3洗脫。Y＝5.75g白色結(jié)晶性吸濕性固體(76.3％th)。
(2S)-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)-2-羥基-1-氯丙烷和(2S)-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)-2-羥基-1-氨基丙烷將3.423g 3-甲基-2，5-二氧代咪唑啉、3.60ml R-表氯醇(-)(99％e.e.)與0.30ml Barton堿(1.5mmol)在無水乙腈中的混合物在60℃下攪拌20小時。將所得溶液在highvac上蒸發(fā)，在硅膠柱上純化，用氯仿-甲醇洗脫(5至20％甲醇的梯度)，得到5.572g氯代化合物，為白色無定形固體(90％Y)。氯化物如下轉(zhuǎn)化為胺。將所得羥基-氯代中間體溶于氨的甲醇溶液(用氨氣飽和)，加入碳酸鉀，將混合物在密閉的燒瓶內(nèi)攪拌2.5天。過濾反應(yīng)混合物，蒸發(fā)濾液。殘余物經(jīng)過硅膠柱純化，用氯仿-甲醇-濃氨水80∶15∶1.5的混合物洗脫。
實施例145-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物22)(一般方法)向105mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮雜苯并三唑酯(制備如下在DMF(5ml)中，在Hunig堿(3.0mol，0.525ml)的存在下，將(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亞甲基)-5-氟-1，3-二氫-2H-吲哚-2-酮(480mg，1.6mmol)用HATU試劑(570mg，1.5mmol)活化，用氯仿(5ml)沉淀分離純的形式，在高真空下干燥，收率92％(579mg))的無水二甲基乙酰胺(1.5ml)漿液加入72mg 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羥基-1-氨基丙烷。將混合物攪拌30分鐘，高真空蒸發(fā)。將殘余物懸浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)內(nèi)結(jié)晶1小時，過濾，將沉淀用冰冷的甲醇洗滌，高真空干燥。Y＝106mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例155-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物23)(一般方法)向109mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮雜苯并三唑酯(制備如下在DMF(20ml)中，在Hunig堿(9.0mmol，1.58ml)的存在下，將(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基)亞甲基)-5-氯-1，3-二氫-2H-吲哚-2-酮(1.520g，4.8mmol)用HATU試劑(1.768g，4.65mmol)活化，用氯仿(20ml)沉淀分離純的形式，在高真空下干燥，收率94％(1.907g))的無水二甲基乙酰胺(1.5ml)漿液加入72mg 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羥基-1-氨基丙烷。將混合物攪拌30分鐘，高真空蒸發(fā)。將殘余物懸浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)內(nèi)結(jié)晶1小時，過濾，將沉淀用冰冷的甲醇洗滌，高真空干燥。Y＝109mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例16N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物24)(一般方法)向1 21.5mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-三氟甲氧基-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮雜苯并三唑酯(制備如下在DMF(25ml)中，在Hunig堿(9.0mmol，1.58ml)的存在下，將(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亞甲基)-5-三氟甲氧基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-酮(1.768g，4.8mmol)用HATU試劑(1.758g，4.8mmol)活化，蒸發(fā)和用無水乙腈沉淀分離純的形式，在高真空下干燥，收率85.5％(1.929g))的無水二甲基乙酰胺(1.5ml)漿液加入72mg 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羥基-1-氨基丙烷。將混合物攪拌30分鐘，在highvac上蒸發(fā)。將殘余物懸浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)內(nèi)結(jié)晶1小時，過濾，將沉淀用冰冷的甲醇洗滌，高真空干燥。Y＝113mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例175-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物25)按照實施例14的方法從72mg對應(yīng)的胺制備。Y＝113mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例185-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物26)按照實施例15的方法從72mg對應(yīng)的胺制備。Y＝122mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例19N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物27)按照實施例16的方法從72mg對應(yīng)的胺制備。Y＝118mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例20N-[3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物28)按照實施例14的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝99mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例215-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物29)按照實施例15的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝101mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例22N-[3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物30)按照實施例16的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝89mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例235-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物34)按照實施例14的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝109mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例245-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物36)按照實施例15的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝107mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例25N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物35)按照實施例16的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝123mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例265-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物31)按照實施例14的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝110mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例275-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物32)按照實施例15的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝103mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例28N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物33)按照實施例16的方法從95mg對應(yīng)的胺制備。Y＝120mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例29
5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯 在冰浴中冷卻DMF(4ml，3eq.)，同時攪拌。向其中加入POCl3(1.1eq.，1.8ml)。30分鐘后，向反應(yīng)加入3，5-二甲基-4-乙基酯吡咯(4g，17.4mmol)的DMF溶液(2M，9ml)，繼續(xù)攪拌。10分鐘后，反應(yīng)混合物固化。將其用5ml DMF稀釋，在90℃油浴中加熱。1小時后，將反應(yīng)冷卻至室溫，用水(100ml)稀釋，用1N NaOH堿化至pH＝11。將產(chǎn)物用二氯甲烷萃取(3×200ml)，將有機層用鹽水(200ml)洗滌，干燥(MgSO4)，濃縮，得到4.3g(95％)5-甲?；?2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯，為褐色固體。1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.5(br s，1H，NH)，9.11(s，1H，CHO)，7.35(s，5H，ArH)，3.98(q，J＝6.8和7.2Hz，2H，OCH2CH3)，2.48(s，3H，CH3)，0.98(t，J＝7Hz，3H，OCH2CH3).
