專利名稱：改進(jìn)的基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多核苷酸，這種多核苷酸包括一個(gè)遍在染色質(zhì)開放元件(UCOE)和一個(gè)選擇標(biāo)記。當(dāng)可操作地連接到可表達(dá)核酸上，并將其置于側(cè)翼時(shí)，這種元件組合提供高的且可再現(xiàn)的基因表達(dá)水平。本發(fā)明也涉及到包含多核苷酸序列的載體，包含該載體的宿主細(xì)胞，以及多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞在治療上的應(yīng)用，或涉及細(xì)胞培養(yǎng)中的蛋白表達(dá)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高等真核生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的當(dāng)今模型假設(shè)，基因是以“結(jié)構(gòu)域”形式被組織的(Dillon，N.& Grosveld，F(xiàn).，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域作為真核基因功能的潛在單元(Chromatin domain as potential units of eukaryotic genefunction，Curr.Opin.Genet.Dev.4，260-264(1994)；Higgs，D.R.LCR開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域嗎？(Do LCRs open chromatindomains？)Cell，95，299-302(1998))?？梢韵胂?，染色質(zhì)區(qū)域既以一種凝聚的，“密閉的”，轉(zhuǎn)錄沉默的狀態(tài)存在，也以一種解凝聚，“開放的”和具轉(zhuǎn)錄活性的構(gòu)型存在。開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的確立特征在于DNase I敏感性增加，DNA甲基化不足和組蛋白超乙?；饔?，它被認(rèn)為是基因表達(dá)開始的前提。
染色質(zhì)區(qū)域的開放和密閉狀態(tài)可以通過轉(zhuǎn)基因的行為反映出來，這些轉(zhuǎn)基因隨機(jī)地整合到宿主細(xì)胞基因組中。完全相同的構(gòu)造當(dāng)整合進(jìn)小鼠基因組的不同位點(diǎn)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同模式的組織特異和發(fā)育期特異的表達(dá)(Palmiter，R.D.& Brinster，R.L.Ann.Ref.Genet.20，465-499(1986)；Allen，N.D等，Nature 333，852-855(1988)；Bonnerot，C.，Grimber，G.，Briand，P.& Nicolas，J.F.Proc Natl.Acad.Sci.USA876331-6335(1990))。
給定轉(zhuǎn)基因小鼠組織中的花斑表達(dá)模式，已知是位置效應(yīng)花斑(PEV)，也可以頻繁地被觀察到(Kioussis，D.& Festenstein，R.Curr.Opin.Genet.Dev 7，614-619(1997))。當(dāng)外源基因整合進(jìn)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體時(shí)，許多整合事件會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的快速沉默，而其它的則會(huì)在表達(dá)水平上產(chǎn)生很大的變化(Pikaart，M.J.，Recillas-Targa，F(xiàn) & Felsenfield，G.，Genes Dev.12，2852-2862(1998)；Fussenegger，M.，Bailey，J.E.，Hauser，H & Mueller，P.P.Trends Biotech，17，35-42(1999)。這些位置效應(yīng)使得轉(zhuǎn)基因表達(dá)無效，這會(huì)牽連到基礎(chǔ)研究和生物技術(shù)應(yīng)用。
基因結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域模型表明，能夠確立和保持具轉(zhuǎn)錄活性的開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基因控制元件應(yīng)該和基因組活性區(qū)域相聯(lián)系。
基因座控制區(qū)(LCR)是一類具長(zhǎng)范圍染色質(zhì)重塑能力的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，LCR根據(jù)它們的能力在功能上定義，所述能力是給予順式連接的基因，尤其是單拷貝轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合獨(dú)立的，轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)依賴的生理表達(dá)水平，(Fraser，P & Grosveld，F(xiàn).Curr.Opin.Cell Biol.，10，361-365(1998)；Li，Q，Harju，S & Peterson，K.P.TrendsGenet.15403-408(1999)。關(guān)鍵是這種表達(dá)是組織特異性的。LCR能夠阻斷異染色質(zhì)的擴(kuò)散，預(yù)防PEV(Kioussis，D & Festenstein，R.Curr.Opin.Genet.Dev.7，614-619(1997))，并且是由一系列DNase I超敏感位點(diǎn)(HS)組成，這些超敏感位點(diǎn)位于LCR所調(diào)節(jié)基因的5’或3’端(Li，Q.，Harju，S & Peterson，K.P.Trends Genet.15403-408(1999))。
LCR看起來包括兩個(gè)單獨(dú)的，盡管并不是必須獨(dú)立的成分。首先是“開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域”的確立，其次是給予轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)依賴性表達(dá)顯性轉(zhuǎn)錄激活能力(Fraser，P.& Grosveld，F(xiàn).Curr.Opin.Cell Biol.10，361-365(1998)。LCR發(fā)揮功能的分子機(jī)制現(xiàn)在仍然是一個(gè)爭(zhēng)論點(diǎn)(Higgs，D.R.Cell，95，299-302(1998)；Bulger，M.& Groudine，M.GenesDev.13，2465-2477(1999)；Grosveld，F(xiàn).Curr.Opin.Genet.Dev.9.152-157(1999)；Bender，M.A.，Bulger，M.，Close，J & Groudine，M.，Mol Cell 5，387-393(2000)。
培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生高水平的治療用蛋白質(zhì)產(chǎn)品，產(chǎn)生了是一個(gè)主要的正在發(fā)展的工業(yè)。染色質(zhì)位置效應(yīng)使得它是一種困難、耗時(shí)和昂貴的過程。制造這么一種哺乳動(dòng)物“細(xì)胞工廠”最常用的方法依賴基因擴(kuò)增，而基因擴(kuò)增通過藥物抗性基因(例如，DHFR，谷氨酰胺合酶(Kaufman RJ.Methods Enzymol 185，537-566(1990))和嚴(yán)謹(jǐn)選擇性壓力保持的組合來誘導(dǎo)。使用包含來自高表達(dá)基因結(jié)構(gòu)域的LCR的載體，并利用源自合適組織的細(xì)胞能極大地簡(jiǎn)化這個(gè)過程，從而產(chǎn)生很大比例的表現(xiàn)出穩(wěn)定高表達(dá)水平的克隆細(xì)胞系(Needham M，Gooding C，Hudson K，Antoniou M，Grosfeld F和Hollis M.Nucleic AcidsRes 20，997-1003(1992)；Needham M，Egerton M，Millest A，Evans S，Popplewell M，Cerillo G，Mcpheat J，Monk A，Jack A，Johnstone D和Hollis M.Protein Expr Purif 6，124-131(1995)。
然而，LCR的組織特異性，盡管在某些情況下有用，但在許多應(yīng)用方面也是一個(gè)主要的限制，例如，對(duì)需要表達(dá)的組織LCR是未知的情況，或需要在許多或全部組織中表達(dá)的情況。
我們?cè)趯弻＠暾?qǐng)PCT/GB99/02357(WO 00/05393)，US09/358082，GB 0022995.5和US 60/252,048，在這里一并引作參考，描述了在自然染色體的情況下負(fù)責(zé)確立開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的元件，，所述開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)跨過一個(gè)專門由遍在表達(dá)的看家基因組成的基因座。這些元件并不是源自LCR，而且包括延伸的無甲基化CpG島。我們用遍在染色質(zhì)開放元件(UCOE)這個(gè)術(shù)語來描述這類元件。
在哺乳動(dòng)物DNA中，二核苷酸CpG島可以被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別，這種酶能使胞嘧啶甲基化成5-甲基胞嘧啶。然而，5-甲基胞嘧啶不穩(wěn)定，并能轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶。結(jié)果，CpG二核苷酸出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)低于人們偶然所預(yù)期的頻率。然而在基因組DNA的一些部分，CpG出現(xiàn)的頻率確實(shí)更接近于期望的頻率，而這些序列已知為“CpG島”。在這里使用的“CpG島”被定義為DNA序列，至少長(zhǎng)200bp，其GC含量至少為50％，可觀察/期望的CpG含量比至少為0.6(即CpG二核苷酸含量是偶然所預(yù)計(jì)的至少60％)(Gardiner-Green M和FrommerM.J Mol Biol 196，261-282(1987)；Rice P，Longden I和Bleasby A，TrendsGenet 16，276-277(2000)。
