專利名稱：：穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物藥的相關(guān)方法和組合物以及它們作為抗孕藥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來源于轉(zhuǎn)基因植物的具有藥物活性的蛋白如疫苗、抗體或其它用于治療的化合物生產(chǎn)中的處理技術(shù)，也涉及到了動(dòng)物服用這些化合物用于免疫抗孕、病原體所致疾病的疫苗接種或其它免疫反應(yīng)性組合物感染時(shí)的治療處理。植物源性疫苗的開發(fā)已經(jīng)大大地促進(jìn)了可用于人類和動(dòng)物疫苗接種的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因植物可用于疫苗、抗體以及其它的人、獸疾病的治療性藥劑的開發(fā)，既提高了治療性蛋白的生產(chǎn)效率，也極大地降低了主要的生產(chǎn)成本。
背景技術(shù)：
：關(guān)于植物源性疫苗的生產(chǎn)，在轉(zhuǎn)基因植物中蛋白表達(dá)方面已經(jīng)獲得了重要進(jìn)展。例如，不同的表達(dá)形式、聚集物或融合體已經(jīng)被用于提高疫苗亞單位、抗體和治療藥劑或抗孕蛋白的產(chǎn)量，這些資料已經(jīng)描述在美國專利第5,679,880、5,484,719、5,686,079號(hào)以及美國專利申請(qǐng)第2002/0006411號(hào)中。但是，目前有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物疫苗技術(shù)的規(guī)定仍然要求將藥物蛋白從轉(zhuǎn)基因植物材料中純化出來，或者要求采用標(biāo)準(zhǔn)化處理后的植物組織生料。不幸的是，這樣的方法用于生產(chǎn)可服用性植物源性藥品有其固有的缺陷。優(yōu)選的植物源性藥品是可口服的、標(biāo)準(zhǔn)化處理后的植物組織。更確切的是，要求植物材料可在環(huán)境溫度下保存、運(yùn)輸和給藥。但是，未純化的轉(zhuǎn)基因植物源性疫苗有其下列固有的問題1)不同的植物其蛋白表達(dá)水平不同，2)由植物組織腐爛而導(dǎo)致的蛋白降解。與傳統(tǒng)的制藥學(xué)要求相比，因其相對(duì)短的保鮮期，新鮮收獲的產(chǎn)品比如水果、塊莖、根、樹葉或其它任何植物組織的數(shù)量是有限的。此外，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因蛋白在不同的植物、細(xì)胞克隆或植物組織中具有不同的聚集水平，這就使保持劑量的一致性變得異常困難，而那正是藥物的實(shí)際應(yīng)用所強(qiáng)制要求的。傳統(tǒng)的制藥技術(shù)提供了提取、純化和濃縮藥物蛋白的方法，但代價(jià)昂貴，并且要求對(duì)純化后的產(chǎn)品進(jìn)行冷凍，而不允許用植物細(xì)胞本身對(duì)轉(zhuǎn)基因蛋白進(jìn)行保護(hù)性包裝。因此，需要應(yīng)用新的方法來生產(chǎn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物源性藥物，既可避免不同植物有不同蛋白表達(dá)水平的缺陷，也不需要從原始植物材料中進(jìn)行純化。本文描述的加工方法提供了生產(chǎn)一種室溫下穩(wěn)定、用途廣泛的勻漿混合物的方法。另外，在環(huán)境溫度下穩(wěn)定的勻漿可收集在一起并進(jìn)行以每批為基礎(chǔ)的質(zhì)量控制。而且，本發(fā)明所描述的轉(zhuǎn)基因植物加工方法允許在整個(gè)加工的過程中方便地加入佐劑、緩沖液、抗氧化劑、穩(wěn)定劑或抗原粉末，這樣就可生產(chǎn)多種不同的藥物劑型，其效率以及效價(jià)比都高。該穩(wěn)定的干燥勻漿既可用于疫苗和病原體所致疾病的治療，也可用于抗孕。受精是精子和卵子細(xì)胞表面重要調(diào)控分子間的復(fù)雜反應(yīng)。它們?cè)谏尺^程中所扮演的重要角色使得它們有可能成為控制哺乳動(dòng)物生育率的重要目標(biāo)分子。所有的哺乳動(dòng)物卵子被透明帶所包繞，透明帶是一個(gè)由三種糖蛋白(ZP1，ZP2和ZP3)所組成的相對(duì)簡(jiǎn)單的膜，它使得卵子具有精子受體。一些非哺乳物種的透明帶還有第四種糖蛋白，即ZP4。透明帶的糖蛋白成分在受精和早期發(fā)育中起著特殊的作用，這在小鼠中得到了很好的證實(shí)。ZP1是一種和ZP2、ZP3的纖絲交聯(lián)的結(jié)構(gòu)蛋白。在受精的過程中，精子首先和ZP3結(jié)合，使精子發(fā)生頂體反應(yīng)。次后，ZP2成為了精子二級(jí)受體，這對(duì)精子穿過透明帶是必須的。受精后，ZP2的蛋白酶解以及ZP3的修飾被認(rèn)為與阻止多精入卵有關(guān)。透明帶在受精中扮演的重要作用，它在生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞中的特異性表達(dá)以及它所具有的高度免疫原性，使得它成為開發(fā)免疫抗孕疫苗中具有吸引力的目標(biāo)(EpifanoandDeanReprodFertilDev.1994；6319)。對(duì)整個(gè)透明帶或其成分進(jìn)行免疫已經(jīng)被證明能抑制數(shù)個(gè)物種包括靈長(zhǎng)類，兔子、嚙齒類和狗的受精((Prasadetal.，(1996)JREPRODFERTILSUPPL.50143)。在這些參考文獻(xiàn)中所描述的合成物或許可抑制受精作用，但它們必須通過胃腸外給藥，如針刺注射，因此其經(jīng)濟(jì)的、廣泛的應(yīng)用是不切實(shí)際的。在這些文獻(xiàn)中所描述的合成物，與本發(fā)明相比，不能以生餌料、食物或可消化性加工材料的形式進(jìn)行有效的口服給藥。Fitchen等((1995)VACCINE131051)曾試圖生產(chǎn)一種純化的植物性抗孕蛋白，通過注射的方式在模型動(dòng)物中給藥。在該實(shí)驗(yàn)中，鼠ZP3的抗原決定族被設(shè)計(jì)在煙草花葉病毒(TMV)的膜蛋白序列中，并在TMV感染時(shí)表達(dá)在煙草中。該病毒顆粒(ZP抗原決定族在病毒的外表面表達(dá))被從植物材料中粗略地純化，用于胃腸外給藥。但是，該病毒顆粒在鼠模型中不能有效地減少幼仔數(shù)量。Fitchen等沒有將此實(shí)驗(yàn)結(jié)果和誘導(dǎo)動(dòng)物抗孕的方法或經(jīng)口飼喂動(dòng)物一種轉(zhuǎn)基因植物的方法聯(lián)系起來，在他們的實(shí)驗(yàn)中，口服給藥平均減少幼仔數(shù)量至少50％。在本專業(yè)中，需要一種可作為生餌料或是可消化性食物、能方便地飼喂給動(dòng)物、并能明顯地減少被飼喂動(dòng)物幼仔數(shù)量的植物成分。同時(shí)需要避免應(yīng)用植物病毒來表達(dá)蛋白。因此，需要在植物細(xì)胞自身中直接表達(dá)抗孕蛋白，從而在動(dòng)物消化植物材料時(shí)產(chǎn)生一種黏膜免疫反應(yīng)。預(yù)計(jì)世界人口將繼續(xù)膨脹超過60億，其它野生物種的種群分布將繼續(xù)極大地受到工業(yè)化人類環(huán)境活動(dòng)的影響。在20世紀(jì)，人類對(duì)土地和水資源的利用對(duì)動(dòng)物物種的增長(zhǎng)有著越來越深刻的影響。世界野生生物基金會(huì)預(yù)測(cè)多至1/3的世界物種在未來的20年內(nèi)可能滅絕。除了某些動(dòng)物區(qū)系和植物群落將減少直至滅絕或處于危險(xiǎn)的邊緣，現(xiàn)代人類的活動(dòng)也導(dǎo)致了一些動(dòng)物物種的過度膨脹。一個(gè)特別的例子是，多年來食草動(dòng)物的存活狀況受到地理限制因素、自然天敵、氣候條件和獲得食物的能力等自然力的影響而保持平衡。在這不勝枚舉的影響因素中，工業(yè)化世界毀滅森林以用于農(nóng)業(yè)和建設(shè)用途，減少了肉食動(dòng)物的種群和自然活動(dòng)范圍，出現(xiàn)了突破地理屏障的物種，為物種適應(yīng)極端的氣候變化提供非自然的庇護(hù)，并孵育了一種動(dòng)物權(quán)利和人類利益相互沖突的社會(huì)文化。已有哺乳動(dòng)物的例子表明，食草動(dòng)物物種數(shù)量的過度膨脹已經(jīng)和人類共生以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)直接相沖突。由于眾多的原因，還沒有實(shí)現(xiàn)對(duì)這些哺乳動(dòng)物種群數(shù)量的有效控制，需要尋找另外的辦法。因此，人類需要開發(fā)種群控制的技術(shù)，以減輕失控動(dòng)物物種的過度繁殖而導(dǎo)致的破壞性影響，不管這種影響是經(jīng)濟(jì)的、環(huán)境的或動(dòng)物保護(hù)方面的。而且也需要采取高效的方法來達(dá)到此目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物源性生物藥品的生產(chǎn)方法。本文描述的方法允許生產(chǎn)一種干燥的轉(zhuǎn)基因植物源性材料，它在室溫下穩(wěn)定、均一、藥效充分。一般用已有的食品加工技術(shù)對(duì)完整的或分割后的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行干燥或冷凍干燥。含有生藥產(chǎn)物的干燥勻漿可用于治療而不需要進(jìn)一步的提取、純化或沉淀藥物蛋白。穩(wěn)定性干燥勻漿可用作疫苗、病原菌所致疾病的治療以及抗孕藥。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種控制生育安全有效的疫苗。因此，本發(fā)明滿足了生產(chǎn)穩(wěn)定的植物源性藥品所需要的有效方法，也滿足了家畜、飼養(yǎng)的物種、動(dòng)物園動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物以及人類的數(shù)量控制所需要的方便和效價(jià)比高的方法。本文描述植物源性藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用。本發(fā)明提供了生產(chǎn)表達(dá)異種蛋白的轉(zhuǎn)基因植物穩(wěn)定干勻漿的方法，具體方法包括1)完整的或分割后的轉(zhuǎn)基因植物材料的獲得；2)轉(zhuǎn)基因植物材料的脫水；3)在脫水前/后，混合轉(zhuǎn)基因植物材料成勻漿，從而生成一種表達(dá)異種藥物蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定干燥勻漿。在一個(gè)實(shí)施例中，通過對(duì)材料的冷凍干燥、空氣干燥或噴射干燥而實(shí)現(xiàn)其脫水過程。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法還包括在混勻之前對(duì)脫水后的材料進(jìn)行分割的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法還包括加入賦形劑的步驟。本發(fā)明還提供由上述方法生產(chǎn)的穩(wěn)定干勻漿。在一個(gè)實(shí)施例中，該穩(wěn)定干勻漿含有一種抗原或一種抗體。本發(fā)明還提供了一種含有轉(zhuǎn)基因蛋白的脫水后的轉(zhuǎn)基因植物材料所組成的穩(wěn)定干勻漿。本發(fā)明還提供了一種含有穩(wěn)定干勻漿的藥物組合物，該勻漿含有脫水的、含有一種轉(zhuǎn)基因蛋白并可選的與制藥學(xué)上可接受的佐劑混合后的轉(zhuǎn)基因植物材料。本發(fā)明還提供了一種給動(dòng)物飼喂由穩(wěn)定干勻漿組成的藥物組合物以防止病原體致病的一種方法，該勻漿含有脫水的、含有一種轉(zhuǎn)基因蛋白并可選的與制藥學(xué)上可接受的佐劑混合后的轉(zhuǎn)基因植物材料。本發(fā)明還提供了一種給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因蛋白的方法，該藥物組合物由穩(wěn)定干勻漿組成，而勻漿由脫水后的、含有一種轉(zhuǎn)基因蛋白并可選的與制藥學(xué)上可接受的佐劑混合后的轉(zhuǎn)基因植物材料組成。在一個(gè)實(shí)施例中，穩(wěn)定干勻漿中的轉(zhuǎn)基因蛋白即為一種疫苗。本發(fā)明還提供了利用轉(zhuǎn)基因植物源性藥物抗孕的方法。本發(fā)明利用植物染色體來表達(dá)抗孕蛋白而無需病毒干預(yù)。本發(fā)明提供了一種抗孕的方法給動(dòng)物飼喂一種含有編碼一種抗孕多肽的核苷酸分子的轉(zhuǎn)基因植物材料；上述處理使動(dòng)物的每個(gè)生育周期的平均幼仔數(shù)目至少減少了50％。本發(fā)明提供了一種抗孕的方法包括給動(dòng)物飼喂足夠數(shù)量含有編碼一種抗孕多肽的核苷酸分子的轉(zhuǎn)基因植物材料以有效地誘發(fā)抗孕；上述處理在動(dòng)物中誘導(dǎo)了針對(duì)抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)。本發(fā)明提供了一種抗孕的方法包括給動(dòng)物飼喂含有編碼一種抗孕多肽的核苷酸分子的轉(zhuǎn)基因植物材料，核苷酸被整合到植物染色體；上述處理使被飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料的動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少了50％。本發(fā)明還提供了一種抗孕的方法包括給動(dòng)物飼喂足夠數(shù)量的含有編碼一種抗孕多肽的核苷酸分子的轉(zhuǎn)基因植物材料以有效地誘發(fā)抗孕，核苷酸被整合到植物染色體；上述抗孕方法使被飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料的動(dòng)物每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少了50％。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，從由葉、根、芽、桿、果實(shí)、塊莖、花和種子等組成的群體中挑選出所述的轉(zhuǎn)基因植物材料。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的轉(zhuǎn)基因植物材料是可食用的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的由核苷酸編碼的抗孕多肽是從一個(gè)由透明帶糖蛋白(ZP)、GnRH(GnRH)、促黃體激素釋放激素(LHRH)、促黃體激素(LH)、乳酸脫氫酶(LDH)和抗精子抗原等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的透明帶糖蛋白是從由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的透明帶糖蛋白即ZP3。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的抗孕蛋白呈種系特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的編碼抗孕蛋白的核苷酸包括了編碼一種黏膜靶蛋白的序列。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的黏膜靶蛋白是大腸桿菌腸毒素亞單位B。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的轉(zhuǎn)基因植物材料是整體給藥。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的轉(zhuǎn)基因植物材料是通過黏膜給藥。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的黏膜給藥是經(jīng)口、鼻或眼來進(jìn)行。本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)的方法包括給動(dòng)物飼喂一種含有編碼抗孕多肽的核苷酸分子的轉(zhuǎn)基因植物材料，上述給藥在動(dòng)物中誘發(fā)了針對(duì)抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)，并且使動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少了50％。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的轉(zhuǎn)基因植物材料是從由葉、根、芽、桿、果實(shí)、塊莖、花和種子等組成的材料群體中挑選出來的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的轉(zhuǎn)基因植物材料是可食用的植物。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述的由上述核苷酸編碼的抗孕多肽是從一個(gè)由透明帶糖蛋白、GnRH、促黃體激素釋放激素、促黃體激素、乳酸脫氫酶和抗精子抗原等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的透明帶糖蛋白是從由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的透明帶糖蛋白即ZP3。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述的抗孕蛋白是種系特異性的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的編碼抗孕蛋白的核苷酸包括了編碼一種黏膜靶蛋白的序列。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的黏膜靶蛋白是大腸桿菌腸毒素亞單位B。本發(fā)明還提供了含有一種編碼抗孕多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物材料的轉(zhuǎn)基因植物，給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料可在動(dòng)物中誘發(fā)針對(duì)抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)，上述給藥使動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少了50％。本發(fā)明還提供了一種含有編碼抗孕多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物材料的轉(zhuǎn)基因植物，編碼抗孕多肽的核苷酸序列在病毒顆粒中沒有表達(dá)，而給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料可在動(dòng)物中誘發(fā)針對(duì)抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種含有編碼抗孕多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物材料的轉(zhuǎn)基因植物，上述給藥使被飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少了50％。本發(fā)明還提供了一種含有編碼抗孕多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物材料的可食用轉(zhuǎn)基因植物，而給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料可在動(dòng)物中誘發(fā)針對(duì)抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)，核苷酸被整合到植物染色體。在一個(gè)實(shí)施例中，抗孕多肽是從一個(gè)由透明帶糖蛋白、GnRH、促黃體激素釋放激素、促黃體激素、乳酸脫氫酶和抗精子抗原等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的透明帶糖蛋白是從由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等組成的群體中挑選出來的在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的透明帶糖蛋白或其片段是種系特異性的。