5-甲?；?2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸 在攪拌下，將5-甲?；?2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯溶于水(100ml)和甲醇(45ml)。加入KOH(2eq.，1.9g)，在100℃下加熱。2.5小時后，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(200ml)萃取除去剩余的酯，干燥，濃縮。水層用2N HCl酸化至pH＝3。過濾除去白色固體，用水沖洗。將固體再次從甲苯中濃縮，用己烷研制，干燥，得到2g(52％)灰白色固體。1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.46(br s，1H，CO2H)，11.95(s，1H，NH)，9.08(s，1H，CHO)，7.36(s，5H，ArH)，2.49(s，3H，CH3).MS m/z(相對強度％，ion)實測值229(100，M+)；calc.229.2.
5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羥基-丙基)-酰胺 將5-甲?；?2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(1.0mg，4.36mmol)、1-氨基-3-二乙氨基-2-丙醇(950mg，6.54mmol)、DDC(900mg，4.36mmol)與HOBt(884mg，6.54mmol)在氯仿(60ml)中的混合物在rt下攪拌12小時。將反應(yīng)倒入飽和碳酸氫鈉(60ml)中，向其中加入1N NaOH(8ml)。然后用EtOAc萃取(3×100ml)，用水和鹽水洗滌，干燥，濃縮，得到400mg 5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羥基-丙基)-酰胺。
實施例30化合物11-21的合成方法在DMSO中制備每種氧代吲哚的0.36M溶液以及每種醛的0.576M溶液。在200μl DMSO的存在下，將300μl適當(dāng)?shù)难醮胚崤c300μl適當(dāng)?shù)娜┗旌?。然后加?0mg二亞乙基三胺清除劑樹脂。將混合物置于Robbins Block內(nèi)，密封，置于60℃烘箱內(nèi)，在那里搖動18小時。
18小時后，從烘箱內(nèi)取出Robbins Block。除去頂部的密封，向混合物加入800μl DMSO。然后再次密封，再次置于60℃烘箱內(nèi)，在那里繼續(xù)旋轉(zhuǎn)1小時。
1小時結(jié)束后，從烘箱內(nèi)取出Robbins Block，冷卻。小心地除去Robbins Block的底部密封，完整地裝入過濾裝置內(nèi)，使新合成的化合物能夠從樹脂中過濾出來。
實施例313-[1-H-(7-氮雜苯并三唑基)-氧基]-2-羥基-1-氨基丙烷將4.083g 1-羥基-7-氮雜苯并三唑(30mmol)、0.53ml二異丙胺(3mmol)與4.70ml表氯醇在無水氯仿中的混合物在60℃下攪拌2小時。將反應(yīng)混合物倒在硅膠柱上，用氯仿-甲醇100∶3混合物洗脫。將所得羥基-氯代中間體(4.83g，淡黃色油，70％Y)溶于氨的甲醇溶液(100ml，用氨氣飽和)，加入8.3g碳酸鉀，將混合物在密閉的燒瓶內(nèi)攪拌2.5天。過濾反應(yīng)混合物，蒸發(fā)濾液。殘余物經(jīng)過硅膠柱純化，用氯仿-甲醇-濃氨水80∶15∶1.5混合物洗脫。Y＝2.793g白色結(jié)晶性固體(63th，從氯化物計)。
3-[1-H-(苯并三唑基)-氧基]-2-羥基-1-氯丙烷和3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羥基-1-氯丙烷將12.162g羥基氮雜苯并三唑(90mmol)、1.59ml二異丙基乙胺(9mmol)與14.1ml表氯醇(180mmol)在無水氯仿中的混合物在55℃下攪拌2小時。蒸發(fā)反應(yīng)混合物，將殘余物在highvac上干燥，然后在硅膠柱上純化，用氯仿-甲醇100∶5混合物洗脫。第一部分得到3-[1-H-(苯并三唑基)-氧基]-2-羥基-1-氯丙烷10.570g(淡黃色蜜狀物，51.5％Y)，后一部分是3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羥基-1-氯丙烷9.990g(白色結(jié)晶性固體，48.5％Y)。
3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羥基-1-氨基丙烷類似于3-[1-H-(7-氮雜苯并三唑基)-氧基]-2-羥基-1-氨基丙烷的合成，通過3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羥基-1-氯丙烷的氨解作用制備。
實施例325-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3H-[1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(一般方法)向105mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮雜苯并三唑酯(制備如下在DMF(5ml)中，在Hunig堿(3.0mmol，0.525ml)的存在下，將(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亞甲基)-5-氟-1，3-二氫-2H-吲哚-2-酮(480mg，1.6mmol)用HATU試劑活化，用氯仿(5ml)沉淀分離純的形式，在高真空下干燥，收率92％(579mg))的無水二甲基乙酰胺(1.5ml)漿液加入105mg 3-[1-H-(7-氮雜苯并三唑基)-氧基]-2-羥基-1-氨基丙烷。將混合物攪拌30分鐘，在highvac上蒸發(fā)。將殘余物懸浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)內(nèi)結(jié)晶1小時，過濾，將沉淀用冰冷的甲醇洗滌，高真空干燥。Y＝121mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例335-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3H-[1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(一般方法)向109mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮雜苯并三唑酯(制備如下在DMF(20ml)中，在Hunig堿(9.0mmol，1.58ml)的存在下，將(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亞甲基)-5-氯-1，3-二氫-2H-吲哚-2-酮(1.520g，4.8mmol)用HATU試劑(1.768g，4.65mmol)活化，用氯仿(20ml)沉淀分離純的形式，在高真空下干燥，收率94％(1.907g))的無水二甲基乙酰胺(1.5ml)漿液加入105mg 3-[1-H-(7-氮雜苯并三唑基)-氧基]-2-羥基-1-氨基丙烷。將混合物攪拌30分鐘，在highvac上蒸發(fā)。將殘余物懸浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)內(nèi)結(jié)晶1小時，過濾，將沉淀用冰冷的甲醇洗滌，高真空干燥。Y＝130mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例345-[(Z)-(5-三氟甲氧基-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3H-[1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(一般方法)向121.5mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-三氟甲氧基-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮雜苯并三唑酯(制備如下在DMF(25ml)中，在Hunig堿(9.0mmol，1.58ml)的存在下，將(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亞甲基)-5-三氟甲氧基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-酮(1.768g，4.8mmol)用HATU試劑(1.758g，4.8mmol)活化，蒸發(fā)和用無水乙腈沉淀分離純的形式，在高真空下干燥，收率85.5％(1.929g))的無水二甲基乙酰胺(1.5ml)漿液加入105mg 3-[1-H-(7-氮雜苯并三唑基)-氧基]-2-羥基-1-氨基丙烷。將混合物攪拌30分鐘，高真空蒸發(fā)。將殘余物懸浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)內(nèi)結(jié)晶1小時，過濾，將沉淀用冰冷的甲醇洗滌，高真空干燥。Y＝142mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例355-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3-氧-1H-1，2，3-苯并三唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺按照實施例32的方法，從105mg對應(yīng)的胺制備。Y＝120mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例365-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3-氧-1H-1，2，3-苯并三唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺按照實施例33的方法，從105mg對應(yīng)的胺制備。Y＝127mg橙色結(jié)晶性固體。
實施例37N-[2-羥基-3-(3-氧-1H-1，2，3-苯并三唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺按照實施例34的方法，從105mg對應(yīng)的胺制備。Y＝141mg橙色結(jié)晶性固體。
生物學(xué)實施例采用下列測定法發(fā)現(xiàn)那些證實有最佳程度的所需活性的化合物。
A.測定方法下列測定法可以用于測定不同的本發(fā)明化合物對一種或多種PK的活性和作用水平。利用本領(lǐng)域熟知的方法，可以對任意PK設(shè)計相似的測定法。
本文所述的若干測定法是按照ELISA(酶聯(lián)免疫吸附三明治測定法)格式進行的(Voller等，1980，″Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，″Manual of Clinical Immunology，2d ed.，Rose and Friedman，Am.Soc.Of Microbiology，Washington，D.C.，pp.359-371)。一般程序如下向表達供試激酶的細胞按天然方式或重組方式引入化合物達所選擇的時間階段，然后，如果供試激酶是一種受體，那么加入已知激活該受體的配體。使細胞溶解，將溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至ELISA平板小孔，小孔預(yù)先涂有識別酶磷酸化反應(yīng)底物的特異性抗體。洗去溶胞產(chǎn)物的非底物組分，利用特異性識別磷酸酪氨酸的抗體檢測關(guān)于底物的磷酸化作用量，與沒有接觸供試化合物的對照細胞對比。