無甲基化的CpG島是本領(lǐng)域中眾所周知的(Bird等(1985)Cell4091-99；Tazi和Bird(1990)Cell 60909-920)，并被定義為CpG島，在CpG島中，大量比例的胞嘧啶殘基沒被甲基化，并通常延伸到兩個(gè)在空間上緊連的趨異轉(zhuǎn)錄基因的5’端。據(jù)報(bào)道，這些DNA區(qū)域在整個(gè)發(fā)育期中、在所有組織中都維持甲基化不足(Wise和Pravtcheva(1999)Genomics 60258-271)。它們經(jīng)常和遍在表達(dá)基因相偶連，同時(shí)估計(jì)40％的基因表現(xiàn)出組織限制的表達(dá)圖行(Antequera，F(xiàn).& Bird，A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 901195-1199(1993)；Gross，S.H.& Bird，A.P.Curr.Opin.Genet.Dev.5，309-314(1995)，并且已知定位于活性染色質(zhì)的區(qū)域(Taze，J.& Bird，A.Cell 60，909-920(1990)。
一個(gè)“延伸”的無甲基化CpG島是一個(gè)無甲基化的CpG島，這個(gè)CpG島延伸跨過包括一個(gè)以上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)域，和/或延伸了大約300bp，優(yōu)選超過500bp。延伸的無甲基化CpG島邊界的功能性限定可以通過對(duì)這段區(qū)域采用PCR，結(jié)合使用限制性核酸內(nèi)切酶，內(nèi)切酶能在識(shí)別序列消化(剪切)DNA，并對(duì)出現(xiàn)的任何CpG殘基的甲基化狀態(tài)敏感。Hpa II就是這么一種內(nèi)切酶，它能識(shí)別和消化CCGG位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)經(jīng)常在CpG島中被發(fā)現(xiàn)，但只有中央的CG殘基沒有甲基化。因此，假如DNA沒有被甲基化，由于Hpa II的消化，用HpaII消化的DNA和包含Hpa II位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行PCR將得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR只有DNA甲基化后才能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，在無甲基化區(qū)域之外，Hpa II將不會(huì)消化DNA，一個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將會(huì)被觀察到，由此去限定“延伸的無甲基化CpG島”的邊界。
我們已經(jīng)證明(WO 00/05393)跨越無甲基化CpG島的區(qū)域可以給予可再現(xiàn)的生理水平的基因表達(dá)，所述區(qū)域包括雙重趨異轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子來自人TATA結(jié)合蛋白(TBP)/蛋白體成分-B1(PSMB1)和不均一核核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2)/異染色質(zhì)蛋白1Hsγ(HP1Hsγ)的基因座位，以及證明隨著轉(zhuǎn)基因整合到著絲粒異染色質(zhì)，它們能夠防止花斑表達(dá)模式和正常發(fā)生的沉默。
在這里使用的術(shù)語“可再現(xiàn)的表達(dá)”意思是指，不管它的染色質(zhì)環(huán)境如何，優(yōu)選地不管本發(fā)明的多核苷酸所在的細(xì)胞類型和組織類型如何，本發(fā)明的多核苷酸將指導(dǎo)可表達(dá)基因基本上以基本上相同的表達(dá)水平進(jìn)行表達(dá)。本領(lǐng)域的那些專業(yè)人員將會(huì)意識(shí)到可操作連接的可表達(dá)基因的表達(dá)水平基本上相同是可以得到的，不管所要求保護(hù)的多核苷酸的染色質(zhì)環(huán)境如何，以及優(yōu)選不管細(xì)胞類型如何，前提是這種細(xì)胞能激活基因表達(dá)。
我們已經(jīng)表明(WO 00/05393)，和活性轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子相連的無甲基化CpG島具有重塑染色質(zhì)的能力，因此它們被稱為是看家基因座位上開放區(qū)域確立和保持的主要決定因素。
隨著轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性的改良，UCOE使生產(chǎn)基因傳遞事件的比例上升。這具有重要的研究和生物技術(shù)應(yīng)用，包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和培養(yǎng)細(xì)胞中重組蛋白產(chǎn)品的生成。我們已經(jīng)顯示(WO 00/05393)了UCOE在CMV-EGFP報(bào)告構(gòu)建體表達(dá)上的有益作用以及UCOE與分泌的藥用上有價(jià)值的蛋白質(zhì)促紅細(xì)胞生成素UCOE的有益作用。UCOE的特點(diǎn)也表明它在基因治療上的用處，以及它的有效性經(jīng)常被可生產(chǎn)基因傳遞事件的低頻和表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間的不足所限制(Verma，I.M & Somia，N.Nature 389239-242(1997)。
盡管意義重大以及應(yīng)用范圍廣泛，但仍需要進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)水平。有必要進(jìn)一步去提高單獨(dú)利用UCOE獲得的表達(dá)水平，特別是在體內(nèi)基因治療領(lǐng)域以及為了體外生產(chǎn)重組蛋白。
令人驚奇的是，在表達(dá)的核酸3’端存在可選擇元件的情況下，可操作地連接到5’UCOE的核酸的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步提高，以便可表達(dá)核酸序列被5’UCOE和3’選擇標(biāo)記置于側(cè)翼。
一個(gè)可選擇元件在載體中執(zhí)行一個(gè)以上功能，如提供選擇標(biāo)記以及增加可操作連接基因的表達(dá)，允許構(gòu)建更緊湊和更有效的表達(dá)載體。
Mei，Kothary和Wall(Mei，Q，Kothary R和Wall L.Exp CellResearch 260，304-312(2000)公開了一種載體，這種載體包括一個(gè)可操作連接到LCR上的可表達(dá)基因(β-珠蛋白)和一個(gè)pgk/嘌呤霉素抗性元件。然而這個(gè)工作教導(dǎo)我們，正是可表達(dá)基因，LCR和tk/新霉素抗性元件的組合在給基因表達(dá)施加位置效應(yīng)中是重要的，以pgk/嘌呤霉素抗性元件用作陰性對(duì)照。這篇論文沒有指出從pgk I嘌呤霉素抗性基因使用中獲得的有益效果。這篇論文并沒有公開包含延伸的無甲基化CpG島(或UCOE)，可表達(dá)基因以及pgk/嘌呤霉素抗性元件的構(gòu)建體，因?yàn)檫@些構(gòu)建體包含LCR。同樣，這篇論文也沒公開可操作地連接到啟動(dòng)子上的可表達(dá)基因，而可表達(dá)基因并不是天然就連接在這種啟動(dòng)子上的，也沒公開可操作地連接到pgk/嘌呤霉素抗性元件上的表達(dá)基因，因?yàn)樵诿糠N情況下，β-珠蛋白基因都是在其內(nèi)源啟動(dòng)子控制下表達(dá)的。
Altelt等人比較了新霉素和嘌呤霉素抗性基因?qū)φ婧吮磉_(dá)載體中順式連接基因的影響(Artelt P，Grannemann R，Stocking C，F(xiàn)riel J，Bartsch J和Hauser H Gene 99，249-254(1991)。他們的結(jié)論認(rèn)為，新霉素抗性基因?qū)B接基因可能具有沉默作用，但“賦予白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素抗性的基因并不影響鄰近的啟動(dòng)子”。因此，這篇論文并沒有如本申請(qǐng)所公開的那樣，公開或提示抗性基因位置或空間使用的重要性。
我們?cè)趯弻＠暾?qǐng)PCT/GB99/02357(WO 00/05393)，US09/358082，GB 0022995.5和US 60/252,048公開多核苷酸和載體，所述多核苷酸和載體包括可操作地連接到可表達(dá)核酸上的延伸的無甲基化CpG島和抗生素抗性基因。然而在公開的實(shí)施例中，抗生素抗性基因并不和可表達(dá)核酸相鄰和位于其3’端。這么一種相鄰選擇標(biāo)記的驚奇貢獻(xiàn)同樣沒有被公開或暗示。
發(fā)明陳述本發(fā)明公開在選擇標(biāo)記的存在下，延伸的非甲基化CpG島(UCOE)正調(diào)節(jié)可操作連接的核酸序列的表達(dá)的影響可被進(jìn)一步增強(qiáng)，條件是所述的選擇標(biāo)記位于可表達(dá)核酸序列的3’端并和其相鄰。
在這里使用的術(shù)語5’和3’針對(duì)可表達(dá)核酸序列的有義鏈。因此，所述序列的5’端對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄起始，轉(zhuǎn)錄朝3’方向前進(jìn)。
在這里使用的術(shù)語“可操作連接”指的是本發(fā)明多核苷酸中，元件之間的可操作性關(guān)系?！翱刹僮鬟B接”是一個(gè)術(shù)語，對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員而言眾所周知，它描述的是順式作用DNA序列的功能關(guān)系。確切的結(jié)構(gòu)關(guān)系可能相關(guān)或不相關(guān)，而對(duì)于不同類型的元件，它們是不同的。對(duì)于啟動(dòng)子，“可操作連接”暗指和它驅(qū)動(dòng)的可讀框的5’端基本上相鄰(通常小于100bp)的位置在延伸的無甲基化CpG島的情況下，似乎染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的區(qū)域效應(yīng)負(fù)責(zé)增加基因表達(dá)的水平和一致性。在實(shí)施例中，包含延伸的無甲基化CpG島的元件緊靠著可表達(dá)基因的5’端放置。然而“可操作連接”包含放在他處的可能性，只要清晰的功能效果可以得到證明。
