專利名稱：：預(yù)防和治療癌癥及治療炎癥的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療癌癥及治療炎癥的藥物組合物，特別地，此藥物不僅能抑制突變和腫瘤的產(chǎn)生、增強(qiáng)致癌物解毒酶活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而且可抑制與炎癥反應(yīng)相關(guān)的環(huán)氧合酶-2(COX-2)及誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)的活性。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)今，癌癥是一種全世界范圍的疾病，每年有7百萬人死亡癌癥。另據(jù)報(bào)道，1997年美國有超過約1.5百萬人成為癌癥患者。鑒于這種趨勢，癌癥在不久之后將被認(rèn)為是最主要的死亡原因。眾所周知癌癥可由各種原因引起。通過形成DNA加合物或引起基因損傷，致癌物可引起突變，并且突變是癌癥的主要原因這也是眾所周知的。通過身體的新陳代謝致癌物最后轉(zhuǎn)化成為終致癌物，并可直接進(jìn)入身體。致癌作用可分為三個(gè)時(shí)期，即啟動(dòng)期、促進(jìn)期及演進(jìn)期。當(dāng)在細(xì)胞或細(xì)胞群中的DNA被外源的或內(nèi)源的致癌物損傷時(shí)，初始期開始。如果這種損傷沒有修復(fù)，那么將導(dǎo)致遺傳突變。突變細(xì)胞對(duì)其小環(huán)境的響應(yīng)可以變化，并相對(duì)于正常細(xì)胞而言可對(duì)突變細(xì)胞給出更有利的生長條件。促進(jìn)期的特征在于癌初始細(xì)胞的選擇性克隆擴(kuò)增，并是基因表達(dá)變化的結(jié)果，基因生產(chǎn)與超增殖、組織改造、及炎癥有關(guān)。在腫瘤演進(jìn)期，經(jīng)克隆擴(kuò)增過程，癌前期細(xì)胞(良性腫瘤)發(fā)展成惡性腫瘤，克隆擴(kuò)增是由漸近的染性體不穩(wěn)定促成的并可改變基因表達(dá)。如果良性腫瘤發(fā)展成惡性腫瘤，那么就是不可治療的。因此，近來的研究集中于阻止誘導(dǎo)作用、抑制或延緩癌癥的演進(jìn)。已發(fā)展了許多用于治療癌癥的治療方法，如化學(xué)療法、放射療法、手術(shù)療法、及基因療法。其中，使用醫(yī)藥的化學(xué)療法是最普遍的。此前，已有關(guān)于開發(fā)合成抗癌藥物的研究，但近來，研究興趣已集中到開發(fā)對(duì)預(yù)防及治療癌癥有用的天然材料上。為開發(fā)抑制腫瘤形成的癌癥化學(xué)預(yù)防藥劑，美國國家癌癥研究院(NCI)已公布了對(duì)于臨床測試具有化學(xué)預(yù)防可能性的16個(gè)化合物，參照表1。表1臨床測試臨床前測試I期II期III期第一代類維生素A++維生素A+++13-順視黃酸++++4-HPR+++鈣+++β-胡蘿卜素+++三苯氧胺+非那雄胺++第二代DFMO+++舒林酸++吡羅昔康++Oltipratz++N-乙酰半胱氨酸++阿斯匹林++布洛芬++Carbenoxole++18-β-甘草次酸++DFMO+吡羅昔康++第三代S-丙烯基脬胺基酸++Phenhexylnate+姜黃素+鞣花酸+富馬酸+Fluasterone+4-HPR+Oltipratz+4-HPR+它莫西芬+在表1所示的原料中，姜黃素(curcumin)是一種顏料成分，是從在印度被用作傳統(tǒng)民間醫(yī)藥的姜黃(姜科)中分離出的。眾所周知，其具有極好的抗氧化作用和抗炎作用(ElizabathK.和RaoM.N.A.，Int.J.Pharm.，58237-240，1990、TonnesanH.H.，Int.J.Pharm.，51179-181，1989)、極好的抗突變作用、抗癌作用、及對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用(NagabhushanM.和BhideS.V.，J.Nutr.GrowthCancer，483-89，1987、HuangM.T.等CancerRes.，485941-5946，1988、SoudaminiK.K.和KuttanR.，J.Ethnopharmacol.，27227-233，1989、JeeS.H.等J.Invest.Dermatol.，111，656-661，1998)。此外，據(jù)報(bào)道姜黃素可抑制由佛波酯引起的腫瘤增多，并具有可對(duì)抗人類白血病、結(jié)腸癌、CNS、黑素瘤、腎癌、乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用(RamsewakR.S.等Phytomedicine，7303-308，2000)。NCI已計(jì)劃了一種將姜黃素開發(fā)為化學(xué)預(yù)防藥劑的臨床測試(KelloffG.J.等，CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.，385-98，1994)。