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的透明帶糖蛋白是ZP3或其中的一個(gè)片段。在一個(gè)實(shí)施例中，所述的核苷酸序列可編碼一種黏膜靶蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，黏膜靶蛋白是大腸桿菌腸毒素亞單位B。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的植物屬單子葉植物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的植物屬雙子葉植物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的植物是從由番茄、稻谷、小麥、玉米、胡蘿卜、馬鈴薯、蘋果、大豆、苜蓿、蔬菜和水果植物所組成的群體中挑選出來的。本發(fā)明提供的一種植物細(xì)胞含有核酸載體，而該核酸載體編碼一種抗孕多肽，它被整合并表達(dá)在植物細(xì)胞染色體上，而給動(dòng)物飼喂該植物細(xì)胞使動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少了50％。在一個(gè)實(shí)施例中，由該核酸載體編碼的抗孕多肽是從一個(gè)由透明帶糖蛋白、GnRH、促黃體激素釋放激素、促黃體激素、乳酸脫氫酶和抗精子抗原等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例中，透明帶糖蛋白是從由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等組成的群體中挑選出來的。還是在進(jìn)一步的實(shí)施例中，抗孕蛋白是種系特異性的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該透明帶糖蛋白是ZP3。在一個(gè)實(shí)施例中，該核酸載體編碼一種黏膜靶蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該黏膜靶蛋白是大腸桿菌腸毒素亞單位B。在一個(gè)實(shí)施例中，該植物細(xì)胞是從單子葉植物中獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，該植物細(xì)胞是從雙子葉植物中獲得。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該植物細(xì)胞是從由番茄、稻谷、小麥、玉米、胡蘿卜、馬鈴薯、蘋果、大豆、苜蓿、蔬菜和水果等植物細(xì)胞所組成的群體中挑選出來的。本發(fā)明還提供了一種用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的質(zhì)粒載體，它包括編碼一種抗孕多肽的核酸序列，一個(gè)植物特異的啟動(dòng)子連接到編碼抗孕多肽的核酸序列，這樣就能指導(dǎo)抗孕蛋白在植物細(xì)胞中的合成。因此，給動(dòng)物飼喂含有該質(zhì)粒載體的植物細(xì)胞可在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)黏膜免疫反應(yīng)，而那樣的給藥可使動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少50％。在一個(gè)實(shí)施例中，由該核酸序列編碼的抗孕多肽是從一個(gè)由透明帶糖蛋白、GnRH、促黃體激素釋放激素、促黃體激素、乳酸脫氫酶和抗精子抗原等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該透明帶糖蛋白是從由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4等組成的群體中挑選出來的。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例中，該植物細(xì)胞是從一種可食用植物中獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，該質(zhì)粒載體包含了編碼一種黏膜靶蛋白的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該黏膜靶蛋白即大腸桿菌腸毒素亞單位B。本發(fā)明也提供了一種至少含有部分上述轉(zhuǎn)基因植物的食品組合物，可被動(dòng)物攝入，而轉(zhuǎn)基因植物的攝入可在動(dòng)物中誘發(fā)黏膜免疫反應(yīng)。因此，轉(zhuǎn)基因植物的的攝入可在動(dòng)物中誘發(fā)黏膜免疫反應(yīng)，從而使動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少50％。本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，它至少部分地是由上述的轉(zhuǎn)基因植物與制藥學(xué)上可接受的載體混合組成，而給動(dòng)物飼喂該藥物組合物可使動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少50％。本發(fā)明也提供了一種組合物，它由皂甙佐劑和加工后的轉(zhuǎn)基因植物材料混合組成，用于經(jīng)口飼喂動(dòng)物，而該組合物的飼喂可使動(dòng)物的每個(gè)生育周期中平均幼仔數(shù)目至少減少50％。在本文中，“抗孕品”指用于抗孕的藥劑?！翱乖小北欢x為減少單只動(dòng)物在單次生育周期中所生育的幼仔數(shù)目，或者是阻止有性生殖活動(dòng)中精子與卵母細(xì)胞的受精作用。如下所述，該阻止受精的作用可被單只雌性動(dòng)物在飼喂抗孕劑后所產(chǎn)幼仔數(shù)目的減少所證實(shí)。在本文中，“抗孕劑”指上述的減少或阻止受精，或阻止受精卵植入的作用，使得每個(gè)生育周期的幼仔數(shù)目最少。在本文中，“有性繁殖”是指哺乳動(dòng)物特有的繁殖方式。它包括一種性細(xì)胞對(duì)另一種性細(xì)胞的受精作用(配子雌性為卵子，雄性為精子)，從而產(chǎn)生一種新細(xì)胞(被叫做受精卵)，它可發(fā)育成一個(gè)新的生物體。卵子或精子是在雌性或雄性動(dòng)物的生殖器官中產(chǎn)生的。在單個(gè)的有性生殖過程中，卵子和精子受精后，攜帶受精卵的雌性動(dòng)物常常不能再產(chǎn)生更成熟的卵子直到幼仔生下后。在本文中，一個(gè)“生育周期”是指單個(gè)的有性生殖過程，包括成熟卵子的受精和幼仔的生產(chǎn)，均發(fā)生在下一個(gè)生育周期發(fā)生之前。依照本發(fā)明，一個(gè)“生育周期”也指被抗孕劑所阻斷的一個(gè)潛在的繁殖過程。在本文中，“抗孕蛋白”是指能減少單只動(dòng)物的單個(gè)生育周期中的幼仔數(shù)目的多肽或多肽片段。對(duì)于那些平均產(chǎn)仔數(shù)目是3或更多的動(dòng)物物種來說，“抗孕蛋白”是指能減少幼仔數(shù)目至少達(dá)60％、70％、80％、90％甚至達(dá)100％的多肽。對(duì)于那些平均產(chǎn)仔數(shù)目是1或2的動(dòng)物物種來說，“抗孕蛋白”是指能減少幼仔數(shù)目至少達(dá)50％(即從2個(gè)減到一個(gè))或100％(即從1個(gè)或2個(gè)減到?jīng)]有)的蛋白或多肽。此外，如上所述，抗孕蛋白也可指能阻斷卵子和精子的受精作用或阻止受精卵在動(dòng)物子宮的著床從而減少平均幼仔數(shù)目的多肽。另外，“抗孕蛋白”是指一種可刺激動(dòng)物產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)的多肽，該免疫反應(yīng)可使針對(duì)抗孕蛋白的抗體增加?？贵w可與性激素、卵母細(xì)胞或精母細(xì)胞的位點(diǎn)結(jié)合，從而阻斷性成熟、卵母細(xì)胞的受精和/或受精卵在動(dòng)物子宮的著床，因此減少幼仔數(shù)目。本發(fā)明中有用的“抗孕蛋白”包括但不限于透明帶糖蛋白、GnRH(GnRH)、促黃體激素釋放激素(LHRH)、促黃體激素(LH)、乳酸脫氫酶(LDH)和抗精子抗原。“抗精子抗原”包括但不限于SP5、SP56、fertilin、PH30、LDH-C4和P10。在本文中，“有效誘發(fā)抗孕的數(shù)量”是指能誘發(fā)抗孕的轉(zhuǎn)基因植物材料的數(shù)量。有效誘發(fā)抗孕的轉(zhuǎn)基因植物材料數(shù)量是指將幼仔數(shù)目減少10％、30％、60％，、80％至100％的植物材料的數(shù)量。對(duì)于那些每個(gè)生育周期的平均產(chǎn)仔數(shù)目是1或2的動(dòng)物物種來說，有效誘發(fā)抗孕的轉(zhuǎn)基因植物材料數(shù)量是指能減少幼仔數(shù)目至少達(dá)50％或100％的植物材料。在本文中，有效誘發(fā)抗孕的數(shù)量是指誘發(fā)抗孕的轉(zhuǎn)基因植物材料的數(shù)量至少是每克干重的轉(zhuǎn)基因植物材料里含抗孕蛋白5μg，優(yōu)選是每克干重的轉(zhuǎn)基因植物含抗孕蛋白至少10μg、20μg、40μg、60μg、80μg，、100μg、120μg、140μg和150μg或更多。在本文中，“轉(zhuǎn)基因植物”是一種植物，其細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)一種異種外源基因，該外源基因被整合到植物細(xì)胞的染色體上，但沒有攜帶病毒特異的病毒載體序列，該外源基因可傳代到下一代植物個(gè)體，并能在植物宿主染色體上表達(dá)。一種轉(zhuǎn)基因植物有多種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。文中的“轉(zhuǎn)基因植物”是指整個(gè)植物，或是它包括的一部分，而不是僅限于根、莖、葉、桿、種子、果實(shí)、塊莖、花、花粉或諸如此類。異種外源性基因的例子包括但不限于諾瓦克病毒外殼蛋白(NVCP)，禽流感病毒血凝素(AIV-HA)，新城疫病毒神經(jīng)酰胺酶(NDV-HN)，透明帶糖蛋白3(ZP3)，和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。在本文中，“異種蛋白”是指由異種基因表達(dá)的蛋白，異種基因是指編碼一個(gè)或多個(gè)其它來源的蛋白的基因或其片段，而不是來自該蛋白最終在其中表達(dá)的植物種類的染色體?；虻膩碓纯梢允亲匀坏?，例如，基因可來自另外的活體生物，比如細(xì)菌、病毒、酵母菌、霉菌以及諸如此類，或來自不同類的植物；基因也可以是合成的，例如，基因或基因片段可在體外化學(xué)合成?！爱惙N”一詞也可用于當(dāng)基因片段的來源不是來自其最終在其中表達(dá)的植物染色體。異種蛋白可以是抗原，或其它治療性蛋白，例如內(nèi)皮他丁、血管他丁等(但不限于此)。異種蛋白也可以是抗體或抗體復(fù)合體，例如植物抗體。植物抗體是在植物中產(chǎn)生的抗體。在本文中，“轉(zhuǎn)基因植物材料”是指加工或未加工的的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明，文中的“轉(zhuǎn)基因植物材料”是指整個(gè)轉(zhuǎn)基因植物，或是它包括的一部分，而不是僅限于轉(zhuǎn)基因葉、轉(zhuǎn)基因根、轉(zhuǎn)基因芽、轉(zhuǎn)基因莖、轉(zhuǎn)基因果實(shí)、轉(zhuǎn)基因塊莖、轉(zhuǎn)基因花、轉(zhuǎn)基因種子。轉(zhuǎn)基因植物材料也指一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是指穩(wěn)定表達(dá)一個(gè)外源基因的植物細(xì)胞，其中的外源基因被整合到植物細(xì)胞的染色體而沒有攜帶病毒特異的病毒載體序列。該外源基因可傳代到下一代細(xì)胞個(gè)體，并能在宿主植物細(xì)胞染色體上表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)基因植物材料是指含有一種或多種通過常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。(Street，HE.1973，Planttissueandcellculturebotanicalmonographs.VolII，UniversityofCalifornia，Berkely)在本文中，完整的轉(zhuǎn)基因植物材料是指整個(gè)植物或植物的部分，它們沒有被諸如切片、切斷或垛碎等進(jìn)一步的加工而減小它們的大小?？傊?，該植物材料在收獲時(shí)是完整的，但可能僅是轉(zhuǎn)基因植物的一部分。例如，完整的轉(zhuǎn)基因葉子，轉(zhuǎn)基因根、轉(zhuǎn)基因芽、轉(zhuǎn)基因莖，轉(zhuǎn)基因果實(shí)，轉(zhuǎn)基因塊莖、轉(zhuǎn)基因花或轉(zhuǎn)基因種子。在本文中，分割的轉(zhuǎn)基因植物材料是指完整植物的某些部分，通過常規(guī)的工藝已使它們的尺寸減小。分割的方法包括(但不限于此)二等分、四等分、切碎、切片、切方、垛碎或制漿、碾磨、壓碎、壓榨或裂化。轉(zhuǎn)基因植物材料，無論是切斷或不切斷、烹飪過或未烹飪過，都可用該工藝中的技術(shù)處理來成漿，包括室溫下在廚房的攪拌器中壓汁、混勻或碾碎。成漿后的植物材料可與適當(dāng)?shù)馁x形劑混合，該賦形劑必須是制藥學(xué)上可以接受并且與該轉(zhuǎn)基因蛋白相容。轉(zhuǎn)基因植物材料可被研磨成精細(xì)的粉末。在本文中，勻漿是指將較大的植物器官縮減成均衡的混合物，其中不同組織的不同數(shù)量的同源蛋白被混合成統(tǒng)一成批的材料。因此，術(shù)語“同質(zhì)物”或“勻漿”也指被分割或縮減的植物材料，如此，含不同數(shù)量植物蛋白和或轉(zhuǎn)基因蛋白的不同植物組織被混合成含有統(tǒng)一蛋白量、成批的植物材料。在本文中，可食用的植物是指那些可被動(dòng)物消化、有營養(yǎng)價(jià)值而沒有毒性的植物。可食用的植物是指可作為食物而被人類或其它動(dòng)物吸收的植物或從植物上獲得的材料。術(shù)語“食物”特別包括可供人類或其它動(dòng)物食用的植物材料或加工過的植物材料。從植物中獲得的材料還特別地包括最終可被人類或其它動(dòng)物吸收的植物成分?？墒秤弥参锇?但不限于此)番茄、稻谷、小麥、玉米、胡蘿卜、馬鈴薯、蘋果、大豆、苜蓿、蔬菜和水果。在有些情況下，一種可食用植物因其營養(yǎng)價(jià)值而被吸收，它是指可提供可代謝能量、輔助或必需維生素或協(xié)同因子、粗飼料的來源或其它對(duì)動(dòng)物吸收有益的效應(yīng)。因此，當(dāng)本發(fā)明所提供方法處理的對(duì)象是可憑借細(xì)菌來輔助消化纖維素的食草動(dòng)物時(shí)，那樣的食物可用轉(zhuǎn)基因草本植物來代表。其它的可食用植物包括蔬菜和水果。類似的，雖然轉(zhuǎn)基因萵苣植物不能充分地提供能源、結(jié)構(gòu)大分子如蛋白、碳水化合物或脂肪，也不能提供其它的必需或非必需維生素或協(xié)同因子，如本文所述，如果萵苣植物的吸收因?yàn)樘峁┝舜诛暳隙o動(dòng)物帶來益處，并且其核酸分子被轉(zhuǎn)基因，那么被動(dòng)物當(dāng)作食物的轉(zhuǎn)基因萵苣植物也歸入本文的有關(guān)食物的定義，縱使動(dòng)物不能消化萵苣的纖維性內(nèi)容物也是如此?？墒秤弥参锊话煵荨Ｔ诒疚闹?，“加工過的”轉(zhuǎn)基因植物材料是指切割或?qū)⒅参锊牧霞?xì)分為最小尺寸約為1mm2大小的較小片塊，其中切割又指剁碎、切碎或切方。不管是切割過的還是沒有切割過的轉(zhuǎn)基因植物材料都可以用烹飪植物材料來進(jìn)一步加工，應(yīng)用的是該工藝中已知的方法包括(但不限于此)煮沸、烘烤和嫩煎，此時(shí)植物材料的溫度被提高到至少140℃、160℃、180℃，最高200℃至少5分鐘、最多30分鐘。被烹飪過的轉(zhuǎn)基因植物材料，在本發(fā)明中是有用的，它可不需要將抗孕蛋白純化而直接飼喂，因?yàn)榕腼冞^的植物材料可含有裂解的植物細(xì)胞。不管是切割過的還是沒有切割過、烹飪過或沒有被烹飪過的轉(zhuǎn)基因植物材料都可以通過與非轉(zhuǎn)基因植物或非植物材料混合而進(jìn)一步地被加工，其中轉(zhuǎn)基因植物材料至少占混合物總重量的50％。例如，轉(zhuǎn)基因玉米可通過把玉米顆粒與其它的蔬菜混合而得到加工，再如，轉(zhuǎn)基因豆類植物可通過與香料或其它的調(diào)味品混合制成諸如大豆?jié)h堡包、大豆冰淇淋攪合飲料或豆奶等而得到加工?；蛘撸诒景l(fā)明中有用的轉(zhuǎn)基因植物材料可通過應(yīng)用該工藝技術(shù)中已知的方法，包括室溫下在廚房的攪拌器中壓汁、混勻或碾碎至少20分鐘，使切割過或沒有切割過的、烹飪過或沒有烹飪過的植物材料液化，從而使其得到加工。液化后的植物材料可直接飼喂給動(dòng)物，也可將液化后的植物材料與適當(dāng)?shù)馁x形劑混合而使其得到進(jìn)一步的加工，該賦形劑必須是制藥學(xué)上可以接受并且與該轉(zhuǎn)基因蛋白相容。液化后的植物材料可通過將其與制藥學(xué)上可接受的乳膏、軟膏或油膏等混合而得到進(jìn)一步加工。在轉(zhuǎn)基因植物材料的液化過程中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可能破裂，從而將其內(nèi)容物釋放到液化后的混合物中。在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的抗孕蛋白沒有被從液化后的植物材料中純化出來的情況下，該液化混合物在本發(fā)明中是有用的?；蛘?，在本發(fā)明中有用的轉(zhuǎn)基因植物原料，切割過或沒有切割過的，烹飪過或沒有烹飪過的，都可通過將植物原料凍干或脫水處理去除水分而得到加工。可通過空氣干燥或噴射干燥或凍干而實(shí)施脫水，其中凍干是指通過快速冷凍和凍結(jié)狀態(tài)的脫水(有時(shí)指升華)而制備一種干燥植物組合物。該處理發(fā)生在真空狀態(tài)，此時(shí)壓力足夠地低而保持產(chǎn)物的凍結(jié)狀態(tài)，優(yōu)選是少于500毫托，更好一點(diǎn)是少于約200毫托，再好一點(diǎn)是少于約1毫托，持續(xù)時(shí)間在1-72小時(shí)之間。植物材料也可以放在溫度約為60-200℃的烘箱中脫水約1-72小時(shí)。當(dāng)植物原料的重量不隨時(shí)間而變化時(shí)，它被認(rèn)為已經(jīng)充分地凍干或脫水。例如，當(dāng)將植物原料放置在如上述溫度的烤箱內(nèi)時(shí)，其水分被蒸發(fā)，因而它的重量將隨時(shí)間而減少。當(dāng)其重量停止變化時(shí)，所有的水分被蒸發(fā)，此時(shí)植物原料可認(rèn)為是被脫水。不過應(yīng)用何種干燥方法，優(yōu)選是在最后時(shí)，原料的水分重量至少被除去90％而被充分地脫水。凍干或脫水后的植物原料可通過與制藥學(xué)上可接受的并與抗孕多肽相容的賦形劑乳化而得到進(jìn)一步的加工。舉例來說，適當(dāng)?shù)馁x形劑包括水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇或類似物及其組合，在它與賦形劑的混合物中，″凍干″或″脫水″的植物材料至少包含40％、優(yōu)選是50％的重量。此外，必要時(shí)，″凍干″或″脫水″的植物材料可含較小量的附加物質(zhì)如濕化或乳化劑，pH緩沖劑，或提高植物材料效力的佐劑。在本文中，″凍干″或″脫水″的植物材料可通過與制藥學(xué)上可接受的乳膏、軟膏、油膏或栓劑混合而得到進(jìn)一步的加工，其中植物材料至少占混合物40％優(yōu)選是50％的重量?；蛘?，″脫水″植物材料可用液體如果汁、蔬菜汁、牛奶、水或其它的疫苗配方的方法來重構(gòu)植物材料而使其得到進(jìn)一步的加工，從而形成多效價(jià)或多成分疫苗。在本文中，賦形劑是指在加工的任何階段加入的外源性原料。例如，可在分割轉(zhuǎn)基因植物材料時(shí)，或脫水時(shí)，或脫水前后混勻時(shí)加入賦形劑。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括(但不限于此)佐劑、緩沖液、糖、抗氧化劑、穩(wěn)定劑或抗原粉。在本文中，″多肽″表示一系列的氨基酸殘基，它們通過一個(gè)氨基酸的羧基碳原子與下一個(gè)氨基酸羧基氮原子間的肽鍵相聯(lián)。此處的“多肽”可以是整個(gè)蛋白、蛋白的片段或蛋白的免疫表位。用在此處，″透明帶糖蛋白″是指組成哺乳動(dòng)物透明帶的三個(gè)硫化的糖蛋白。該透明帶還包括一層由卵母細(xì)胞微絨毛以及卵泡細(xì)胞的細(xì)胞突起。透明帶糖蛋白，特別是ZP3，是作為哺乳動(dòng)物精子的主要結(jié)合部位。