具體而言，可表達(dá)基因的側(cè)翼5’端帶有UCOE，而3’端是選擇標(biāo)記，導(dǎo)致表達(dá)水平增加大約2倍。在一些情況下，這種表達(dá)比單獨(dú)使用UCOE獲得的表達(dá)能增加5倍多。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種分離的多核苷酸，和單獨(dú)使用可操作連接的UCOE或延伸的無甲基化CpG島獲得的表達(dá)相比，這種多核苷酸使得獲得的可操作連接的基因的表達(dá)水平上升。
分離的多核苷酸包括一個(gè)延伸的無甲基化島，被聚腺苷酸化信號(hào)終止的可表達(dá)核酸和可操作連接到啟動(dòng)上的選擇標(biāo)記，其中，CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接到可表達(dá)核酸上，這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’→3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)在選擇標(biāo)記近端的2000bp以內(nèi)。
這里使用的“近端”指的是距可表達(dá)核酸3’端最近的選擇標(biāo)記基因的末端(包括啟動(dòng)子)，正如被聚腺苷酸化信號(hào)標(biāo)記?？梢韵胂螅x擇標(biāo)記可以是任何一個(gè)方向，以便相對(duì)于可表達(dá)核酸的近端既可以在選擇標(biāo)記的5’啟動(dòng)子末端，也可以在選擇標(biāo)記的3’啟動(dòng)子末端，即轉(zhuǎn)錄的終止末端，采用5’端和3’端是根據(jù)選擇標(biāo)記的有義鏈確定的。
優(yōu)選地，選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于距可表達(dá)核酸3’端1500bp以內(nèi)，正如被可表達(dá)核酸的聚腺苷酸化信號(hào)所標(biāo)記。更優(yōu)選的是位于3’端1000bp以內(nèi)，最優(yōu)選的則位于3’端500bp以內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，可選擇元件是一種抗生素抗性基因。優(yōu)選地，它是一種從鏈霉菌種中獲得的抗生素抗性基因。更優(yōu)選地，所述抗生素抗性基因可操作地連接到磷酸甘油酸激酶(pgk)基因的啟動(dòng)子上。最優(yōu)選地，可選擇元件是鼠pgk基因的啟動(dòng)子(Adra，CN，Boer PH和McBurney，MW.Gene 60，65-74(1987)?；蛘?，它也可能是另一種哺乳動(dòng)物pgk的啟動(dòng)子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，抗生素抗性基因是來自鏈霉菌種的嘌呤霉素抗性基因。最優(yōu)選地，它是來自白黑鏈霉菌(Streptomycesalboniger)的嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因(Vara JA，Portela A，Ortin J，Jimenez A.Nucleic Acids Res 14，4617-4624(1986)。
或者，抗生素抗性基因是來自白黑鏈霉菌(Streptomycesalboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因的修飾形式。優(yōu)選地，這個(gè)基因通過操作密碼子選擇而被修飾，為了在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)細(xì)菌基因，以一種常用方式來修飾細(xì)菌基因。這樣的密碼子修飾并沒改變編碼的氨基酸序列，其結(jié)果表達(dá)出來的酶和野生型嘌呤霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶相比并沒有發(fā)生改變。最優(yōu)選地，修飾基因的序列如

圖15所示。
或者，抗生素抗性基因是衍生自鏈霉菌種中的新霉素抗性基因。優(yōu)選地，它是來自弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Thompson CJ和Gray GS.Proc Natl Acad Sci USA80，5190-5197(1983)。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是潮霉素抗性基因。優(yōu)選地，這是一個(gè)來自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的潮霉素轉(zhuǎn)移酶基因。
在另一可選擇的實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是博來霉素抗性基因。優(yōu)選地，這是一個(gè)來自輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的博來霉素結(jié)合蛋白?；蛘?，它是來自輪枝鏈霉菌(Streptomycesverticillus)的博來霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是一個(gè)殺稻瘟素抗性基因。優(yōu)選地，它是來自輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的殺稻瘟素S-乙?；D(zhuǎn)移酶基因。
本發(fā)明的另一方面，抗生素抗性基因并不是從鏈霉菌種中獲得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，它是一個(gè)來自大腸桿菌(Escherichiacoli)的編碼氨基環(huán)多醇磷酸轉(zhuǎn)移酶的潮霉素抗性基因。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，它是一個(gè)原始來自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)轉(zhuǎn)座子Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
在本發(fā)明的一個(gè)可選擇的方面，選擇標(biāo)記并不是抗生素抗性基因?？商娲倪x擇機(jī)制涉及使用一些編碼胸苷酸合酶，胸腺嘧啶核苷激酶或二氫葉酸還原酶的基因。這樣的選擇機(jī)制在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中是眾所周知的。在一種缺乏甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，編碼谷氨酰胺合成酶的基因可用作在缺乏內(nèi)源性谷氨酰胺合成酶的細(xì)胞中或在利用抑制劑如methionine sulphoxamine已使它失活的情況下的選擇工具(Kaufman RJ，異源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的選擇和共擴(kuò)增(Selectionand amplification of heterologous genes in mammalian cells)，MethodsEnzymol 185，537-566(1990)。
另一方面，可采用一種篩選標(biāo)記。例如，編碼熒光蛋白，如水母(Aequoria victoria)綠色熒光蛋白(GFP)或它的增強(qiáng)型變體(EGFP)的基因可以用作選擇標(biāo)記。包含本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)染子，其中選擇標(biāo)記編碼GFP，通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，根據(jù)FACS上熒光的亮度可以加以分類。使用本發(fā)明的多核苷酸，并和帶選擇標(biāo)記的可表達(dá)核酸構(gòu)建體進(jìn)行比較，所述選擇標(biāo)記位于UCOE的5’端或3’端，但遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)基因(可表達(dá)核酸)，高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)可用于可比較的亮度水平。因此，選擇最亮的細(xì)胞將允許選擇具最高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，延伸的無甲基化CpG島包含一個(gè)跨越人類hnRNP A2基因的16kb DNA片段，該片段5’端和3’端分別有5kb和1.5kb的側(cè)翼序列。優(yōu)選地，延伸的無甲基化CpG島包含一個(gè)跨越人hnRNP A2基因的8kb DNA片段(WO 00/05393)。
或者，公開的多核苷酸的延伸的無甲基化CpG島是一種包含人β-肌動(dòng)蛋白CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域或其片段的“人工UCOE”，如在我們?cè)趯弻＠暾?qǐng)GB 0022995.5和US 60/252,048中所公開。優(yōu)選地，該片段大小在100bp-3.0kb，而且跨越人β-肌動(dòng)蛋白CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域或其片段。優(yōu)選地，人工UCOE也包含人PDCD2 CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域或其片段。更優(yōu)選地，人PDCD2 CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域包括一個(gè)大小在100bp-3.0kb的片段。進(jìn)一步優(yōu)選地，延伸的無甲基化CpG島包含一個(gè)大小為100bp-3.0kb、跨越人β-肌動(dòng)蛋白CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段，此外也包括一個(gè)大小為100bp-3.0kb、跨越人PDCD2 CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段。