由此，可連續(xù)地檢測天然產(chǎn)物，此天然產(chǎn)物既沒有副作用、又可抑制腫瘤形成和演進(jìn)成惡性癌癥并且可治療與腫瘤演進(jìn)密切相關(guān)的炎癥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種藥物組合物，其不僅可預(yù)防腫瘤形成，而且可通過抑制由致癌物引起的突變和腫瘤形成來治療惡性腫瘤(癌癥)及炎癥，并可增強(qiáng)去致癌物毒性的酶的活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、及抑制與腫瘤形成和炎癥密切相關(guān)的COX-2和iNOS的活性或表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于預(yù)防癌癥和治療癌癥及炎癥的藥物組合物，其含有作為有效成分的黃根醇(xanthorrhizol)。黃根醇是一種倍半萜化合物，最初是由Rimpler等在1970年從姜黃根中分離出來的，其結(jié)構(gòu)如下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)式1。化學(xué)結(jié)構(gòu)式1(+)-黃根醇據(jù)報(bào)道，黃根醇可抑制大鼠子宮的剛性收縮并與其濃度相關(guān)(Ponce-MonterH.等Phytother.Res.，13202-205，1999)，并表現(xiàn)出對(duì)口部微生物如鏈球菌突變異種的抗菌活性(HwangJ.K.，F(xiàn)itoterapia，71321-323，2000、HwangJ.K.，PlantaMed.，66196-197，2000)。所述的黃根醇可從用作印度尼西亞民間藥物的姜科植物黃姜根(CurcumaxanthorrhizaRoxb)中提取，可使用諸如有機(jī)溶劑提取、超臨界液體提取、微波提取、超聲波提取等提取方法，這些都已公開在韓國專利公開第2000-73295號(hào)和WO88/05304中。我們作為發(fā)明人已觀察了黃根醇對(duì)突變、腫瘤形成和炎癥的抑制作用。黃根醇可增強(qiáng)致癌物去毒性酶的活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制與炎癥反應(yīng)相關(guān)的COX-2和iNOS的活性或表達(dá)。因而，我們的結(jié)果表明黃根醇可有效地預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥。黃根醇預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥的功效詳述如下。大多數(shù)致癌物是突變劑，特-丁基氫過氧化物或過氧化氫是公知的氧化性突變劑，其可通過氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致DNA損傷和突變(TaffeB.G.等J.BiolChem.，26212143-12149，1987、KappusH.，Arch.Toxicol.，60144-149，1987)，特別地，特-丁基氫過氧化物可通過在生理?xiàng)l件下形成活性氧物種而用作小鼠皮膚腫瘤促進(jìn)劑(EpeB.等Environ.HealthPerspect.，88111-115，1990)。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，黃根醇對(duì)抑制由特-丁基氫過氧化物或過氧化氫引起的細(xì)菌突變作用比姜黃素更有效。黃根醇可有效地抑制二步小鼠皮膚致癌模型中的腫瘤形成(DiGiovanniJ.，Pharmacol.Ther，5463-128，1992)。此表明黃根醇是有用的癌癥化學(xué)預(yù)防藥劑和抗癌藥劑。此外，黃根醇可引發(fā)II期去毒性酶的活性，去毒性酶可在身體內(nèi)通過去致癌物的活性而抑制腫瘤形成。黃根醇可通過活化QR[(NADP(H)苯醌氧化還原酶)]而增強(qiáng)身體去致癌物毒性的能力，QR是一種II期去毒性酶[TalalayP.等在CancerBiologyandTherapeutics.eds.J.G.Cory和A.Szentivanyi.PlenumPress，NewYork，NY，pp.197-216，1981]。NF-κB的活化可提高腫瘤形成(參考CogswellP.C.等Oncogene，191123-1131，2000)。NF-κB的活化被認(rèn)為是調(diào)控COX-2和iNOS誘導(dǎo)的關(guān)鍵。在NF-κB的活化中關(guān)鍵情況之一是通過磷酸化作用和泛素化作用抑制蛋白IκB的分裂及隨后的降解。通過抑制IκBα的降解，黃根醇可有效地抑制NF-κB的活化。從上述結(jié)果可以理解，黃根醇對(duì)于抑制腫瘤形成是一種有用的藥劑。黃根醇可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過程中，被稱為白介素-1β轉(zhuǎn)化酶(IL-1β轉(zhuǎn)化酶)的凋亡蛋白酶(caspase)起重要的作用(Martin，S.J.