透明帶，特別是透明帶糖蛋白ZP3可應(yīng)用ZP3特異性抗體和標(biāo)準(zhǔn)免疫組化技術(shù)而被鑒定(在East等，1985，Dev.Biol.109268中有很好的描述)。在文獻(xiàn)中用來描述ZP糖蛋白的命名法是不同的。例如，ZP糖蛋白包括(但不限于此)，從豬分離的ZP蛋白有PZI，PZIII，90K，65K，55K，25K，ZP1，ZP2，ZP3(PPZA)，ZP4，87K(ZP1/ZP2)，58K等；從兔分離的ZP蛋白有RZI，RZII，RZIII，ZP1，ZP2，ZP3，RZII等；從小鼠分離的ZP蛋白有ZP1，ZP2，ZP3；從貓分離的ZP蛋白有CZI和CZII；從狗分離的ZP蛋白有DZI，DZII，和DZIII；從松鼠猴分離的ZP蛋白有ZP1，ZP2，ZP3，和ZP4；從人分離的ZP蛋白有ZP1，ZP2，和ZP3。除了上述的ZP肽外，許多物種(如小鼠、人、倉鼠、兔)的ZP糖蛋白編碼核苷序列已被闡明，在本發(fā)明中它們是有用的，因?yàn)樗鼈兛删幋a抗孕蛋白。本發(fā)明對(duì)其糖蛋白分別命名為ZP1，ZP2，ZP3。然而，其它的文獻(xiàn)將ZP糖蛋白分成ZPA、B和C，其中ZPA包括ZP1、ZP2所指的肽，ZPB包括ZP3∝和rc55所指的肽，ZPC包括ZP3β和ZP3所指的肽(參見美國專利5,989,550)。在此處，″免疫抗孕″指由針對(duì)抗孕蛋白的免疫反應(yīng)引起的暫時(shí)的、可逆性的抗孕，也指永久性非可逆性抗孕或絕育。對(duì)于平均每窩的幼仔數(shù)目為3個(gè)或更多的動(dòng)物物種，當(dāng)接受免疫抗孕動(dòng)物的每個(gè)生育周期的平均幼仔數(shù)量減少了至少60％、70％、80％、90％甚至到100％，那么可認(rèn)為免疫抗孕是″有效的″。對(duì)于每窩的平均幼仔數(shù)目少于3的動(dòng)物物種，有效的免疫抗孕將導(dǎo)致幼仔數(shù)量減少至少50％甚至達(dá)100％。此處，免疫反應(yīng)是指生物體的免疫系統(tǒng)對(duì)包括(但不限于此)外源性或自身蛋白等物質(zhì)引起的反應(yīng)。普通類型的免疫反應(yīng)包括(但不限于此)黏膜、體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。黏膜免疫反應(yīng)是由覆蓋呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道的黏膜的分泌型IgA以及來自所有分泌腺的分泌物中的分泌型IgA(sIgA)抗體的產(chǎn)生引起的免疫反應(yīng)(McGHee，J.R.etal.，1983，annalsNYacad.Sci.409)。這些分泌型IgA抗體可阻止病原體在黏膜表面的定植(Williams，R.C.etal.，Science177，697(1972)；McNabb，P.C.etal.，Ann.Rev.Microbiol.35，477(1981))，因而是阻止病原體通過黏膜入侵或定植的第一道黏膜保護(hù)屏障。可通過對(duì)分泌腺或組織的局部免疫或暴露抗原給腸道相關(guān)淋巴組織(GALT或Peyer′s斑)或支氣管相關(guān)淋巴組織等方法來刺激sIgA的產(chǎn)生(BALT；Cebra，J.J.etal.，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.41，210(1976)；Bienenstock，J.M.，Adv.Exp.Med.Biol.107，53(1978)；Weisz-Carrington，P.etal.，J.IMMUNOL123，1705(1979)；McCaughan，G.etal.，InternalRev.Physiol28，131(1983))。膜性小結(jié)相關(guān)上皮細(xì)胞，也叫做M細(xì)胞，覆蓋了腸道相關(guān)淋巴組織或支氣管相關(guān)淋巴組織的表面，并且可能和其它的分泌黏膜表面有關(guān)。M細(xì)胞可從鄰近黏膜表面的體腔內(nèi)提取抗原并將其轉(zhuǎn)移到抗原遞呈細(xì)胞(樹狀突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)，后者依次將抗原遞呈至T淋巴細(xì)胞(當(dāng)抗原是T細(xì)胞依賴性時(shí))，T淋巴細(xì)胞將抗原處理后呈送給待命的B細(xì)胞。然后B細(xì)胞被刺激而增殖，遷移并最終被轉(zhuǎn)化成抗體分泌型漿細(xì)胞而產(chǎn)生針對(duì)所遞呈抗原的IgA。當(dāng)該抗原被覆蓋在腸道相關(guān)淋巴組織或支氣管相關(guān)淋巴組織的M細(xì)胞所俘獲時(shí)，全身的分泌組織都可產(chǎn)生針對(duì)抗原的分泌型免疫球蛋白(sIgA)主導(dǎo)的全身黏膜免疫反應(yīng)。(Cebra等，supra；Bienenstock等，supra；Weinz-Carrington等，supra；McCaμghan等，supra)。因此經(jīng)口接種是刺激全身免疫反應(yīng)的重要途徑，它可引起口腔和胃腸道的局部刺激分泌免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)可用文獻(xiàn)中介紹的方法檢測(cè)到。例如，可從被懷疑發(fā)生了免疫反應(yīng)的生物體中獲得血清、全血或其它的分泌物，再用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)上述免疫球蛋白的出現(xiàn)(ELISA；美國專利5,951,988；Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology3rdEd.JohnWiley&Sons，Inc.1995)。依照本發(fā)明，當(dāng)在經(jīng)過抗孕蛋白處理過的動(dòng)物中定量檢測(cè)到的免疫球蛋白水平與沒有經(jīng)過抗孕蛋白處理過的動(dòng)物中檢測(cè)到的免疫球蛋白水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異時(shí)，就可以說，本發(fā)明中的抗孕蛋白激發(fā)出免疫反應(yīng)，其中免疫球蛋白是特異性地針對(duì)該抗孕蛋白的?？捎梦墨I(xiàn)中提供的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括(但不限于此)單因素方差分析、Student氏T-檢驗(yàn)以及其它類似的方法來檢驗(yàn)檢測(cè)到的免疫球蛋白的差異，其中的P值是至少＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005＜0.001，和＜0.0001?？捎闷渌姆椒ㄈ缑庖呓M化來檢測(cè)免疫反應(yīng)，所用的抗體是特異性針對(duì)在免疫反應(yīng)中升高的免疫球蛋白的標(biāo)記抗體。根據(jù)本發(fā)明中的方法飼喂過抗孕蛋白的動(dòng)物的組織(如卵巢組織)獲得后可用文獻(xiàn)中常規(guī)的方法處理以備免疫組化檢測(cè)Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology3rdEd.JohnWiley&Sons，Inc.1995)。通過掃描免疫組化染色的組織標(biāo)本并用文獻(xiàn)中介紹的電腦軟件包括(但不限于此)NIHIMAGE(美國國立衛(wèi)生研究所，Bethesda，MD)，來定量染色的水平，從而對(duì)免疫組化方法獲得的顯微鏡下的資料進(jìn)行定量。依照本發(fā)明，當(dāng)在經(jīng)過抗孕蛋白處理過的動(dòng)物中用免疫組化染色定量檢測(cè)到的免疫球蛋白水平與沒有經(jīng)過抗孕蛋白處理過的動(dòng)物中用免疫組化染色定量檢測(cè)到的免疫球蛋白水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異時(shí)，就可以說，本發(fā)明中的抗孕蛋白激發(fā)出免疫反應(yīng)，其中組織化學(xué)染色需要特異性地結(jié)合該抗孕蛋白。可用文獻(xiàn)中提供的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括(但不限于此)單因素方差分析、Student氏T-檢驗(yàn)以及其它類似的方法來檢驗(yàn)檢測(cè)到的免疫組化染色水平的差異，其中的P值是至少＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005＜0.001，和＜0.0001。可用上述的方法中的一種來檢測(cè)黏膜免疫反應(yīng)。例如使用抗-IgA抗體的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)可被用來檢測(cè)黏膜特異性免疫球蛋白(Dickinson，B.L.&Clements，J.D.DissociationofEscherichiacoliheat-labileenterotoxinadjuvanticityfromADP-ribosyltransferaseactivity.InfectImmun63，1617-1623(1995))。在此處，佐劑是指與抗原共同飼喂給動(dòng)物后可增強(qiáng)對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)的化合物(ColiganLGetal.eds.CurrentProtocolsinImmunology，NewYorkJohnWiley&Sons，1995)。一種佐劑之所以有效，是因?yàn)樗赏ㄟ^延遲抗原的破壞而使其在組織中保持較低的、但有效的抗原水平或通過激發(fā)一種炎癥反應(yīng)或其它可提高免疫敏感性的免疫反應(yīng)而非特異性地激活免疫系統(tǒng)。在本文中，種系特異性是指核酸或氨基酸序列是其來源的種系所特有的。例如，編碼透明帶糖蛋白的種系特異性核酸序列是指該核酸序列與不同物種來源的編碼對(duì)應(yīng)的透明帶糖蛋白的核酸序列的同源性不超過95-70％、80-50％和60-40％。特定核酸和氨基酸序列的種系特異性可用文獻(xiàn)中常規(guī)的方法包括染色體區(qū)帶分析來檢測(cè)。在本文中，黏膜靶蛋白是指一種多肽，當(dāng)它與第二種蛋白共軛結(jié)合或者以與之成融合蛋白的形式表達(dá)就可增加組合肽激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)的潛能。黏膜靶蛋白可以不是所引入生物體的內(nèi)源性多肽。有證據(jù)顯示，當(dāng)黏膜靶蛋白和一種抗原(如ZP糖蛋白)一起經(jīng)口用藥時(shí)，它可作為佐劑而增強(qiáng)保護(hù)性免疫反應(yīng)(Black等，INFECT.IMMUNOL.551116(1987))。因此，當(dāng)至少以10μg、1μg、500ng甚或1ng的劑量給藥時(shí)，黏膜靶蛋白是對(duì)黏膜上皮細(xì)胞有神經(jīng)節(jié)苷脂親和力的一種蛋白，它能促進(jìn)蛋白在黏膜上皮細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)位，所以黏膜靶蛋白可能對(duì)誘發(fā)分泌免疫反應(yīng)來說是重要的。可預(yù)見的是，抗孕蛋白和黏膜靶蛋白的基因融合產(chǎn)物可能比較容易轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜細(xì)胞并引起局部分泌免疫反應(yīng)增強(qiáng)。黏膜靶蛋白的例子包括(但不限于此)大腸桿菌腸毒素亞單位B和A，霍亂毒素、志賀氏菌毒素B(StxB)、葡萄球菌腸毒素B(SEB)、諾瓦克病毒外殼蛋白(NVCP)，以及乙型肝炎病毒表面抗原?？赏ㄟ^用一些方法如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)或免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)由于組合蛋白的應(yīng)用而引起的黏膜免疫反應(yīng)(如檢測(cè)分泌型IgA的水平)并用上述的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法觀察，并且與只應(yīng)用抗原蛋白而不用黏膜靶蛋白時(shí)的情況相比較，觀察該免疫反應(yīng)有無明顯增加，以判斷一種多肽將抗原的免疫原性傳導(dǎo)給黏膜的能力。在此處，動(dòng)物是指在動(dòng)物類目中分類的一種生物體。在本文中，動(dòng)物是指哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明中有用的動(dòng)物包括(但不限于此)哺乳動(dòng)物，有袋類，老鼠，狗，貓，母牛，人，鹿，馬，羊，家畜類，家禽，雞肉，火雞，駝鳥，魚，鰭魚，貝殼魚以及諸如此類。在本文中，單子葉植物是指胚芽只有一個(gè)子葉的一種類型植物。單子葉植物包括(但不限于此)百合；草；玉黍蜀；谷粒，包括燕麥，小麥和大麥；蘭花；野鳶尾；洋蔥和棕櫚樹。在本文中，雙子葉植物是指胚芽有兩個(gè)子葉的一種類型植物。雙子葉植物包括(但不限于此)煙草；蕃茄；包括紫花苜蓿的豆類；橡樹；楓；玫瑰；白蘇；南瓜；雛菊；胡桃；仙人掌；紫羅蘭和毛良。在本文中，核酸載體是指一種核酸分子，它能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接在一起的另一種核酸。一類載體是質(zhì)粒，它是一種環(huán)形雙鏈的核酸分子，另外的核酸序列片段可與其連接。某些類型的載體可在其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)復(fù)制(如有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳類載體)。另外的載體(如非游離型哺乳類載體)在導(dǎo)入到宿主細(xì)胞后可與宿主細(xì)胞的基因組整合，并與其一起復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)和它們適當(dāng)?shù)剡B接基因的表達(dá)。那樣的載體在這里被稱作表達(dá)載體。一般來說，用于核酸重組技術(shù)的表達(dá)載體常常以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)。在本發(fā)明中，質(zhì)粒和載體在應(yīng)用時(shí)可互換，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體類型。在本文中，啟動(dòng)子是指一段DNA序列，常常位于一個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)域的上游(5′端)，它可提供識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)給核糖核酸聚合酶以及在復(fù)制啟動(dòng)中需要的其它因子，并因此控制編碼區(qū)的表達(dá)。啟動(dòng)子的選擇依賴于研究者感興趣的核酸序列。一個(gè)植物功能性啟動(dòng)子是指能在植物細(xì)胞中支持復(fù)制啟動(dòng)。在本發(fā)明中有用的植物功能性啟動(dòng)子包括(但不僅限于此)菜花樣花葉病毒(CaMV)的啟動(dòng)子(35S)、種子存儲(chǔ)基因如Zma10Kz和Zmagl2的啟動(dòng)子、光感應(yīng)基因如核酮糖二磷酸羧化酶小亞單位(rbcS)、應(yīng)激誘導(dǎo)基因如乙醇脫氫酶(Adh1)，或在所有細(xì)胞中表達(dá)的看家基因(如Zmact，一個(gè)玉米肌動(dòng)蛋白基因)、番茄E8啟動(dòng)子、泛素、甘露糖合成酶(mas)、稻谷肌動(dòng)蛋白、大豆球蛋白(Gyl)、大豆?fàn)I養(yǎng)存儲(chǔ)蛋白(VSP)、顆粒結(jié)合淀粉合成酶(gbss)。其它的植物功能性啟動(dòng)子包括在可食用植物部分高表達(dá)的基因的啟動(dòng)子，如來自馬鈴薯的patatin基因啟動(dòng)子。在本文中，可操作的連接是指聯(lián)合核酸序列適當(dāng)?shù)奈恢煤痛涡?，其中上述核酸成分相互間的位置關(guān)系允許它們以特定的方式行使其功能。當(dāng)一個(gè)控制序列以可操作的方式與一個(gè)編碼序列連接時(shí)，其結(jié)合方式必要能使編碼序列在與控制序列相容的條件下完成其表達(dá)。當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子序列控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有足夠的相似性時(shí)，就可認(rèn)為該啟動(dòng)子是以可操作的方式連接到一個(gè)基因上。用在此處，給藥是指將本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植物材料、細(xì)胞、組合物以及藥物配方遞送給動(dòng)物，具體的遞送方式要求保證遞送的材料與被給藥動(dòng)物的黏膜表面接觸。本發(fā)明中有用的遞送途徑包括(但不僅限于此)，經(jīng)鼻，經(jīng)直腸或經(jīng)陰道遞送(如栓劑或局部給藥)，或被遞送的材料與黏膜表面直接接觸的遞送途徑(即經(jīng)黏膜遞送)。在本文中，“制藥學(xué)上可接受的”是指不干擾藥物活性成分生物活性發(fā)揮的無毒材料。載體的特性取決于用藥的途徑。用在此處，“黏膜表面”、“黏膜表層”、“黏膜”是指這些結(jié)構(gòu)公認(rèn)的醫(yī)學(xué)定義，它是指一些由上皮層、固有層以及在消化道時(shí)還有一層平滑肌組成的結(jié)構(gòu)的黏膜表面。黏膜表面的例子包括(但不僅限于此)支氣管的內(nèi)表面、鼓室腔的黏膜層、結(jié)腸的內(nèi)黏膜、輸精管的內(nèi)表面、食道內(nèi)膜、小腸的黏膜層、喉的黏膜層、舌的黏膜層、垂體膜、口腔黏膜、咽腔黏膜、氣管黏膜、咽鼓管黏膜、子宮內(nèi)膜、陰道黏膜、胃黏膜、膀胱黏膜、精囊腺黏膜。用在此處，種系是指生物屬的劃分和生物個(gè)體的一種生物分類，其中一個(gè)種系的所有生物個(gè)體在他們的整體形態(tài)、軀體大小和發(fā)育等方面有很大的相似性。用在此處，穩(wěn)定材料是指保存在室溫下的植物材料。其中穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物材料是指其中的異種蛋白或轉(zhuǎn)基因蛋白保持有效，當(dāng)用某些方法如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、定量蛋白印記實(shí)驗(yàn)或凝集實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)時(shí)，其免疫反應(yīng)性并沒有明顯的下降。根據(jù)本發(fā)明的過程，在生產(chǎn)時(shí)觀察到了至少40％的免疫反應(yīng)性，保持至少5個(gè)月之久，以及更長(zhǎng)的時(shí)間，至10個(gè)月、12個(gè)月或18個(gè)月或甚至更久，就可認(rèn)為該異種蛋白是穩(wěn)定的。圖1aElisa檢測(cè)T0植物葉和果實(shí)標(biāo)本中的LTB含量圖1bElisa檢測(cè)T1植物葉和果實(shí)標(biāo)本中的LTB含量圖1cElisa檢測(cè)的植物葉和果實(shí)標(biāo)本中LTB含量的隊(duì)比較圖2a受檢小鼠中抗LTB抗體的平均終末稀釋度。柱子表示當(dāng)OD450讀數(shù)為0.1時(shí)，接受相同處理的6只動(dòng)物的平均血清稀釋度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理包括給小鼠飼喂非轉(zhuǎn)基因番茄(對(duì)照組)、給小鼠飼喂轉(zhuǎn)基因番茄糊劑(實(shí)驗(yàn)組)以及給小鼠飼喂給小鼠飼喂轉(zhuǎn)基因番茄糊劑與10mg的Quillaja提取粉末(Garuda)。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖2b該圖顯示，給小鼠飼喂表達(dá)LTB和鼠ZP3表位融合后的融合蛋白的番茄材料后抗LTB抗體效價(jià)的升高(系列1)與生育力下降(系列2)的關(guān)系。第三組的數(shù)據(jù)表示飼喂與額外的佐劑混合后的番茄材料的實(shí)驗(yàn)組小鼠。圖3經(jīng)口飼喂受檢材料對(duì)小鼠生育力的影響。