專利名稱：具有免疫增強(qiáng)特性的粘蛋白肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有免疫增強(qiáng)特性的粘蛋白肽(mucin peptide)，包含該肽的藥物組合物，以及治療或預(yù)防癌癥的方法。
背景技術(shù)：
MUC1基因在正常的上皮細(xì)胞和多種人類癌癥中被表達(dá)，在乳腺腫瘤中所表達(dá)的水平非常高(1)。這種基因的主要產(chǎn)物是一種多態(tài)型1跨膜分子，其包含有一個大的，多糖基化的細(xì)胞外區(qū)域，一個跨膜區(qū)和一個含72個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)尾巴(2)。
這種多態(tài)性主要來自于存在于細(xì)胞外區(qū)域的20個氨基酸串聯(lián)重復(fù)單元的數(shù)目變化。已發(fā)現(xiàn)一種分泌型MUC1同種型(isoform)(MUC1/sec)(3)，其包括內(nèi)含子2的序列，并在內(nèi)含子的中止密碼子處永久性終止，因此可缺少跨膜區(qū)。
MUC1及其片段和衍生物已經(jīng)被廣泛地用于抗癌疫苗和癌癥治療的研究中。U.S.Pat.No.6,344,203公開了模擬MUC1的肽及將其結(jié)合到IB4植物血凝素和抗-Gal.alpha.(1，3)Gal抗體中，以用于癌癥疫苗中。這些肽偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體，如破傷風(fēng)類毒素，白喉類毒素或氧化的KLH上，用以刺激T細(xì)胞。
U.S.Pat.No.5,827,666公開了一種合成的MUC1肽，它包括MUC1的20-氨基酸串聯(lián)的至少兩個重復(fù)，其能夠在沒有糖基化的情況下，獲得其天然結(jié)構(gòu)。表明該合成肽可被用于包括抗原決定基的氨基酸序列的疫苗及其它物質(zhì)中。U.S.Pat.No.5,989,552公開了一種MUC1多肽或其串聯(lián)重復(fù)和氧化的甘露聚糖的偶聯(lián)物被用于免疫治療中。
U.S.Pat.No.6,080,725公開了皂甙類似物佐劑可與MUC1及其肽片段用于疫苗中，該MUC1及其肽片段作為腫瘤相關(guān)抗原。
公開的U.S.專利申請20020009759，200020012931，20020022235和20010051351中描述了MUC1被用作癌癥細(xì)胞的決定簇或標(biāo)記物。
在上述公開物中，MUC1及其片段和模擬物被用作或被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)抗原而被用于疫苗或免疫組合物中，或被用作診斷測試的標(biāo)記物。
本發(fā)明的意料之外的發(fā)現(xiàn)是，一種不同的MUC1分泌的同種型具有佐劑的性質(zhì)，并因此具有與抗原不同的免疫增強(qiáng)性質(zhì)。
發(fā)明概述一種含有氨基酸序列VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)的肽及其類似物和衍生物，表現(xiàn)出在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)活性。這樣的肽和編碼它們的核酸(如，RNA，DNA)可被用作佐劑來刺激或增強(qiáng)動物或人體內(nèi)的免疫應(yīng)答，可通過本領(lǐng)域已知的體液或細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)檢測。例如，可使抗體的產(chǎn)生得到增強(qiáng)，可溶性免疫調(diào)節(jié)子(如，細(xì)胞因子)的分泌，抗原的呈遞、效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生或發(fā)揮功能(如，細(xì)胞毒性)，以及其它已知的免疫反應(yīng)方法、或其結(jié)合來顯示功效。尤其是，肽或核酸可被用作疫苗佐劑來增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)，以誘導(dǎo)體內(nèi)和/或體外細(xì)胞因子的生成，作為一個或多個細(xì)胞亞群的促細(xì)胞分裂劑，或增強(qiáng)細(xì)胞毒性。本發(fā)明的一個目的就是提供一種新型的免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)分子。
為了刺激或增強(qiáng)一種抗原特異性的免疫反應(yīng)，該肽可與抗原(如，一種腫瘤抗原或一種來源于傳染性物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、原生動物、真菌、霉菌或酵母菌的抗原)一起混合到疫苗制劑中或被偶聯(lián)到抗原上應(yīng)用。核酸可以與抗原和/或編碼抗原的表達(dá)載體一起整合至基因疫苗的制劑中；或一種編碼VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)的核苷酸序列，或其類似物或衍生物也包含在與編碼抗原的一個區(qū)域相接合的或與該區(qū)域顯著不同的表達(dá)載體上。該疫苗制劑的成分還包含諸如其它佐劑和/或細(xì)胞因子。因此，組合物可被混合至細(xì)胞內(nèi)的，無細(xì)胞的，分次或純化的，重組的、基于蛋白質(zhì)的、或“裸露的DNA”疫苗中。
可以治療的腫瘤類型包括，但不限于，肉瘤和癌。例如，癌癥如白血病、淋巴瘤、或腦癌都可以被治療。通常，本發(fā)明可使任何基于抗體或其它的免疫治療得以增強(qiáng)。
本發(fā)明提供了有效的和低毒的佐劑替代物來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。它是在能夠滿足醫(yī)用或獸醫(yī)治療為目的的生物品的標(biāo)準(zhǔn)條件下制備的，并與用于治療和預(yù)防的制劑是生物相容的。
本發(fā)明所用的術(shù)語“肽”“多肽”和“蛋白質(zhì)”可以相互轉(zhuǎn)變，每一種都指天然存在的氨基酸的序列。通常，“肽”是指少于20個氨基酸殘基的序列，“多肽”是指20個或更多個氨基酸殘基的序列，本發(fā)明所用的多肽也包括蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽、多肽或蛋白質(zhì)包含11至200個氨基酸殘基，更優(yōu)選為11至100個殘基，再更優(yōu)選為11至50個殘基，最優(yōu)選為11，12，13，14，15，16，17，18，19或20個殘基。