最優(yōu)選的是，本發(fā)明實(shí)施方案的要求保護(hù)的多核苷酸包括一種人工UCOE，所述人工UCOE包括一個(gè)跨越人β-肌動(dòng)蛋白CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域的2.0kb DNA片段和一個(gè)跨越人PDCD2 CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域的1.8kb DNA片段。
此外也提供一個(gè)載體，這種載體包含前述實(shí)施方案中任一所述的多核苷酸。這種載體既可以是游離型載體，也可以是整合型載體。根據(jù)其目的用途，游離型載體可能是所需的，因?yàn)樗鼈兡茏灾鲝?fù)制，而且不必要整合就可以保持。這種游離型載體描述在WO 98/07876中。非復(fù)制和非整合型載體也是優(yōu)選的。
此外還提供一種載體，當(dāng)其結(jié)構(gòu)線性化并被整合進(jìn)染色體時(shí)，用于傳遞多核苷酸，所述多核苷酸包括一個(gè)延伸的無甲基化CpG島，一個(gè)被聚腺苷酸化信號(hào)終止的可表達(dá)核酸以及一個(gè)可操作地連接到啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記，其中CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接到可表達(dá)核酸上，這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)則位于選擇標(biāo)記近端2000bp以內(nèi)。
優(yōu)選的載體是質(zhì)粒。或者，載體也可以是病毒，如腺病毒，腺伴隨病毒，皰疹病毒，痘苗病毒，慢病毒或其他反轉(zhuǎn)錄病毒。
優(yōu)選地，所述載體是適合真核基因表達(dá)的表達(dá)載體。通過舉例而非限制方式，通常所述適應(yīng)包括提供介導(dǎo)細(xì)胞/組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動(dòng)子序列)。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語，它們包括下列僅通過舉例而非限制方式提供的特征。啟動(dòng)子是5’端的順式作用調(diào)節(jié)序列，它直接與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)連接。啟動(dòng)子元件包括所謂的TATA框和RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列，它們的功能是選擇轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。這些序列也結(jié)合多肽，所述多肽的作用尤其有助于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始選擇。
增強(qiáng)子元件是順式作用的核酸序列，通常發(fā)現(xiàn)于基因的5’端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(增強(qiáng)子也能在基因序列的3’端發(fā)現(xiàn)，甚至發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)含子序列中，因此它們位置是獨(dú)立的)。增強(qiáng)子的功能是增強(qiáng)它所連接的基因的轉(zhuǎn)錄速率。增強(qiáng)子活性對(duì)已顯示特異性結(jié)合增強(qiáng)子元件的反式作用轉(zhuǎn)錄因子(多肽)產(chǎn)生反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合/活性對(duì)許多環(huán)境刺激反應(yīng)，通過舉例而非限制方式，這些環(huán)境刺激包括中間代謝物(如葡萄糖)，環(huán)境效應(yīng)物(如熱)(參見真核轉(zhuǎn)錄因子(EukaryoticTranscription Factors)，David S Latchman，Academic Press Ltd，SanDiego)。
適應(yīng)也包括提供選擇標(biāo)記和自主復(fù)制序列，它們均有助于所述載體在真核細(xì)胞或原核宿主中的保持。在真核細(xì)胞中自動(dòng)維持的載體被稱作游離型載體。其它有助于載體編碼基因的表達(dá)的適應(yīng)包括提供轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列。此外也包括提供內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，IRES的功能是使以雙順反子或多順反子表達(dá)盒排列的載體編碼基因的表達(dá)最大化。這些適應(yīng)在本領(lǐng)域是眾所周知的。一般來說，關(guān)于表達(dá)載體構(gòu)建和重組DNA技術(shù)的文獻(xiàn)已出版了很多。請(qǐng)參見Sambrook等(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecule CloningALaboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY及其中的參考文獻(xiàn)；Marston，F(xiàn)(1987)DNA克隆技術(shù)實(shí)用方法(DNA Cloning TechniquesAPractical Approach)，第三卷，IRI出版社，英國牛津；DNA克隆(DNACloning)；FM Ausubel等，當(dāng)代分子生物學(xué)方案(Current Protocols inMolecular Biology)John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述載體編碼一種分泌信號(hào)，從而所述多肽擁有分泌信號(hào)，以有助于所述多肽的純化。
或者，其他優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)一步包括精制，以有利于表達(dá)的重組蛋白純化，如親和標(biāo)記物或表位或酶剪切位點(diǎn)。
優(yōu)選地，可表達(dá)核酸是一種治療用核酸。
或者，可表達(dá)核酸編碼一種用于在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白。
或者，可表達(dá)基因編碼非多肽產(chǎn)物，如RNA。這種RNA可以是反義RNA，它能在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制特定基因的表達(dá)，或可具有酶學(xué)(核酶)或其它功能，如核糖體RNA。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是一種載體，它包括一個(gè)延伸的無甲基化CpG島，一個(gè)被聚腺苷酸化信號(hào)終止的可表達(dá)核酸，一個(gè)可操作性連接到啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記。其中，CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接在可表達(dá)核酸上，這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)則位于選擇標(biāo)記近端2000bp以內(nèi)。優(yōu)選地，可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸信號(hào)在選擇標(biāo)記近端的1500bp以內(nèi)。更優(yōu)選的是1000bp以內(nèi)，最優(yōu)選的是500bp。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是一種載體，它包括一個(gè)延伸的無甲基化CpG島，一個(gè)多克隆位點(diǎn)，一個(gè)來在鏈霉菌種的抗生素抗性基因，其中CpG島和選擇標(biāo)記可操作地連接在多克隆位點(diǎn)上，這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，多克隆位點(diǎn)，選擇標(biāo)記，而多克隆位點(diǎn)則位于選擇標(biāo)記近端2000bp以內(nèi)。
更優(yōu)選的是多克隆位點(diǎn)進(jìn)一步可操作地連接到啟動(dòng)子上。進(jìn)一步優(yōu)選地，啟動(dòng)子選自CMV，EF-1α，RSV LTR或HIV2 LTR或衍生其中的序列的組合。更優(yōu)選的啟動(dòng)子是CMV立即/早期啟動(dòng)子。最優(yōu)選的是鼠CMV立即/早期啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包括CMV啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，聚腺苷酸序列以及在合適控制元件下編碼選擇標(biāo)記的基因。
一個(gè)載體的優(yōu)選實(shí)施方案包括圖9所示序列中第1-10551位的核苷酸。最優(yōu)選的實(shí)施方案是載體CET710。
或者，該載體包含圖10所示序列中第1-13545位的核苷酸，而優(yōu)選的載體是CET720。
載體進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是CET740，在CET740中，CET720的嘌呤霉素抗性基因被來自弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因所取代(如圖15所示)。在CET740多克隆位點(diǎn)插入具有可表達(dá)核酸序列的載體也是優(yōu)選的，如CET741。
CET760，在CET760中，CET720的嘌呤霉素抗性基因被來自大腸桿菌(Escherichia coli)的氨基環(huán)多醇磷酸轉(zhuǎn)移酶基因所取代(如圖17所示)。在CET760多克隆位點(diǎn)插入具有可表達(dá)核酸序列的載體也是優(yōu)選的，如CET761。
CET780，在CET780中，CET720的嘌呤霉素抗性基因被來自白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶的修飾形式所取代(如圖14所示)。在CET780多克隆位點(diǎn)插入具有可表達(dá)核酸序列的載體也是優(yōu)選的，如CET781。
CET820，在CET820中，為了驅(qū)動(dòng)其中插入的可表達(dá)核酸序列的表達(dá)，可操作地連接到多克隆位點(diǎn)上的人IE CMV啟動(dòng)子已經(jīng)被鼠IE CMV啟動(dòng)子所取代。在CET820多克隆位點(diǎn)插入具有可表達(dá)核酸序列的載體也是優(yōu)選的，如CET821。