下面提供目前優(yōu)選用于進行特異性PK的ELISA實驗方案。不過，為了測定化合物對其他PTK以及CTK和STK的活性而對這些方案加以調(diào)整，也完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。本文所述的其他測定法測量響應(yīng)于供試激酶的活化而產(chǎn)生的DNA量，這是增殖響應(yīng)的一般量度。關(guān)于這種測定法的一般程序如下向表達供試激酶的細胞按天然方式或重組方式引入化合物達所選擇的時間階段，然后，如果供試激酶是一種受體，那么加入已知激活該受體的配體。培育至少過夜后，加入DNA標記試劑，例如5-溴脫氧尿苷(BrdU)或H3-胸苷。利用抗BrdU抗體或者通過測量放射性檢測所標記的DNA量，與沒有接觸供試化合物的對照細胞對比。
GST-FLK-1生物測定法本測定法分析GST-Flk1對聚(glu，tyr)肽的酪氨酸激酶活性。
材料和試劑1、Corning 96孔ELISA平板(Corning Catalog No.5805-96)。
2、聚(glu，tyr)4∶1，凍干產(chǎn)物(Sigma Catalog#P0275)。
3、涂有聚(glu，tyr)(pEY)制備物的測定平板涂以2μg/孔聚(glu，tyr)(pEY)的100μl PBS溶液，保持在室溫下達2小時或者在4℃下過夜。蓋好平板防止蒸發(fā)。
4、PBS緩沖液關(guān)于1L，在大約900ml dH2O中混合0.2g KH2PO4，1.15g Na2HPO4，0.2g KCl和8g NaCl。當(dāng)全部試劑都已溶解后，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.2。用dH2O加至總體積1L。
5、PBST緩沖液向1L PBS緩沖液加入1.0ml Tween-20。
6、TBB-封閉緩沖液關(guān)于1L，在大約900ml dH2O中混合1.21gTRIS，8.77g NaCl，1ml Tween-20。用HCl調(diào)節(jié)pH至7.2。加入10gBSA，攪拌至溶解。用dH2O加至總體積1L。過濾除去顆粒物。
7、含1％BSA的PBS為了制備1x工作溶液，向大約990ml PBS緩沖液加入10g BSA，攪拌至溶解。用PBS緩沖液調(diào)節(jié)總體積至1L，過濾除去顆粒物。
8、50mM Hepes pH 7.5。
9、從sf9重組桿狀病毒轉(zhuǎn)化作用純化的GST-Flk1cd(SUGEN，Inc.)。
10、含4％DMSO的dH2O。
11、含10mM ATP的dH2O。
12、40mM MnCl2。
13、激酶稀釋緩沖液(KDB)混合10ml Hepes(pH 7.5)，1ml 5MNaCl，40μL 100mM原釩酸鈉，0.4ml含5％BSA的dH2O和88.56mldH2O。
14、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板，Applied Scientific Catalog#AS-72092。
15、EDTA混合14.12g乙二胺四乙酸(EDTA)與大約70ml dH2O。加入10N NaOH直至EDTA溶解。調(diào)節(jié)pH至8.0。用dH2O調(diào)節(jié)總體積至100ml。
16、1°抗體稀釋緩沖液混合10ml含5％BSA的PBS緩沖液與89.5ml TBST。
17、與辣根過氧化物酶綴合的抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(PY99HRP，Santa Cruz Biotech)。
18、2，2′-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Moss，Cat.No.ABST)。
19、10％SDS。
方法1、將Corning 96孔ELISA平板涂以2μg聚EY肽的無菌PBS溶液，如“材料和試劑”的步驟3所述。
2、倒置平板，從小孔中除去未結(jié)合的液體。用TBST洗滌一次。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體。
3、向每孔加入100μl含1％BSA的PBS。在室溫下培育1小時，并搖動。
4、重復(fù)步驟2。
5、用50mM HEPES(pH 7.5)浸泡小孔(150μl/孔)。
6、在96孔聚丙烯平板中，用dH2O/4％DMSO稀釋供試化合物至4倍于所需最終測定濃度。
7、向ELISA平板加入25μl稀釋后的供試化合物。在對照小孔中，放置25μl dH2O/4％DMSO。
8、向每孔加入25μl 40mM MnCl2和4x ATP(2μM)。
9、向陰性對照小孔加入25μl 0.5M EDTA。
10、用KDB稀釋GST-Flk1至0.005μg(5ng)/孔。
11、向每孔加入50μl稀釋后的酶。
12、在室溫下培育15分鐘，并搖動。
13、加入50μl 250mM EDTA(pH 8.0)終止反應(yīng)。
14、用TBST洗滌3X，在紙巾上輕拍平板，除去過量液體。
15、加入100μl/孔的抗磷酸酪氨酸HRP綴合物在抗體稀釋緩沖液中的1∶5,000稀釋液。在室溫下培育90分鐘，并搖動。
16、洗滌，同步驟14。
17、向每孔加入100μl室溫ABTS溶液。
18、培育10至15分鐘，并搖動。除去所有氣泡。
19、向每孔加入20μl 10％SDS終止反應(yīng)。
20、在Dynatech MR7000 ELISA讀數(shù)器上讀取結(jié)果，供試濾光器設(shè)置在410nM下，參照濾光器設(shè)置在630nM下。
PYK2生物測定法本測定法用于在ELISA測定法中測量HA表位定向的全長pyk2(FL.pyk2-HA)的體外激酶活性。
材料和試劑1、Corning 96孔ELISA平板。
2、12CA5單克隆抗HA抗體(SUGEN，Inc.)。
3、PBS(Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水，Gibco Catalog#450-1300EB)。
4、TBST緩沖液關(guān)于1L，在大約900ml dH2O中混合8.766g NaCl，6.057g TRIS和1ml 0.1％Triton X-100。調(diào)節(jié)pH至7.2，加至體積1L。
5、封閉緩沖液關(guān)于1L，混合100g 10％BSA，12.1g 100mM TRIS，58.44g NaCl和10mL 1％Tween-20。
6、來自sf9溶胞產(chǎn)物的FL.pyk2-HA(SUGEN，Inc.)。
7、含4％DMSO的MilliQue H2O。
8、含10mM ATP的dH2O。
9、1M MnCl2。
10、1M MgCl2。
11、1M二硫蘇糖醇(DTT)。
12、10X激酶緩沖液磷酸化在2.8ml dH2O中混合5.0ml 1M Hepes(pH 7.5)，0.2ml 1M MnCl2，1.0ml 1M MgCl2，1.0ml 10％Triton X-100。在使用前加入0.1ml 1M DTT。
13、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
14、含500mM EDTA的dH2O。
15、抗體稀釋緩沖液關(guān)于100ml，在88ml TBS中混合1mL 5％BSA/PBS和1mL 10％Tween-20。
16、與HRP綴合的抗Ptyr PY99，Santa Cruz Biotech Cat.No.SC-7020。
17、ABTS，Moss，Cat.No.ABST-2000。
18、10％SDS。
方法1、將Corning 96孔ELISA平板涂以0.5μg每孔的12CA5抗HA抗體的100μl PBS溶液。在4℃下貯存過夜。
2、倒置平板，從小孔中除去未結(jié)合的HA抗體。用dH2O洗滌平板。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體。
3、向每孔加入150μl封閉緩沖液。在室溫下培育30分鐘，并搖動。
4、用TBS-T洗滌平板4x。
5、在PBS中稀釋細胞溶胞產(chǎn)物(1.5μg細胞溶胞產(chǎn)物/100μl PBS)。
6、向每孔加入100μl稀釋后的細胞溶胞產(chǎn)物。在室溫下?lián)u動1小時。
7、洗滌，同步驟4。
8、向含有所捕獲的pyk2-HA的ELISA平板加入50μl 2X激酶緩沖液。
9、向每孔加入25μl含400μM供試化合物的4％DMSO。對照小孔使用單獨的4％DMSO。
10、向陰性對照孔加入25μl 0.5M EDTA。
11、向所有小孔加入25μl 20μM ATP。培育10分鐘，并搖動。
12、向所有小孔加入25μl 500mM EDTA(pH 8.0)，終止反應(yīng)。
13、洗滌，同步驟4。
14、向每孔加入100μl按1∶6000稀釋在抗體稀釋緩沖液中的與HRP綴合的抗Ptyr。在室溫下培育1小時，并搖動。
15、用TBST洗滌平板3X，用PBS洗滌1X。
16、向每孔加入100μl ABST溶液。
17、如果必要的話，向每孔加入20μl 10％SDS終止顯色反應(yīng)。
18、在ELISA讀數(shù)器上讀取平板，供試濾光器設(shè)置在410nM下，參照濾光器設(shè)置在630nM下。
FGFR1生物測定法本測定法用于在ELISA測定法中測量FGF1-R的體外激酶活性。
材料和試劑1、Costar 96孔ELISA平板(Corning Catalog#3369)。
2、聚(Glu-Tyr)(Sigma Catalog#P0275)。
3、PBS(Gibco Catalog#450-1300EB)。
4、50mM Hepes緩沖溶液。
5、封閉緩沖液(5％BSA/PBS)。
6、純化的GST-FGFR1(SUGEN，Inc.)。
7、激酶稀釋緩沖液。混合500μl 1M Hepes(GIBCO)，20μl 5％BSA/PBS，10μl 100mM原釩酸鈉和50μl 5M NaCl。
8、10mM ATP。
9、ATP/MnCl2磷酸化混合物混合20μl ATP，400μl 1M MnCl2和9.56ml dH2O。
10、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板(Applied Scientific Catalog#AS-72092)。
11、0.5M EDTA。
12、0.05％TBST。向1升TBS加入500μl Tween。
13、兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)。
14、山羊抗兔IgG過氧化物酶綴合物(Biosource，Catalog#ALI0404)。
15、ABTS溶液。
16、ABTS/H2O2溶液。
方法1、將Costar 96孔ELISA平板涂以1μg每孔的聚(Glu，Tyr)的100μl PBS溶液。在4℃下貯存過夜。
2、用PBS洗滌涂過的平板一次。
3、向每孔加入150μl 5％BSA/PBS封閉緩沖液。在室溫下培育1小時，并搖動。
4、用PBS洗滌平板2x，然后用50mM Hepes洗滌一次。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體和氣泡。
5、向平板加入25μl含0.4mM供試化合物的4％DMSO或單獨的4％DMSO(對照)。
6、在激酶稀釋緩沖液中稀釋純化的GST-FGFR1(5ng激酶/50μlKDB/孔)。
7、向每孔加入50μl稀釋后的激酶。
8、加入25μl/孔的新鮮制備的ATP/Mn++(0.4ml 1M MnCl2，40μl10mM ATP，9.56ml dH2O)，開始激酶反應(yīng)。
9、這是一種快速的激酶反應(yīng)，必須用25μl 0.5M EDTA終止，方式類似于ATP的加入。
10、用新鮮的TBST洗滌平板4x。
11、配制抗體稀釋緩沖液每50ml混合5ml 5％BSA，250μl 5％牛奶和50μl 100mM釩酸鈉，用0.05％TBST加至最終體積。
12、加入100μl每孔的抗磷酸酪氨酸(在ADB中的1∶10000稀釋液)。在室溫下培育1小時，并搖動。
13、洗滌，同步驟10。