如本發(fā)明所用，術(shù)語“分離”是指物質(zhì)從其原始的環(huán)境中被取出(如，天然存在的物質(zhì)從其自然環(huán)境中被取出)。這樣的物質(zhì)能作為載體的部分或作為一種組合物，或能在細(xì)胞內(nèi)獲得，如果上述載體、組合物或細(xì)胞不是物質(zhì)的原始環(huán)境。
本發(fā)明的一個目的是提供一種被分離肽，多肽或蛋白質(zhì)，它包含氨基酸序列VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)，或其類似物或衍生物。本發(fā)明的肽具有免疫增強(qiáng)特性并能夠用于藥物組合物和疫苗中。
本發(fā)明使用的術(shù)語“類似物”是指具有相同或相似功能性質(zhì)(即，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用)的序列變體。這樣的變體可以具有一個或幾個(2-3)替代的氨基酸殘基，優(yōu)選為保守性替代，以使變體保持“母體化合物”的免疫調(diào)節(jié)特性。
本發(fā)明使用的“衍生物”是指一種肽、多肽或蛋白質(zhì)，它包含添加了至少了一個附加基團(tuán)而修飾的序列VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)，并仍保持母體化合物的免疫調(diào)節(jié)能力的特性。在一個優(yōu)選的實施例中，衍生物包括一個KLH分子，其上偶聯(lián)了多拷貝的本發(fā)明的肽。該衍生物也可以是連接了本發(fā)明的肽、多肽、或蛋白質(zhì)的抗原。衍生物的其他實例包括，但不限于，偶聯(lián)了多拷貝的肽的OVA和BSA。該肽也可以純品形式使用。本發(fā)明的肽、多肽或蛋白質(zhì)可以以常規(guī)的化學(xué)合成或DNA重組技術(shù)的方法制備。例如，將編碼多肽的DNA片段轉(zhuǎn)化至宿主微生物中，然后從培養(yǎng)物中收集多肽。宿主微生物可以是，如細(xì)菌、酵母菌、病毒的載體或哺乳動物細(xì)胞，其中所述的DNA片段被整合到宿主微生物的基因組中，或被插入至合適的表達(dá)載體中通過宿主微生物復(fù)制。將DNA片段放置在由含有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號的區(qū)域所控制的位置。多肽的制備采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種核酸，該核酸編碼本發(fā)明的肽、多肽或蛋白質(zhì)，或其衍生物或類似物。本發(fā)明的核酸可以重組地、合成地或通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的方法制備，并可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)被克隆。在這個方面，本發(fā)明也包括一種包含本發(fā)明核酸的載體，和一種包括本發(fā)明核酸的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明使用的術(shù)語“核酸”，“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA，DNA，或RAN/DNA雜交序列，并且它們在其中一個單鏈或雙鏈上具有一個以上的核苷酸，這些術(shù)語可以相互轉(zhuǎn)換使用。
本發(fā)明使用的術(shù)語“互補(bǔ)”或“其互補(bǔ)體”是指多核苷酸序列，其在整個互補(bǔ)區(qū)能形成與另一個特定的多核苷酸配對的Watson & Crick堿基。該術(shù)語用于僅根據(jù)其序列的多核苷酸對，而不是指任何特定條件下兩個多核苷酸都能夠結(jié)合的情況。
本發(fā)明還包括一種免疫性的藥物組合物，其包括本發(fā)明的肽或多肽，或其類似物或衍生物，以及可藥用的賦型劑或載體。在一個優(yōu)選實施例中，藥物組合物包括至少一種抗原，優(yōu)選為腫瘤抗原。腫瘤抗原包括，如自體腫瘤細(xì)胞、同種異體腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)糖苷、胚胎性癌抗原、前列腺特異性抗原、黑素瘤相關(guān)的抗原和p53以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的腫瘤抗原。其它可用于本發(fā)明的抗原包括病毒抗原，如來源于乳頭狀瘤病毒、B型和C型肝炎病毒、HIV和HTLV-1以及細(xì)菌及其它感染性微生物如M.Tuberculosis的抗原。
本發(fā)明還包括一種疫苗，和一種誘導(dǎo)或加強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。在一個優(yōu)選實施例中，疫苗包括一種本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)肽或多肽，或其類似物或衍生物，一種抗原、一種藥學(xué)可接受的賦型劑或載體。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，抗原為腫瘤抗原。
疫苗的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的并被廣泛描述在技術(shù)文獻(xiàn)中(見，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，17thed.，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，USA)。