CET823，在CET823中，包含一個(gè)跨越人hnRNP A2基因的8kbDNA片段的延伸的無甲基化CpG島被包含一個(gè)跨越鼠hnRNP A2基因的8kb DNA片段的延伸的無甲基化CpG島所取代(如圖19所示序列顯示)。在CET823多克隆位點(diǎn)插入具有可表達(dá)核酸序列的載體也是優(yōu)選的，如CET824。
還提供用已公開的載體中的任何實(shí)施方案轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
或者，所述的多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞可以用于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中去獲得所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是本領(lǐng)域眾所周知的，并充分公開在那些本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的文獻(xiàn)中。本發(fā)明提供生產(chǎn)多核苷酸的方法，其包括1)根據(jù)本發(fā)明，提供一種用核酸分子轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；
2)在有助于制造所述多肽的條件下生長(zhǎng)所述細(xì)胞；并且3)從所述細(xì)胞內(nèi)或其生長(zhǎng)環(huán)境中純化所述的多肽。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子是本發(fā)明的載體。
本發(fā)明也提供用于治療的多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞在制備用于基因治療的組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明也提供一種治療方法，其包括給需要這種療法的病人施用藥物有效量的本發(fā)明的多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞。優(yōu)選的是病人正患有一種可用基因治療的疾病。
本發(fā)明也提供一種藥物組合物，其包含多核苷酸和/或載體和/或宿主細(xì)胞，它們?nèi)芜x與可藥用的載體或稀釋劑混合，用于治療疾病或提供具有利蛋白或功能的特定組織的細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞或藥物組合物可以通過一種途徑施用，該途徑包括全身性肌肉，靜脈內(nèi)，氣溶膠，口服(固體或液體形式)，局部，眼睛，直腸，腹膜內(nèi)和/或鞘內(nèi)和局部直接注射。
當(dāng)然，確切的劑量將必須由每個(gè)臨床醫(yī)生針對(duì)各個(gè)病人分別確定，而這又必須由目的基因表達(dá)蛋白的確切狀態(tài)以及用靶向治療的組織類型來確定。
劑量也將依賴于疾病指征和用藥途徑。劑量數(shù)將依賴疾病以及來自臨床試驗(yàn)的功效數(shù)據(jù)。
根據(jù)本發(fā)明用于有效基因治療的多核苷酸或載體DNA的傳遞量?jī)?yōu)選在50ng-1000μg載體DNA/kg體重，而更優(yōu)選的范圍則是在1-100μg載體DNA/kg體重。
根據(jù)本發(fā)明，盡管優(yōu)選的是給哺乳動(dòng)物施用多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞用于體內(nèi)細(xì)胞吸收，但也可利用離體方法，從而從動(dòng)物中取出細(xì)胞，用多核苷酸或載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后，再重新植入動(dòng)物。例如，通過離體方法可以使多核苷酸或載體進(jìn)入肝，首先從動(dòng)物中取出肝細(xì)胞，在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞并把轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞重新植入動(dòng)物中(例如，如Chowdhury等人對(duì)兔子所述，Science 2541802-1805，1991，或如Wilson在人中所述，Hum.Gene.Ther.3179-222，1992)。這樣的方法對(duì)于在循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)中各種不同的細(xì)胞群，如紅細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞和造血干細(xì)胞的傳遞也是有效的。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種分離的多核苷酸，它包含一個(gè)可操作地連接在表達(dá)基因上的第一種啟動(dòng)子，但這種啟動(dòng)子并不是天然就可操作地連接在表達(dá)基因上，也包括一個(gè)選擇標(biāo)記，它也是可操作地連接的并位于表達(dá)基因的3’端，包含pgk啟動(dòng)子和一個(gè)嘌呤霉素抗性基因。利用這種多核苷酸獲得所述可表達(dá)基因的可再現(xiàn)表達(dá)在至少兩種組織或細(xì)胞類型中得到提供。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種非人的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它包括一種人工導(dǎo)入的延伸的無甲基化CpG島元件和人工導(dǎo)入的選擇標(biāo)記，其中兩種元件均是可操作地連接在一個(gè)位于它們之間的可表達(dá)基因上，而且其中所述可表達(dá)基因的可再現(xiàn)表達(dá)至少發(fā)生兩種組織或細(xì)胞類型中。制造轉(zhuǎn)基因小鼠的方法(Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777380(1980)；Harbers等，Nature 293540(1981)；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786376(1981)，綿羊，豬，小雞(參見Hammer等，Nature 315680(1985))等是本領(lǐng)域眾所周知的，并且根據(jù)本發(fā)明考慮使用。
這種包含本發(fā)明的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可以用作長(zhǎng)期生產(chǎn)目的蛋白。
本發(fā)明也提供了利用本發(fā)明的多核苷酸，載體或宿主細(xì)胞用來確定基因治療功效的哺乳動(dòng)物模型。這種哺乳動(dòng)物模型包括一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞含有本發(fā)明的載體。這樣的動(dòng)物測(cè)試允許在人的臨床試驗(yàn)之前進(jìn)行。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明的多核苷酸在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用。
產(chǎn)量提高以及對(duì)疾病，害蟲，干旱或鹽的抗性增加的轉(zhuǎn)基因植物的生成是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。對(duì)于細(xì)胞中含有本發(fā)明的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明也提供。一些或全部包括人工UCOE的細(xì)胞可能起源于植物。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明多核苷酸在功能基因組學(xué)應(yīng)用中的用途。功能基因組學(xué)主要涉及到對(duì)在特定類型的細(xì)胞或疾病狀態(tài)中特異性表達(dá)的基因進(jìn)行鑒定，現(xiàn)在提供了數(shù)以千計(jì)的用于藥物發(fā)現(xiàn)或基因治療目的的潛在目的的新基因序列。使用開發(fā)新療法的信息的主要問題在于怎樣決定這些基因的功能。為了決定這些基因序列的功能，本發(fā)明的多肽可用于眾多功能基因?qū)W應(yīng)用中。本發(fā)明的功能基因組學(xué)應(yīng)用包括，但并不局限于1)使用本發(fā)明的多核苷酸獲得基因序列反義形式的持續(xù)表達(dá)或核酶敲除文庫，由此確定使基因失活對(duì)細(xì)胞表型的影響。
2)使用本發(fā)明的多核苷酸制備基因序列的表達(dá)文庫，以便傳遞進(jìn)細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致可靠的，可再現(xiàn)的，持續(xù)的基因序列表達(dá)。所得的細(xì)胞表達(dá)基因序列，可以用在許多方法中發(fā)揮確定和藥物發(fā)現(xiàn)的功能。例如，提高針對(duì)基因產(chǎn)物的中和抗體，快速純化基因自身的蛋白產(chǎn)物用于結(jié)構(gòu)、功能或藥物篩選研究；或用于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的藥物篩選。
3)在一些涉及小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠的方法中使用本發(fā)明的多核苷酸。功能基因組學(xué)中的一個(gè)最有力的方法涉及在構(gòu)建的小鼠ES細(xì)胞中隨機(jī)插入基因，而構(gòu)建的小鼠ES細(xì)胞只允許在插入表達(dá)的基因后進(jìn)行藥物篩選，而且這種細(xì)胞也能輕易地被拯救出來用于測(cè)序(G.Hicks等，Nature Genetics，16，338-334)。在含新序列基因中帶有敲除突變的轉(zhuǎn)基因小鼠能輕易地制備以探測(cè)它們的功能。目前，這種技術(shù)在小鼠ES細(xì)胞中充分表達(dá)的小鼠基因中有10％運(yùn)轉(zhuǎn)良好。把本發(fā)明的多核苷酸整合進(jìn)整合型載體中能使這種技術(shù)延伸到用來鑒定所有在小鼠中表達(dá)的基因。