每個(gè)柱子代表一個(gè)接受特定處理的6只動(dòng)物平均效應(yīng)，其中“對(duì)照”表示給飼喂動(dòng)物非轉(zhuǎn)基因番茄糊劑的結(jié)果，“實(shí)驗(yàn)”表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄糊劑的結(jié)果，“實(shí)驗(yàn)+佐劑”表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄糊劑加10mg佐劑粉末(Garuda)的結(jié)果。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4經(jīng)口飼喂受檢材料對(duì)田鼠生育力的影響。每個(gè)柱子代表一個(gè)接受特定處理的6只動(dòng)物平均效應(yīng)，其中“對(duì)照”表示給飼喂動(dòng)物非轉(zhuǎn)基因番茄糊劑的結(jié)果，“實(shí)驗(yàn)”表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄糊劑的結(jié)果，“實(shí)驗(yàn)+佐劑”表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄糊劑加10mg佐劑粉末(Garuda)的結(jié)果。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖5aLTB融合體的構(gòu)件。圖5b另外的LTB融合體的構(gòu)件。圖5c氨基端融合“盒”。圖6該圖顯示了有關(guān)三個(gè)表達(dá)在轉(zhuǎn)基因番茄(NT-1)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的免疫抗孕融合體的平均和高峰表達(dá)水平的資料。以夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為基礎(chǔ)來測(cè)定抗原決定族，其中原發(fā)的反應(yīng)是LT-B特異性的，而繼發(fā)反應(yīng)是融合抗孕蛋白特異性的(依應(yīng)用的融合體構(gòu)件的不同，可以是小鼠ZP3表位，或GnRH十肽)。LTB-GnRH2的資料顯示，融合蛋白的結(jié)構(gòu)可干擾自然的寡聚化作用，因此正如夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)融合表位的能力下降一樣，完全形成的五聚物的檢測(cè)也是明顯下降的。表1加工后的材料提高的同質(zhì)性。來自加工過的或未加工過的轉(zhuǎn)基因植物材料的抗原含量，這些植物材料是成批地混合在一起或來自特定的植物類別的沒有混合的標(biāo)本。圖7該圖顯示了用不同地切割方法時(shí)干燥時(shí)間的影響。表2不同組織的抗原回收率以及用不同方法獲得抗原的濃度。用做菜泥和冷凍干燥的方法處理番茄(生物藥)，可檢測(cè)到的抗原濃度平均增加至4.2倍。當(dāng)先用切方或四分法然后用冷凍干燥的方法處理同一材料，則可檢測(cè)到的抗原濃度增加至15.2倍。當(dāng)在冷凍之前用做菜泥的方法來使材料勻漿化時(shí)，其它的材料如轉(zhuǎn)基因番茄中的抗原一樣地被破壞。當(dāng)用冷凍干燥的方法來處理轉(zhuǎn)基因胡蘿卜材料(而沒有做菜泥或切片)時(shí)，抗原濃度與生料是相同的，與重量的下降正好成比例，進(jìn)一步提示該處理可保存抗原。圖8在多樣性的材料中隨時(shí)間而進(jìn)行的水分重吸收。圖9抗原穩(wěn)定性。圖10T2果實(shí)材料的加工對(duì)LTB含量的影響。實(shí)心柱表示收集在一起果實(shí)中的平均LTB濃度，而誤差線代表均數(shù)地標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖11受檢成年小鼠血清標(biāo)本中抗-LTB抗體的平均終末稀釋度。其中“對(duì)照”柱表示給小鼠飼喂野生型番茄粉末時(shí)的平均終末血清稀釋度，“轉(zhuǎn)基因”柱表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄時(shí)的平均終末血清稀釋度，“轉(zhuǎn)基因+佐劑”柱表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄加Quillaja提取粉末時(shí)的平均終末血清稀釋度。終末血清稀釋度是由OD450nm時(shí)的讀數(shù)為0.1時(shí)的第一個(gè)血清稀釋度。對(duì)照組的標(biāo)本數(shù)為3，轉(zhuǎn)基因組為4，轉(zhuǎn)基因+佐劑組為2。誤差線代表均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖12受檢幼鼠血清標(biāo)本中抗-LTB抗體的平均終末稀釋度。其中“對(duì)照”柱表示給成年小鼠飼喂野生型番茄粉末時(shí)其幼仔的平均終末血清稀釋度，“轉(zhuǎn)基因”柱表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄時(shí)其幼仔的平均終末血清稀釋度，“轉(zhuǎn)基因+佐劑”柱表示給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因番茄加Quillaja提取粉末時(shí)其幼仔的平均終末血清稀釋度。終末血清稀釋度是由OD450nm時(shí)的讀數(shù)為0.1時(shí)的第一個(gè)血清稀釋度。對(duì)照組的標(biāo)本數(shù)為18，轉(zhuǎn)基因組為17，轉(zhuǎn)基因加佐劑組為13。*包括OD值小于0.1的血清標(biāo)本，采用其最小的稀釋度(25個(gè)中的一個(gè))。誤差線代表均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖13截?cái)嘈r(jià)與幼仔效價(jià)的關(guān)系。所謂的截?cái)嘟K末稀釋度是指在相應(yīng)的幼仔出生前的最后一次抽取的血清標(biāo)本的抗體終末稀釋度，幼仔的終末稀釋度表示一窩幼仔的平均抗體終末稀釋度。終末血清稀釋度是由OD450nm時(shí)的讀數(shù)為0.1時(shí)的第一個(gè)血清稀釋度。截?cái)鄶?shù)為7，幼仔窩數(shù)為9，幼仔數(shù)為13。圖14a凍干的LT-B馬鈴薯材料的穩(wěn)定性研究圖。圖14b凍干的LT-B馬鈴薯材料的穩(wěn)定性研究圖。圖15凍干的HAONT細(xì)胞的穩(wěn)定性研究。圖16凍干的HA110-A11馬鈴薯材料的穩(wěn)定性研究。圖17凍干的SLT102細(xì)胞的穩(wěn)定性研究。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物生物藥的生產(chǎn)方法。本文描述的方法可用于生產(chǎn)室溫下穩(wěn)定、勻質(zhì)和藥效明顯的干燥轉(zhuǎn)基因植物材料。一般而言，可產(chǎn)生生物藥的完整的或分割過的轉(zhuǎn)基因植物可應(yīng)用文獻(xiàn)終已知的食品處理的方法進(jìn)行干燥或凍干。該干燥勻漿產(chǎn)物可被用作治療而無須進(jìn)一步的提取、純化或沉淀該藥物蛋白。因此形成的轉(zhuǎn)基因植物材料含有易于操作的特定量的粉末，并且在環(huán)境穩(wěn)定下保存12個(gè)月都可以保持穩(wěn)定。此外，本文描述的批處理技術(shù)明顯地增加了不同植物或植物組織之間可測(cè)定抗原的一致性，并通過濃縮抗原而提高藥效。轉(zhuǎn)基因植物種系可用于本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因植物種系包括雙子葉植物和單子葉植物種類。具體的植物包括(但不僅限于此)胡蘿卜，菠菜，胡椒粉，馬鈴薯，蕃茄，蘋果，小麥，裸麥，大豆，稻谷，玉蜀黍，玉黍蜀，漿果如草莓，復(fù)盆子，紫花苜蓿和香蕉的草莓類植物等。因?yàn)槿祟愑米魇澄锘騽?dòng)物的食物組分的可食用植物是雙子葉植物。雖然單子葉植物植物對(duì)動(dòng)物是有益的食品，但常用的還是雙子葉植物。依照本發(fā)明，來源于這些植物的細(xì)胞和種子作為疫苗也是有用的?？捎梦墨I(xiàn)種已知的任何方法來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)實(shí)施例中，一系列的轉(zhuǎn)基因植物種系包括煙草、馬鈴薯和胡蘿卜在溫室內(nèi)部條件的生物安全性水平下生長(zhǎng)，不應(yīng)用任何的殺蟲劑或除草劑，并讓其生長(zhǎng)到成熟階段。在本發(fā)明種有用的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)外源性蛋白。適當(dāng)?shù)耐庠葱缘鞍装?但不僅限于此)諾瓦克病毒殼蛋白(NVCP)，禽流感病毒血細(xì)胞凝集抗原(AIV-HA)，新城疫病毒神經(jīng)酰胺酶[(NDV-HN)，透明帶糖蛋白3(ZP3)，以乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，植物生成的抗體(如植物抗體)以及其它的治療性蛋白(如內(nèi)皮他丁和血管他丁)。收獲收獲轉(zhuǎn)基因植物可用手工或機(jī)器，或用文獻(xiàn)種已知的任何方法。收獲的方法可能隨不同的植物種系而不同。在一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯或胡蘿卜克整批地收獲并保存在4℃至加工處理。再舉例來說，對(duì)于將要成熟或已經(jīng)成熟的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)，可在6周地時(shí)間內(nèi)，每二周一次地收獲，并且在收獲后立即加工處理。在另一個(gè)實(shí)施例中，在將番茄果實(shí)、馬鈴薯塊莖或胡蘿卜根放在0.1％氯溶液(1％次氯酸鈉)中清洗以除去泥沙和生物負(fù)載之前，用手工將它們的葉子或莖去掉。為了保持實(shí)驗(yàn)記錄，每一批的材料被記數(shù)和稱重，并填寫收獲和加工處理記錄表格。勻漿轉(zhuǎn)基因植物材料的勻漿化既可在干燥前也可在干燥之后進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，在干燥之前進(jìn)行勻漿化，主要包括對(duì)新鮮收獲的植物材料進(jìn)行粗糙的成漿和混勻，然后對(duì)該混合材料進(jìn)行冷凍，接著是冷凍干燥。首先進(jìn)行的切片、混勻或研磨處理，將原始植物組織(水果，塊莖，葉，種子等)簡(jiǎn)化為一種漿狀混合物。該混合物被認(rèn)為既含有完整的植物細(xì)胞，也有被研磨細(xì)胞的碎片，。該處理的好處是將較大的植物器官如果實(shí)或塊莖等簡(jiǎn)化為一種便于處理的混合物，因而同源蛋白的含量不同的各個(gè)植物組織被組合成一批更加統(tǒng)一的材料。該處理能夠提供一種統(tǒng)一成批的材料，而沒有完全破壞其中所有植物細(xì)胞的完整性，因而能夠在隨后的處理階段同源蛋白的保存提供穩(wěn)定的環(huán)境。在另一個(gè)實(shí)施例中，在勻漿化之前，需要對(duì)植物材料進(jìn)行最小限度的處理。對(duì)切片、四分后的或完整的材料進(jìn)行冷凍干燥后在實(shí)施勻漿化處理。因此而生成的材料被碾碎成精細(xì)的粉末，整個(gè)都放置到單個(gè)的批處理容器內(nèi)，并用搖動(dòng)或干燥混合等機(jī)械的方法充分地混勻以獲得一勻漿混合物。分割可用文獻(xiàn)重已知的方法將整個(gè)植物或完整的植物部分的尺寸縮小。分割的方法包括(但不限于此)二等分、四分、切碎、切片、切方、做菜泥、制漿、研磨、壓碎、壓制或裂化等。如果選擇做菜泥，將新鮮收獲的果實(shí)、塊莖或根放在Stephan工業(yè)公司生產(chǎn)的垂直混合器/切片機(jī)中約一分鐘。最多每次只能處理約20磅的植物材料。當(dāng)將馬鈴薯做菜泥時(shí)，可加入一定量的水(可多至500毫升)輔助該處理過程。做菜泥時(shí)植物原料的溫度優(yōu)選不要超過2℃。在一個(gè)實(shí)施例中，然后該勻漿被傾倒在一個(gè)標(biāo)示清楚的冷凍-40℃托盤內(nèi)。為防止任何基因改變后的果漿或種子的丟失，需要用紙巾檫拭混合器/切片機(jī)。也可用任何文獻(xiàn)中已知的方法對(duì)材料進(jìn)行四分、脫皮或切片。脫水在一個(gè)實(shí)施例中，四分、脫皮或切片后的轉(zhuǎn)基因植物材料被轉(zhuǎn)移到冷凍托盤并放置于一工業(yè)用冷凍器內(nèi)在-30℃下冷凍干燥2-6天，其最高的貯存溫度25℃。因此而形成的材料被放置于一個(gè)標(biāo)示清楚的容器內(nèi)并與填寫好的收獲和加工處理記錄表格一起放回原地。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因材料在1-加侖的不銹鋼Waring混合器中切片，標(biāo)本被轉(zhuǎn)移到500毫升或1升的燒瓶中，再用一個(gè)實(shí)驗(yàn)用冷凍干燥器對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥。在這種情況下，植物材料需要在30℃下干燥1-6天。抗原濃度的檢測(cè)可用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELSA)來分析植物材料以檢測(cè)其中的待檢抗原的濃度，或用適當(dāng)?shù)哪瘜?shí)驗(yàn)檢測(cè)植物組織中含有的抗原。被用來檢測(cè)原始材料和加工過的材料中特定抗原的方法應(yīng)該始終是一致的。穩(wěn)定性和賦形劑的應(yīng)用為了評(píng)價(jià)加工過的材料在環(huán)境溫度下的穩(wěn)定性，在冷凍干燥后立即抽取10-50克的標(biāo)本，在拿到實(shí)驗(yàn)架上保存之前，將其放置于密閉袋內(nèi)，并將袋子放在另一個(gè)容器內(nèi)。保持環(huán)境溫度在23±2℃。剩余的加工后的材料被保存在4℃或-20℃。定期地從每一種保存條件下的材料中抽取標(biāo)本，用適當(dāng)?shù)姆椒ū容^其抗原濃度，以檢測(cè)保存在環(huán)境中的材料地相對(duì)穩(wěn)定性?？乖斜景l(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即轉(zhuǎn)基因植物可表達(dá)誘發(fā)抗孕的蛋白，給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料可充分地誘發(fā)一種針對(duì)該抗孕蛋白地黏膜免疫反應(yīng)，這樣就達(dá)到了有效抗孕。本發(fā)明提供了免疫抗孕地方法，即給動(dòng)物飼喂表達(dá)一種抗孕蛋白地轉(zhuǎn)基因植物，其中給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因植物可在被飼喂地動(dòng)物中誘導(dǎo)一種黏膜免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種方法以生產(chǎn)表達(dá)一種在本發(fā)明中有用的抗孕蛋白、并可飼喂動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因植物，并進(jìn)一步提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，給動(dòng)物飼喂后可在誘發(fā)動(dòng)物抗孕?？乖械鞍妆景l(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因的植物材料，其細(xì)胞表達(dá)一種可在被飼喂該植物的動(dòng)物中誘發(fā)抗孕的蛋白或多肽。在本發(fā)明中有用的抗孕蛋白包括(但不限于此)透明帶糖蛋白、促黃體激素釋放激素、促黃體激素、乳酸脫氫酶和抗精子抗原。透明帶糖蛋白透明帶是包繞卵母細(xì)胞的一層堅(jiān)固、可曲折的細(xì)胞外糖蛋白基質(zhì)。它的特征性的條紋外觀是由穿透它的無數(shù)的纖細(xì)的管道造成的。來自卵泡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)突起延伸至透明帶并且偶爾將卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜套進(jìn)內(nèi)部。卵泡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)突起也將營養(yǎng)材料轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞的表面。另外，卵母細(xì)胞的微絨毛也延伸進(jìn)透明帶并增加在卵母細(xì)胞表面的吸收能力。[參見，W.J.Hamilton，ed.，Hamilton，BoydandMossman′sHumanEmbryology，pp.27-32and54-64(1972)；J.B.Warshaw，ed.，TheBiologicalBasisOfReproductionAndDevelopmentalMedicine(1973)]。透明帶糖蛋白，在本發(fā)明中是有用的抗孕蛋白，包括各種形式的可誘導(dǎo)生成針對(duì)透明帶的抗體的基質(zhì)糖蛋白，包括透明帶糖蛋白1，2，3和4。這些糖蛋白包含有可在卵母細(xì)胞發(fā)育的晚期階段、成竇和排卵前階段的透明帶表位，也包括在排卵后才表達(dá)的抗原決定族。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明中的抗孕蛋白是ZP3糖蛋白，或者其中的一個(gè)表位。本發(fā)明中的一個(gè)抗孕蛋白表位至少是6，8，10，12，14，20，直至30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。用在此處，在本發(fā)明中有用的抗孕蛋白的一個(gè)表位是指該抗孕蛋白的能激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)的一部分。可用文獻(xiàn)中已知的方法來檢測(cè)飼喂過抗孕蛋白表位的動(dòng)物中分泌形IgA的數(shù)量，并以此來測(cè)定該抗孕蛋白激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)的能力。例如，可用應(yīng)用抗-IgA抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來檢測(cè)飼喂過抗孕蛋白表位的動(dòng)物中的分泌型IgA的數(shù)量，并與沒有飼喂該表位的動(dòng)物中的分泌型IgA的水平作比較。如用文獻(xiàn)中已知的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了這兩種不同處理組的動(dòng)物間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的差異，則提示該表位能誘發(fā)黏膜免疫反應(yīng)。本發(fā)明中有用的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的P值是至少＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005，＜0.001，＜0.0005，優(yōu)選＜0.0001。雖然不同種系動(dòng)物的透明帶的形態(tài)學(xué)特征相同，但不同動(dòng)物種系的透明帶具有不同的免疫區(qū)域或表位(Timmonsetal.，InPerspectivesinImmunoreproductionConceptionandContraception(Mathuretal.，eds.)HemispherePUBL.，pp.242-260(1988)).從不同動(dòng)物種系種分離到的一些透明帶蛋白，在本發(fā)明種可作為有用的抗孕蛋白。從豬種分離到的透明帶蛋白包括PZI，它是由Dunbar等分離到的一個(gè)分子量為40-110kD的蛋白，Biol.Reprod.241111(1981)；PZII，一個(gè)70-110kD的蛋白，PZIII，一個(gè)95-118kD的蛋白，以及PZIV，一個(gè)18-25kD的蛋白，均由Dunbar等分離到。(Biol.Reprod.32619(1985))；90K，一個(gè)89-119kD的蛋白，65K，一個(gè)61-83的蛋白，55K，一個(gè)47-66kD的蛋白，以及25K，一個(gè)18-26kD的蛋白，均由Hedrick，J.L.和Wardrip，N.J.分離到。(BIOCHEM.15763(1986))；ZP1，一個(gè)82-118kD的蛋白，ZP2，一個(gè)58-96kD的蛋白，ZP3(PPZA)，一個(gè)40-74kD的蛋白，以及ZP4，一個(gè)21kD的蛋白，均由Subramanian等分離到。