本發(fā)明的免疫性藥物組合物或疫苗也可包括一種或多種附加的佐劑，如BCG，KLH，IL-2，GM-CSF和環(huán)磷酰胺(cytoxan)，其可選擇性地與本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)肽或多肽相連接。在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)肽與馬來酰胺活化的KLH偶聯(lián)。依據(jù)與肽結(jié)合的佐劑采用一些本領(lǐng)域已知的連接鍵。通常的形式有R-HNCO-X或R-HCNO-X，其中R＝佐劑，X＝肽。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種預(yù)防或治療疾病或失調(diào)的方法，其是通過施用安全且有效劑量的本發(fā)明的疫苗或藥物組合物而進(jìn)行的。本發(fā)明的藥物組合物和疫苗的安全且有效的劑量可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)適當(dāng)?shù)膶嶒灦_定。安全和有效的劑量被認(rèn)為是在受試體使用該劑量可以產(chǎn)生有益的免疫應(yīng)答效果，并且不會產(chǎn)生本領(lǐng)域技術(shù)人員不可接受的副作用的劑量?？梢灶I(lǐng)會到，任何這樣的副作用一定會與本發(fā)明的治療療效，可選擇的治療方法，和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的因素相抵消。在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療腫瘤尤其是癌性瘤的方法。


圖1在注入106未轉(zhuǎn)染的DA-3乳腺腫瘤細(xì)胞，或只用新霉素載體轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/neo)，或用跨膜MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/TM)，或用分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/sec)后，純系BALB/c小鼠的存活率。
圖2未轉(zhuǎn)染的DA-3乳腺腫瘤細(xì)胞或只用新霉素載體轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/neo)，或用跨膜MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/TM)，或用分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/sec)的體外生長動力學(xué)特征。
圖3注入106未轉(zhuǎn)染的DA-3乳腺腫瘤細(xì)胞(DA-3/neo)，或只用新霉素載體轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/neo)，或用跨膜MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/TM)，或用分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/sec)后，BALB/c(nu+nu+)小鼠中的腫瘤生長。
圖4接種106未轉(zhuǎn)染的DA-3乳腺腫瘤細(xì)胞(DA-3/neo)，或只用新霉素載體轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/neo)，或用跨膜MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/TM)，或用分泌型MUC1同種型的三個單獨(dú)的轉(zhuǎn)染子轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/sec)接種后，BALB/c裸鼠中的腫瘤生長。
圖5用分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/sec)接種，對于跨膜MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/TM)和DA-3/sec細(xì)胞的混合物在BALB/c小鼠中生長的作用。
圖6接種分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/sec)對于新霉素載體轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/neo)和DA-3/sec細(xì)胞的混合物在BALB/c小鼠中生長的作用。
圖7接種分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3乳腺腫瘤細(xì)胞(DA-3/sec)對于RENCA腎細(xì)胞癌和DA-3/sec細(xì)胞的混合物在BALB/c小鼠中生長的作用。
圖8接種分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3乳腺腫瘤細(xì)胞(DA-3/sec)對于K7骨瘤細(xì)胞和DA-3/sec乳腺腫瘤細(xì)胞的混合物在BALB/c小鼠中生長的作用。
圖9人跨膜MUC1(MUC1/TM)和人分泌MUC1(MUC1/sec)同種型的cDNAs示意圖。
圖10肽免疫。用分泌型的人MUC1同種型的獨(dú)特的11個氨基酸肽與KLH的偶聯(lián)物來接種，它對偶聯(lián)獨(dú)特肽的KLH與只用新霉素載體轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞(DA-3/neo)或跨膜MUC1同種型(DA-3/TM)轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞的混合物的生長作用。
圖11A和11B用分泌型的人MUC1同種型的獨(dú)特的氨基酸肽與KLH的偶聯(lián)物來接種，對于偶聯(lián)獨(dú)特氨基酸肽的KLH和BALB/c小鼠中的RENCA腫瘤細(xì)胞(11A)或C57/BL6小鼠中Lewis肺癌細(xì)胞(11B)的混合物的生長作用。該圖表明MUC1/sec肽的免疫接種效果不受菌株限制。
圖12施用含有較低數(shù)量的可產(chǎn)生抗體的抗原細(xì)胞(DA-3/TM)和DA-3/sec細(xì)胞的混合物對于腫瘤生長的影響。該圖顯示了在沒有接種疫苗時，較低數(shù)量的可產(chǎn)生抗體的抗原細(xì)胞能夠產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。
圖13注射DA-3/sec的小鼠脾細(xì)胞對于DA-3腫瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
圖14穿孔素抑制劑concanamycin A對于DA-3/sec脾細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。該圖顯示了穿孔素通過活化的脾細(xì)胞介導(dǎo)DA-3/sec腫瘤細(xì)胞的溶解。