發(fā)明詳述本發(fā)明將只通過實(shí)施例方式并參照附圖來進(jìn)行描述，在所述附圖中圖1所示為“空”載體CET200.1，210，710和720的圖譜。在多克隆位點(diǎn)插入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因分別產(chǎn)生CET230，711和721。所有的載體都包含一個(gè)CMV啟動(dòng)子，從CMV啟動(dòng)子開始插入基因被表達(dá)。然而，在CET210中(以及它的EGFP-表達(dá)衍生物，CET230)，盡管質(zhì)粒中的插入基因會(huì)被UCOE和pgk/嘌呤酶素抗性元件置于側(cè)翼，但后者并不是緊密相鄰。更重要的是，質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染前被用來使質(zhì)粒線性化的Pvu I位點(diǎn)分離。在整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體后，其導(dǎo)致基因不再被置于側(cè)翼，因?yàn)閁COE和pgk/嘌呤霉素抗性元件均會(huì)整合進(jìn)基因的同一側(cè)。而在質(zhì)粒CET710(以及它的EGFP-表達(dá)衍生物，CET711)和CET720(以及它的EGFP-表達(dá)衍生物，CET721)中，Pvu I線性化導(dǎo)致基因緊密整合，所述基因的一側(cè)為UCOE，而另一側(cè)為pgk/嘌呤霉素抗性元件。CET210(以及CET230)和CET720(以及CET721)攜帶hnRNP衍生的UCOE，而CET710(以及CET711)則攜帶“人工”β-肌動(dòng)蛋白/PDCD2衍生的UCOE。
圖2所示為在轉(zhuǎn)染后的指示日期，如FACS分析的中值熒光所測(cè)量，來自各種不同的轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO-K1細(xì)胞中的載體的EGFP的表達(dá)情況。“EGFP”描繪的是用含有對(duì)照的(pEGFP)非-UCOE的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。CET220所示為用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在這種質(zhì)粒中，EGFP表達(dá)單元被可操作地連接在hnRNP衍生的UCOE上，但不是連接到pgk/嘌呤霉素抗性元件上。而是使用SV40/新霉素抗性元件。其它的細(xì)胞用CET230，711或721轉(zhuǎn)染，它們的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
圖3所示為在轉(zhuǎn)染后的指示日期，圖2中所示的細(xì)胞群經(jīng)判斷為表達(dá)陽性的比例。
圖4所示為如中值熒光所檢測(cè)，EGFP在轉(zhuǎn)染有載體CET220，230，721和711的CHO-K1中的表達(dá)情況，中值熒光在沒超出FACScan檢測(cè)能力的情況下經(jīng)糾正后允許進(jìn)行比較。這清楚地顯示把選擇標(biāo)記(puror)置于可表達(dá)基因(EGFP)的5’端(CET230)或3’端(CET721)的效果相當(dāng)。
圖5所示為如中值熒光檢測(cè)，EGFP在轉(zhuǎn)染有載體CET701，721，704，741，705，751，706，761，708和781的CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)，中值熒光在沒超出FACScan檢測(cè)能力的情況下經(jīng)糾正后允許進(jìn)行比較。
圖6所示為EGFP在轉(zhuǎn)染有 載體的CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)水平，所述載體用5’人和鼠hnRNP UCOE和3’嘌呤霉素抗性基因相比較。
圖7所示為鏈霉菌新霉素抗性基因的位置對(duì)EGFP表達(dá)的影響。CET741在轉(zhuǎn)基因的3’端有選擇標(biāo)記，而CET745在轉(zhuǎn)基因和UCOE的5’端有選擇標(biāo)記。在兩個(gè)載體中，UCOE都是人RNP UCOE。
圖8所示為質(zhì)粒CET700的圖譜。
圖9所示為質(zhì)粒CET710的圖譜。
圖10所示為CET710的核苷酸序列。
圖11所示為質(zhì)粒CET720的圖譜。
圖12所示為CET720的核苷酸序列。
圖13所示為野生型白黑鏈霉菌(S.alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。
圖14所示為修飾的白黑鏈霉菌(S.alboniger)的嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。
圖15所示為弗氏鏈霉菌(S.fradiae)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。
圖16所示為吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。
圖17所示為大腸桿菌(E.coli)氨基環(huán)多醇磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygror)基因的核苷酸序列。
圖18所示為轉(zhuǎn)座子Tn5(肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae))的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。
圖19所示為小鼠hnRNP A2 HindIII片段的核苷酸序列。
圖20所示為質(zhì)粒CET1010的圖譜。
圖21所示為CET1010的核苷酸序列。
圖22所示為質(zhì)粒CET1020的圖譜。
圖23所示為CET1020的核苷酸序列。
圖24所示為質(zhì)粒CET1030的圖譜。
圖25所示為CET1030的核苷酸序列。
圖26所示為質(zhì)粒CET1110的圖譜。
圖27所示為CET1110的核苷酸序列。
圖28所示為質(zhì)粒CET1120的圖譜。
圖29所示為CET1120的核苷酸序列。
圖30所示為質(zhì)粒CET1130的圖譜。
圖31所示為CET1130的核苷酸序列。
實(shí)施例實(shí)施例1可表達(dá)基因的側(cè)翼帶有UCOE和可選擇元件材料和方法pGK-Puro CET表達(dá)載體的構(gòu)建CET700CMV-MCS-SV40pA盒以Ase I/Afl II片段從CET31(一種以CMVMCS pA SV40Neo為基礎(chǔ)的質(zhì)粒)中取出，平端用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平并被連接進(jìn)已用EcoRV消化的pPGK-Puro(mPGK啟動(dòng)子，嘌呤霉素抗性基因，pBluescript中的bGHpA)。
CET720用HindIII消化CET20(pBluescript中的8.3kb hnRNP A2片段)，得到8kb的RNP UCOE，然后將其連接入也已用HindIII切割的CET700中。
CET710從CET21(pBluescript中的人工UCOE)中，以Xba I/CIa I片段的形式取出人工UCOE，用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平平端，并將其連接入已用HindIII消化且用T4 DNA聚合酶填平平端的CET700中。
CET230用Nar I和EcoR I消化pUC19，去除大約160bp的片段，然后鈍化和重新連接，便構(gòu)建了載體CET230。這從載體骨架上去掉了兩個(gè)Pvu I和Pvu II位點(diǎn)中的一個(gè)。用Ase I/Afl II消化pEGFPN-1(Clontech)，接著將平端補(bǔ)平，然后插入到已用Nde I和Eco1091消化并重新補(bǔ)平平端的pUC19載體骨架，從而將CMV-EGFP-SV40pA盒(其MCS缺失)從pEGFPN-1中剪切掉。
PGK-Puro-bGpA盒以EcoR I/Xba I平端填平片段從pPGK-Puro中取出，然后鈍化并插入上述載體的單一PvuII位點(diǎn)處。最后，這個(gè)8.3kb hnRNP A2片段作為衍生自CET20的HindIII片段被插入這個(gè)載體的唯一的HindIII位點(diǎn)。
為了清楚目的CET230是“空”載體CET210的EGFP-表達(dá)形式。
CET711是“空”載體CET710的EGFP-表達(dá)形式。
CET721是“空”載體CET720的EGFP-表達(dá)形式。
基于CET720的帶有不同抗生素抗性基因和可選擇的啟動(dòng)子或UCOE的載體可通過如下方式構(gòu)建。通過限制性消化可從CET720中取出PGK啟動(dòng)子(bp11384-11894)和bghpA(bp12567-12893)。將這些元件能插入到pBluescript骨架中，從而以讓抗性基因表達(dá)的方式，限制性位點(diǎn)能有效用于插入在PGK啟動(dòng)子和bghpA之間的任何抗性基因序列(利用RCR或限制性消化衍生)。CMV-MCS-SV40pA表達(dá)盒也能從CET720(bp10533-11380)中取出，然后插入上述載體的PGK啟動(dòng)子的5’端。另一種方法，mCMV-MCS-SV40pA表達(dá)盒也能放置在同一位置(CET801，821，824-EGFP表達(dá)形式)。hnRNPA2 UCOE能通過限制性消化從CET720中(bp2240-10525)中取出，然后插入上述載體的CMV表達(dá)盒的5’端，或者，其他UCOE(例如，鼠hnRNPA2)能被插入到同一位置(CET824-EGFP表達(dá)載體)。
為了清楚目的CET741是“空”載體CET740的EGFP-表達(dá)形式，它的5’端含有一個(gè)人RNP UCOE，而3’端則包含一個(gè)弗氏鏈霉菌(S.fradiae)的neor基因。
CET761是“空”載體CET760的EGFP-表達(dá)形式，它的5’端含有一個(gè)人RNP UCOE，而3’端則包含一個(gè)大腸桿菌氨基環(huán)多醇磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygror)基因。
CET781是“空”載體CET780的EGFP-表達(dá)形式，它的5’端含有一個(gè)人RNP UCOE，而3’端則包含一個(gè)修飾的白黑鏈霉菌(S.alboniger)的嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因。