(Biol.Reprod.24933(1981))；87K(ZP1/ZP2)，aReprod.29511(1983))；去糖基化的PZI，一個(gè)35kD的蛋白；PZII，一個(gè)55kD的蛋白；以及PZIII，一個(gè)80kD的蛋白，均由Skinner和Dunbar分離到，在“ImmunologicalApproachestoContraceptionandthePromotionofFertility，G.P.Talwar(ed.)NewYorkPlenumpp.251-268(1986)”一書中有描述；以及分子量為45kD的去糖基化的ZP3，由Sacco等分離到的77-97kD的蛋白58K，一個(gè)40-70kD的蛋白，也是由Yurewicz等分離到(Biol.J.Reprod.Fertil.76575(1986)).從兔中分離到的透明帶蛋白包括RZI，RZII，和RZIII，其分子量分別為68-125kD，80-100.5kD，和100-132kD，均由Dunbar等分離到。(Biol.Reprod.241111(1986))ZP1，ZP2，andZP3的分子量分別為100-118kD，83-110kD，和80-92kD，均由Sacco等分離到(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167318(1981))；去糖基化的RZI和RZII的分子量分別為65kD，和80kD均由Skinner和Dunbar分離到。在“ImmunologicalApproachestoContraceptionandPromotionofFertility.G.P.Talwar(ed.).NewYorkPlenum，pp.251-268(1986)”一書中有描述；以及去糖基化的RZIII，一個(gè)90kD的蛋白，由Timmons和Dunbar分離到。(Biol.Reprod.361275(1987))。已經(jīng)分離到的小鼠透明帶蛋白包括ZP1，ZP2和ZP3；其分子量分別為200kD，120kD，和83kD，均由Bleil和WASSARMAN分離到(Dev.Biol.76185(1980))；以及分子量分別為166-122kD和90-92kD的ZP1和ZP2，由Sacco等分離到(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167318(1981)).Bleil和Sacco等報(bào)告了小鼠ZP1和ZP2分子量的差異，這可能是因?yàn)锽leil用的是2D-聚丙烯酰胺凝膠非遞減電泳而Sacco用2D-聚丙烯酰胺凝膠遞減電泳。貓的透明帶蛋白CZI和CZII是由Maresh和DunbarJ分離到(Exp.Zool.244299(1987))，其分子量分別是50-110kDand90-110kDMaresh和Dunbar(J.Exp.Zool.244299(1987))，分離到狗的透明帶蛋白DZI，DZII和DZIII其分子量分別為50-110kD，70-95kD，和90-100kD。Sacco等(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.167318(1981))描述了松鼠猴的透明帶蛋白ZP1，ZP2，ZP3，和ZP4，其分子量分別為63-78kD，63-70kD，47-51kD，和43-47kD。在同一個(gè)出版物中Sacco等描述了人透明帶蛋白ZP1，ZP2，和ZP3，其分子量分別為80-120kD，73kD，和59-65kD。除了上述的透明帶肽外，已有一些動(dòng)物物種的透明帶糖蛋白編碼核酸序列被闡明，因?yàn)樗鼈兙幋a抗孕蛋白，所以在本發(fā)明中是有用的。例如，Ringuette等(Dev.Biol.，(1988)127287-295)以及Liang等(Mol.Cell.Biol.，(1990)101507-1515)已經(jīng)分別報(bào)道了編碼透明帶蛋白ZP3和ZP2的小鼠DNA序列。這些克隆是通過用抗-ZP3和抗-ZP2來篩查小鼠的cDNA文庫的方法而獲得。在小鼠的ZP3和ZP2之間沒有發(fā)現(xiàn)序列同源型。Ringuette等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1986)834341-4345)報(bào)道了小鼠的部分ZP3cDNA克隆。該克隆能與小鼠、大鼠、狗、牛以及人的基因組DNA雜交，但不能與豬或兔的基因組DNA雜交，除非采用低嚴(yán)謹(jǐn)度的條件來進(jìn)行雜交。Ringuette描述了全長(zhǎng)的ZP3cDNA序列(Dev.Biol.(1988)127287-295)表現(xiàn)出一個(gè)種系特異性的mRNA，即相對(duì)短的5和3′端非翻譯區(qū)，約1317個(gè)核苷酸的開放讀碼框以及另外的大約2000-3000個(gè)核苷酸的poly-A尾。Ringuette也發(fā)現(xiàn)大鼠、兔、狗核牛卵巢種存在能與小鼠的ZP3cDNA雜交的mRNA的轉(zhuǎn)錄，并且ZP3的轉(zhuǎn)錄物有相似的分子量。Liang等(Mol.Cell.Biol.，(1990)101507-1515)的實(shí)驗(yàn)也顯示ZP2的核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列與ZP3的明顯不同，雖然它也有相同的5′和3′端非編碼區(qū)的短基序。ZP2mRNA被報(bào)道有2,139個(gè)核苷酸組成的單個(gè)開放讀碼框，編碼713個(gè)氨基酸組成的分子量為80,217D的多肽。Chamberlin和Dean，(Dev.Biol.(1989)131207-214)以及Kinloch，R.A.等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，(1988)856409-6413)已經(jīng)報(bào)道過ZP3基因的克隆。小鼠ZP3基因被報(bào)道有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位的長(zhǎng)度為8.6kbp。Kinloch等(Dev.Biol.(1990)142414-421，)報(bào)道了用一個(gè)小鼠的ZP3DNA作為探針從一個(gè)倉鼠基因組文庫中克隆倉鼠基因組ZP3DNA。倉鼠的ZP3基因有一個(gè)長(zhǎng)度為7900個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄單位，被發(fā)現(xiàn)有7個(gè)內(nèi)含子核8個(gè)外顯子。倉鼠的ZP3蛋白與小鼠的ZP3蛋白的同源性大約為81％。倉鼠的ZP3轉(zhuǎn)錄單位有1266個(gè)核苷酸，比小鼠的ZP3mRNA.少6個(gè)核苷酸。Chamberlain和Dean(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876014-6018)報(bào)道了用一個(gè)小鼠的ZP3cDNA作為探針從一個(gè)人基因組DNA文庫中克隆人ZP3。人ZP3基因含8個(gè)外顯子，其轉(zhuǎn)錄單位的長(zhǎng)度為18.3kbp。外顯子的長(zhǎng)度與小鼠ZP3的8個(gè)外顯子的長(zhǎng)度幾乎相同，并且其編碼區(qū)的核苷酸序列的同源性為74％。人ZP3的轉(zhuǎn)錄與小鼠ZP3mRNA非常相似。二者均短的5′和3′端的非翻譯區(qū)，并且二者都只有一個(gè)1272個(gè)核苷酸組成的開放讀碼框，編碼424個(gè)氨基酸組成的蛋白。授權(quán)給Dunbar的U.S.專利第4,996,297號(hào)，報(bào)道了用抗-ZP1核抗-ZP2抗體作為篩選探針分離編碼兔ZP1和ZP2蛋白的三個(gè)兔透明帶克隆。在Dunbar的專利中的圖4中命名為P2和P3的序列表示長(zhǎng)度分別為812和705個(gè)核苷酸兔的ZPcDNA。Schwoebel等(J.Biol.Chem.(1991)2667214-7219)用種系雜交親和性純化的抗血清分離到了一個(gè)編碼55-kD兔透明帶蛋白的全長(zhǎng)序列cDNA(被命名為rc55)并描述其特征。該cDNA編碼的蛋白與Liang描述的小鼠的ZP2蛋白有某些相似性。但是，當(dāng)將rc55與小鼠的ZP2蛋白比較時(shí)卻沒有發(fā)現(xiàn)有同源性。其它在本發(fā)明種有用的ZP糖蛋白的核苷酸序列包括(但不限于此)促黃體激素釋放激素(LHRH，基因庫登記號(hào)No.X01059)，人ZP3A糖蛋白(基因庫登記號(hào)No.XM004616)，人ZPB糖蛋白(基因庫登記號(hào)No.XM001779)，牛ZPA核B糖蛋白(基因庫登記號(hào)Nos.AB042653；AB042652)，雞ZP1核3糖蛋白(基因庫登記號(hào)Nos.AJ289697；AB031033)，小鼠ZP1，2，和3糖蛋白(基因庫登記號(hào)Nos.Nos.AJ289697；AB031033)，小鼠ZP1，2，和3糖蛋白(基因庫登記號(hào)Nos.NM011776；[NM011775]；NM009580)，田鼠ZP3糖蛋白(基因庫登記號(hào)No.AF304487)，dunnartZPA(基因庫登記號(hào)No.AF263025)，藍(lán)尾袋鼯ZPA和B(基因庫登記號(hào)Nos.AF263014；AF263013)，藍(lán)尾袋鼯ZP2和3(基因庫登記號(hào)Nos.AF079525；AF079524)豬ZP1，2，和3糖蛋白(基因庫登記號(hào)Nos.S74651；E07737；D45064)，大鼠ZP1，2，和3糖蛋白(基因庫登記號(hào)Nos.D78482；[AB000929]；[AB000928]，)猿ZP1和2糖蛋白(基因庫登記號(hào)Nos.Y10822；Y10767)，貓ZP2和3(基因庫登記號(hào)Nos.E07930；E06506)，狗ZP2和3(基因庫登記號(hào)Nos.D45064；D45070)，以及袋鼠ZP3糖蛋白，澳大利亞專利No.AU78554/98).術(shù)語“透明帶糖蛋白”，用在此處，包括完整的ZP蛋白、酶解或化學(xué)變形形式的ZP蛋白、或二者的混合體。此外，透明帶糖蛋白還包括分離的ZP蛋白的抗原決定簇，本來它們是沒有免疫原性的，但當(dāng)它們被用化學(xué)方法連接到免疫原性攜帶分子(如LT-B)時(shí)，就可用作免疫原，這種情況下列就會(huì)描述到。一個(gè)透明帶的抽提物包括一個(gè)完整的抽提物，三個(gè)組成透明帶的單個(gè)糖蛋白部分中的一個(gè)或更多。其它的抗孕蛋白除了上述的透明帶糖蛋白以外的其它抗孕蛋白或它們的片段，在本發(fā)明中可用作抗孕蛋白的其它蛋白。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，可供選擇的抗孕蛋白包括(但決不是僅限于此)GnRH(GnRH)、促黃體激素(LH)，乳酸脫氫酶(LDH)和抗精子抗原。除了這些抗孕蛋白外，在本發(fā)明中有用的編碼抗孕蛋白的核苷酸序列也能用于產(chǎn)生表達(dá)該被編碼的抗孕蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。例如，在本發(fā)明中有用的編碼GnRH的核苷酸序列包括(但不限于此)人促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.XM005041)，大鼠促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.M31670)，刷尾負(fù)鼠GnRH基因庫登記號(hào)No.AF193516，以及地鼠GnRH基因庫登記號(hào)No.AF107315).在本發(fā)明中有用的編碼促黃體激素的核苷酸序列包括(但不限于此)大鼠促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.D00576)，豬促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.D00579)，犀牛促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.AF024521)，貘促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.AF047606)，馬促黃體激素(基因庫登記號(hào)Nos.Y16326；Y16265)，牛促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.ML1506)，以及狗促黃體激素(基因庫登記號(hào)No.Y00518)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明中的抗孕蛋白包括抗精子抗原。已經(jīng)證明用完整的精子提取物對(duì)雌性和雄性動(dòng)物進(jìn)行免疫可導(dǎo)致不育(Tungetal.，(1979)J.Reprod.Immunol.20931)。因此，本發(fā)明中的抗孕蛋白可含有精子相關(guān)蛋白或編碼該蛋白的核苷酸序列。這些精子相關(guān)蛋白包括(但不限于此)PH30(美國專利No.5,935,578)，PH34[美國專利No.5,723,305]，SP17(美國專利No.5,814,456)，SP22(美國專利No.6,197,940)，SP56(小鼠SP56基因庫登記號(hào)No.U17108)，LDHC4(人LDHC4基因庫登記號(hào)No.J02938；美國專利No.5,891,992；Goldburg″LDH-Xasasperm-specificantigen″，inT.WegmannandT.J.Gill(eds.)，ReproductiveImmunology，OxfordUniversityPress，1981，fertilin(小鼠fertilin基因庫登記號(hào)No.AF167406；人fertilin基因庫登記號(hào)No.AJ133005；樹地鼠fertilin基因庫登記號(hào)No.Y15965)；狒狒fertilin基因庫登記號(hào)No.Y15520)；大猩猩fertilin基因庫登記號(hào)No.Y15492)；小絹猴fertilin基因庫登記號(hào)No.Y15512)；牛fertilin基因庫登記號(hào)No.AF086808；and大鼠fertilin基因庫登記號(hào)No.Y08616)。黏膜靶蛋白在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，給動(dòng)物飼喂轉(zhuǎn)基因植物，該植物表達(dá)上述一種或更多中抗孕蛋白的一部分或其表位。文獻(xiàn)中已經(jīng)清楚地知道，免疫原性物質(zhì)的黏膜靶向性高度地依賴于顆粒大小或其自然親和力是否能達(dá)到有效地保證被M細(xì)胞識(shí)別的程度。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過給動(dòng)物飼喂低劑量的某些種類的蛋白可有效地刺激黏膜免疫系統(tǒng)。特別是當(dāng)這些蛋白具有能和黏膜層細(xì)胞表面不同的糖脂和糖蛋白特異地結(jié)合地特性時(shí)，更能達(dá)到刺激黏膜免疫的效應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了一種含有輔助免疫原性蛋白的融合蛋白，其中的輔助蛋白與復(fù)雜的免疫抗孕蛋白相融合，或者如果需要更小的可溶性抗孕蛋白，則讓輔助蛋白和諸如ZP3表位或GnRH等融合，以增強(qiáng)抗孕性表位的免疫原性。依照本發(fā)明，在本發(fā)明中有用于刺激黏膜免疫反應(yīng)的輔助蛋白包括抗原性蛋白如碘胺脒毒素B(StxB)(基因庫登記號(hào)No.AJ132761)，葡萄球菌腸毒素B(SEB)(基因庫登記號(hào)No.M11118)，LT-B(LT-B)(基因庫登記號(hào)No.AB011677，大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素A亞單位(LT-A)(基因庫登記號(hào)No.AB011677，)諾瓦克病毒殼蛋白(NVCP)(基因庫登記號(hào)No.AF093797)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(基因庫登記號(hào)No.AF090842)。當(dāng)需要組合抗原以便將免疫原性遞送到體內(nèi)時(shí)，則上述的抗原蛋白需要組合成抗原顆粒和/或組合物。下文將描述怎樣構(gòu)建一個(gè)融合蛋白，既含有本發(fā)明中有用的抗孕蛋白又含有能增強(qiáng)黏膜免疫原性的輔助蛋白。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)已經(jīng)證實(shí)乙型肝炎表面抗原可在植物體內(nèi)表達(dá)成病毒樣顆粒(VLPS)(Masonetal.，1992)。該病毒樣顆粒與已經(jīng)被批準(zhǔn)用于胃腸外免疫接種的重組酵母菌來源的疫苗相似，乙型肝炎表面抗原顆粒的形成需要該肽以其四個(gè)跨膜域插入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上，然后該顆粒出芽到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。在小鼠動(dòng)物模型中的研究表明，植物來源的乙型肝炎表面抗原保持有B和T細(xì)胞抗原決定族(Thanavalaetal.，]1995).。植物細(xì)胞可產(chǎn)生一種具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原的病毒樣顆粒的發(fā)現(xiàn)提示，植物是表達(dá)動(dòng)物、病毒或細(xì)菌等裝配成復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白的可能系統(tǒng)。因此，已經(jīng)鑒定出了生成具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原顆粒素所必須的遺傳學(xué)因素。這些因素，如調(diào)控和編碼區(qū)域，可被組合到一個(gè)編碼有本文描述的抗孕蛋白的載體中，以提供一種方法在植物中擴(kuò)增表達(dá)該抗原蛋白。諾瓦克病毒殼蛋白(NVCP)諾瓦克病毒殼蛋白在植物中的表達(dá)及病毒樣顆粒的組裝，以及在小鼠中經(jīng)口產(chǎn)生的免疫原性已經(jīng)有報(bào)道(Masonetal.，1996).。諾瓦克病毒殼蛋白占總蛋白的0.3％，在煙草的葉子和馬鈴薯的塊莖細(xì)胞內(nèi)以大約60％的有效性組裝成病毒樣顆粒。當(dāng)用負(fù)染電鏡技術(shù)觀察時(shí)，該空殼體與在一個(gè)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的完全不能區(qū)分。而且，當(dāng)采用強(qiáng)飼法給藥4次，每次劑量低至10μg，或采用直接飼喂馬鈴薯塊莖切片的方法給藥4次，每次劑量低至50μg，二者均能使小鼠產(chǎn)生經(jīng)口的免疫原性。該植物疫苗既可刺激血清IgG的產(chǎn)生，也可刺激腸黏膜IgA的產(chǎn)生。因此，已經(jīng)鑒定出生產(chǎn)足夠數(shù)量的諾瓦克病毒殼蛋白的病毒樣顆粒以產(chǎn)生有效免疫原性的方法?？梢勒毡疚拿枋龅幕驍U(kuò)增方法在植物中產(chǎn)生更高水平的抗原。大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)LT是一種強(qiáng)烈的黏膜免疫原，并且也是一種刺激針對(duì)與其一起用藥的抗原的免疫反應(yīng)(Clementsetal.，1988)。在植物中表達(dá)LT的B亞單位(LT-B)組裝成能結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂GM1]的活性寡聚體(Haqetal.，1995)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在LT-B的羧基末端添加一個(gè)微粒體固位序列(SEKDEL)可增加它在植物組織中的聚集，同時(shí)保留結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂的能力和其免疫原性。在經(jīng)口飼喂小鼠LT-B的實(shí)驗(yàn)中，用強(qiáng)飼法飼喂煙草葉提取物或?qū)ⅠR鈴薯塊莖不經(jīng)過處理(而不是切成片快)直接飼喂都能刺激血清和腸黏膜抗LT-B抗體的產(chǎn)生(Haqetal.，1995)。來自這些動(dòng)物的抗LT-B血清抗體表現(xiàn)出抑制LT活性，提示它具有作為保護(hù)性疫苗的潛在價(jià)值。