圖15抗-Fas抗體作用于DA-3/sec活化的脾細(xì)胞相對于DA-3/sec靶體和陽性對照的細(xì)胞毒性效果。該圖顯示Fas/FasL在DA-3/sec的細(xì)胞毒性中不起作用。
圖16體內(nèi)注入DA-3/sec對抑制YAC-1靶體的典型NK活性的影響。該圖顯示了體內(nèi)注入DA-3/sec導(dǎo)致更強(qiáng)的抑制YAC-1靶體的典型NK活性。
圖17A和17B。MUC1/sec肽對于體外(17A)和體內(nèi)(17B)含有的D1-DMBA-3腫瘤的免疫應(yīng)答的影響。該圖顯示了MUC1/sec肽刺激了含有D1-DMBA-3腫瘤的免疫應(yīng)答。
圖18A和18B。含有和不含MUC1/sec肽的正常BALB/c腎細(xì)胞對于YAC-1(18A)和EL-4(18B)靶細(xì)胞的影響。該圖顯示了MUC1/sec肽活化正常的BALB/c腎細(xì)胞而殺死多種靶體。
圖19A和19B。含有和不含MUC1/sec肽的不同種類小鼠的正常腎細(xì)胞對于DA-3/sec腫瘤細(xì)胞的溶解作用。該圖顯示了在MUC1/sec肽存在時，正常的腎細(xì)胞能殺死DA-3/sec腫瘤細(xì)胞。
發(fā)明詳述為了用一種確定的腫瘤抗原研究乳腺腫瘤的免疫應(yīng)答，將跨膜MUC1同種型(DA-3/TM)、分泌型(DA-3/sec)，或單獨(dú)的新酶素載體(DA-3/neo)轉(zhuǎn)染至DA-3細(xì)胞中，該細(xì)胞是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移損害以及BALB/c小鼠宿主死亡的乳腺腫瘤細(xì)胞系。MUC1分泌型的轉(zhuǎn)染使DA-3細(xì)胞不能在純系BALB/c小鼠中生長，但是能在BALB/c裸鼠中生長。用DA-3/sec細(xì)胞進(jìn)行免疫接種可以激發(fā)對DA-3/TM或DA-3/neo細(xì)胞的免疫應(yīng)答，而且抑制BALB/c的同源小鼠中的兩種不相關(guān)的腫瘤。結(jié)果顯示在分泌型MUC1同種型中存在一種獨(dú)特的11個氨基酸的肽，其具有保護(hù)作用并可用作免疫增強(qiáng)分子。
材料和方法小鼠和腫瘤。純系BALB/c小鼠在University of Miami School of Medicine的實驗室通過兄弟-姐妹交配的方法繁衍。BALB/c un+/nu+從Taconic Labs中購得。DA-3腫瘤細(xì)胞系是從BALB/c小鼠(4)同源的D1-DMBA-3體內(nèi)的乳腺腫瘤中得到的。DA-3細(xì)胞在BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤并引起肺部轉(zhuǎn)移損傷。該細(xì)胞系在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基還補(bǔ)充有5％FCS(胎牛血清)、100U青霉素、100μg/ml鏈霉素、5×10-5M 2-β-巰基乙醇(2-BME)、2mM L-谷胺酰胺、1％非必需氨基酸、1％必需氨基酸和1％丙酮酸鈉(所有都來自GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)，并通過連續(xù)的傳代延續(xù)。通過常規(guī)的鱟魚阿米巴狀細(xì)胞自溶(Limulus amebocyte lysate(Pyrogent R plus；Whittaker M.A.Bioproducts，Inc.，Walkersville，MD))方法測定這些細(xì)胞沒有內(nèi)毒素。
肽片段和抗體的制備。使用稱為H23的單克隆抗體來檢測MUC1/TM和MUC1/sec中都常見的串聯(lián)重復(fù)序列。通過含有MUC1/sec的特定肽VSIGLSFMLP(SEQ ID NO)與馬來酰胺活化的鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)偶聯(lián)來免疫雞制得抗體1709(Aves Labs，Tigard，OR)。游離肽的濃度以及每分子KLH至少結(jié)合150個肽分子的偶聯(lián)物被用于免疫中。免疫前IgY抗體是從免疫前的雞蛋中制得的。
DA-3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。表達(dá)MUC1同種型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體是通過具有MUC1/TM或分泌型MUC1/sec cDNA的表達(dá)質(zhì)粒與新霉素質(zhì)粒(pSV2 neo)選擇標(biāo)記物共同轉(zhuǎn)染至DA-3小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞中而得到的。作為對照，用空質(zhì)粒和選擇耐受新霉素的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
體內(nèi)腫瘤的生長。清洗DA-3母細(xì)胞及新霉素對照和MUC1同種型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并計數(shù)，將106個細(xì)胞皮下注射(s.c.)至同源的BALB/c純系小鼠或un+/nu+裸鼠中。每隔2-3天監(jiān)控腫瘤的生長，當(dāng)小鼠的腫瘤大小用標(biāo)尺測量＞10mm時，為腫瘤陽性。
疫苗免疫方案。用106個DA-3/sec腫瘤細(xì)胞的生理鹽水溶液免疫BALB/c小鼠兩次或三次，每次間隔兩個星期。在最后一次免疫的兩個星期后，用DA-3細(xì)胞對動物進(jìn)行免疫激發(fā)，該DA-3細(xì)胞是未轉(zhuǎn)染的或單獨(dú)用新霉素載體轉(zhuǎn)染或與MUC1跨膜同種型一起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在一些實驗中，進(jìn)行免疫激發(fā)的腫瘤是腎細(xì)胞瘤、RENCA或骨瘤K7。每次將106個腫瘤細(xì)胞與106個DA-3/sec細(xì)胞混合以激發(fā)免疫應(yīng)答。