14、加入100μl每孔的Biosource山羊抗兔IgG過氧化物酶綴合物(在ADB中的1∶6000稀釋液)。在室溫下培育1小時，并搖動。
15、洗滌，同步驟10，然后用PBS洗滌，除去氣泡和過量Tween。
16、向每孔加入100μl ABTS/H2O2溶液。
17、培育10至20分鐘，并搖動。除去所有氣泡。
18、在Dynatech MR7000 ELISA讀數(shù)器上讀取測定結(jié)果，供試濾光器設(shè)置在410nM下，參照濾光器設(shè)置在630nM下。
EGFR測定法本測定法用于在ELISA測定法中測量FGF1-R的體外激酶活性。
材料和試劑1、Corning 96孔ELISA平板。
2、SUMO1單克隆抗EGFR抗體(SUGEN，Inc.)。
3、PBS。
4、TBST緩沖液。
5、封閉緩沖液關(guān)于100ml，混合5.0g Carnation Instant脫脂牛奶和100ml PBS。
6、A431細胞溶胞產(chǎn)物(SUGEN，Inc.)。
7、TBS緩沖液。
8、TBS+10％DMSO關(guān)于1L，混合1.514g TRIS，2.192g NaCl和25ml DMSO；用dH2O加至1升總體積。
9、ATP(腺苷-5′-三磷酸，來自馬肌肉，Sigma Cat.No.A-5394)，在dH2O中的1.0mM溶液。該試劑應(yīng)當(dāng)現(xiàn)用現(xiàn)配，保存在冰上。
10、1.0mM MnCl2。
11、ATP/MnCl2磷酸化混合物混合300μl 1mM ATP，500μl MnCl2和9.2ml dH2O。現(xiàn)用現(xiàn)配，保存在冰上。
12、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
13、EDTA。
14、兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)。
15、山羊抗兔IgG過氧化物酶綴合物(Biosource Cat.No.ALI0404)。
16、ABTS。
17、30％過氧化氫。
18、ABTS/H2O2。
19、0.2M HCl。
方法1、將Corning 96孔ELISA平板每孔涂以0.5μg SUMO1的100μlPBS溶液，在4℃下貯存過夜。
2、倒置平板，從小孔中除去未結(jié)合的SUMO1，以除去液體。用dH2O洗滌1x。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體。
3、向每孔加入150μl封閉緩沖液。在室溫下培育30分鐘，并搖動。
4、用去離子水洗滌平板3x，然后用TBST洗滌一次。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體和氣泡。
5、在PBS中稀釋溶胞產(chǎn)物(7μg溶胞產(chǎn)物/100μl PBS)。
6、向每孔加入100μl稀釋后的溶胞產(chǎn)物。在室溫下?lián)u動1小時。
7、洗滌平板，同上4。
8、向含有所捕獲的EGFR的ELISA平板加入120μl TBS。
9、在TBS中按1∶10稀釋供試化合物，置于小孔中。
10、向ELISA平板加入13.5μl稀釋后的供試化合物。向?qū)φ招】准尤?3.5μl TBS的10％DMSO溶液。
11、在室溫下培育30分鐘，并搖動。
12、向除陰性對照小孔以外的所有小孔加入15μl磷酸化混合物。最終的小孔容量應(yīng)當(dāng)為大約150μl，每孔中的最終濃度為3μMATP/5mM MnCl2。培育5分鐘，并搖動。
13、加入16.5μl EDTA溶液終止反應(yīng)，并搖動。搖動另外1分鐘。
14、用去離子水洗滌4x，用TBST洗滌2x。
15、每孔加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中的1∶3000稀釋液)。在室溫下培育30-45分鐘，并搖動。
16、洗滌，同上4。
17、向每孔加入100μl Biosource山羊抗兔IgG過氧化物酶綴合物(在TBST中的1∶2000稀釋液)。在室溫下培育30分鐘，并搖動。
18、洗滌，同上4。
19、向每孔加入100μl ABTS/H2O2溶液。
20、培育5至10分鐘，并搖動。除去所有氣泡。
21、如果必要的話，每孔加入100μl 0.2M HCl終止反應(yīng)。
22、在Dynatech MR7000 ELISA讀數(shù)器上讀取測定結(jié)果，供試濾光器設(shè)置在410nM下，參照濾光器設(shè)置在630nM下。
PDGFR生物測定法本測定法用于在ELISA測定法中測量FGF1-R的體外激酶活性。
材料和試劑1、Corning 96孔ELISA平板。
2、28D4C10單克隆抗PDGFR抗體(SUGEN，Inc.)。
3、PBS。
4、TBST緩沖液。
5、封閉緩沖液(與EGFR生物測定法相同)。
6、表達PDGFR-β的NIH 3T3細胞溶胞產(chǎn)物(SUGEN，Inc.)。
7、TBS緩沖液。
8、TBS+10％DMSO。
9、ATP。
10、MnCl2。
11、激酶緩沖液磷酸化混合物關(guān)于10ml，在足夠的dH2O中混合250μl 1M TRIS，200μl 5M NaCl，100μl 1M MnCl2和50μl 100mMTriton X-100，制成10ml。
12、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
13、EDTA。
14、兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)。
15、山羊抗兔IgG過氧化物酶綴合物(Biosource Cat.No.ALI0404)。
16、ABTS。
17、過氧化氫，30％溶液。
18、ABTS/H2O2。
19、0.2M HCl。
方法1、將Corning 96孔ELISA平板每孔涂以0.5μg 28D4C10的100μlPBS溶液，在4℃下貯存過夜。
2、倒置平板，從小孔中除去未結(jié)合的28D4C10，以除去液體。用dH2O洗滌1x。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體。
3、向每孔加入150μl封閉緩沖液。在室溫下培育30分鐘，并搖動。
4、用去離子水洗滌平板3x，然后用TBST洗滌一次。在紙巾上輕拍平板，除去過量液體和氣泡。
5、在HNTG中稀釋溶胞產(chǎn)物(10μg溶胞產(chǎn)物/100μl HNTG)。
6、向每孔加入100μl稀釋后的溶胞產(chǎn)物。在室溫下?lián)u動60分鐘。
7、洗滌平板，如步驟4所述。
8、向含有所捕獲的PDGFR的ELISA平板加入80μl工作激酶緩沖液混合物。
9、在TBS中按1∶10稀釋供試化合物，置于96孔聚丙烯平板中。
10、向ELISA平板加入10μl稀釋后的供試化合物。向?qū)φ招】准尤?0μl TBS+10％DMSO。在室溫下培育30分鐘，并搖動。
11、直接向除陰性對照小孔以外的所有小孔加入10μl ATP(最終的小孔容量應(yīng)當(dāng)為大約100μl，每孔含有20μM ATP)。培育30分鐘，并搖動。
12、向每孔加入10μl EDTA溶液終止反應(yīng)。
13、用去離子水洗滌4x，用TBST洗滌2x。
14、每孔加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中的1∶3000稀釋液)。在室溫下培育30-45分鐘，并搖動。
15、洗滌，同步驟4。
16、向每孔加入100μl Biosource山羊抗兔IgG過氧化物酶綴合物(在TBST中的1∶2000稀釋液)。在室溫下培育30分鐘，并搖動。
17、洗滌，同步驟4。
18、向每孔加入100μl ABTS/H2O2溶液。
19、培育10至30分鐘，并搖動。除去所有氣泡。
20、如果必要的話，每孔加入100μl 0.2M HCl終止反應(yīng)。
21、在Dynatech MR7000 ELISA讀數(shù)器上讀取測定結(jié)果，供試濾光器設(shè)置在410nM下，參照濾光器設(shè)置在630nM下。
細胞HER-2激酶測定法本測定法用于按ELISA格式測量全細胞中的HER-2激酶活性。
材料和試劑1、DMEM(GIBCO Catalog# 11965-092)。
2、胎牛血清(FBS，GIBCO Catalog# 16000-044)，在56℃水浴中熱滅活30分鐘。
3、胰蛋白酶(GIBCO Catalog# 25200-056)。
4、L-谷氨酰胺(GIBCO Catalog# 25030-081)。
5、HEPES(GIBCO Catalog# 15630-080)。
6、生長培養(yǎng)基混合500ml DMEM，55ml熱滅活FBS，10mlHEPES和5.5ml L-谷氨酰胺。
7、饑餓培養(yǎng)基混合500ml DMEM，2.5ml熱滅活FBS，10mlHEPES和5.5ml L-谷氨酰胺。
8、PBS。
9、平底96孔組織培養(yǎng)微量滴定平板(Corning Catalog# 25860)。
10、15cm組織培養(yǎng)皿(Corning Catalog# 08757148)。
11、Corning 96孔ELISA平板。
12、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
13、用于Transtar 96的Costar轉(zhuǎn)移藥筒(Costar Catalog# 7610)。
14、SUMO1單克隆抗EGFR抗體(SUGEN，Inc.)。
15、TBST緩沖液。
16、封閉緩沖液含5％Carnation Instant牛奶的PBS。
17、EGF配體EGF-201，Shinko American，Japan。將粉末懸浮在100μl 10mM HCl中。加入100μl 10mM NaOH。加入800μl PBS，轉(zhuǎn)移至Eppendorf試管，貯存在-20℃下備用。
18、HNTG溶解緩沖液。關(guān)于儲備5X HNTG，混合23.83g Hepes，43.83g NaCl，500ml甘油，100ml Triton X-100和足夠的dH2O，制成1L溶液。關(guān)于1X HNTG*，混合2ml HNTG，100μl 0.1M Na3VO4，250μl0.2M Na4P2O7和100μl EDTA。
19、EDTA。
20、Na3VO4。為了制備儲備溶液，混合1.84g Na3VO4與90mldH2O。調(diào)節(jié)pH至10。在微波中沸騰1分鐘(溶液變澄清)。冷卻至室溫。調(diào)節(jié)pH至10。重復(fù)加熱/冷卻循環(huán)，直至pH停留在10。
21、200mM Na4P2O7。
22、磷酸酪氨酸特異性兔多克隆抗血清(抗Ptyr抗體，SUGEN，Inc.)。
23、親合性純化抗血清，山羊抗兔IgG抗體，過氧化物酶綴合物(Biosource Cat# AL10404)。
24、ABTS溶液。
25、30％過氧化氫溶液。
26、ABTS/H2O2。
27、0.2M HCl。
方法1、將Corning 96孔ELISA平板涂以SUMO1的PBS溶液，每孔1.0μg，最終體積100μl/孔。在4℃下貯存過夜。
2、在使用當(dāng)天，除去涂覆緩沖液，用dH2O洗滌平板3次，用TBST緩沖液洗滌一次。本測定法中的所有洗滌都應(yīng)當(dāng)以這種方式進行，另有指定的除外。
3、向每孔加入100μl封閉緩沖液。在室溫下培育30分鐘，并搖動。臨使用前洗滌平板。
4、本測定法使用EGFr/HER-2嵌合體/3T3-C7細胞系。
5、選擇具有80-90％融合率的平皿。通過胰蛋白酶的作用收集細胞，在室溫、1000rpm下離心5分鐘。
6、將細胞再次懸浮在饑餓培養(yǎng)基中，用臺盼藍計數(shù)。要求存活率在90％以上。在96孔微量滴定平板中，將細胞接種在饑餓培養(yǎng)基中，密度為2,500細胞每孔，90μl每孔。在37℃、5％CO2下培育所接種的細胞。
7、接種后兩天開始測定。