和Green，D.R.，Cell，82349-352，1995)。Caspase群至少由10個(gè)caspase酶組成，并分為亞群ICE(caspase-1，4，5)、Ich-1(caspase-2，9)、CPP32(caspase-3，6，7，8，10)。如果前凋亡蛋白酶(procaspase)被活化成caspase，那么它也可在下一步驟中活化另一個(gè)caspase。聚(ADP-核糖)聚合酶(PRAP)和DNA修復(fù)酶可被caspase-3分解，并活化DNA斷裂-促進(jìn)因子(DFF)以引起細(xì)胞凋亡(LiuX.S.等Cell，89175-184，1997)。在用黃根醇處理的癌細(xì)胞中表現(xiàn)出形態(tài)特征，如通常在細(xì)胞凋亡時(shí)觀察到的DNA斷裂和細(xì)胞核濃縮。通過抑制COX-2和iNOS的表達(dá)，可利用黃根醇有效地治療炎癥。眾所周知，腫瘤形成過程的每一步越深，COX-2(環(huán)氧合酶-2)和iNOS(誘導(dǎo)性一氧化氮合酶)的表達(dá)增加越大(KitayamaW.等Carcinogenesis，202305-2310，1999、TakahashiM.CancerRes.，571233-1237，1997)。由此可以理解，在腫瘤形成和炎癥反應(yīng)之間有密切的關(guān)系。環(huán)氧合酶(COX)是催化從花生四烯酸中生物合成前列腺素(PGs)的關(guān)鍵性的酶。已確定出COX有兩種變體，表示為COX-1和COX-2。在大多數(shù)組織中COX-1是基本表達(dá)，并且看起來在正常的生理功能中起管家角色(AmiramR.，J.Biol.Chem.，2633022-2024，1988)。相反，在大多數(shù)正常組織中不容易檢測到COX-2，但可由在炎癥和細(xì)胞生長的控制中對(duì)于COX-2起作用的前炎癥細(xì)胞因子、生長因子、致癌基因、致癌物及腫瘤促進(jìn)因子引起(SubbaramaiahK.，CancerRes.，564424-4429，1996)。在腫瘤中PGs水平的提高至少部分是由于COX-2表達(dá)提高的原因。COX-2的過度表達(dá)也可抑制細(xì)胞凋亡及惡性細(xì)胞入侵(TsujiiM.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，943336-3340，1997)。由此，可選擇性地抑制COX-2活性或表達(dá)的化合物對(duì)于癌癥的化學(xué)預(yù)防或抗炎作用是一個(gè)重要角色。一氧化氮合酶(NOS)是另一種重要的酶，并與炎癥、血管緊張、神經(jīng)傳導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞及其他人身體的自我平衡調(diào)控相關(guān)。NOS也以兩種形式純?cè)?，?gòu)成形式和誘導(dǎo)形式。過量的一氧化碳(NO)的產(chǎn)生與病態(tài)的血管舒張、細(xì)胞毒性作用、組織損傷有關(guān)。根據(jù)最近的結(jié)果，NOS可提高血管的滲透性，可引起炎癥反應(yīng)如水腫，可促進(jìn)COX的活性以刺激炎癥介質(zhì)如前列腺素的生物合成而引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。在各種癌癥組織中，iNOS都高度增加。因此，可顯著抑制COX-2和iNOS活性的黃根醇不僅可用于預(yù)防癌癥還可用于治療炎癥和癌癥。本發(fā)明的藥物組合物含有用于預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥的黃根醇，還可含有藥物可容許的載體(vector)和稀釋劑?？稍卺t(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域商用的溶劑、分散介質(zhì)、吸附延緩劑等可作為載體。本發(fā)明用于預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥的藥物組合物可通過任何常規(guī)給藥方案而到達(dá)靶組織。因此，本發(fā)明的組合物可通過對(duì)身體有影響的部分給藥、口服給藥、腸胃外給藥、鼻內(nèi)給藥、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射及鞏膜(intrascleral)給藥。此組合物也可配成溶液、懸浮液、片劑、藥丸、膠囊、及持續(xù)性釋放劑的形成。優(yōu)選的制劑是注射劑，并根據(jù)疾病的種類和程度、年齡、性別等結(jié)合本領(lǐng)域的知識(shí)決定組合物的給藥劑量。附圖簡要說明圖1是曲線圖，表明黃根醇對(duì)由特-丁基氫過氧化物(a)或過氧化氫(b)引起的細(xì)菌突變的抑制作用。圖2是瓊脂培養(yǎng)板的照片，表明黃根醇對(duì)由過氧化氫引起的突變的抑制作用。