在其它研究中，存在于分泌型MUC1同種型中獨(dú)特的11個氨基酸肽是由Aves Labs，Inc.(Tigard，OR)合成的，并偶聯(lián)到KLH上。由于在每次合成中，肽和KLH的確切比率會不同，因而需要使制備規(guī)格化以使每次能以相同量施用。KLH肽作為疫苗時，間隔兩個星期使用。第一次免疫BALB/c小鼠時，給予50μg肽和完全的福氏佐劑。兩個星期后，給予25μg肽和不完全的福氏佐劑。兩個星期后，用含有25μg肽且沒有佐劑的106個DA-3c細(xì)胞或DA-3/neo細(xì)胞來激發(fā)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
在所有的研究中，未免疫的小鼠給予和試驗組相同的腫瘤激發(fā)，來作為對照。每兩天或三天監(jiān)控腫瘤生長并用標(biāo)尺測量腫瘤大小。
實施例1如材料和方法中所描述，將人MUC1的跨膜或分泌同種型轉(zhuǎn)染至DA-3乳腺腫瘤細(xì)胞。用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列的特異性H23抗體對存在該序列的細(xì)胞進(jìn)行染色以證明轉(zhuǎn)染成功(5)。將得到的細(xì)胞系用于體內(nèi)試驗以確定在BALB/c小鼠中腫瘤的發(fā)生和時間。如表1所示，將DA-3，DA-3/neo和DA-3/TM乳腺腫瘤細(xì)胞植入小鼠中，可產(chǎn)生明顯的腫瘤，腫瘤在7天和15天的大小基本相同，且所有動物都具有類似大小的腫瘤。
表1 BALB/c小鼠中腫瘤的發(fā)生和時間

令人驚異的是，用MUC1分泌型(DA-3/sec)轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞不會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。從圖1可以明顯的看出，這些動物甚至在植入該類細(xì)胞12個多月后仍沒有腫瘤，而植入其它三種類型的DA-3細(xì)胞的動物都不能存活100天。應(yīng)該指出的是，每次以高達(dá)1×107的濃度給小鼠植入DA-3/sec腫瘤細(xì)胞，都沒有觀察到腫瘤產(chǎn)生。
實施例2這樣結(jié)果的一個解釋是轉(zhuǎn)染過程選擇性地減弱了DA-3/sec細(xì)胞的基本生長能力。為了檢驗這種可能，我們研究了DA-3腫瘤細(xì)胞的四種類型的體外生長特性。如圖2所示，母細(xì)胞系和所有轉(zhuǎn)染體的生長在體外都具有相似的動力學(xué)特征。事實上，DA-3/sec細(xì)胞似乎比其它細(xì)胞系繁殖得更好，顯示了這些細(xì)胞體外生長能力并沒有由于轉(zhuǎn)染處理而被改變。
實施例3
為了確定DA-3/sec細(xì)胞在體內(nèi)是否失去了產(chǎn)生腫瘤的能力，將四種DA-3細(xì)胞系都植入un+/nu+BALB/c小鼠中，測量腫瘤出現(xiàn)的幾率和不同時間的腫瘤大小。圖3顯示了將DA-3，DA-3/neo，和DA-3/TM細(xì)胞植入BALB/c裸鼠7天后就導(dǎo)致產(chǎn)生明顯的腫瘤，而且腫瘤的生長與在純系BALB/c動物中生長的方式相似。與表1和圖1的結(jié)果形成對比，DA-3/sec腫瘤細(xì)胞在14天時，使30％的裸鼠產(chǎn)生腫瘤，在25天時，使所有的動物都產(chǎn)生腫瘤。因此，在純系BALB/c小鼠中植入DA-3/sec細(xì)胞而沒有產(chǎn)生腫瘤，這似乎是免疫性原因而控制的結(jié)果。因為將這種腫瘤植入裸鼠中，盡管有些腫瘤出現(xiàn)的時間較晚，但它能導(dǎo)致100％的小鼠產(chǎn)生腫瘤。用帶有分泌型MUC1的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染其它兩種DA-3腫瘤細(xì)胞，該腫瘤細(xì)胞重復(fù)了同樣的結(jié)果。如表2所示，用MUC1/sec基因分別轉(zhuǎn)染的那三種DA-3細(xì)胞都不能在純系BALB/c小鼠中產(chǎn)生腫瘤。
表2不同的DA-3/sec轉(zhuǎn)染體在BALB/c小鼠中產(chǎn)生腫瘤的幾率轉(zhuǎn)染體 幾率DA-3/neo 6/6DA-3/TM6/6DA-3/sec 0/6DA-3/sec 110/14DA-3/sec 220/11圖4顯示了三種不同的DA-3/sec細(xì)胞轉(zhuǎn)染體，即DA-3/sec，DA-3/secll，和DA-3/sec22，都能夠在BALB/c裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤，只是在免疫缺陷的小鼠中，其各自的生長動力學(xué)特征略有不同。有趣的是，當(dāng)DA-3/sec腫瘤被植入至免疫純系BALB/c小鼠中時，能夠在BALB/c裸鼠中生長的DA-3/sec腫瘤卻不生長了，但是當(dāng)接種至其它BALB/c裸動物中時腫瘤仍然生長(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這些實驗結(jié)果提示了T細(xì)胞或至少是另一種非T細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞參與控制了用MUC1分泌型轉(zhuǎn)染的腫瘤生長。
實施例4我們評價了將DA-3/sec細(xì)胞植入BALB/c小鼠中是否能夠提供對于其它表達(dá)MUC1的腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用。不表達(dá)粘蛋白的DA-3細(xì)胞(DA-3/neo)也包含在本研究中。在單獨(dú)給予1×106的DA-3/TM細(xì)胞或DA-3/neo細(xì)胞，或與DA-3/sec細(xì)胞相混合進(jìn)行免疫激發(fā)反應(yīng)之前，實驗組間隔1周接受兩次或三次注射1×106的DA-3/sec細(xì)胞。作為對照，沒有接種疫苗的動物用DA-3/neo或DA-3/TM細(xì)胞來激發(fā)免疫。接受兩次未混合的DA-3/sec(106細(xì)胞)注射的動物，當(dāng)僅用DA-3/TM細(xì)胞來激發(fā)免疫反應(yīng)時，只是引起腫瘤出現(xiàn)的短時間的延遲，即13/22動物在兩周時出現(xiàn)腫瘤，而對照組13/14動物在一周時出現(xiàn)腫瘤。在激發(fā)免疫應(yīng)答之前接受了三次注射106DA-3/sec細(xì)胞的小鼠，與未接種的對照組相比，不僅異想不到地延遲了DA-3/TM細(xì)胞的生長，而且延遲了DA-3/neo細(xì)胞的生長。明顯地，當(dāng)用于激發(fā)的DA-3/TM腫瘤細(xì)胞在植入的時候就與DA-3/sec細(xì)胞混合(圖5)，與對照組相比，其不僅延遲了腫瘤出現(xiàn)的時間，而且產(chǎn)生了實質(zhì)性保護(hù)，導(dǎo)致50％接種后的小鼠沒有出現(xiàn)DA-3/TM腫瘤細(xì)胞的生長。此外，由于MUC1分子的識別，這種保護(hù)作用沒有出現(xiàn)，因為在免疫接種DA-3/sec細(xì)胞并且用DA-3/neo和DA-3/sec乳腺腫瘤細(xì)胞混合物進(jìn)行免疫激發(fā)的動物中能夠看到類似的效果。