8、將供試化合物溶于4％DMSO。然后將樣本直接用饑餓DMEM稀釋在平板上。通常，該稀釋比將是1∶10或以上。然后將所有小孔轉(zhuǎn)移至細胞平板，進一步用饑餓培養(yǎng)基按1∶10稀釋(向90μl饑餓培養(yǎng)基加入10μl樣本與培養(yǎng)基)。最終的DMSO濃度應(yīng)當(dāng)是1％或以下。還可以采用標準系列稀釋。
9、在5％CO2、37℃下培育2小時。
10、將儲備EGF(16.5μM)稀釋在溫?zé)岬腄MEM中至150nM，制成EGF配體。
11、制備新鮮的HNTG*，足夠每孔100μl；置于冰上。
12、與供試化合物培育2小時后，向細胞加入所制備的EGF配體，50μl每孔，最終濃度50nM。陽性對照小孔接受等量的EGF。陰性對照不接受EGF。在37℃下培育10分鐘。
13、除去供試化合物、EGF和DMEM。用PBS洗滌細胞一次。
14、轉(zhuǎn)移HNTG*至細胞，100μl每孔。置于冰上5分鐘。同時，從ELISA平板上除去封閉緩沖液，洗滌。
15、用微量吸移管從平板上刮取細胞，通過反復(fù)攪拌和分散HNTG*溶解緩沖液，使細胞材料均質(zhì)化。轉(zhuǎn)移溶胞產(chǎn)物至經(jīng)過涂覆的、封閉的、洗滌的ELISA平板。或者，利用Costar轉(zhuǎn)移藥筒轉(zhuǎn)移溶胞產(chǎn)物至平板。
16、在室溫下培育1小時，并搖動。
17、除去溶胞產(chǎn)物，洗滌。轉(zhuǎn)移新鮮稀釋的抗Ptyr抗體(按1∶3000稀釋在TBST中)至ELISA平板，100μl每孔。
18、在室溫下培育30分鐘，并搖動。
19、除去抗Ptry抗體，洗滌。轉(zhuǎn)移新鮮稀釋的BIOSOURCE抗體(按1∶8000稀釋在TBST中)至ELISA平板，100μl每孔。
20、在室溫下培育30分鐘，并搖動。
21、除去BIOSOURCE抗體，洗滌。轉(zhuǎn)移新鮮制備的ABTS/H2O2溶液至ELISA平板，100μl每孔。
22、培育5-10分鐘，并搖動。除去所有氣泡。
23、每孔加入100μl 0.2M HCl終止反應(yīng)。
24、在Dynatech MR7000 ELISA讀數(shù)器上讀取測定結(jié)果，供試濾光器設(shè)置在410nM下，參照濾光器設(shè)置在630nM下。
CDK2/細胞周期蛋白A測定法本測定法用于在閃爍近似性測定法(SPA)中測量人cdk2/細胞周期蛋白A的體外絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。
材料和試劑1、Wallac 96孔聚乙烯對苯二甲酸酯(flexi)平板(Wallac Catalog#1450-401)。
2、Amersham Redivue[γ33P] ATP(Amersham catalog# AH 9968)。
3、Amersham涂有鏈霉抗生物素的聚乙烯甲苯SPA珠粒(Amersham catalog# RPNQ0007)。珠粒應(yīng)當(dāng)在不含鎂或鈣的PBS中再生，濃度20mg/ml。
4、從Sf9細胞純化的活化cdk2/細胞周期蛋白A酶復(fù)合體(SUGEN，Inc.)。
5、生物素基化的肽底物(Debtide)。將肽生物素-X-PKTPKKAKKL溶于dH2O，濃度5mg/ml。
6、肽/ATP混合物關(guān)于10ml，混合9.979ml dH2O，0.00125ml″冷″ATP，0.010ml Debtide和0.010ml[γ33P]ATP。每孔的最終濃度將是0.5μM″冷″ATP，0.1μg Debtide和0.2μCi γ33P ATP。
7、激酶緩沖液關(guān)于10ml，混合8.85ml dH2O，0.625ml TRIS(pH7.4)，0.25ml 1M MgCl2，0.25ml 10％NP40和0.025ml 1M DTT，臨使用前加入新鮮品。
8、含10mM ATP的dH2O。
9、1M Tris，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4。
10、1M MgCl2。
11、1M DTT。
12、PBS(Gibco Catalog# 14190-144)。
13、0.5M EDTA。
14、終止溶液關(guān)于10ml，混合9.25ml PBS，0.005ml 100mM ATP，0.1ml 0.5M EDTA，0.1ml 10％Triton X-100和1.25ml 20mg/ml SPA珠粒。
方法1、在5％DMSO中制備供試化合物的溶液，濃度5倍于所需最終濃度。向每孔加入10μl。關(guān)于陰性對照，在小孔中使用單獨的10μl5％DMSO。
2、將5μl cdk2/細胞周期蛋白A溶液用2.1ml 2x激酶緩沖液稀釋。
3、向每孔加入20μl酶。
4、向陰性對照小孔加入10μl 0.5M EDTA。
5、為了開始酶反應(yīng)，向每孔加入20μl肽/ATP混合物。培育1小時，不搖動。
6、向每孔加入200μl終止溶液。
7、保持至少10分鐘。
8、使平板在大約2300rpm下自旋3-5分鐘。
9、利用Trilux或相似的讀數(shù)器計數(shù)平板。
MET轉(zhuǎn)磷酸作用測定法本測定法用于測量關(guān)于聚(谷氨酸∶酪氨酸(4∶1))的磷酸酪氨酸水平，作為鑒別對底物met轉(zhuǎn)磷酸作用的激動作用/拮抗作用的手段。
材料和試劑1、Corning 96孔ELISA平板，Corning Catalog# 25805-96。
2、聚(glu，tyr)4∶1，Sigma，Cat.No；P 0275。
3、PBS，Gibco Catalog# 450-1300EB。
4、50mM HEPES。
5、封閉緩沖液將25g牛血清白蛋白Sigma Cat.No A-7888溶于500ml PBS，通過4μm濾器過濾。
6、純化的GST融合蛋白，含有met激酶結(jié)構(gòu)域，Sugen，Inc。
7、TBST緩沖液。
8、10％含水(MilliQue H2O)DMSO。
9、10mM含水(dH2O)腺苷-5′-三磷酸，Sigma Cat.No.A-5394。
10、2X激酶稀釋緩沖液關(guān)于100ml，在88.4ml dH2O中混合10ml1M HEPES pH 7.5，0.4ml 5％BSA/PBS，0.2ml 0.1M原釩酸鈉和1mL5M氯化鈉。
11、4X ATP反應(yīng)混合物關(guān)于10ml，在9.56ml dH2O中混合0.4ml1M氯化錳和0.02mL 0.1M ATP。
12、4X陰性對照混合物關(guān)于10ml，在9.6ml dH2O中混合0.4ml1M氯化錳。
13、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板，Applied Scientific Catalog#S-72092。
14、500mM EDTA。
15、抗體稀釋緩沖液關(guān)于100ml，在88.4ml TBST中混合10ml5％BSA/PBS，0.5ml含5％Carnation Instant牛奶的PBS和0.1ml0.1M原釩酸鈉。
16、兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗體，Sugen，Inc。
17、山羊抗兔辣根過氧化物酶綴合抗體，Biosource，Inc。
18、ABTS溶液關(guān)于1L，混合19.21g檸檬酸，35.49g Na2HPO4和500mg ABTS，用足量dH2O加至1L。
19、ABTS/H2O2在使用前5分鐘混合15ml ABST溶液與2μlH2O2。
20、0.2M HCl。
方法1、將ELISA平板涂以2μg聚(Glu-Tyr)的100μl PBS溶液，在4℃下貯存過夜。
2、將平板用150μl 5％BSA/PBS封閉60分鐘。
3、用PBS洗滌平板兩次，用50mM Hepes緩沖液pH 7.4洗滌一次。
4、向所有小孔加入50μl稀釋后的激酶(將純化的激酶用激酶稀釋緩沖液稀釋。最終濃度應(yīng)當(dāng)是10ng/孔)。
5、向平板加入25μl供試化合物(的4％DMSO溶液)或單獨的DMSO(的4％dH2O溶液)，用于對照。
6、將激酶/化合物混合物培育15分鐘。
7、向陰性對照小孔加入25μl 40mM MnCl2。
8、向所有其他小孔(陰性對照除外)加入25μl ATP/MnCl2混合物。培育5分鐘。
9、加入25μl 500mM EDTA終止反應(yīng)。
10、用TBST洗滌平板3x。
11、向每孔加入按1∶10,000稀釋在抗體稀釋緩沖液中的100μl兔多克隆抗Ptyr。在室溫下培育1小時，并搖動。
12、用TBST洗滌平板3x。
13、將Biosource與HRP綴合的抗兔抗體按1∶6,000稀釋在抗體稀釋緩沖液中。每孔加入100μl，在室溫下培育1小時，并搖動。
14、用PBS洗滌平板1x。
15、向每孔加入100μl ABTS/H2O2。
16、如果必要的話，每孔加入100μl 0.2M HCl終止顯色反應(yīng)。
17、在Dynatech MR7000 ELISA讀數(shù)器上讀取平板，供試濾光器設(shè)置在410nM，參照濾光器設(shè)置在630nM。
IGF-1轉(zhuǎn)磷酸作用測定法本測定法用于測量聚(谷氨酸∶酪氨酸(4∶1))中的磷酸酪氨酸水平，用于鑒別對底物gst-IGF-1轉(zhuǎn)磷酸作用的激動作用/拮抗作用。
材料和試劑1、Corning 96孔ELISA平板。
2、聚(glu，tyr)4∶1，Sigma，Cat.No；P 0275。
3、PBS，Gibco Catalog# 450-1300EB。
4、50mM HEPES。
5、TBB封閉緩沖液關(guān)于1L，混合100g BSA，12.1g TRIS(pH 7.5)，58.44g氯化鈉和10ml 1％Tween-20。
6、純化的GST融合蛋白，含有IGF-1激酶結(jié)構(gòu)域，Sugen，Inc。
7、TBST緩沖液關(guān)于1L，混合6.057 Tris，8.766g氯化鈉和0.5mlTween-20，用足夠的dH2O加至1升。
8、含4％DMSO的MilliQue H2O。
9、含10mM ATP的dH2O。
10、2X激酶稀釋緩沖液關(guān)于100ml，混合10ml 1M HEPES pH7.5，0.4ml含5％BSA的dH2O，0.2ml 0.1M原釩酸鈉和1mL 5M氯化鈉，用足夠的dH2O加至100ml。
11、4X ATP反應(yīng)混合物關(guān)于10ml，混合0.4ml 1M MnCl2，0.008mL 0.01M ATP和9.56ml dH2O。
12、4X陰性對照混合物關(guān)于10ml，混合0.4ml 1M氯化錳和9.60ml dH2O。
13、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
14、含500mM EDTA的dH2O。
15、抗體稀釋緩沖液關(guān)于100ml，在88.4ml TBST中混合10ml含5％BSA的PBS，0.5ml含5％Carnation Instant無脂牛奶的PBS和0.1ml 0.1M原釩酸鈉。
16、兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗體，Sugen，Inc。
17、山羊抗兔HRP綴合抗體，Biosource，Inc。
18、ABTS溶液。
20、ABTS/H2O2在使用前5分鐘混合15ml ABST與2μl H2O2。
21、含0.2M HCl的dH2O。
方法1、將ELISA平板涂以2.0μg/孔的聚(Glu-Tyr)4∶1(Sigma P0275)的100μl PBS溶液，將平板在4℃下貯存過夜。
2、用PBS洗滌平板一次。
3、向每孔加入100μl TBB封閉緩沖液。在室溫下培育1小時，并搖動。
4、用PBS洗滌平板一次，然后用50mM Hepes緩沖液pH 7.5洗滌兩次。