CET821是“空”載體CET820的EGFP-表達(dá)形式，它的5’端含有一個(gè)人RNP UCOE，而3’端則包含一個(gè)野生型的白黑鏈霉菌(S.alboniger)嘌呤霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因。EGFP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)由鼠(而不是人)CMV IE啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。
CET824是“空”載體CET823的EGFP-表達(dá)形式，它的5’端含有一個(gè)鼠(而不是人)RNP UCOE，而3’端則包含一個(gè)野生型的自黑鏈霉菌(S.alboniger)嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因。
pCIA載體這是一系列載體，當(dāng)整合進(jìn)染色體時(shí)，它們能輕易地允許對(duì)帶有最終優(yōu)化構(gòu)型(UCOE表達(dá)盒抗性盒)的UCOE表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建。
CET900是一個(gè)空的克隆載體，在這個(gè)載體中，成對(duì)的稀有限制性位點(diǎn)位于MCS的側(cè)翼。CET901和CET902分別包括hCMV和mCMV啟動(dòng)子，以及一個(gè)MCS和SV40pA。相同的成對(duì)的稀有限制性位點(diǎn)也位于這些表達(dá)盒的側(cè)翼。
CET1000系列載體包含各種不同的UCOE和抗性表達(dá)盒的組合。它們?cè)赨COE的3’端和抗性盒的5’端，也包含和CET900系列相同的稀有限制性位點(diǎn)。這類載體在UCOE的5’端和抗性盒的3’端也含有線性化位點(diǎn)。
因此，任何轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒在CET900系列中能被構(gòu)建，然后且能很容易地轉(zhuǎn)移到CET1000系列中，以便于在整合進(jìn)染色體時(shí)，最終的構(gòu)型是所需的UCOE-表達(dá)盒抗性盒。
如上所述，抗生素抗性基因在CET1000系列中通過限制性消化或PCR得以交換。
轉(zhuǎn)染根據(jù)基本方法以及在此一并引作參考的在審專利申請(qǐng)中所述，CHOK1細(xì)胞被轉(zhuǎn)染和篩選。
結(jié)果具體參照?qǐng)D2，和CET721轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，CET721和CET230轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表示出一貫地更高的表達(dá)水平。這兩個(gè)載體的相似性在于它們都帶有8kb hnRNP衍生的UCOE，所述UCOE可操作地連接到驅(qū)動(dòng)EGFP基因的CMV啟動(dòng)子上，并且這兩個(gè)載體也都攜帶有pgk/嘌呤霉素抗性基因元件。然而，用Pvu I線性化后，CET230整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體后導(dǎo)致元件按如下順序放置pgk/Puro，hnRNP UCOE，EGFP基因。用CET721進(jìn)行同樣的處理導(dǎo)致EGFP基因被UCOE和pgk/Puro置于側(cè)翼。用CET230獲得的表達(dá)水平并沒顯著高于用CET220獲得的表達(dá)水平，CET220是一種不攜帶pgk/Puro元件但具有同樣的能驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)的UCOE和啟動(dòng)子的載體。
和基本的EGFP表達(dá)質(zhì)粒相比，所有含UCOE的載體表示出顯著升高的表達(dá)水平。
圖3所示的是，就表達(dá)而言，在轉(zhuǎn)染后的所有時(shí)間點(diǎn)，用中值熒光表示的表達(dá)水平升高也可以反映在轉(zhuǎn)化細(xì)胞群中被判定為陽性的細(xì)胞比例的上升。這是一個(gè)位置效應(yīng)缺乏的檢測(cè)，因?yàn)檩d體的隨機(jī)整合通常會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群(非克隆)中一系列的表達(dá)水平。這個(gè)已被5’UCOE和3’選擇元件的組合所克服，產(chǎn)生導(dǎo)致均一的高表達(dá)群體。
圖2中所示的某些細(xì)胞池的表達(dá)水平是如此之高，以至于產(chǎn)生的熒光超出了檢測(cè)器的能力。
在圖4中，檢測(cè)已被糾正到檢測(cè)器反應(yīng)的線性區(qū)域，以讓構(gòu)建體之間進(jìn)行比較。這表明和單獨(dú)用UCOE(CET220)或把選擇元件(Puror)放在UCOE 5’端而獲得的表達(dá)水平相比，在CET721中采用UCOE和3’側(cè)翼選擇元件的組合使EGFP表達(dá)水平增加大約7倍。很明顯，把UCOE和選擇標(biāo)記置于表達(dá)的轉(zhuǎn)基因側(cè)翼對(duì)表達(dá)水平的提升是必需的。
這種效果并不局限于特定的選擇標(biāo)記。圖7比較了可操作地連接在人RNP UCOE 5’端和5’(CET745)或3’(CET741)放置弗氏鏈霉菌(S.fradiae)新霉素抗性基因的EGFP的表達(dá)。這幾乎是已經(jīng)高表達(dá)水平的2倍。
實(shí)施例2其他3’側(cè)翼選擇標(biāo)記的有效性結(jié)果圖5所示為將5’人RNP UCOE和各種不同的3’側(cè)翼抗生素抗性基因置于EGFP轉(zhuǎn)基因側(cè)翼的效果。CET701是一個(gè)對(duì)照，它不含UCOE，但具野生型的白黑鏈霉菌(S.alboniger)的Puror。CET721既有5’UCOE又有3’Puror。CET704含有弗氏鏈霉菌(S.fradiae)的neor，但沒有UCOE，而CET741兩者均有。CET705包含吸水鏈霉菌(Shygroscopicus)的hygror，但沒有UCOE，而CET751兩者均有。CET706具有大腸桿菌的hygror，但沒有UCOE，而CET761兩者均有。CET708具有密碼子修飾的Puror，但沒有UCOE，而CET781兩者均有。在所有的情況下，3’側(cè)翼抗性基因的促進(jìn)效果是明顯的。
實(shí)施例3其他UCOE和Puro選擇元件的組合結(jié)果如圖2和圖3所示，帶有人工構(gòu)建的UCOE的可比較質(zhì)粒(CET711)的表達(dá)和帶有RNP UCOE的質(zhì)粒的表達(dá)在中值熒光和陽性細(xì)胞比例方面是相對(duì)等的。這就證明了第二個(gè)位于側(cè)翼的富含CpG元件產(chǎn)生的UCOE的效應(yīng)放大現(xiàn)象總體上是一個(gè)，并不局限于RNPUCOE和pgk/Puro元件的特定組合。圖4中對(duì)CET711和CET721表達(dá)的比較顯示，CET711中獲得一種輕微低水平的表達(dá)，但這仍比單獨(dú)使用UCOE高出至少6倍。
圖6所示的是利用鼠CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的人hnRNPUCOE(CET821)和鼠hnRNP UCOE中(CET824)獲得的同等結(jié)果。CET721包括人hnRNP UCOE而且使用人CMV啟動(dòng)子。
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其包括a.一個(gè)延伸的無甲基化CpG島b.一個(gè)被聚腺苷酸化信號(hào)終止的可表達(dá)核酸c.一個(gè)可操作地連接在啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記其中，CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接在可表達(dá)核酸上，并且這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)則位于選擇標(biāo)記近端的2000bp以內(nèi)。
2.一種分離的多核苷酸，其包括a.一個(gè)延伸的無甲基化CpG島b.一個(gè)被聚腺苷酸化信號(hào)終止的可表達(dá)核酸c.一個(gè)可操作地連接在啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記其中，CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接在可表達(dá)核酸上，并且這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)則位于選擇標(biāo)記近端的1500bp以內(nèi)。
3.一種分離的多核苷酸，其包括a.一個(gè)延伸的無甲基化CpG島b.一個(gè)被聚腺苷酸化信號(hào)終止的可表達(dá)核酸c.一個(gè)可操作地連接在啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記其中，CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接在可表達(dá)核酸上，并且這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)則位于選擇標(biāo)記近端的1000bp以內(nèi)。
4.一種分離的多核苷酸，其包括a.一個(gè)延伸的無甲基化CpG島b.一個(gè)被聚腺苷酸化信號(hào)終止的可表達(dá)核酸c.一個(gè)可操作地連接在啟動(dòng)子上的選擇標(biāo)記其中，CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接在可表達(dá)核酸上，并且這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)則位于選擇標(biāo)記近端的500bp以內(nèi)。
5.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。
6.如權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是從鏈霉菌種中獲得的。
7.如權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是嘌呤霉素抗性基因。
8.如權(quán)利要求7所述的分離的多核苷酸，其中嘌呤霉素抗性基因是來自白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因。