用于抗孕蛋白表達(dá)的載體應(yīng)用本發(fā)明的中心是一個(gè)核酸構(gòu)建體的構(gòu)建和運(yùn)用，該核酸構(gòu)建體含編碼一種抗孕蛋白的核酸系列，有時(shí)也有編碼一種黏膜靶蛋白的核酸序列，其中該核酸構(gòu)建體能被導(dǎo)入到選定的植物細(xì)胞以生成一種表達(dá)該抗孕蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)首先的實(shí)施例中，該核酸構(gòu)建體優(yōu)選是一種植物表達(dá)載體，一種可制備并能在植物細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒。正如文獻(xiàn)已知的，該構(gòu)建體的核酸可含有DNA、RNA、合成的核酸、或其中幾種的聯(lián)合體。在數(shù)個(gè)實(shí)施例中，核酸構(gòu)建體既含有抗孕蛋白也含有一種黏膜靶蛋白，此時(shí)編碼該構(gòu)建體的任一部分的序列根據(jù)需要均可插入其它的序列(如調(diào)控序列)。可利用文獻(xiàn)中已經(jīng)熟知的質(zhì)粒主鏈來生成本發(fā)明中有用的核酸構(gòu)建體，依照本發(fā)明，該中構(gòu)建體可被用于介導(dǎo)抗孕蛋白在植物細(xì)胞中的表達(dá)。文獻(xiàn)中有已知的可用作起始材料的適當(dāng)質(zhì)粒。下列作者已經(jīng)描述過可用于轉(zhuǎn)化植物組織的合適質(zhì)粒，deFramond等.(Biotechnology1983，263)，An等.(EMBO1985，277)，Rothstein等.(Gene1987，53)，具體的質(zhì)粒包括但不限于pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)，pIBT210(Haqetal.，(1995)Science268714)，pGEM(Promega，Medison，WI)pGPTV.kan(Beckeretal.，(1992)PlantMol.Biol.201195-1197.)，Agrobacterium-Tiplasmid(Whiteetal.，PlantBiotechnologyKungandArntzeneds.ButterworthPub.，Boston，MA，1989)除了這些載體外，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了許多其它的載體可適合用于本發(fā)明。在本發(fā)明中有用的載體構(gòu)建體優(yōu)選包含了編碼抗孕蛋白的DNA序列。通過傳統(tǒng)的方法獲得編碼抗孕蛋白的DNA序列，并將它插入到適合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體中。例如，可從基因組克隆的基因庫中分離到DNA序列。或者通過反轉(zhuǎn)錄的方法制備DNA序列。然后可用下列許多種已知的技術(shù)將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，因此生成轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織和植物。也可依據(jù)抗孕蛋白的氨基酸序列或該蛋白已知氨基酸序列的一部分，用化學(xué)的方法合成其DNA序列。可應(yīng)用數(shù)個(gè)文獻(xiàn)種重要的方法來測(cè)定一種抗孕蛋白的氨基酸序列(參見，例如，Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology[3RD]Ed.JohnWiley&Sons，Inc.1995)。編碼抗孕蛋白或其一部分的DNA序列被用適當(dāng)?shù)姆绞讲迦氲竭m當(dāng)?shù)妮d體種，抗孕蛋白才能正確地表達(dá)。換句話說，該DNA序列必須以正確地方法和讀碼框排列，這樣DNA序列在植物種地表達(dá)才能有正確地氨基酸順序。與傳統(tǒng)的方法一致的是，一般需構(gòu)建一個(gè)嵌合DNA序列，它包含有一個(gè)在植物組織種有功能的啟動(dòng)子以及編碼一種抗孕蛋白的DNA序列。該DNA序列可能還含有在植物組織種有功能的3′端非編碼序列?？赏ㄟ^在體外將編碼抗孕蛋白或其中一部分的DNA序列插入到一個(gè)已知植物轉(zhuǎn)化載體的限制性位點(diǎn)處而生成嵌合DNA序列?；蛘?，先構(gòu)建嵌合基因，然后將其插入到載體以生成一個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體。在本發(fā)明種有用的載體常常被插入到一個(gè)原核宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌，在那里載體的數(shù)目通過復(fù)制而被擴(kuò)增。應(yīng)用文獻(xiàn)中已知的方法，可將這些載體再從原核宿主細(xì)胞中分離出來，然后被用來轉(zhuǎn)化有關(guān)的植物宿主細(xì)胞。本發(fā)明中的啟動(dòng)子序列包括但不限于依照本發(fā)明在植物宿主細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子。依照本發(fā)明構(gòu)建的DNA構(gòu)建體優(yōu)選有一個(gè)可操作地連接在目的核苷酸序列5′端地植物功能性啟動(dòng)子。首先的啟動(dòng)子選自CVMV，γSein，Gelvin啟動(dòng)子CAMV35S，番茄E8，patatin，泛素，甘露糖合成酶(mas)，稻谷ACTIN1，大豆球蛋白(Gyl)，大豆植物存儲(chǔ)蛋白(VSP)，以及粒結(jié)合淀粉合成酶(gbss)。本發(fā)明的基因構(gòu)建體中也可包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域，比如煙草腐蝕病毒(TEV)增強(qiáng)子，這在其它地方已經(jīng)有所描述(CARRINGTON，)etal.(1990)。有時(shí)，本發(fā)明中的基因構(gòu)建體可含有至少一個(gè)植物性儲(chǔ)存蛋白(VSP)信號(hào)肽序列，例如一個(gè)可操作地連接到編碼目的蛋白地核苷酸序列5′的aS或aL序列(Masonetal.1988)。編碼抗孕蛋白的DNA以及可選黏膜靶蛋白DNA構(gòu)建體的序列優(yōu)選是處于單個(gè)啟動(dòng)子的控制之下，由此表達(dá)的融合蛋白含有所有的三個(gè)成分。這就保證了該抗孕蛋白和黏膜靶蛋白以等比例的方式合成，因此導(dǎo)致抗孕蛋白和黏膜靶蛋白的表達(dá)水平相似。或者，該黏膜靶蛋白被第二個(gè)啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)，該啟動(dòng)子可以雙向的方式插入，或啟動(dòng)子是插入到一個(gè)其3′端核酸序列編碼抗孕蛋白、而其5′核酸序列編碼黏膜靶蛋白的基因構(gòu)建體中。在本發(fā)明中有用的載體除了能攜帶上述的DNA構(gòu)建體外，也可包含另外的選擇性標(biāo)記基因。依照本發(fā)明有用的標(biāo)記基因可包含有編碼選擇性標(biāo)記物的基因，比如抗生素抗性基因如細(xì)菌的四環(huán)素抗性基因。依照本發(fā)明，四環(huán)素抗性基因的組合使得在質(zhì)粒制備的過程中應(yīng)用四環(huán)素作為選擇劑成為可能。應(yīng)用四環(huán)素抗性基因的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是四環(huán)素在大腸桿菌中不降解，因此在在發(fā)酵的過程中不需要加入更多的四環(huán)素。此外，四環(huán)素抗性基因比編碼氨卡青霉素抗性基因更適合應(yīng)用的原因是在臨床上四環(huán)素更少被用作抗生素給病人使用，因此應(yīng)用該抗性基因可能會(huì)較少地干擾臨床抗生素的應(yīng)用。另外的依照本發(fā)明有用的標(biāo)記基因包括生物殺滅劑特別是抗生素的抗性基因，如卡那霉素、G418(紅霉素類似物)，博來霉素，潮霉素，氯霉素或諸如此類。另外的依照本發(fā)明有用的標(biāo)記基因也包括除草劑的抗性基因如有機(jī)磷酸鹽、二丙氨酸磷酸鹽。另外的依照本發(fā)明有用的標(biāo)記基因還包括β-葡糖苷酸酶(GUS)、綠色熒光蛋白(GFP)，或諸如此類。本發(fā)明應(yīng)用的特別標(biāo)記物應(yīng)是能將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞從那些缺乏需導(dǎo)入核苷酸的細(xì)胞中挑選出來。用于本發(fā)明的載體也可有一個(gè)根癌農(nóng)桿菌復(fù)制起點(diǎn)，比如希望將該載體保持在根癌農(nóng)桿菌以便以后用該系統(tǒng)來轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在這種情況下，編碼目的蛋白(即抗孕蛋白)的核苷酸序列被左和右轉(zhuǎn)化DNA(轉(zhuǎn)化DNA，Ti質(zhì)粒上能轉(zhuǎn)移到植物基因組中的DNA片段)邊緣區(qū)域所包圍以便促進(jìn)它向宿主植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。根據(jù)文獻(xiàn)(Ausubel，supra)中已知的方法，本發(fā)明中的表達(dá)載體可轉(zhuǎn)染到細(xì)菌株比如大腸桿菌以擴(kuò)增該瞬時(shí)表達(dá)盒。純化后的表達(dá)盒可被加入到根癌農(nóng)桿菌并用電脈沖或熱休克處理以導(dǎo)入其中的載體，在那里它以一個(gè)穿梭載體的形式保留其完整性。根癌農(nóng)桿菌中的一個(gè)輔助Ti質(zhì)?？商峁-DNA從該穿梭質(zhì)粒中直接轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中所必需的毒性VIR基因?；蛘撸撦d體能和腫瘤誘導(dǎo)性(Ti)質(zhì)粒進(jìn)行同源重組并將該瞬時(shí)表達(dá)盒與腫瘤誘導(dǎo)性(Ti)質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)行交換。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，其中被導(dǎo)入植物細(xì)胞的DNA構(gòu)建體可被穩(wěn)定地整合到染色體。轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物和植物材料(如葉、果實(shí)、根等)，它們的植物細(xì)胞可表達(dá)一種或更多的在本發(fā)明中有用的抗孕蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，將上述的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到目的植物細(xì)胞，而該基因構(gòu)建體在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)可使植物細(xì)胞產(chǎn)生抗孕蛋白。將核苷酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞的方法將基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的方法包括(但不限于此)根癌農(nóng)桿菌-Ti質(zhì)粒系統(tǒng)。根癌農(nóng)桿菌中的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒包含有被叫作轉(zhuǎn)化DNA(T-DNA)的質(zhì)粒DNA片段，它可整合到植物宿主細(xì)胞基因組中。首先，構(gòu)建一個(gè)可在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體。該質(zhì)粒含有編碼目的蛋白(如抗孕蛋白)的DNA序列并且該DNA序列被轉(zhuǎn)化DNA的邊緣序列所包圍，這樣界定了可被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并整合到植物基因組的DNA片段的界限。通常一個(gè)編碼選擇性標(biāo)記物(如編碼抗生素如卡那霉素的抗性基因)的基因也被插入到左側(cè)邊緣序列(LB)和右側(cè)邊緣序列(RB)之間。該基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞植物細(xì)胞中的表達(dá)可提供了陽性選擇方法用來對(duì)那些包含有整合T-DNA區(qū)域的植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定。為了隨后能將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物中，所用的農(nóng)桿菌株必須包含有一套可誘導(dǎo)性毒性(vir)基因，它對(duì)于將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中是必需的。上述基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的根癌農(nóng)桿菌是冠狀癭瘤的病原體，冠狀癭瘤是許多雙子葉植物和裸子植物的罹患的疾病DeCleene，M.etal.，Bot.Rev.42，389(1976)，它可導(dǎo)致在感染部位的植物組織內(nèi)形成腫瘤或癭瘤。該農(nóng)桿菌桿菌系統(tǒng)的開發(fā)使得許多植物組織的轉(zhuǎn)化成為可能[參見，例如Schell，J.等Biotechnology1，175(1983)；Chilton，M-D，ScientificAmerican248，50(1983)。能用這種方式轉(zhuǎn)化的代表性組織包括煙草(Barton，K.etal.，Cell32，1033(1983))；番茄[Fillatti，J.etal，Biotechnology5，726(1987)；sunflowerEverett，N.etal.，Biotechnology5，1201(1987)；棉花[Umbeck，P.etal.，Biotechnology5，263(1987)；油菜籽[Pua，E.etal.，Biotechnology5，815(1987)；馬鈴薯[FacciottiD.etal.，Biotechnology3，241(1985)；白楊[Pythoud，F(xiàn).etal.，Biotechnology5，1323(1987)；大豆[Hinchee，M.etal.，Biotechnology6，915(1988)。其它的植物也可用這些方法的常規(guī)拓展或改進(jìn)而得到轉(zhuǎn)化。可選擇許多的農(nóng)桿菌株或質(zhì)粒構(gòu)建策略用來對(duì)植物的基因轉(zhuǎn)化的優(yōu)化。例如，根癌農(nóng)桿菌可能并不是唯一能用的農(nóng)桿菌株。其它的根癌農(nóng)桿菌株如發(fā)根農(nóng)桿菌也許更適合于某些用途。發(fā)根農(nóng)桿菌可誘發(fā)許多雙子葉植物種系的根須的形成，它攜帶有一個(gè)叫做Ri(根誘生)質(zhì)粒的染色體外元件，它以于根癌農(nóng)桿菌的Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒相似的方式起作用。已經(jīng)開發(fā)出與根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法相似的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法并已成功地用于轉(zhuǎn)化，如苜蓿[SUKHAPINDA，K.etal.，PlantMol.Biol.8，209(1987)。植物組織接種方法隨植物種系和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的不同而不同。轉(zhuǎn)化馬鈴薯的方便的方法是葉盤方法，但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的實(shí)施可生成一種植物外植體，它能為植物整體的分化和再生作用的啟動(dòng)提供良好來源。在某些情況下可能需要加入輔助組織。其它的方法，比如應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌的再生原生質(zhì)體的體外轉(zhuǎn)化也可能被用來獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。數(shù)個(gè)所謂的“直接”基因轉(zhuǎn)移方法已經(jīng)被用來轉(zhuǎn)化植物和植物組織而不需要用農(nóng)桿菌來介導(dǎo)，比如從原生質(zhì)體發(fā)生的植物再生作用(Evans，D.A.etal.，HandbookofPlantCellCulture1，124(1983)。當(dāng)可從原生質(zhì)體再生成一種植物種系時(shí)，可用直接基因轉(zhuǎn)移方法而轉(zhuǎn)化不依賴于根癌農(nóng)桿菌的應(yīng)用。在原生質(zhì)體的直接轉(zhuǎn)化中，可應(yīng)用化學(xué)劑或電場(chǎng)來加強(qiáng)原生質(zhì)體對(duì)外源性基因物質(zhì)的攝入。該外源性物質(zhì)于是可被整合到核基因組中。早期的工作是在雙子葉植物煙草屬中的煙草中進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)表明外源DNA被整合到基因組中并被傳遞到子代植物中[Paszkowski，J.等EMBOJ，32717(1984)；Potrykus，etal.Mol.Gen.Genet.199169(1985)。也曾用這種方法對(duì)單子葉原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化例如，小麥屬[LorzH.等Mol.Gen.Genet.199178(1985)；黑麥草屬(意大利黑麥草)Potrykus，etal.等，Mol.Gen.Genet199，183(1985)。玉米[Rhodes，C.，等Biotechnology5，56(1988)；黑色墨西哥甜玉米[Fromm，M.等Nature319，719(1986).。其它從原生質(zhì)體再生而來的植物包括稻谷[Abdulah，R.等Biotechnology4，1987(1987)；油菜籽[Kansha，等PlantCellReports5，101(1986)；馬鈴薯[Tavazza，R.等PlantCellReports5，243(1986)；茄子，Sihachaki，D.等PlantCell，Tissue，OrganCulture11，179(1987)；以及黃瓜[Jia，S-R.，等J.PlantPhysiol.124，393(1986)。用電脈沖處理原生質(zhì)體可影響將DNA導(dǎo)入到植物原生質(zhì)體的作用，此時(shí)需要將適當(dāng)?shù)腄NA用于這個(gè)被稱作電穿孔的處理中。用這種方法時(shí)，需分離原生質(zhì)體并將其懸浮在甘露醇溶液中。加入超螺旋或環(huán)形質(zhì)粒。混勻溶液并將其置于室溫下400V/cm的電脈沖中少于10到100微秒。此時(shí)發(fā)生了一種可逆性的生理性細(xì)胞膜的裂隙，因此DNA可被吸納到原生質(zhì)體內(nèi)。已有證據(jù)顯示脂質(zhì)體融合法也是一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法。應(yīng)用這種方法時(shí)，脂質(zhì)體的細(xì)胞膜與脂質(zhì)體攜帶的目的基因集合在一起。當(dāng)發(fā)生膜的融合時(shí)，該外源基因因此被轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體內(nèi)[Dehayes，A.等EMBOJ.4，2731(1985)。聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已經(jīng)在N煙草(雙子葉植物)核黑麥草(單子葉植物)中被應(yīng)用過。它是建立在鎂離子、聚乙二醇，以及可能還有鈣離子之間協(xié)同作用的基礎(chǔ)之上的用于直接基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法[Negrutiu，R.etal.，PlantMol.Biol.8，363(1987)?；蛘撸€可以用微注射的方法將外源性DNA導(dǎo)入到細(xì)胞或原生質(zhì)體中。用一種做工精細(xì)地玻璃針可將質(zhì)粒DNA溶液直接注射到細(xì)胞內(nèi)。另外開發(fā)地用于直接基因轉(zhuǎn)移地方法包括攜帶DNA的“微彈”、“炮轟”細(xì)胞[Klein，T.M.