5、向平板加入25μl供試化合物的4％DMSO溶液(將10mM供試化合物在100％DMSO中的儲備溶液用dH2O稀釋而得)。
6、向所有小孔加入10.0ng gst-IGF-1激酶的50μl激酶稀釋緩沖液。
7、向所有供試小孔和陽性對照小孔加入25μl 4X ATP反應(yīng)混合物，開始激酶反應(yīng)。向所有陰性對照小孔加入25μl 4X陰性對照混合物。在室溫下培育10分鐘，并搖動。
8、向所有小孔加入25μl 0.5M EDTA(pH 8.0)。
9、用TBST緩沖液洗滌平板4x。
10、向所有小孔加入按1∶10,000稀釋在100μl抗體稀釋緩沖液中的兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗血清。在室溫下培育1小時，并搖動。
11、洗滌平板，同步驟9。
12、向所有小孔加入100μl按1∶10,000稀釋在抗體稀釋緩沖液中的Biosource抗兔HRP。在室溫下培育1小時，并搖動。
13、洗滌平板，同步驟9，然后用PBS洗滌一次，以減少氣泡和過量的Tween-20。
14、向每孔加入100μl ABTS/H2O2，顯色。
15、約5分鐘后，在ELISA讀數(shù)器上讀數(shù)，供試濾光器設(shè)置在410nM，參照濾光器設(shè)置在630nM。
BRDU摻入測定法下列測定法使用被加工以表達所選擇的受體的細胞，然后通過測定向DNA摻入的BrdU，評價有關(guān)化合物對配體誘導(dǎo)DNA合成的作用。
下列材料、試劑和程序是每種下列BrdU摻入測定法所通用的。具體測定法的差別已注明。
材料和試劑1、適當(dāng)?shù)呐潴w。
2、適當(dāng)?shù)谋患庸さ募毎?br> 3、BrdU標記試劑10mM，PBS溶液(pH 7.4)(BoehringerMannheim，Germany)。
4、FixDenat固定溶液(即用型)(Boehringer Mannheim，Germany)。
5、抗-BrdU-POD與過氧化物酶綴合的小鼠單克隆抗體(Boehringer Mannheim，Germany)。
6、TMB底物溶液四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Boehringer Mannheim，Germany)。
7、PBS洗滌溶液1X PBS，pH 7.4。
8、牛白蛋白(BSA)，V級粉末(Sigma Chemical Co.，USA)。
一般方法1、將10％CS、2mM Gln的DMEM中的細胞接種在96孔平板中，8000細胞/孔。將細胞在37℃、5％CO2下培育過夜。
2、24小時后，將細胞用PBS洗滌，然后在無血清培養(yǎng)基(含0.1％BSA的0％CS DMEM)中饑餓24小時。
3、第3天，同時向細胞加入適當(dāng)?shù)呐潴w和供試化合物。陰性對照小孔僅接受含0.1％BSA的無血清DMEM；陽性對照小孔接受配體但是沒有供試化合物。在96孔平板中制備供試化合物在含有配體的無血清DMEM中的溶液，連續(xù)稀釋成7種供試濃度。
4、配體活化18小時后，加入稀釋后的BrdU標記試劑(按1∶100稀釋在含0.1％BSA的DMEM中)，將細胞與BrdU(最終濃度＝10μM)培育1.5小時。
5、與標記試劑培育后，傾析和輕拍倒置在紙巾上的平板，除去培養(yǎng)基。加入FixDenat溶液(50μl/孔)，在平板搖動器上在室溫下培育45分鐘。
6、傾析和輕拍倒置在紙巾上的平板，徹底除去FixDenat溶液。加入牛奶(含5％脫水牛奶的PBS，200μl/孔)作為封閉溶液，在平板搖動器上將平板在室溫下培育30分鐘。
7、傾析除去封閉溶液，將小孔用PBS洗滌一次。加入抗-BrdU-POD溶液(按1∶200稀釋在含1％BSA的PBS中)(50μl/孔)，在平板搖動器上將平板在室溫下培育90分鐘。
8、傾析和用PBS沖洗小孔5次，徹底除去抗體綴合物，將平板倒置在紙巾上輕拍，使干燥。
9、加入TMB底物溶液(100μl/孔)，在平板搖動器上在室溫下培育20分鐘，直至顯色足以進行光度檢測。
10、在Dynatech ELISA平板讀數(shù)器上，在410nm下測量樣本的吸光度(以“雙波長”模式，濾光器在490nm下的讀數(shù)作為參照波長)。
EGF誘導(dǎo)BrdU摻入測定法材料和試劑1、小鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2、3T3/EGFRc7。
EGF誘導(dǎo)的Her-2驅(qū)動的BrdU摻入測定法材料和試劑1、小鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2、3T3/EGFr/Her2/EGFr(具有Her-2激酶結(jié)構(gòu)域的EGFr)。
EGF誘導(dǎo)的Her-4驅(qū)動的BrdU摻入測定法材料和試劑1、小鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2、3T3/EGFr/Her4/EGFr(具有Her-4激酶結(jié)構(gòu)域的EGFr)。
PDGF誘導(dǎo)BrdU摻入測定法材料和試劑1、人PDGF B/B(Boehringer Mannheim，Germany)。
2、3T3/EGFRc7。
FGF誘導(dǎo)BrdU摻入測定法材料和試劑1、人EGF2/bFGF(Gibco BRL，USA)。
2、3T3c7/EGFr。
IGF-1誘導(dǎo)BrdU摻入測定法材料和試劑1、人重組(G511，Promega Corp.，USA)。
2、3T3/IGF1r。
胰島素誘導(dǎo)BrdU摻入測定法材料和試劑1、胰島素，結(jié)晶性，牛，鋅(13007，Gibco BRL，USA)。
2、3T3/H25。
HGF誘導(dǎo)BrdU摻入測定法材料和試劑；1、重組人HGF(Cat.No.249-HG，R&D Systems，Inc.，USA)。
2、BxPC-3細胞(ATCC CRL-1687)。
方法1、將含10％FBS的RPMI中的細胞接種在96孔平板中，9000細胞/孔。將細胞在37℃、5％CO2下培育過夜。
2、24小時后，將細胞用PBS洗滌，然后在100μl無血清培養(yǎng)基(含0.1％BSA的RPMI)中饑餓24小時。
3、第3天，向細胞加入25μl配體(在含0.1％BSA的RPMI中制成1μg/ml；最終的HGF濃度為200ng/ml)和供試化合物。陰性對照小孔僅接受25μl含0.1％BSA的無血清RPMI；陽性對照小孔接受配體(HGF)但是沒有供試化合物。在96孔平板中制備供試化合物在含有配體的無血清RPMI中的溶液，濃度5倍于它們的最終濃度，連續(xù)稀釋，得到7種供試濃度。通常，供試化合物的最高最終濃度為100μM，稀釋比使用1∶3(也就是說，最終的供試化合物濃度范圍為0.137-100μM)。
4、配體活化18小時后，向每孔加入12.5μl稀釋后的BrdU標記試劑(按1∶100稀釋在含0.1％BSA的RPMI中)，將細胞與BrdU(最終濃度為10μM)培育1小時。
5、與一般程序相同。
6、與一般程序相同。
7、傾析除去封閉溶液，將小孔用PBS洗滌一次。加入抗-BrdU-POD溶液(按1∶100稀釋在含1％BSA的PBS中)(100μl/孔)，在平板搖動器上將平板在室溫下培育90分鐘。
8、與一般程序相同。
9、與一般程序相同。
10、與一般程序相同。
HUV-EC-C測定法本測定法用于測量化合物對PDGF-R、FGF-R、VEGF、aFGF或Flk-1/KDR的活性，它們都是被HUV-EC細胞天然表達的。
第0天1、洗滌和用胰蛋白酶處理HUV-EC-C細胞(人臍靜脈內(nèi)皮細胞，American Type Culture Collection，catalogue no.1730 CRL)。用Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS，得自Gibco BRL，catalogue no.14190-029)洗滌2次，用量約1ml/10cm2組織培養(yǎng)瓶。用0.05％胰蛋白酶-EDTA的無酶細胞解離溶液(Sigma Chemical Company，catalogueno.C-1544)進行胰蛋白酶處理。0.05％胰蛋白酶是這樣制備的，將0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA(Gibco，catalogue no.25200-049)稀釋在細胞解離溶液中。在37℃下用1ml/25-30cm2組織培養(yǎng)瓶的胰蛋白酶處理約5分鐘。細胞從瓶子脫離后，加入等體積的測定培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管(Fisher Scientific，catalogue no.05-539-6)。
2、如下在50ml無菌離心管內(nèi)將細胞用約35ml測定培養(yǎng)基洗滌加入測定培養(yǎng)基，在大約200xg下離心10分鐘，攪拌上清液，用35mlD-PBS再次懸浮。用D-PBS重復(fù)洗滌兩次，將細胞再次懸浮在約1ml測定培養(yǎng)基/15cm2組織培養(yǎng)瓶中。測定培養(yǎng)基由F12K培養(yǎng)基(GibcoBRL，catalogue no.21127-014)和0.5％熱滅活的胎牛血清組成。用Coulter計數(shù)器(Coulter Electronics，Inc.)計數(shù)細胞，向細胞加入測定培養(yǎng)基，得到濃度為0.8-1.0×105細胞/ml。
3、向96孔平底平板加入細胞，密度為100μl/孔或0.8-1.0×104細胞/孔，在37℃、5％CO2下培育～24小時。
第1天1、在單獨的96孔平板中進行兩倍供試化合物滴定，一般50μM向下至0μM。使用與上述第0天第2步相同的測定培養(yǎng)基。滴定是這樣進行的，向特定平板列的頂部小孔加入90μl/孔的供試化合物，濃度為200μM(4倍于最終的小孔濃度)。由于儲備供試化合物通常是20mMDMSO溶液，200μM藥物濃度含有2％DMSO。
使用含2％DMSO的測定培養(yǎng)基(F12K+0.5％胎牛血清)作為供試化合物滴定的稀釋劑，目的是稀釋供試化合物，但是保持DMSO濃度恒定。向該列其余小孔加入這種稀釋劑，60μl/孔。從該列頂部小孔中的120μl 200μM供試化合物稀釋液中取60μl，與該列第二小孔中的60μl混合。從該小孔中取60μl，與該列第三小孔中的60μl混合，依此類推，直至完成兩倍滴定。在混合倒數(shù)第二個小孔時，從該小孔的120μl中取60μl棄去。留下含有60μl DMSO/培養(yǎng)基稀釋劑的最后一個小孔作為不含供試化合物的對照。準備9列滴定供試化合物，下列三種測定一式三份(1)VEGF(Tech Inc.，catalogue no.100-200)，(2)內(nèi)皮細胞生長因子(ECGF)(也已知為酸性成纖維細胞生長因子或aFGF)(Boehringer Mannheim Biochemica，catalogue no.1439 600)，或(3)人PDGF B/B(1276-956，Boehringer Mannheim，Germany)，和一個測定培養(yǎng)基對照。ECGF是與肝素鈉的制備物的形式。
2、轉(zhuǎn)移50μl/孔供試化合物稀釋液至含有來自第0天的0.8-1.0×104細胞/100μl/孔HUV-EC-C細胞的96孔測定平板，在37℃、5％CO2下培育～2小時。
3、向每種供試化合物條件一式三份地加入50μl/孔的80μg/mlVEGF、20ng/ml ECGF或培養(yǎng)基對照。關(guān)于供試化合物，生長因子的濃度4倍于所需的最終濃度。使用來自第0天第2步的測定培養(yǎng)基制備各種濃度的生長因子。在37℃、5％CO2下培育大約24小時。每孔將具有50μl供試化合物稀釋液、50μl生長因子或培養(yǎng)基和100μl細胞，計算得到總計200μl/孔。因而，一旦向小孔加入全部成分，供試化合物和生長因子的4X濃度變?yōu)?X。