圖3是曲線圖，表明姜黃根(A)的甲醇提取物和黃根醇(B)對(duì)由7，12-二甲基苯[a]蒽(DMBA)和12-鄰-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯(TPA)引起的二步小鼠皮膚致癌中的皮膚腫瘤形成的抑制作用。圖4中小鼠的照片，表明黃根醇對(duì)由DMBA和TPA引起的二步小鼠皮膚致癌中的皮膚腫瘤形成的抑制作用。圖5是表明由黃根醇引起的苯醌還原酶(QR)活性增長的圖。圖6是西方墨點(diǎn)法(westernblotting)形成的照片，表明黃根醇可抑制由TPA引起的COX-2蛋白的表達(dá)。圖7是曲線圖，表明黃根醇對(duì)脂多糖(LPS)活化的PGE2產(chǎn)物(COX-2活性)的抑制作用。圖8是曲線圖，表明黃根醇對(duì)LPS活化的一氧化氮產(chǎn)物(iNOS活性)的抑制作用。圖9是westernblotting照片，表明黃根醇對(duì)IkBa分解的抑制作用。圖10是瓊脂糖凝膠的照片，表明由黃根醇引起的DNA斷裂。圖11是流式細(xì)胞分析，表明黃根醇對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。圖12是westernblotting照片，表明黃根醇對(duì)procaspase-3的活化。實(shí)施方案結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案可最佳地更詳細(xì)地理解本發(fā)明的說明。但是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案可有各種變化，并且本發(fā)明的范圍也不限于下面的實(shí)施方案。本發(fā)明的實(shí)施方案是為對(duì)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員更全面地闡明而提供的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為均數(shù)+SE和IC50，IC50是抑制反應(yīng)到50％時(shí)的濃度。通過t-test評(píng)估在各亞群平均值之間的差值。統(tǒng)計(jì)顯著性為P＜0.05。黃根醇的分離和純化實(shí)施例用75％的甲醇提取姜黃根的干燥根莖后，用乙酸乙酯、丁醇、水分餾提取物。用己烷/乙酸乙酯(10∶1，v/v)的混合物洗脫硅膠柱色層來純化源于乙酸乙酯餾分的一種原料。使用EI-MS測其分子量及分析其1H-NMR、13C-NMR及IR光譜以表征經(jīng)純化的原料是否黃根醇。IR(CDCl3，Vmax)3402、2915、1708、1620、1599cm-1；EI-MS(m/z)218、148、136、135、121；1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.18(3H，d，J＝7.1Hz)、1.52(3H，s)、1.57(2H，dt，J＝7.1、7.2Hz)、1.67(3H，s)、1.85(2H，dt，J＝7.0、7.2Hz)、2.20(3H，s)、2.59(1H，qt)、5.08(1H，t，J＝7.0、7.2Hz)、6.59(1H，brs)、6.66(1H，brd)、7.01(1H，d，J＝7.6Hz)；13C-NMR(CDCl3，400MHz)147.16、113.50、153.51、120.86、130.74、119.42、38.98、38.32、26.10、124.48、131.39、15.31、25.67、17.64、22.3。實(shí)施方案1對(duì)由活性氧物種引起的突變的抗誘變作用在和活性氧物種共同引起突變的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)TA102的菌株中檢測黃根醇的抗誘變作用(Levin，D.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，79；7445-7449，1982)。在Oxoid營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌TA102菌株11小時(shí)。將100μl上述培養(yǎng)基加入到600μl含有特-丁基氫過氧化物(100μg/培養(yǎng)板)或過氧化氫(50μg/培養(yǎng)板)的反應(yīng)混合物中，反應(yīng)混合物可含有或不含有黃根醇，并在37℃孵育30分鐘。在陽性對(duì)照組中加入姜黃素以代替黃根醇。在測定黃根醇對(duì)由特-丁基氫過氧化物和過氧化氫引起的突變的抑制作用的實(shí)驗(yàn)中，黃根醇或姜黃素的濃度分別是0、10、20、40、60nmol/培養(yǎng)板、及2、4、8、10、20、50nmol/培養(yǎng)板。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到2ml含有0.5mM組氨酸和生物素的軟性瓊脂溶液中并混均。將其倒在最低營養(yǎng)需求培養(yǎng)板(minimalglucoseplate)上，將此板在37℃下孵育48小時(shí)，計(jì)算His+的回復(fù)突變菌落數(shù)目。