9.如權(quán)利要求8所述的分離的多核苷酸，其中嘌呤霉素抗性基因是來自白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)的修飾的嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因。
10.如權(quán)利要求9所述的分離的多核苷酸，其包括圖14所示的序列。
11.如權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是新霉素抗性基因。
12.如權(quán)利要求11所述的分離的多核苷酸，其中新霉素抗性基因是來自弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
13.如權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是潮霉素抗性基因。
14.如權(quán)利要求13所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是來自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
15.如權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是博來霉素抗性基因。
16.如權(quán)利要求15所述的分離的多核苷酸，其中博來霉素抗性基因是來自輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的博來霉素結(jié)合蛋白。
17.如權(quán)利要求15所述的分離的多核苷酸，其中博來霉素抗性基因是來自輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的博來霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶。
18.如權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是殺稻瘟素抗性基因。
19.如權(quán)利要求18所述的獨(dú)立的多核苷酸，其中殺稻瘟素抗性基因是來自輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillum)的殺稻瘟素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因。
20.如權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是來自大腸桿菌(Escherichia coli)的氨基環(huán)多醇磷酸轉(zhuǎn)移酶。
21.如權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其中抗生素抗性基因是來自轉(zhuǎn)座子Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
22.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中延伸的無甲基化CpG島包括一個(gè)跨越人hnRNP A2基因的8kb DNA片段。
23.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中延伸的無甲基化CpG島包括一個(gè)跨越鼠hnRNP A2基因的8kb DNA片段。
24.如權(quán)利要求23所述的分離的多核苷酸，其中延伸的無甲基化CpG島包括圖19所示序列中第1-7898位的核苷酸。
25.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中延伸的無甲基化的CpG島包含一個(gè)跨越人β-肌動(dòng)蛋白CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域的2.0kb DNA片段和一個(gè)跨越人PDCD2 CpG島/啟動(dòng)子區(qū)域的1.8kbDNA片段。
26.一種載體，其包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
27.一種載體，當(dāng)其結(jié)構(gòu)線性化并整合進(jìn)染色體時(shí)，傳遞權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
28.如權(quán)利要求26所述的載體，其中載體是游離型載體。
29.如權(quán)利要求26所述的載體，其中載體是整合型載體。
30.如權(quán)利要求26所述的載體，其中載體是質(zhì)粒。
31.如權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)所述的載體，其中可表達(dá)核酸是治療用核酸。
32.如權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)所述的載體，其中可表達(dá)核酸編碼一種在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白。
33.一種載體，其包括a.一個(gè)延伸的無甲基化CpG島b.一個(gè)多克隆位點(diǎn)c.一個(gè)獲自鏈霉菌種的抗生素抗性基因其中，CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接在可表達(dá)核酸上，并且這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，多克隆位點(diǎn)，選擇標(biāo)記，而多克隆位點(diǎn)則位于選擇標(biāo)記近端的2000bp以內(nèi)。
34.如權(quán)利要求33所述的載體，其中多克隆位點(diǎn)進(jìn)一步可操作地連接在啟動(dòng)子上。
35.如權(quán)利要求34所述的載體，其中所述的啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒立即/早期啟動(dòng)子。
36.如權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)所述的載體，其包括圖10所示序列中第1-10551位的核苷酸。
37.載體CET710。
38.如權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)所述的載體，其包括圖12所示序列中第1-13545位的核苷酸。
39.載體CET720。
40.載體CET740。
41.載體CET760。
42.載體CET780。
43.載體CET820。
44.載體CET823。
45.一種載體，其含有圖21所示序列中第1-12039位的核苷酸。
46.載體CET1010。
47.一種載體，其含有圖23所示序列中第1-11646位的核苷酸。
48.載體CET1020。
49.一種載體，其含有圖25所示序列中第1-9027位的核苷酸。
50.載體CET1030。
51.一種載體，其含有圖27所示序列中第1-12221位的核苷酸。
52.載體CET1110。
53.一種載體，其含有圖29所示序列中第1-11828位的核苷酸。
54.載體CET1120。
55.一種載體，其含有圖3 1所示序列中第1-9209位的核苷酸。
56.載體CET1130。
57.一種宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求26-56中任一項(xiàng)所述的載體。
58.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，如權(quán)利要求26-56所述的載體，或如權(quán)利要求57所述的宿主細(xì)胞在獲得可表達(dá)核酸的表達(dá)中的應(yīng)用。
59.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，如權(quán)利要求26-56所述的載體，或如權(quán)利要求57所述的宿主細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得所需基因產(chǎn)物的表達(dá)中的應(yīng)用。
60.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，如權(quán)利要求26-56所述的載體，或權(quán)利要求57所述的宿主細(xì)胞在治療中的應(yīng)用。
61.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，如權(quán)利要求26-56所述的載體，或權(quán)利要求57所述的宿主細(xì)胞在制備用于基因治療的組合物中的應(yīng)用。
62.一種治療方法，其包括給需要這種治療的病人施用藥物有效量的如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，如權(quán)利要求26-56所述的載體，或如權(quán)利要求57所述的宿主細(xì)胞。
63.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，如權(quán)利要求26-56所述的載體，或如權(quán)利要求57所述的宿主細(xì)胞，與可藥用賦形劑組合。
64.一種非人的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其包含人工導(dǎo)入的延伸的無甲基化CpG島元件和人工導(dǎo)入的選擇標(biāo)記，其中CpG島和選擇標(biāo)記均可操作地連接在可表達(dá)核酸上，并且這些成分按可表達(dá)核酸有義鏈的5’-3’方向依次放置延伸的無甲基化CpG島，可表達(dá)核酸，選擇標(biāo)記，而可表達(dá)核酸3’端的聚腺苷酸化信號(hào)則位于選擇標(biāo)記近端2000bp以內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了包括被5’端延伸的無甲基化CpG島和3’端選擇標(biāo)記置于側(cè)翼的可表達(dá)核酸的多核苷酸和載體。這種多核苷酸和載體提供了獲得側(cè)翼可表達(dá)核酸高水平表達(dá)的工具。優(yōu)選的實(shí)施方案包括5’端延伸的無甲基化CpG島和3’端抗生素抗性基因的組合。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1500147SQ02807711
公開日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月5日
發(fā)明者斯蒂芬·杰蘭特·威廉斯, 羅伯特·拉克倫·克龍比, 拉克倫 克龍比, 斯蒂芬 杰蘭特 威廉斯 申請(qǐng)人:Ml實(shí)驗(yàn)室公開有限公司