等Nature327，70(1987)。應(yīng)用這種“生物導(dǎo)向”的方法中，包被有外源性DNA的鎢或金顆粒加速?zèng)_向目標(biāo)細(xì)胞。在洋蔥中至少得到了外源基因的瞬時(shí)表達(dá)。該方法被用來將DNA導(dǎo)入到懸浮培養(yǎng)的黑色墨西哥甜玉米細(xì)胞核玉米的未成熟胚胎以及大豆的原生質(zhì)體中[Klein，T.M.etal.，Biotechnology6，559(1988)。“用微彈炮轟”方法已經(jīng)得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉蜀黍，煙草，大麥，燕麥，小麥，稻，胡蘿卜，香蕉和大豆培養(yǎng)物。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也可用這種方法而得到再生和復(fù)原(McCabe，D.E.等Biotechnology6，923(1988))。按照下述方法轉(zhuǎn)化阿布屬植物的花以生產(chǎn)轉(zhuǎn)化種子。農(nóng)桿菌通過真空滲透進(jìn)發(fā)育中的花，由此生成的種子以抗性標(biāo)記物篩選外源性基因的表達(dá)。雄蕊/花粉，子房/卵等被轉(zhuǎn)化，如果此時(shí)已發(fā)生了受精作用，則甚至發(fā)育中的接合體也能被轉(zhuǎn)化。這種方法曾被用來將含有一個(gè)在At2S-2種子啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的rep基因的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)阿布菌屬植物中。轉(zhuǎn)化后，用傳統(tǒng)的方法挑選或篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植物組織?？捎靡阎姆椒ㄊ拱猩鲜銮逗螪NA序列的植物組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生，這些方法包括那些上述參考文獻(xiàn)中描述的方法。那些最容易用這些方法再生的植物種系(因而在本發(fā)明中屬首選)包括(但不限于此)玉蜀黍，向日葵，油菜籽，苜蓿，煙草，棉花，紫花苜蓿，稻谷，馬鈴薯，茄子，黃瓜和大豆。篩選再生的植物用于下述方法的轉(zhuǎn)化。篩選再生植物的子代并將持續(xù)表達(dá)整合DNA序列的植物挑選出來以生成改善的植物合種子系列?？捎迷S多的技術(shù)包括經(jīng)典繁殖技術(shù)、原生質(zhì)體融合、核轉(zhuǎn)移技術(shù)核染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)來將DNA序列轉(zhuǎn)移到其它基因序列中。依照本發(fā)明有用的植物、細(xì)胞和種子可用于本發(fā)明實(shí)踐的植物包括雙子葉植物核單子葉植物。這些植物包括(但不限于此)煙草，胡蘿卜，菠菜，胡椒粉，馬鈴薯，蕃茄，蘋果，小麥，裸麥，大豆，稻，玉蜀黍，玉黍蜀，漿果如草莓，復(fù)盆子，紫花苜蓿和香蕉。因?yàn)樽鳛槿祟愂澄锘騽?dòng)物飼料成分的許多可食用植物是雙子葉植物，所以本發(fā)明常常應(yīng)用的是雙子葉植物。雖然單子葉植物的轉(zhuǎn)化也特別適用于生產(chǎn)某些種類用作動(dòng)物飼料的谷物。在人類的免疫抗孕中特別有優(yōu)勢(shì)的做法是在汁液中生成抗孕蛋白，如蕃茄，大豆和胡蘿卜的汁，或牛奶，這樣容易給藥。依照本發(fā)明從這些植物疫苗中獲得的細(xì)胞或種子也是有用的。用上述的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物是本發(fā)明的另一個(gè)方面。特別實(shí)用于用這些載體轉(zhuǎn)化的植物包括香蕉，蕃茄，馬鈴薯，胡蘿卜，紫花苜蓿，苜蓿，玉蜀黍和煙草。馬鈴薯品種FL1607(″FritoLay1607″)以及Desiree，番茄品種TanksleyTA234TM2R是特別適合選用的品種，這些品種均被用上述的方法以二元載體轉(zhuǎn)化過。在這些轉(zhuǎn)化過的品種中，Desiree唯一被商品化的品種。其它的品種可從下列地址中獲得Frito-Lay(Rhinelander，威斯康星)和SteveTanksley(科內(nèi)爾大學(xué)，植物繁殖系)。番茄之所以被用作外源基因表達(dá)的模型系統(tǒng)是因?yàn)樗菀妆换蜣D(zhuǎn)化，而且是因?yàn)橛泄麑?shí)特異性的、成熟依賴性啟動(dòng)子來控制外源基因的表達(dá)(Giovannoni等1989)。E8啟動(dòng)子曾被用來介導(dǎo)突變型番茄果實(shí)中高水平聚半乳糖醛酸酶蛋白的表達(dá)(Giovannoni等1989)以及野生型番茄果實(shí)中莫尼糖蛋白的表達(dá)(Penarrubia等1992)。該研究領(lǐng)域中的研究人員對(duì)植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)早已熟悉并利用。植物細(xì)胞培養(yǎng)之所以被用作表達(dá)外源型蛋白的模型系統(tǒng)是因?yàn)樗募?xì)胞轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)核蛋白生成速度比用整體植物系統(tǒng)的方法快。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物可在液體中生長(zhǎng)，也可轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生植物胼胝體。用于本發(fā)明中所描述目的的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的普通例子包括(但不限于此)胡蘿卜、煙草(如NT-1或BY-1細(xì)胞系)，玉蜀黍。轉(zhuǎn)化植物材料的檢測(cè)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)編碼抗孕蛋白的核苷酸序列和抗孕蛋白本身的方法包括(但不限于此)DNA和RNA印跡分析、基于PCR的檢測(cè)方法、以及依照本發(fā)明檢測(cè)目的蛋白的免疫學(xué)方法。依照本發(fā)明這些方法可用來確定編碼抗孕蛋白特別是黏膜靶蛋白核酸序列的存在，也可用來確定抗孕蛋白以及黏膜靶蛋白本身的表達(dá)。目的核酸序列的檢測(cè)1.DNA印記分析DNA印記分析可用來從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中或從總基因組DNA受檢標(biāo)本中通過一個(gè)非基于PCR的方法檢測(cè)目的核酸序列的存在。DNA印記分析的方法在該行業(yè)中已經(jīng)是熟悉的(Ausubeletal.，supra，Sambrooketal.，1989，MolecularCloning.ALaboratoryManual.，2ndEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)。該技術(shù)包括將DNA片段從電泳膠中轉(zhuǎn)移到一種膜支持物上并讓DNA片段固定在那里。因此生成的膜攜帶有電泳膠中DNA序列帶型的半永久型復(fù)制品。根據(jù)下列的方法來進(jìn)行DNA印記分析。依照本發(fā)明中的方法轉(zhuǎn)化植物的基因組DNA[(5-20PG)，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化，在TAE緩沖液中用0.6-1.0％的瓊脂糖凝膠分離消化后的核酸產(chǎn)物，然后用文獻(xiàn)中(Ausubel等，supra，Sambrook等，supra)熟悉的方法將DNA轉(zhuǎn)移到商品化的尼龍或硝酸纖維素膜上(e.g.Hybond-N膜，Amersham，阿林頓高度，IL)。轉(zhuǎn)移并預(yù)雜交后，將膜放置于雜交液體中用一個(gè)標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交(如在一定的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，5XSSC，5XDENHARDT溶液，1％SDS)，65℃?；蛘?，高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交克在68℃或在一個(gè)含低鹽濃度(如0.1XSSC)的雜交緩沖液中進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)中已知的參數(shù)可在必要時(shí)應(yīng)用不同的雜交條件。雜交后，室溫下在2XSSC/0.1％SDS以及65℃在0.2XSSC/0.1％SDS的溶液中漂洗雜交膜，并將雜交膜暴光。依照不同數(shù)量的背景信號(hào)可應(yīng)用不同嚴(yán)謹(jǐn)度的漂洗緩沖液體(Ausubel等，supra)。對(duì)核酸探針-目的核酸的雜交物的檢測(cè)包括首先將核酸探針與DNA目標(biāo)雜交，其中的探針也上述的DNA重構(gòu)體的核酸序列的一部分是互補(bǔ)的。探針可被標(biāo)記上放射活性物質(zhì)或以共價(jià)鍵連接一種酶，而該共價(jià)鍵連接不會(huì)干擾雜交的特異性。由此生成的植物DNA和探針的雜交物能被檢測(cè)到。標(biāo)記探針的方法包括隨機(jī)寡核苷酸引物合成法、缺口翻譯法、激酶反應(yīng)法活多聚酶鏈反應(yīng)法(Ausubel等，supra)?；蛘?，可通過非同位素的方法檢測(cè)雜交物，非同位素標(biāo)記探針可通過加入生物素或地高辛，熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(如dioxetane，特別室觸發(fā)的dioxetanes)，酶或抗體。通常，非同位素標(biāo)記探針通過熒光或酶的方法來檢測(cè)。放射標(biāo)記的探針-目標(biāo)核酸組合物的檢測(cè)可通過將組合物與未結(jié)合的探針分離以及通過用放射自顯影或閃爍計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)組合物的水平進(jìn)行。如果該探針與酶共價(jià)連接，則該酶-探針-共軛-目標(biāo)核酸組合物將被從未結(jié)合探針-酶結(jié)合物中分離出來，加入適當(dāng)?shù)牡孜镉糜诿傅臋z測(cè)。通過觀察顏色和活熒光輸出的變化來檢測(cè)酶活性，這可提高敏感性。作為雜交探針的核酸探針-酶結(jié)合物(其中的酶是堿性磷酸酶)的制備和應(yīng)用的例子在下列文獻(xiàn)中有描述(Jablonski等，1986，Nuc.AcidsRes.，146115)。二步標(biāo)記擴(kuò)增法在文獻(xiàn)中有記載。這些方法均是建立在這樣的原理基礎(chǔ)之上一種小的配基(比如洋地黃毒甙配基，生物素，或諸如此類)被連接到一個(gè)能特異性地與目的基因(即編碼一種抗孕蛋白活或其中一部分的基因)結(jié)合地核酸探針上。依照探針的二步標(biāo)記擴(kuò)增法，連接到核酸探針上的小配基可用一種抗體-酶的結(jié)合物特異性地識(shí)別。例如，洋地黃毒甙配基被連接到核酸探針并且用一個(gè)抗體-堿性磷酸酶共軛物來檢測(cè)雜交物地存在，其中地堿性磷酸酶可與化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)。制備核酸探針-小配基共軛物地方法參見(Martin等，1990，BioTechniques，9762)。或者，該小配基也可被一種能特異性地配位給第一個(gè)配基的第二個(gè)配基-酶共軛物所識(shí)別。有關(guān)這種小配基相互反應(yīng)方式的一個(gè)熟悉例子是生物素-抗生物素蛋白間的相互反應(yīng)。標(biāo)記核酸探針的方法以及它們?cè)谏锼?抗生物素檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用被描述在下列文獻(xiàn)中Rigby等，1977，J.Mol.Biol.，113237和Nguyen等，1992，BioTechniques，13116)。雜交物的基本檢測(cè)方法的變化在文獻(xiàn)中已經(jīng)有所記載，其中包括了將需要檢測(cè)的雜交物與外源性材料加快分離的修改以及應(yīng)用來自標(biāo)記部分的信號(hào)的修改。一系列有關(guān)的這些類型的方法學(xué)修改被綜述在下列文獻(xiàn)Matthews&Kricka，1988，Anal.BIOCHEM.，1691；Landegren等，1988，Science，242229；Mittlin，1989，ClinicalChem.351819；美國專利No.4,868,105，以及EPO出版No.225,807.2.RNA印記分析RNA印記的方法在文獻(xiàn)中有很好的記載。該方法包括將RNA從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到一種膜支持物上，以便檢測(cè)RNA制備品中的特定序列。根據(jù)下列方法進(jìn)行RNA印記雜交。在1X3-[N-嗎啉代丙磺酸緩沖液的瓊脂糖/甲醛凝膠上將從用上述的DNA重構(gòu)體轉(zhuǎn)化的植物組織中獲得的RNA標(biāo)本(通過加入1X3-[N-嗎啉代丙磺酸緩沖液、甲醛以及甲酰胺而制備]。在用溴乙錠染色并在紫外光下觀察以確定RNA完整性后，RNA通過0.05MNaOH/1.5MNaCl溶液處理水解，然后在溶液0.5MTris-Cl(pH7.4)/1.5MNaCl孵育。用文獻(xiàn)(Ausubel等，supra，Sambrook等，supra)中熟知的方法將RNA轉(zhuǎn)移到商品化的尼龍膜或硝酸纖維素膜上(e.g.Hybond-N膜，Amersham，阿林頓高度公司，IL)。轉(zhuǎn)移并封膜后，雜交膜用標(biāo)記探針在雜交液(比如50％甲酰胺/2.5％Denhardt′s/100-200mg變性鮭魚精子DNA/0.1％SDS/5XSSPE)42℃中雜交。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)，雜交條件在必要時(shí)可有變化(Ausubel等，supra和Sambrook等，supra.)。雜交后，雜交膜依次在下列條件下漂洗，室溫下2XSSC/0.1％SDS，42℃1XSSC/0.1％SDS，65℃0.2XSSC/0.1％SDS，然后將膜暴光。隨背景信號(hào)數(shù)量的不同，漂洗緩沖液的嚴(yán)謹(jǐn)度可不同。3.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通過用聚合酶鏈反應(yīng)從基因組DNA或其它自然來源的DNA擴(kuò)增本發(fā)明中的目的核苷酸序列(比如編碼抗孕蛋白的核酸序列)。熟練本專業(yè)的人對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)上熟悉的。聚合酶鏈反應(yīng)提供了一種快速擴(kuò)增特定DNA序列的方法，即通過用一種由耐熱DNA依賴性多聚酶催化的多個(gè)循環(huán)的DNA復(fù)制而對(duì)有關(guān)的目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)需要下列材料需要擴(kuò)增的核酸模板、兩條包繞所需擴(kuò)增序列的單鏈寡核苷酸引物、一種多聚酶、脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖液和鹽。在本專業(yè)中PCR是非常熟悉的方法，在下列文獻(xiàn)中有描述Mullis和Faloona，1987，MethodsEnzymol.，155335，。在這里有相應(yīng)的參考文獻(xiàn)。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)需要模板DNA(至少1fg；更常見的是，1-1000ng)以及至少25的寡聚核苷酸引物。常規(guī)的反應(yīng)混合物包括2μl的DNA，25pmol的寡聚核苷酸引物，2.5μl的10X聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液1(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster，CA)，0.4μl的1.25μMdNTP，0.15μl(或2.5單位)的TaqDNA多聚酶(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster，CA)以及去離子水，使反應(yīng)總體積為25μl。用一個(gè)程序化的熱循環(huán)器進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)的每一步的時(shí)間長(zhǎng)度和溫度，以及循環(huán)的次數(shù)需根據(jù)反應(yīng)的嚴(yán)禁度要求調(diào)整。退火溫度和時(shí)間是由預(yù)期的引物退火到模板上的效率以及能耐受的錯(cuò)配程度。中等熟練本專業(yè)的人就有能力對(duì)引物退火條件進(jìn)行優(yōu)化。所用的退火溫度在30℃和72℃之間。模板分子的初始變性的條件一般是92℃到99℃4分鐘，然后是20-40個(gè)循環(huán)中的15秒到1分鐘(94-99℃)的變性過程，退火(退火穩(wěn)定以上述的方法確定，時(shí)間為1-2分鐘)以及延伸(72℃，時(shí)間為1分鐘)。最后一步延伸常常在72℃進(jìn)行4分鐘，并且可接著一個(gè)不確定的步驟(0-24小時(shí)，4℃)。依照本發(fā)明，可用數(shù)個(gè)技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)而不用電泳。其中的一種技術(shù)，有商品化的試劑盒如TAQMANTM(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster，CA)，用的是轉(zhuǎn)錄特異性反義探針。該探針能特異性地識(shí)別PCR產(chǎn)物(如一種目的基因來源的核苷酸片段)，用淬滅劑和能配位給寡聚核苷酸5′端的熒光報(bào)道探針制備該探針。不同的熒光標(biāo)記物被連接到不同的報(bào)道探針上，可在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)兩種PCR產(chǎn)物。當(dāng)TaqDNA聚合酶被激活時(shí)，它可以其5′-至-3′核酸裂解活性將連接到模板上的探針的熒光報(bào)道分子裂解。在無淬滅劑存在的情況下，該報(bào)道分子開始發(fā)熒光。報(bào)道分子中顏色的變化與每一種特定產(chǎn)物的數(shù)目成比例并能用熒光計(jì)檢測(cè)到。PCR反應(yīng)可在96孔板上進(jìn)行，因此可同時(shí)處理和檢測(cè)多個(gè)標(biāo)本。[TAQMANTM系統(tǒng)有另外的優(yōu)點(diǎn)不需要凝膠電泳，而且與一條標(biāo)準(zhǔn)曲線一起應(yīng)用時(shí)，可定量檢測(cè)。目的蛋白序列的檢測(cè)1.抗體的制備本發(fā)明中的抗孕蛋白的特異性抗體對(duì)于蛋白的純化和檢測(cè)是有用的。對(duì)于抗體，我們包括了應(yīng)用那些抗體的不同結(jié)合區(qū)域的構(gòu)建體或其它的抗體修飾。因此，在本發(fā)明中有用的抗體可包含整個(gè)抗體，抗體片段、多功能抗體聚合體或一般而言的一種抗體含有一種或更多特異性結(jié)合部位的一種物質(zhì)。抗體片段可以是如Fv、Fab或F(ab′)2片段或其衍生物，如單鏈Fv片段。抗體或抗體片段可以是非重組的或重組的或人源化的?？贵w可有一種免疫球蛋白同型，如IgG，IgM等等。此外，可以在適當(dāng)?shù)牡胤綉?yīng)用免疫球蛋白或其中的一部分的聚合物、聚合體、衍生物和共軛物。雖然在本發(fā)明中目的基因的可用于誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物(或其中的片段或寡聚肽)不一定需要生物活性，但它必須具有抗原性。用于誘導(dǎo)特異性抗體的寡聚肽需有至少由5個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列，并且優(yōu)選是10個(gè)氨基酸。優(yōu)選它們自然蛋白的一個(gè)區(qū)域相同，并可含有一個(gè)自然存在的小分子的整個(gè)氨基酸序列。與本發(fā)明中的抗孕蛋白的種系特異性表位相對(duì)應(yīng)的氨基酸短延伸片段可與來自另一種蛋白(即一種黏膜靶蛋白)如LT-B的氨基酸相融合，由此產(chǎn)生的是針對(duì)該嵌合分子的抗體。