對(duì)由特-丁基氫過氧化物(a)和過氧化氫(b)引起的突變的抗誘變作用分別由圖1中的曲線圖(A)和曲線圖(B)表示。圖2是瓊脂培養(yǎng)板的照片，表明黃根醇對(duì)由過氧化氫引起的突變的抗誘變作用。如圖2所示，與用作陽性對(duì)照組的姜黃素相比，黃根醇對(duì)由特-丁基氫過氧化物和過氧化氫引起的突變有更好的抑制作用。實(shí)施方案2在二步小鼠皮膚致癌模型中對(duì)腫瘤形成的抑制作用在由腫瘤引發(fā)劑(DMBA)和腫瘤促進(jìn)劑(TPA)引起的多步小鼠致癌中研究黃根醇和姜黃根的甲醇提取物對(duì)腫瘤形成的化學(xué)預(yù)防作用。姜黃根的甲醇提取物按如下制備。將干燥的姜黃根切成小片后，在100g的樣品中加入400ml75％甲醇，在室溫下反復(fù)提取兩天。甲醇提取物用過濾紙過濾，并在凍干器中蒸發(fā)干燥。為評(píng)估黃根醇和姜黃根的甲醇提取物對(duì)腫瘤形成的抑制作用，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組使用30只小鼠(6周齡，雌性)。用電動(dòng)剪刀對(duì)ICR小鼠背部剃毛。于表皮涂抹在0.2ml丙酮中的0.2μmolDMBA之后，于每周三次連續(xù)19周每次表皮涂抹在0.2ml丙酮中的10nmolTPA之前，用黃根醇或姜黃根的甲醇提取物處理小鼠表皮30分鐘。陰性對(duì)照組僅用0.2ml丙酮處理。每兩周計(jì)數(shù)和記錄腫瘤。以每只小鼠的平均腫瘤數(shù)目(患瘤數(shù))及患有腫瘤小鼠百分比(患瘤率)表達(dá)此結(jié)果，并表明在圖3和圖4中。圖3的曲線圖(A)表明每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的患瘤數(shù)，曲線圖(B)表明患瘤率。圖4是表明19周內(nèi)黃根醇對(duì)腫瘤形成的抑制作用的照片。如圖3和圖4所示，黃根醇抑制腫瘤形成與劑量相關(guān)。所有用DMBA和TPA處理而沒有用黃根醇處理的小鼠皮膚患瘤數(shù)平均為15.5個(gè)。另一方面，對(duì)于在19周內(nèi)每周三次表皮涂抹6μmol黃根醇的小鼠而言，每只小鼠皮膚患瘤數(shù)為4.0個(gè)，57％的受處理小鼠有腫瘤。這些結(jié)果表明黃根醇是一種極好的化學(xué)預(yù)防藥劑并可明顯減小患瘤率和患瘤數(shù)。實(shí)施例3苯醌還原酶活性的誘導(dǎo)將Hepa1C1C7細(xì)胞(2.5×104/ml)、大鼠肝癌細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)板中，在37℃下于含有5％CO2的潮濕空氣中用10％FBS-o-MEM(GibcoBRL)培養(yǎng)24小時(shí)。將190μl的新制培養(yǎng)基和溶在10％DMSO中的10μl黃根醇加到上述的培養(yǎng)基中，并在37℃下于5％CO2中培養(yǎng)48小時(shí)。丟棄培養(yǎng)基，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌后，在每一個(gè)孔中加入含有0.8％毛地黃皂苷和2mMEDTA的50μl反應(yīng)溶液，并培養(yǎng)10分鐘以破壞細(xì)胞。在軌道搖動(dòng)器(100rpm)中搖動(dòng)培養(yǎng)板10分鐘后，加入含有甲萘醌和MTT(3-[4，5-二甲基-2-噻唑基]-2，5-二苯基溴化四唑)的200μl反應(yīng)溶液(最終反應(yīng)溶液50ml中含2.5ml0.5M-tris、0.34ml1.5％Tween-20、0.034ml7.5mMFAD、0.334ml150mMG-6-P、30μl50mMNADP、100μl葡萄糖6-磷酸脫氫酶、33.4mgBSA、15mgMTT、50μl50mM甲萘醌)，并反應(yīng)10分鐘。然后加入含有0.3mM敗壞翹搖素的5mM磷酸鉀溶液(pH7.4)50μl，結(jié)束反應(yīng)，并用分光光度法測量在595nm處的吸光率。為評(píng)估黃根醇對(duì)細(xì)胞生長的作用，測量在和上面相同的條件下培養(yǎng)的第二塊培養(yǎng)板中的蛋白。除掉培養(yǎng)基后，用0.2％的結(jié)晶紫處理細(xì)胞10分鐘，然后用自來水洗滌，再干燥。在細(xì)胞中加入200μl0.5％SDS并混合，然后用分光光度法測量在595nm處的吸光率。為評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果，首先，用下面的方程式1計(jì)算經(jīng)黃根醇處理的每一組和對(duì)照組的QR比活性(QRspecificactivity)。由黃根醇引起的QR活性相對(duì)水平，即QR誘導(dǎo)比(QRinductionratio，處理/對(duì)照)，按下面的方程式2定義為經(jīng)黃根醇處理的組的QR比活性和對(duì)照組的QR比活性的比。QR比活性＝(每分鐘MTT的吸光率變化/結(jié)晶紫的吸光率變化)×3247nmol/mg[方程式2]QR誘導(dǎo)比＝經(jīng)黃根醇處理的測試樣品的比活性/對(duì)照組的比活性由黃根醇引起的QR誘導(dǎo)比表明在圖5中。