第2天1、加入3H-胞苷(Amersham，catalogue no.TRK-686)，1μCi/孔(在RPMI培養(yǎng)基+10％熱滅活的胎牛血清中制成10μl/孔的100μCi/nl溶液)，在37℃、5％CO2下培育～24小時。RPMI得自Gibco BRL，catalogue no.11875-051。
第3天1、將平板在-20℃下冷凍過夜。
第4天融化平板，用96孔平板收獲器(Tomtec Harvester 96)收獲在濾墊(Wallac，catalogue no.1205-401)上，在Wallac BetaplateTM液體閃爍計數(shù)器上讀數(shù)。
下面詳細描述已經(jīng)或者能夠用于評價化合物的生物測定法。試驗了化合物1-9，發(fā)現(xiàn)在flkGST、FGFR1和PDGF測定法中有活性。
體內(nèi)動物模型異種移植動物模型人腫瘤作為異種移植物生長在無胸腺小鼠(例如Balb/c，nu/nu)中的能力提供了有用的體內(nèi)模型，用于研究對人腫瘤療法的生物學(xué)反應(yīng)。自從第一次成功地將人腫瘤異種移植到無胸腺小鼠上(Rygaardand Povlsen，1969，Acta Pathol.Microbial.Scand.77758-760)，很多不同的人腫瘤細胞系(例如乳腺、肺、泌尿生殖、胃腸、頭頸、成膠質(zhì)細胞、骨和惡性黑素瘤)已經(jīng)移植和成功生長在裸鼠中。下列測定法可以用于測定不同的本發(fā)明化合物的活性、特異性與作用水平。這些一般類型的測定法可以用于評價化合物細胞/催化性、細胞/生物學(xué)和體內(nèi)方式。細胞/催化性測定法的目的是測定化合物對TK磷酸化細胞已知底物上的酪氨酸的能力的作用。細胞/生物學(xué)測定法的目的是測定化合物對由TK刺激的細胞生物學(xué)反應(yīng)的作用。體內(nèi)測定法的目的是測定化合物在特定功能障礙的動物模型中的作用，例如癌癥。
適合于皮下異種移植實驗的細胞系包括C6細胞(神經(jīng)膠質(zhì)瘤，ATCC# CCL 107)、A375細胞(黑素瘤，ATCC#CRL 1619)、A431細胞(表皮樣癌，ATCC# CRL 1555)、Calu 6細胞(肺，ATCC#HTB 56)、PC3細胞(前列腺，ATCC# CRL 1435)、SKOV3TP5細胞和NIH 3T3成纖維細胞，它們經(jīng)過基因工程的加工，過度表達EGFR、PDGFR、IGF-1R或其他任意供試激酶。下列方案可以用于進行異種移植實驗雌性無胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu)得自Simonsen Laboratories(Gilroy，CA)。所有動物均被供養(yǎng)在清潔房間條件下的Micro-isolator籠子內(nèi)，籠子帶有Alpha-dri基底。它們可自由獲取無菌的嚙齒動物飼料和水。
使細胞系生長在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中(例如MEM、DMEM、Ham’s F10或Ham’s F12加5％-10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺(GLN))。所有細胞培養(yǎng)基、谷氨酰胺和胎牛血清都是購自Gibco LifeTechnologies(Grand Island，NY)，另有指定的除外。細胞的生長條件為37℃，90-95％空氣與5-10％CO2的潮濕氣氛。將所有細胞系進行常規(guī)次代培養(yǎng)，一周兩次，根據(jù)Mycotect法(Gibco)的測定，對支原體屬是陰性的。
在融合或接近融合時用0.05％胰蛋白酶-EDTA收獲細胞，在450xg下離心10分鐘。將沉淀再次懸浮在無菌PBS或培養(yǎng)基(無FBS)中至特定濃度，將細胞植入小鼠的后脅腹(每組8-10只小鼠，2-10×106細胞/動物)。利用venier測徑規(guī)測量3至6周內(nèi)的腫瘤生長。計算腫瘤體積等于長×寬×高，另有指定的除外。利用學(xué)生t檢驗計算P值。一般從植入后第一天開始，可以將供試化合物在50-100μl賦形劑(DMSO或VPD∶D5W)中的溶液通過IP注射按不同濃度給藥。
腫瘤侵襲模型已經(jīng)開發(fā)了下列腫瘤侵襲模型，可以用于評價被鑒別為選擇性抑制KDR/FLK-1受體的化合物的治療作用和功效。
方法使用8周齡裸鼠(雌性)(Simonsen Inc.)作為實驗動物。腫瘤細胞的植入是在板狀流式通風(fēng)櫥中進行的。關(guān)于麻醉，腹膜內(nèi)給以賽拉嗪/氯胺酮雞尾酒試劑(100mg/kg氯胺酮和5mg/kg賽拉嗪)。進行中線切開，暴露腹腔(長大約1.5cm)，注入107個腫瘤細胞，培養(yǎng)基體積為100μl。將細胞注射到胰腺的十二指腸葉或結(jié)腸的絨膜下。將腹膜和肌肉用6-0絲縫合線縫合，用傷口鉗封閉皮膚。每日觀察動物。
分析2-6周后，根據(jù)對動物的粗略觀察結(jié)果，處死小鼠，切除向各種器官(肺、肝、腦、胃、脾、心、肌肉)轉(zhuǎn)移的局部腫瘤，分析(測量腫瘤大小、侵襲的級別、免疫化學(xué)、就地雜交測定等)。
C-KIT測定法本測定法用于檢測c-kit酪氨酸磷酸化作用的水平。
使MO7E(人急性骨髓性白血病)細胞在0.1％血清中饑餓過夜。在配體刺激之前，將細胞用化合物預(yù)處理(與血清饑餓同時進行)。將細胞用250ng/ml rh-SCF刺激15分鐘。刺激后，使細胞溶解，用抗c-kit抗體進行免疫沉淀。通過蛋白質(zhì)印跡測定磷酸酪氨酸和蛋白質(zhì)水平。
MTT增殖測定法對MO7E細胞進行血清饑餓處理，用化合物預(yù)處理，如磷酸化作用實驗所述。將細胞平板接種在96孔平皿中的100μl RPMI+10％血清中，密度4×105細胞/孔。加入rh-SCF(100ng/ml)，將平板培育48小時。48小時后，加入10μl 5mg/ml MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)，培育4小時。加入酸性異丙醇(100μl含0.04NHCl的異丙醇)，在550nm波長下測量光密度。
細胞程序死亡測定法在含有rh-GM-CSF(10ng/ml)和rh-IL-3(10ng/ml)的10％FBS中，培育MO7E細胞+/-SCF和+/-化合物。在24和48小時測定樣本。為了測量活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3，將樣本用PBS洗滌，用冰冷的70％乙醇滲透。然后將細胞用與PE綴合的多克隆兔抗活性天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3染色，用FACS分析。為了測量所裂解的PARP，使樣本溶解，利用抗PARP抗體通過蛋白質(zhì)印跡加以分析。
其他測定法其他可以用于評價本發(fā)明化合物的測定法非限制性地包括bio-flk-1測定法、全細胞中EGF受體-HER2嵌合受體測定法、bio-src測定法、bio-lck測定法和測量raf的磷酸化功能的測定法。每種這些測定法的方案可以參見美國專利申請Ser.No.09/099,842，引用在此作為參考，包括其所有附圖。
細胞毒性的測量治療性化合物應(yīng)當(dāng)在抑制受體酪氨酸激酶活性上比在表現(xiàn)細胞毒性作用上更有力?；衔锏挠行院图毎拘缘牧慷瓤梢酝ㄟ^測定治療指數(shù)而獲得，即IC50/LD50。IC50是達到50％抑制作用所需的劑量，可以利用標準工藝測量，例如本文所述那些。LD50是導(dǎo)致50％毒性的劑量，也可以利用標準工藝測量(Mossman，1983，J.Immunol.Methods，6555-63)，或者在動物模型中測量所釋放的LDH的量(Korzeniewski和Callewaert，1983，J.Immunol.Methods，64313，Decker和Lohmann-Matthes，1988，J.Immunol.Methods，11561)或致死劑量。治療指數(shù)大的化合物是優(yōu)選的。治療指數(shù)應(yīng)當(dāng)大于2，優(yōu)選至少為10，更優(yōu)選至少為50。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還將容易領(lǐng)會到，本發(fā)明加以充分調(diào)整，可實現(xiàn)所提到的目的、獲得所提到的優(yōu)點，以及本身固有的那些。本文所述的分子配合物和方法、程序、處理、分子、具體化合物是優(yōu)選實施方式的代表，是例證性的，不打算限制發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到其中的變化和其他用途，這些都涵蓋在由權(quán)利要求書所定義的發(fā)明精神范圍內(nèi)。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，對本文所公開的發(fā)明可以進行各種替換和修改，而不背離發(fā)明的范圍和精神。
說明書中提到的所有專利和出版物是發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)水平的說明。所有專利和出版物都引用在此作為參考，其程度仿佛每份個別的出版物被具體和單獨引用在此作為參考一樣。
本文所闡述的發(fā)明可以適合在沒有任何在本文中沒有具體公開的要素或限制的存在下加以實施。因而，例如，在本文中的每種情況下，任何一個術(shù)語“包含”、“基本上由……組成”和“由……組成”都可以用其他兩個術(shù)語代替。所采用的術(shù)語和表達方式在使用時是說明性的和沒有限制的，在使用這類術(shù)語和表達方式時不打算排除其任何所示或所述特征的等價方式或部分，在所要求保護的發(fā)明范圍內(nèi)各種修改都是可能的。因而，應(yīng)當(dāng)這樣理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)被優(yōu)選的實施方式和可選的特征所具體公開，不過本領(lǐng)域技術(shù)人員可以訴諸所公開概念上的修改和變化，這類修改和變化被視為屬于由權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍。
另外，若在馬庫什組的含義上描述本發(fā)明的特征或方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，還可以在馬庫什組的個別成員或成員小組的含義上描述本發(fā)明。例如，如果X被描述為選自由溴、氯和碘組成的組，那么關(guān)于X是溴的權(quán)利要求和關(guān)于X是溴和氯的權(quán)利要求也被完整描述了。