實施例5除了在DA-3乳腺腫瘤的環(huán)境下的研究以外，本發(fā)明還進(jìn)行了進(jìn)一步的研究以確定接種DA-3/sec細(xì)胞是否能產(chǎn)生保護(hù)而不形成腫瘤。采用與BALB/c小鼠同源的兩種不相關(guān)的腫瘤，即腎細(xì)胞瘤系RENCA，和骨瘤K7細(xì)胞系。圖7顯示了給BALB/c小鼠接種兩次DA-3/sec細(xì)胞，隨后用RENCA細(xì)胞和DA-3/sec細(xì)胞的混合物進(jìn)行免疫激發(fā)，與未接種的對照組相比，其生長的腫瘤明顯減小。因為未混合的RENCA細(xì)胞的生長并沒有被減弱，因此在激發(fā)免疫應(yīng)答時，加入DA-3/sec是必要的，這對于DA-3/TM和DA-3/neo細(xì)胞的試驗也是同樣。在采用k7骨瘤細(xì)胞的實驗中可得相似的結(jié)果。如圖8所示，植入K7和DA-3/sec混合物的小鼠中的80％未接種疫苗的小鼠，在免疫激發(fā)后的21天出現(xiàn)腫瘤。然而，接種兩次106DA-3/sec乳腺腫瘤細(xì)胞的小鼠在免疫激發(fā)后延遲至40天才出現(xiàn)腫瘤，并能抑制腫瘤發(fā)展。確實，免疫激發(fā)后70天，少于50％的接種疫苗的小鼠具有腫瘤。
實施例6關(guān)于分泌型MUC1可提供保護(hù)的原因，一種可能的線索可以從MUC1跨膜和分泌型同種型的結(jié)構(gòu)分析中得到。圖9是MUC1/TM和MUC1/sec同種型的cDNAs的示意圖。CDNAs是從圖左端5’末端開始描述的。串聯(lián)重復(fù)排列由柵欄狀(barred)區(qū)域描述，編碼信號肽、跨膜區(qū)、和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的區(qū)域由SP，TM和CYT分別表示，兩種類型具有相同的陰影。MUC1/sec同種型末端的氨基酸序列是VSIGLSFPMLP(3)。重要的是，對這11個氨基酸采用高度嚴(yán)格的BLASTP 1.4.11(6)分析，發(fā)現(xiàn)大約50％與人Ly49E配體相同，但不與任何已知的蛋白質(zhì)序列相同。在較低嚴(yán)格度下，兩種Echinococcus中的谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶與分支桿菌屬leprae的假設(shè)蛋白MLCB4.30以及兩種植物種的EF hand蛋白有些相似。該肽的高度抗原性很可能由于其親水性的原因。為了確定這種肽存在于分泌型MUC1同種型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞中，將針對獨(dú)特的11個氨基酸肽的雞IgY抗體偶聯(lián)到KLH上。利用該試劑，用酶聯(lián)法(ELISA)直接檢測DA-3/sec培養(yǎng)物上清液中的肽。簡單描述該方法，4℃下，將含有0.2-10.0μg蛋白質(zhì)/ml的50μl涂覆緩沖液(coating buffer)或無血清培養(yǎng)物的組織培養(yǎng)上清液在培養(yǎng)板上放置過夜。加入封閉液在37℃放置1個小時，清洗培養(yǎng)板3次，將第一抗體孵育1個小時或過夜；清洗3次；如果需要，加入第二抗體，保持1個小時，清洗3次；加入顯影溶液；孵育并讀數(shù)。在所有測試中，用已知濃度的純化的肽作陽性對照。所有測試的培養(yǎng)物對于該分子都呈陽性(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例7進(jìn)行實驗，來評價用這種肽接種可能產(chǎn)生的有益效果(圖10)。無論佐劑是否存在，接受DA-3/TM或DA-3/neo細(xì)胞(106細(xì)胞)注射的對照小鼠都100％導(dǎo)致腫瘤生長。實驗小鼠是在間隔8天接受具有佐劑的KLH-獨(dú)特肽的偶聯(lián)物兩次注射。在第二次注射后的8天，用KLH結(jié)合肽和腫瘤細(xì)胞的混合物激發(fā)動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。用肽和DA-3/TM細(xì)胞混合物激發(fā)免疫應(yīng)答導(dǎo)致12只小鼠中有7只有腫瘤產(chǎn)生，還有一只在4個星期時產(chǎn)生腫瘤。用KLH結(jié)合肽和DA-3/neo細(xì)胞混合物激發(fā)接種后的小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，能夠?qū)Ω嘈∈筇峁┍Ｗo(hù)，只有40％的動物產(chǎn)生腫瘤，還有一只小鼠在一個月后才出現(xiàn)腫瘤。重要的是，存活的動物在用DA-3/TM或DA-3/neo細(xì)胞激發(fā)免疫應(yīng)答后的6個月都沒有腫瘤存在的跡象。
實施例8在進(jìn)一步的研究中，在其它兩種腫瘤中評價接種肽疫苗的效果。從圖11A可以看出，將RENCA細(xì)胞植入BALB/c小鼠時，只有很弱的保護(hù)作用并且使腫瘤的出現(xiàn)延后。重要的是，如圖11B所示，將KLH與免疫增強(qiáng)肽的偶聯(lián)物用于另一小鼠種(C57/BL6小鼠)，并用攻擊性很強(qiáng)的Lewis肺腫瘤進(jìn)行免疫激發(fā)時，也觀察到了保護(hù)作用。
實施例9為了確定混合有DA-3/sec細(xì)胞的低數(shù)量的激發(fā)免疫應(yīng)答細(xì)胞是否能夠避免預(yù)先接種后者DA-3/sec細(xì)胞的必要性，其中該預(yù)先接種是為了抑制腫瘤生長，將5×105DA-3/TM細(xì)胞與等量的DA-3/sec細(xì)胞混合，注入小鼠中。如圖12所示，在沒有提前接種疫苗的情況下，這種治療使60％小鼠的腫瘤生長得到了抑制。