如圖5所示，在黃根醇為0.4μM和50μM處的QR誘導(dǎo)比分別約為對(duì)照組的125％和130％。這些結(jié)果表明，通過提高去致癌物毒性的酶的活性，黃根醇可移除身體內(nèi)的致癌物。實(shí)施方案4由TPA引起的COX-2表達(dá)的抑制眾所周知，COX-2表達(dá)可增大用TPA處理的小鼠皮膚，因而，基于這一事實(shí)測量黃根醇對(duì)由TPA引起的COX-2表達(dá)，方法如下。雌性ICR小鼠，5周齡，購于DaehanExperimentalAnimalCenter(Seoul，Korea)。將小鼠在循環(huán)亮/暗環(huán)境中放置12h。用電動(dòng)剪刀剃掉小鼠背部毛。2天后，在小鼠皮膚表皮上涂抹溶解在0.2ml丙酮中的黃根醇，30分鐘后，表皮涂抹在0.2ml丙酮中的TPA(10nmol)。4小時(shí)后，小鼠由于頸椎脫臼而死。切開皮膚，抽取脂肪。立即將脫脂皮膚置于液氮中并在研缽中磨成粉末。將粉碎的小鼠皮膚溶解在400μl溶解緩沖液[150mMNaCl、0.5％TritonX-100、50mMtris-HCl，pH7.4、20mMEGTA、1mMDTT、1mMNa3VO4、proteaseinhibitorcocktailtablet]中并凍存30分鐘。離心溶解液，用Bio-Rad蛋白分析定量在上層清液中的全部蛋白。含有30μg蛋白的上層清液在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳之前，將其在SDS加樣緩沖液中煮沸5分鐘。將墨點(diǎn)從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用含0.1％Tween20(PBST)的5％脫脂干乳PBS緩沖液在室溫下模印2小時(shí)，然后用PBST緩沖液洗滌。將膜在室溫下孵育1小時(shí)，用羊COX-2多克隆抗體孵育2小時(shí)。用PBST清洗墨點(diǎn)，用抗羊辣根過氧化物酶共軛的二次抗體(ZymedLaboratoriesInc.，SanFrancisco，CA，USA)孵育，然后用PBST緩沖液在5分鐘內(nèi)洗滌三次。用ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)檢測藥盒顯影轉(zhuǎn)印的蛋白。圖6是COX-2的westernblotting照片，表明用黃根醇按與劑量相關(guān)的方式預(yù)處理可降低由TPA引起的COX-2的表達(dá)。實(shí)施方案5由脂多糖(LPS)引起的COX-2活性的抑制如果用LPS處理細(xì)胞，那么COX-2活性增大?；谶@一事實(shí)，為研究黃根醇對(duì)由LPS引起的COX-2活性的作用，測量從細(xì)胞中釋放的PGE2的量，方法如下。在37℃下將RAW264.7巨噬細(xì)胞放在含有青霉素-鏈霉素及10％FBS的DMEM和含有5％CO2的潮濕空氣中。此細(xì)胞(10×105細(xì)胞/ml，200μl)可在阿斯匹林(500μM)的存在下在96孔培養(yǎng)板中維持4小時(shí)，以抑制細(xì)胞內(nèi)不可逆的COX活性。將此培養(yǎng)基洗滌3次，然后在含有1μg/mlLPS的新制培養(yǎng)基中孵育。同時(shí)在每一孔中加入黃根醇。再孵育16小時(shí)后，收取培養(yǎng)基，并用PGE2酶免疫測定法分析。將從每個(gè)孔中收取的培養(yǎng)基加到含有抗PGE2抗體(AmershamLifeScience，ArlingtonHeights，IL)和乙酰膽堿脂酶示蹤劑的每個(gè)孔中，在室溫下孵育18小時(shí)，然后用0.05％Tween20磷酸緩沖溶液洗滌。在每個(gè)孔中加入200μlEllman試劑，并孵育7小時(shí)。測量405nm處的吸光率。使用用標(biāo)準(zhǔn)PGE2繪制的校準(zhǔn)曲線量化每個(gè)培養(yǎng)基中經(jīng)黃根醇處理的PGE2。100％活性定義為在三次實(shí)驗(yàn)中在沒有LPS和有LPS的情況下16小時(shí)內(nèi)PGE2的累積差值。抑制百分比表達(dá)為[1-(樣品的PGE2水平/載體(vehicle)處理的PGE2水平-對(duì)照)]×100。此結(jié)果表明在圖7中。圖7表明黃根醇可以按劑量相關(guān)的方式抑制由LPS引起的COX-2的活性。特別地，黃根醇在不小于1μg/ml的濃度時(shí)表現(xiàn)出不小于98％的抑制百分比(IC50＝0.07μg/ml＝0.32μM)。此結(jié)果表明通過抑制COX-2的活性黃根醇可抑制炎癥和腫瘤形成。實(shí)施方案6由LPS引起的iNOS活性的抑制測量黃根醇對(duì)由LPS引起的iNOS活性的作用。在37℃下將RAW264.7巨噬細(xì)胞放在含有青霉素-鏈霉素及10％FBS的DMEM和含有5％CO2的潮濕空氣中。將在不含酚紅的10％FBS-DMEM中的細(xì)胞置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)(8×105/ml)，然后孵育4小時(shí)。