其他實施方式在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物 其中R1選自由氫、鹵素、烷基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13組成的組；R2選自由氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基)組成的組；R3、R4和R5獨立地是氫或烷基；Z是芳基、雜芳基、雜環(huán)或-NR15R16，其中R15和R16獨立地是氫或烷基，或者R15和R16與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R6選自由氫或烷基組成的組；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組；R8選自由羥基、烷氧基和芳氧基組成的組；R9和R10獨立地選自由氫、烷基、氰基烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組，或者R9和R10聯(lián)合形成雜環(huán)氨基；R12和R13獨立地選自由氫、烷基、羥基烷基和芳基組成的組，或者R12和R13與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R17選自由羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自由氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13組成的組；R2選自由氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基)組成的組；R3、R4和R5獨立地是氫或烷基；Z是芳基、雜芳基、雜環(huán)或-NR15R16，其中R15和R16獨立地是氫或烷基，或者R15和R16與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R6選自由氫或烷基組成的組；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組；R8選自由羥基、烷氧基和芳氧基組成的組；R9和R10獨立地選自由氫、烷基、氰基烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組，或者R9和R10聯(lián)合形成雜環(huán)基；R12和R13獨立地選自由氫、烷基和芳基組成的組，或者R12和R13與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)；R17選自由羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
3.權(quán)利要求1的化合物或鹽，其中該化合物選自下組化合物號結(jié)構(gòu)名稱 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羥基-丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基1-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3 ]三唑-1-基-丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫亞吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-2-甲基-5-{[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-5-[(2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3 ]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺
4.權(quán)利要求3的化合物或鹽，其中該化合物選自下組化合物號 結(jié)構(gòu) 名稱 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-(3Z)-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羥基丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3 ]三唑-1-基丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{(Z)-[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙基)-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]-2-甲基-5-{(Z)-[5-(嗎啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基1-2-羥基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-異丙基-2-氧代-2，3-二氫-1H-吲哚-5-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羥基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基丙基}-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氧-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[(2R)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-(2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代嗎啉-4-基)-2-羥基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-([(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-3H-亞吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺； 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺；和 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羥基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺
5.式(Ia)化合物 其中R1、R3、R4和R5是氫；R2是氟，并且位于二氫吲哚酮環(huán)的5位；和Z是嗎啉-4-基；R6和R7是甲基，和*C的立體化學(xué)是(S)。
6.式(II)化合物 其中R是氫或烷基；R1選自由氫、鹵素、烷基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13組成的組；R2選自由氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基)組成的組；R3、R4和R5獨立地是氫或烷基；Z是芳基、雜芳基、雜環(huán)或-NR15R16，其中R15和R16獨立地是氫或烷基，或者R15和R16與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R6選自由氫或烷基組成的組；R7選自由氫、烷基、芳基、雜芳基和-C(O)R17組成的組；R8選自由羥基、烷氧基和芳氧基組成的組；R9和R10獨立地選自由氫、烷基、氰基烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組，或者R9和R10聯(lián)合形成雜環(huán)氨基；R12和R13獨立地選自由氫、烷基、羥基烷基和芳基組成的組，或者R12和R13與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)氨基；R17選自由羥基、烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基組成的組；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
7.權(quán)利要求6的化合物或鹽，其中該化合物選自下組化合物號 結(jié)構(gòu)名稱 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基)-甲基-酰胺； 5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((S)-2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺；和 5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氫-亞吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((R)-2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺
8.藥物組合物，包含權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7的化合物或鹽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
9.藥物組合物，包含權(quán)利要求5的化合物或鹽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10.蛋白激酶催化活性的調(diào)制方法，包含使所述蛋白激酶與權(quán)利要求1、3或6任意一項的化合物或鹽接觸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述蛋白激酶選自由受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶組成的組。
12.治療或預(yù)防生物體蛋白激酶相關(guān)性功能障礙的方法，包含對所述生物體給以治療有效量的藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求1、3或6任意一項的化合物或鹽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相關(guān)性功能障礙選自由受體酪氨酸激酶相關(guān)性功能障礙、非受體酪氨酸激酶相關(guān)性功能障礙和絲氨酸-蘇氨酸激酶相關(guān)性功能障礙組成的組。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相關(guān)性功能障礙選自由EGFR相關(guān)性功能障礙、PDGFR相關(guān)性功能障礙、IGFR相關(guān)性功能障礙和flk相關(guān)性功能障礙組成的組。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相關(guān)性功能障礙是一種癌癥，選自由鱗狀上皮細胞癌、星形細胞瘤、卡波濟氏肉瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸直腸癌、泌尿生殖癌和胃腸癌組成的組。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相關(guān)性功能障礙選自由糖尿病、自體免疫疾病、過度增殖癥、再狹窄、纖維變性、牛皮癬、林-希氏病、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管生成、炎癥、免疫功能障礙和心血管功能障礙組成的組。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述生物體是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及吡咯取代的2－二氫吲哚酮化合物和它們的藥學(xué)上可接受的鹽，它們調(diào)制蛋白激酶的活性，因此預(yù)期可用于蛋白激酶相關(guān)性細胞功能障礙的預(yù)防和治療，例如癌癥。
文檔編號A61P35/00GK1529704SQ02806680
公開日2004年9月15日 申請日期2002年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月15日
發(fā)明者H·關(guān), H 關(guān), C·梁, 唐, L·孫, 魏, P·C·唐, 馬拉吉斯, C·C·魏, 朔蛩夠, M·A·馬拉吉斯, 赫林頓, T·沃克夫斯基, Q·金, P·M·赫林頓 申請人:蘇根公司, 法瑪西雅厄普約翰美國公司