實施例10為了確定何種效應(yīng)細(xì)胞參與抑制DA-3/sec腫瘤細(xì)胞生長，取兩個星期前接種DA-3/sec腫瘤細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞，進(jìn)行51Cr標(biāo)記的細(xì)胞毒性測定。在絲裂霉素處理過的2×105-2×106個DA-3/sec細(xì)胞C(MMC)存在下，培養(yǎng)10×106個脾細(xì)胞5天。被DA-3/sec初次激活的脾細(xì)胞顯示了很強(qiáng)的抑制DA-3/sec細(xì)胞的活性(圖13)。被DA-3/sec初次激活的脾細(xì)胞對于DA-3/TM，DA-3/neo和DA-3靶體顯示了低水平的抑制作用。這些結(jié)果顯示了在DA-3/sec的刺激下，淋巴細(xì)胞在體外出現(xiàn)增長，且對DA-3/sec靶體具有有效的抑制功能。
實施例11免疫系統(tǒng)的細(xì)胞具有多種殺傷機(jī)制，其包括Fas-Fas配體相互作用(7)和穿孔素-granzyme介導(dǎo)的殺傷(8)。被DA-3/sec初次激活的脾細(xì)胞用抗-Fas抗體或Concanamycin A(CMA)處理，CMA是一種液泡酸化抑制劑，其通過阻斷H+ATP酶而阻滯穿孔素介導(dǎo)的殺傷(9)。CMA以劑量依賴方式有效地阻滯DA-3/sec靶體的殺傷(圖14)，然而當(dāng)加入抗-Fas抗體時沒有觀察到細(xì)胞毒作用(圖15)。上述結(jié)果表明Fas/FasL在DA-3/sec細(xì)胞的細(xì)胞毒性中不起作用，而是通過穿孔素-granzyme途徑介導(dǎo)的。
實施例12為了確定是否體內(nèi)注入DA-3/sec細(xì)胞會導(dǎo)致更強(qiáng)的能抑制YAC-1靶細(xì)胞(一種典型的鼠科NK-靶細(xì)胞)的NK活性(10)，在實驗中，將正常的脾細(xì)胞與體內(nèi)注入DA-3/sec細(xì)胞3-10天的脾細(xì)胞相比較，比較它們誘導(dǎo)溶解的能力。如圖16所示，測試的3天前注射DA-3/sec細(xì)胞的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞對YAC-1細(xì)胞的溶解活性水平比正常小鼠的略高一些。這種NK反應(yīng)性被增強(qiáng)的現(xiàn)象在測試前10天就接種DA-3/sec細(xì)胞的小鼠中更明顯。
實施例13其它初步的研究提示了用人分泌型MUC1，而不是跨膜型轉(zhuǎn)染的DA-3細(xì)胞，無論在體內(nèi)還是體外，都會刺激效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生針對DA-3/sec細(xì)胞的反應(yīng)。如上所述，在MUC1/sec蛋白的C-末端存在一獨(dú)特的11個氨基酸肽，但在MUC1/TM蛋白質(zhì)上沒有該肽。根據(jù)這種肽制備了一種合成肽(稱為“免疫增強(qiáng)肽”，或IEP)，并用于免疫實驗中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有抑制DA-3，DA-3/neo，DA-3/TM，K7骨瘤，RENCA和Lewis肺癌細(xì)胞的作用。我們研究了該肽對細(xì)胞毒反應(yīng)的可能的效果。測試時，采用另一種腫瘤模型，即帶有D1-DMBA-3乳腺腫瘤的小鼠。DA-3細(xì)胞系最初來自于這種腫瘤，該細(xì)胞在同源的BALB/c小鼠體內(nèi)按常規(guī)方式在實驗室傳代。從圖17可以看出，在正常小鼠的脾細(xì)胞或具有D1-DMBA-3腫瘤的小鼠脾細(xì)胞體外加入MUC1/sec獨(dú)特的肽，5天后導(dǎo)致對DA-3/sec腫瘤靶體的顯著細(xì)胞毒作用。重要的是，在接種疫苗的方案與上述方案類似的情況下，表現(xiàn)出明顯的抑制D1-DMBA-3腫瘤生長的作用。在NK細(xì)胞中進(jìn)行該肽刺激免疫細(xì)胞能力的測試。根據(jù)DA-3/sec腫瘤在裸鼠的最初生長階段就被抑制的現(xiàn)象來選擇測定方法，其提示了固有的免疫能力可能參與了抑制DA-3/sec的直接反應(yīng)。因此，為了檢測免疫增強(qiáng)肽(IEP)的免疫調(diào)節(jié)活性，BALB/c脾細(xì)胞用10μg IEP預(yù)處理30-45分鐘，然后加入鉻標(biāo)記的YAC-1或EL-4靶體，進(jìn)行如上所述的4-小時測試(11)。如圖18所示，加入肽導(dǎo)致正常脾細(xì)胞抑制典型的鼠NK-靶細(xì)胞(YAC-1)的細(xì)胞毒水平的提高。而且，當(dāng)將免疫增強(qiáng)肽注入對正常脾細(xì)胞的NK--型的細(xì)胞毒性不敏感的EL-4靶細(xì)胞后，該EL-4靶細(xì)胞易被這些效應(yīng)器溶解。在其他的實驗中，通過提前注入MUC1/sec獨(dú)特的肽，我們也能夠激活正常的BALB/c或C57BL(B6)小鼠中的脾效應(yīng)細(xì)胞以殺傷DA-3/sec靶細(xì)胞(圖19)。
實施例14對于觀察到的細(xì)胞毒性是由于腫瘤細(xì)胞上的獨(dú)特11個氨基酸肽的直接毒性作用的結(jié)果是有爭論的。為了檢測這種可能性，我們將高水平的IEP加入到體外的幾個腫瘤靶體中，培養(yǎng)4天后測定細(xì)胞的存活能力。如表3所示，用比體內(nèi)細(xì)胞，或效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測定中所用的更高水平的肽進(jìn)行處理，卻沒有導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞生長的抑制或?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷作用。
表3 Sec肽對于體外腫瘤生長的作用腫瘤細(xì)胞系 僅培養(yǎng)基+KLH-Sec肽1DA-3 3.7×106細(xì)胞23.5×106細(xì)胞DA-3/neo 3.9×106細(xì)胞4.0×106細(xì)胞DA-3/TM 3.1×106細(xì)胞3.0×106細(xì)胞DA-3/sec 2.9×106細(xì)胞3.1×106細(xì)胞150μg/孔2培養(yǎng)4天后的所有細(xì)胞結(jié)論本發(fā)明公開的數(shù)據(jù)表明用新型分泌型同種型MUC1基因(MUC1/sec)轉(zhuǎn)染，能夠預(yù)防BALB/C小鼠中已存在的進(jìn)攻性強(qiáng)并可產(chǎn)生免疫力的腫瘤細(xì)胞系的生長。當(dāng)將其用于接種方案中，能夠以非特異性方式抑制同源腫瘤。存在于MUC1/sec分子中的一種獨(dú)特的11個氨基酸肽與保護(hù)作用有關(guān)，當(dāng)用于接種免疫的方案中時，它能有效抑制各種腫瘤細(xì)胞系。這些數(shù)據(jù)還提示了，由固有的和/或調(diào)節(jié)性免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性也與所觀察的結(jié)果相關(guān)。由于該肽的作用不被限制于所指出的腫瘤類型或小鼠種類，它應(yīng)該可以單獨(dú)地和/或與其它免疫調(diào)節(jié)分子結(jié)合使用來抑制多種腫瘤。在注射了該肽的動物體內(nèi)，沒有檢測到毒性反應(yīng)。IEP的廣譜作用使其不僅可用于抑制腫瘤，而且還可抑制病毒或細(xì)菌性疾病，如HIV，乙型肝炎和丙型肝炎，以及其它微生物引起的感染(如，肺結(jié)核)，其中免疫應(yīng)答的增強(qiáng)對受試體可能具有積極的作用。