用新培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并在含有1μg/mlLPS和黃根醇的培養(yǎng)基中孵育。再孵育20小時(shí)后，收取培養(yǎng)基，并分析作為由Griess反應(yīng)產(chǎn)生的NO的指示劑的亞硝酸鹽累積。分三次在從LPS和/或黃根醇處理的細(xì)胞的100μl上層清液中加入150μl的Griess試劑。將培養(yǎng)板孵育10分鐘，記錄570nm處的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線。抑制百分比表達(dá)為[1-(樣品的NO水平/載體處理的NO水平-對(duì)照)]×100。此結(jié)果表明在圖8中。參照?qǐng)D8，黃根醇可以按劑量相關(guān)的方式抑制由LPS引起的iNOS的活性，特別表明，在10μg/ml的濃度時(shí)表現(xiàn)出不小于99％的抑制百分比(IC50＝1.01μg/ml＝4.63μM)。此結(jié)果表明通過抑制NO的產(chǎn)生，黃根醇可減輕炎癥和腫瘤演進(jìn)。實(shí)施方案7對(duì)在用TPA處理的小鼠皮膚中的IκB分解的抑制為了檢測黃根醇對(duì)IκB的作用，測量在小鼠皮膚中的IκB水平。細(xì)胞質(zhì)提取物按如下方法制備。通過和實(shí)施方案4相同的方法得到小鼠皮膚組織，并均勻分散在低滲透緩沖液中[10mMHEPES、pH7.8、10mMKCl、2mMMgCl2、1mMDTT、0.1mMEDTA、0.1mM苯甲磺酰氟(PMSF)]。將此均勻混合物加到125μl10％NondietP-40溶液中，然后離心此混合物30秒。將上層清液(細(xì)胞質(zhì)提取物)在12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將墨點(diǎn)從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5％脫脂干乳PBST緩沖液在室溫下模印2小時(shí)，然后用PBST緩沖液洗滌。將膜在室溫下用兔IkBa多克隆抗體(SantaCruzProduct，SantaCruz，CA，USA)孵育2小時(shí)。用PBST清洗墨點(diǎn)，用抗兔辣根過氧化物酶共軛的二次抗體(SantaCrusproduct，SantaCruz，CA，USA)孵育，然后用PBST緩沖液在5分鐘內(nèi)洗滌三次。用ECL檢測藥盒顯影轉(zhuǎn)印的蛋白。圖9是westernblotting照片。參照?qǐng)D9，可以理解，黃根醇可以按與劑量相關(guān)的方式抑制由TPA引起的IkBa的分解。實(shí)施方案8黃根醇誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡在37℃下和含有95％空氣和5％CO2的潮濕氣氛中將人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)放在含有10％(v/v)熱不活化胎牛血清(FBS)的RPMI1640。在含有10％FBS、可含有或不含有姜黃根甲醇提取物(15μg/ml)和黃根醇(40μM)的RPMI1640培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)HL-60，并離心24小時(shí)。將4％中性福爾馬林緩沖液加到細(xì)胞內(nèi)，并將混合物轉(zhuǎn)到載物玻璃片上，然后在室溫下干燥。將固定的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌、空氣干燥、并用DNA-specificfluorochromeHoechest33258染色1分鐘。粘附的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌、空氣干燥、然后加入50％甘油。用熒光顯微鏡觀察載物玻璃片。結(jié)果表明，在經(jīng)姜黃根和黃根醇處理的HL-60細(xì)胞中表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，如明顯的染色質(zhì)縮合和核分裂。在含10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)基的Petri培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HL-60細(xì)胞2天。用0、10、40、80μM的黃根醇處理細(xì)胞以研究黃根醇對(duì)DNA分裂、細(xì)胞凋亡生化標(biāo)記(marker)的作用。24小時(shí)后，收集細(xì)胞，在500μl溶解緩沖液(1％Triton-X100、50mMTris-HClpH7.4、20mMEDTA)中孵育并凍存1小時(shí)，然后離心。將100μl1％SDS、10μlTE/RNase(10mg/ml)、50μl蛋白酶K(1mg/ml)加到上層清液中，將混合物在37℃下孵育至少4小時(shí)。用苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1，v/v)提取DNA，在加入2.5體積的冷乙醇后在-70℃下沉淀1小時(shí)。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳液溶解DNA片段，然后用溴乙啡啶著色顯影。電泳結(jié)果如圖10所示，表明由80μM黃根醇引起的DNA分裂和細(xì)胞凋亡生化標(biāo)記。通過流式細(xì)胞分析檢測黃根醇對(duì)細(xì)胞循環(huán)的作用。在無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)HL-60細(xì)胞48小時(shí)，以阻止在G0態(tài)的細(xì)胞循環(huán)。用分別含0、20、60μM黃根醇的10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)基取代上述培養(yǎng)基。24小時(shí)后，經(jīng)離心得到的細(xì)胞在-20℃下在70％乙醇中凝固過夜。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并在37℃下在100U/mlRnase中孵育1小時(shí)。用PBS洗滌兩次后，在碘化丙啶中重新使細(xì)胞懸浮。用流式細(xì)胞分析法分析細(xì)胞，結(jié)果表明在圖11中。如圖11所示，在亞G1態(tài)區(qū)間[細(xì)胞凋亡峰值，M1片段，亞-倍數(shù)染色體數(shù)量]中的細(xì)胞比例在對(duì)照組中是20％、在用20μM和60μM的黃根醇處理的細(xì)胞中分別是36％和76％。此結(jié)果表明，黃根醇可以按與濃度相關(guān)的方式引起細(xì)胞凋亡。實(shí)施方案9黃根醇對(duì)procaspase-3的活化為研究是黃根醇是否也可引起procaspase-3的活化，用0、10、40、80μM黃根醇處理HL-60細(xì)胞24小時(shí)，并用80μM黃根醇處理0、2、4、6、9、12小時(shí)。收集細(xì)胞，在如實(shí)施方案4中所述的400μl溶解緩沖液懸浮，在4℃時(shí)孵育40分鐘，并離心。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳上層清液。將墨點(diǎn)從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5％脫脂干乳PBST緩沖液在室溫下模印2小時(shí)，然后用PBST緩沖液洗滌。將膜在室溫下用小鼠procaspase-3單克隆抗體(TransductionLaboratories，Lexington，KY，USA)孵育2小時(shí)。用PBST清洗墨點(diǎn)，用小鼠辣根過氧化物酶共軛的二次抗體孵育，然后用PBST緩沖液在5分鐘內(nèi)洗滌三次。用ECL檢測藥盒顯影轉(zhuǎn)印的蛋白。圖12是procaspase-3的westernblotting照片。參照?qǐng)D12，40μM的黃根醇可將procaspase-3活化成caspase-3。上述研究結(jié)果表明，黃根醇可抑制細(xì)菌突變和小鼠皮膚形成、增強(qiáng)去致癌物毒性的酶的活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、顯著抑制與腫瘤演進(jìn)及炎癥密切相關(guān)的COX-2和iNOS的活性或表達(dá)。因此含有黃根醇的藥物組合物對(duì)于預(yù)防癌癥和治療癌癥及炎癥是非常有用的。權(quán)利要求1.一種預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥的藥物組合物，其含有作為活性成分的黃根醇。2.如權(quán)利要求1所述的預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥的藥物組合物，還含有藥物可容許的載體或稀釋劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種可預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥的藥物組合物，其特征在于含有作為活性成分的黃根醇。黃根醇不僅能抑制突變和腫瘤形成、增強(qiáng)致癌物解毒酶活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而且可抑制與腫瘤促進(jìn)和炎癥反應(yīng)相關(guān)的COX－2和iNOS的活性。因而，含有黃根醇的藥物組合物可用于預(yù)防癌癥及治療癌癥和炎癥。文檔編號(hào)A61K31/045GK1527703SQ02807016公開日2004年9月8日申請(qǐng)日期2002年3月22日優(yōu)先權(quán)日2001年3月22日發(fā)明者樸光均,黃在寬,李相國,鄭媛允申請(qǐng)人:拜澳凱爾有限公司,樸光均