在本發(fā)明描述的優(yōu)選實施例中，為了描述清晰使用了特定的術(shù)語。然而，本發(fā)明并無意于使發(fā)明限制于所選擇的特定術(shù)語?？梢岳斫?，每一個具體要素都包括可以相似方式操作以實現(xiàn)相似目的的所有技術(shù)的等效方式。
本發(fā)明詳述部分舉例說明并討論的實施例只是希望給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供發(fā)明人所知的最佳方式以實施和使用本發(fā)明，而不應(yīng)該將其認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員對于上述發(fā)明內(nèi)容的理解，在沒有背離本發(fā)明的情況下，本發(fā)明例舉的實施例可以被修飾或改變，增加或刪減要素。因此可以理解，在權(quán)利要求及其等效轉(zhuǎn)換的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以被實施而不只是作為具體的描述。
所有專利，公開的專利申請和其它公開的參考文獻(xiàn)都在此作為引用文獻(xiàn)。為了方便，將參考文獻(xiàn)列在下面。
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權(quán)利要求
1.一種包含氨基酸序列VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)分離肽或多肽，或其類似物或衍生物，當(dāng)所述肽或多肽施用至哺乳動物時，其具有增強(qiáng)對抗原的免疫反應(yīng)的性質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的肽或多肽，其長度在11和200個氨基酸殘基之間。
3.權(quán)利要求1所述的肽或多肽，其長度在11和20個氨基酸殘基之間。
4.權(quán)利要求1所述的肽或多肽，它包含VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)。
5.權(quán)利要求1所述的衍生物，其包括至少一個含有氨基酸序列VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)的肽或多肽偶聯(lián)至蛋白質(zhì)載體上。
6.權(quán)利要求4所述的衍生物，其中載體是鑰孔血藍(lán)蛋白。
7.一種編碼權(quán)利要求1的肽或多肽的核酸，或一種具有其互補(bǔ)序列的核酸。
8.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1的肽或多肽，或其類似物或衍生物，以及藥用可接受的賦型劑或載體。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其還包括一種抗原。
10.權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中所述抗原為一種腫瘤抗原。
11.權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述抗原選自前列腺特異性抗原、黑素瘤有關(guān)的抗原和p53。
12.權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中，所述肽為VSIGLSFPMLP(SEQ IDNO1)。
13.一種載體，其包含權(quán)利要求7的核酸。
14.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7的核酸。
15.權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其包括編碼MUC1/sec的核酸。
16.權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其為DA-3細(xì)胞。
17.一種疫苗，其包括權(quán)利要求1的肽或多肽，或其類似物或衍生物，一種抗原，和一種藥用可接受的賦型劑或載體。
18.一種治療或預(yù)防哺乳動物癌癥的方法，其包括給哺乳動物施用安全且有效劑量的權(quán)利要求8或9的藥物組合物。
19.一種誘導(dǎo)或增強(qiáng)哺乳動物對抗原的免疫反應(yīng)的方法，其包括給哺乳動物施用安全且有效劑量的權(quán)利要求8或9的藥物組合物。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述抗原也施用于哺乳動物。
全文摘要
一種包含序列VSIGLSFPMLP(SEQ ID NO1)的分離肽或多肽，其在人的分泌型MUCl中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)被施用于哺乳動物時，能增強(qiáng)免疫應(yīng)答，以及包含該肽的組合物，產(chǎn)生該肽的宿主細(xì)胞及使用方法。該肽或多肽可以與載體蛋白偶聯(lián)并作為疫苗或免疫性組合物的一部分使用來預(yù)防或治療疾病或機(jī)能紊亂。
文檔編號A61K38/00GK1525864SQ02807778
公開日2004年9月1日 申請日期2002年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月2日
發(fā)明者黛安娜·M·洛佩斯, 林恩·赫伯特, 小曼特利·多爾西, 甘特·克勞斯, 詹姆斯·H·納蒂欣, H 納蒂欣, 克勞斯, 利 多爾西, 赫伯特, 黛安娜 M 洛佩斯 申請人:邁阿密大學(xué)