可應(yīng)用本專業(yè)種熟知的方法來生產(chǎn)針對(duì)本發(fā)明種的目的蛋白的抗體。在生產(chǎn)抗體的過程種，通過注射本發(fā)明的目的基因的蛋白產(chǎn)物免疫不同的宿主山羊，兔子，大鼠，小鼠等。隨宿主種系的不同，可應(yīng)用不同的佐劑來提高免疫反應(yīng)。那樣的佐劑包括但不限于氟雷氏佐劑、礦物膠如氫氧化鋁以及表面激活物如溶血卵磷脂、聚醚多醇、聚陰離子、肽、油性乳劑、鎖眼(蟲戚)形血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚?？ń槊缫约靶“魻顥U菌也是潛在有用的人類佐劑。a.多克隆抗體抗原可與一種傳統(tǒng)的載體共軛結(jié)合以提高其免疫源性，針對(duì)該肽-載體共軛結(jié)合物的抗血清會(huì)增加。實(shí)施有關(guān)肽與載體的結(jié)合及其免疫在下列文獻(xiàn)種有描述(DYMECKI等，1992，J.Biol.Chem.，2674815)。可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(下述)或者用斑點(diǎn)雜交(Boersma和VanLeeuwen，1994，J.Neurosci.Methods，51317)的方法對(duì)該抗血清進(jìn)行針對(duì)蛋白抗原的效價(jià)滴定。同時(shí)，該抗血清也可在按照文獻(xiàn)制備的組織切片中應(yīng)用。一種有用的抗血清在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)種可與適當(dāng)?shù)碾陌l(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)，例如，按照文獻(xiàn)Greenetal.，1982，Cell，28477中介紹的方法。b.單克隆抗體制備單克隆抗體的方法已被很好地掌握，單克隆抗體可用一種侯選抗原來制備，該侯選抗原地表達(dá)水平將被檢測(cè)或者它將被滅活活親和純化，優(yōu)選是與一種載體結(jié)合，文獻(xiàn)Amheiteretal.，1981，NATURE，294；278.中有描述。單克隆抗體通常是從淋巴瘤組織培養(yǎng)物中或被注射了淋巴瘤組織地動(dòng)物地腹水中獲得?？赏ㄟ^篩選產(chǎn)生單克隆抗體地雜交瘤(或多克隆血清)以獲得特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白地抗體。2.抗體檢測(cè)方法特別適合選用的免疫學(xué)檢測(cè)依賴于單克隆或多克隆抗體的應(yīng)用，具體包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫印記、免疫組化和免疫共沉淀(參見Humason，G.L.，1979，AnimalTissueTechniques，4thed.W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，CA；Voller，1978，DiagnosticHorizons，2:1，MicrobiologicalAssociatesQuarterlyPublication，Walkersville，MD；Volleretal.，1978，J.Clin.Pathol.，31507；U.S.ReissuePat.No.31,006；UKPatent2,019,408；Butler，1981，MethodsEnzymol.，73482；Maggio，E.(ed.)，1980，EnzymeImmunoassay，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L)orradioimmunoassays(RIA)(Weintraub，B.，Principlesofradioimmunoassays，SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques，TheEndocrineSociety，March1986，pp.1-5，46-49and68-78)。依照本發(fā)明分析植物中目的蛋白的出現(xiàn)與否，可應(yīng)用免疫組化技術(shù)。本專業(yè)的熟練人員會(huì)清楚的知道本發(fā)明中所用的抗體分子需被標(biāo)記，以目標(biāo)蛋白更容易被檢測(cè)到。本專業(yè)的熟練人員會(huì)很熟悉標(biāo)記抗體分子的技術(shù)(參見HarlowandLane，1989，Antibodies，ColdSpringHarborLaboratory)。轉(zhuǎn)基因植物材料的劑量和給藥本發(fā)明提供了一種方法，通過以表達(dá)一種抗孕蛋白的轉(zhuǎn)基因植物材料飼喂動(dòng)物在動(dòng)物抗孕，其中轉(zhuǎn)基因植物材料的給藥誘發(fā)了一種針對(duì)該抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)。沒有限制于某一種特定的理論，本發(fā)明依賴于轉(zhuǎn)基因植物材料在動(dòng)物中的給藥，因此，由該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞表達(dá)的抗孕蛋白與一種或多種被飼喂動(dòng)物的黏膜表面接觸。當(dāng)抗孕蛋白(抗原)被覆蓋在腸相關(guān)淋巴細(xì)胞組織和支氣管相關(guān)的淋巴組織的M細(xì)胞所吸納時(shí)，伴隨著針對(duì)該抗孕蛋白的分泌型IgA升高的非特異性黏膜免疫反應(yīng)在體內(nèi)所有的分泌組織中被誘發(fā)(Cebra等，supra；Bienenstock等，supra；Weinz-Carrington等，supra；McCaμghan等，supra)。因此口腔給藥是刺激非特異性黏膜免疫反應(yīng)的一個(gè)優(yōu)選的給藥途徑，此外，它可在口腔和胃腸道內(nèi)局部刺激分泌型免疫反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施例中，用本發(fā)明中的方法制備的抗孕蛋白通過口腔飼喂食品的方法給藥，該食品是由表達(dá)抗孕蛋白的轉(zhuǎn)基因植物活植物細(xì)胞培養(yǎng)物制備的。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植物的可食用部分以飲食成分的方式飼喂動(dòng)物，在這個(gè)過程中，抗孕蛋白同時(shí)也被飼喂。在一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因材料以生料的形式飼喂動(dòng)物，雖然其中的植物材料可能通過切割、剁碎、切碎、做菜泥的方式處理過，或者減小轉(zhuǎn)基因植物材料成更小的片塊以便促進(jìn)動(dòng)物的吸收，比如將轉(zhuǎn)基因草料處理成青貯飼料以便促進(jìn)家畜的吸收。可以生料的形式飼喂的轉(zhuǎn)基因植物材料包括(但不限于此)水果，樹葉，莖，根，塊莖和種子。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，其中的轉(zhuǎn)基因植物材料是草或谷物，可讓需要飼喂抗孕蛋白的動(dòng)物在其成長(zhǎng)的環(huán)境中自己進(jìn)食植物材料(例如，在牛吃草的田野里種植轉(zhuǎn)基因植物，這樣通過牛自己吃草的方式被飼喂了抗孕蛋白)。在另外的實(shí)施例中，在給動(dòng)物飼喂前，可用另外的方式處理轉(zhuǎn)基因植物(例如，剁碎或切割以外的方法)。轉(zhuǎn)基因植物材料也可通過本專業(yè)熟練人員熟悉的方法處理，在那種情況下，本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因植物材料被精制，以便應(yīng)用于口腔、鼻腔或吸入給藥。植物材料也可通過用制藥學(xué)上可接受并與抗原相容的賦形劑的乳化作用來進(jìn)行處理。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括(但不限于此)佐劑、緩沖液、糖、抗氧化劑、穩(wěn)定劑或抗原粉末；例如，抗壞血酸鈉鹽、Quillaja提取物、水、鹽水、右旋糖、葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇或諸如此類，以及其中的組合物。此外，如果需要的話，該疫苗也可含有一定數(shù)量的輔助物質(zhì)如濕潤(rùn)或乳化劑、pH緩沖劑、或可增強(qiáng)該疫苗效應(yīng)的佐劑。而且，也可將轉(zhuǎn)基因植物材料與非轉(zhuǎn)基因植物材料甚至非植物材料混合以促進(jìn)動(dòng)物對(duì)它的吸收。例如，轉(zhuǎn)基因玉米可與其它的蔬菜混合，或者轉(zhuǎn)基因豆類植物也可與其它的成分如香料活其它的調(diào)味品混合做成諸如大豆餡餅、大豆冰淇淋、或豆奶。另外的例子，將轉(zhuǎn)基因煙草培養(yǎng)物過濾并通過下列方法(但不限于此)混合、噴霧、或涂覆的方式加入到常規(guī)的飼料中。此外，轉(zhuǎn)基因植物材料也可經(jīng)干燥后，以粉末的形式單獨(dú)飼喂，或懸浮在可接受的液體如汁液或水中飼喂。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，可對(duì)植物材料進(jìn)行處理以便將植物材料和/或細(xì)胞合并到制藥學(xué)上可以接受的乳膏、軟膏、油膏或栓劑。因此，用制藥學(xué)可接受材料攜帶的轉(zhuǎn)基因植物材料通過將植物材料與黏膜表面包括(但不限于此)口腔、鼻腔、直腸或陰道接觸的方式而被飼喂給動(dòng)物。另外的可與本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因植物材料接觸的黏膜表面包括(但不限于此)支氣管的內(nèi)表面、鼓室腔的黏膜層、結(jié)腸的內(nèi)黏膜層、輸精管的內(nèi)層、食管的內(nèi)層、小腸的黏膜層、喉的黏膜層、舌的黏膜層、垂體膜、口腔的黏膜層、咽的黏膜層、氣管的黏膜層、咽鼓管的黏膜、輸卵管的黏膜層、輸尿管的黏膜層尿道的黏膜層、子宮內(nèi)膜陰道的黏膜層、胃的黏膜層、膀胱的內(nèi)層以及精囊的黏膜層。劑量一定劑量的本發(fā)明中的植物材料可以數(shù)個(gè)上述不同的形式(例如生料，粉末等)飼喂動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在本發(fā)明中有用的轉(zhuǎn)基因植物材料需表達(dá)至少8μg的抗孕蛋白或抗孕蛋白與黏膜靶蛋白的融合蛋白/克干燥植物材料，較好是10μg，優(yōu)選是至少表達(dá)20μg的抗孕蛋白/克干燥植物材料。在一個(gè)實(shí)施例中，圈養(yǎng)在控制性環(huán)境下的動(dòng)物，比如實(shí)驗(yàn)室、狗舍、或私人房屋以及圈養(yǎng)在野外的動(dòng)物(但其食物攝入是受控制的，入家畜)，每周飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料至少12周(即在第0，7，14，21，28，35，42，49，56，63，70，77天飼喂)。每次飼喂時(shí)，動(dòng)物接受的轉(zhuǎn)基因植物材料在4到100000克之間，隨動(dòng)物的個(gè)體大小以及受處理動(dòng)物的平均食物攝入量不同而變化(如牛的平均食物消耗量是90磅/天)。在另外的一個(gè)實(shí)施例中，上述的俘獲的動(dòng)物群體日常地飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料(如第0，1，2，3，4，5，6天)，以達(dá)到基本的免疫效果，然后以規(guī)則的增強(qiáng)免疫的計(jì)劃表(比如每個(gè)月)來指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物材料的飼喂，以維持足夠的抗孕免疫狀態(tài)。在另外的一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因植物材料的注射被用來增加抗孕性制劑的胃腸外給藥。例如，一種抗孕性制劑(通過相應(yīng)的系統(tǒng)入植物、酵母菌、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞生成)可通過獸醫(yī)在動(dòng)物的性成熟的早期注射給藥，并按照一個(gè)規(guī)則的時(shí)間表飼喂上述的轉(zhuǎn)基因植物材料來源的規(guī)定的抗孕性飼料而加強(qiáng)給藥(如每月)。在人類應(yīng)用的另外一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因植物材料可被做成膠囊或片劑并加入到一種自服藥物的用藥方案中，其中的抗孕性和非抗孕性片劑或膠囊被包裝使得每天給藥或不給藥交替發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施例中，野生動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因植物材料的飼喂是通過將食物放在動(dòng)物的自然生活環(huán)境中以食物餌料的形式進(jìn)行的。熟練從事野生動(dòng)物種群控制的專業(yè)人士熟知餌料投放以及確定每次用藥的種群效應(yīng)的優(yōu)選方法，他們可確定每一種目標(biāo)種系的優(yōu)選的特異性餌料飼喂方案?；蛘撸磉_(dá)本發(fā)明種的抗孕蛋白的轉(zhuǎn)基因植物可在將被飼喂該抗孕蛋白的動(dòng)物生活的野外區(qū)域生長(zhǎng)?？赡苄枰蒙鲜龅姆椒z測(cè)植物種表達(dá)的抗孕蛋白的數(shù)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例種，生長(zhǎng)在野外的轉(zhuǎn)基因植物可表達(dá)至少8μg的抗孕蛋白或抗孕蛋白與黏膜靶蛋白的融合蛋白/每克干燥植物材料，較好是至少10μg，優(yōu)選是至少20μg的抗孕蛋白/克干燥植物材料。在這些條件下，野生動(dòng)物被隨意地飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料。佐劑在本專業(yè)地人員很好地了解到，將佐劑添加到一種免疫原中可增強(qiáng)免疫反應(yīng)(ColiganLGetal.eds.CurrentProtocolsinImmunology，NewYorkJohnWiley&Sons，1995)。數(shù)十年來弗氏完全佐劑是免疫佐劑中的中流砥柱。雖然常常是有效地，但該佐劑可誘發(fā)不良副反應(yīng)，因此限制了它的應(yīng)用和其它替代品地問世。其它可選用的佐劑包括(但不限于此)Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS)，那是一個(gè)含無毒化的內(nèi)毒素(MPL)和分枝桿菌細(xì)胞壁成分(TDW，CWS)、2％角鯊?fù)榈挠退榛?RibiImmunochemResearch，Inc.Hamilton，Montana)。TiterMax，一種穩(wěn)定、可代謝的油水佐劑(CYTRX公司，AtlantaNorcross，喬治亞州)；興泰克佐劑配方(SAF)3，是用吐溫80和多聚氧乙烯/多聚氧丙烯共聚物穩(wěn)定的油水乳化劑L121(Chiron公司，Emeryville，加利福尼亞)。弗氏不完全佐劑(FIA)，是弗氏完全佐劑的一種更少發(fā)生炎癥反應(yīng)的替代品(Novavax公司，哥倫比亞，馬里蘭洲)；明礬-氫氧化鋁〔氫氧化物，是一種廣泛應(yīng)用的佐劑，特別是在商品化的產(chǎn)品中如疫苗(商品化的鋁膠，精確化學(xué)和科學(xué)公司，Westbury，紐約)；SuperCarrier(興泰克研究，PaloAlto，加州)；Elvax40W(DuPont化學(xué)品公司.Wilmington，DE)；Montanide，amanide油酸鹽組合物(ISASeppicFairfield，NJ)；硝化纖維吸收蛋白(NilssonBO，LarssonA.Inertcarriersforimmunization.Res.Immunol.143553-557，1992)；Gerbu佐劑，(C-CBiotech，Poway，加利福尼亞)；免疫刺激組合物(ISCOMS)(ColiganLG等.CurrentProtocolsinImmunology，NewYorkJohnWiley&Sons，1995).許多年來，皂甙佐劑被用于胃腸外免疫(產(chǎn)品包括″QuilA″或″QS-21″)。皂甙是糖甙組合物，以次級(jí)代謝物的形式生成。它們廣泛分布在高等植物，也表達(dá)在棘皮門的海洋無脊椎動(dòng)物(ApSimon等，Stud.Org.Chem.17273-286(1984)).。因其有抗微生物的活性，植物皂甙是抵抗微生物特別是真菌的有效化學(xué)防御物(Price等，CRCCrit.Rev.FoodSci.Nutr.2627-135(1987))。皂甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予其廣泛的藥學(xué)和生物學(xué)活性，包括一些強(qiáng)有效的免疫學(xué)活性。此外，該組合物家族的成員具有發(fā)泡的特性(一種鑒別特征)，表面活性劑特性(是其具有溶血活性的原因)、結(jié)合膽固醇、真菌毒性、軟體動(dòng)物毒性、抗孕性、生長(zhǎng)遲滯作用、祛痰作用、抗炎、止痛、抗濾過性病原體、心臟血管、酶抑制以及抗腫瘤活性Hostettmann，K.，etal.，MethodsPlantbiochem.7435-471(1991)；Lacaille-Dubois，M.A.&Wagner，H.，Phytomedicine2363-386(1996)；Price，K.。R.，等，CRCCrit.Rev.FoodSci.Nutr.2627-135(1987)。此外，皂甙溶液也曾被用作去污劑，可增加多肽在黏膜的遞送。例如文獻(xiàn)Pillion，D.J.etal.，Invest.Opthal.Vis.Sci.323021-27(1991)揭示含有1％來自Gypsophilla麥的未純化皂甙溶液的胰島素眼藥水的給藥可導(dǎo)致大鼠發(fā)生快速和可再生的血中D-葡萄糖水平的減少。而不含有皂甙的胰島素滴眼液是無效的。日文摘要No.JP62126135(1987)記載了應(yīng)用含有甾體或三萜結(jié)構(gòu)的皂甙的生長(zhǎng)激素釋放因子的經(jīng)鼻給藥，也可參見文獻(xiàn)，Chiou，G.C.Y.etal.，J.Pharm.Sci.78815-818(1989)；以及ChiouG.C.Y.等，J.Ocul.Pharm.581-91(1989)，它們揭示了含有皂甙(獲自Sigma化學(xué)品公司)的胰島素滴眼液給藥后的胰島素的全身分布。皂甙所具有的去污劑的特性也可增加生物膜的通透性，因此增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng)。來自Quillaja肥皂草屬M(fèi)olina樹(Quillajasaponins)的皂甙佐劑具有良好化學(xué)和免疫學(xué)特性的產(chǎn)品(Dalsgaard，K.Arch.GesamteVirusforsch.44243(1974)；Dalsgaard，K.，ActaVet.Scand.19(Suppl.69)1(1978)；Higuchi，R.等，Phytochemistry26229(1987)；同前.262357(1987)；同前.271168(1988)；Kensil，C.等，J.Immunol.146431(1991)；Kensil等，U.S.Pat.No.5,057,540(1991)；Kensil等，Vaccines9235(1992)；Bomford，R.等，Vaccines10572(1992)；和Kensil，C.等，美國專利5,273,965(1993))。皂甙也存在于其它的植物如大豆(AndrzejewskaE.，1984，RoczPanstwZaklHig，35135-8)。Quillaja皂甙被發(fā)現(xiàn)是大約20種結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的、差別非常小的三萜糖甙化合物的混合物，(Higuchi，R.等，Phytochemistry26229(1987)；同前.，262357(1987)；同前，271169(1988)；Kensil等，美國專利No.5,057,540(1991)；Kensil等，Vaccines9235(1992))，使得要分離它們非常的困難。QUILLIAJA皂甙提取物已經(jīng)商品化(如Garuda國際公司，LemonCove，加洲93244)美國專利Nos5,273,965and5,650,398記錄了一種粗制的皂甙提取物而美國專利No.5,057,540記錄了一種大體上純化的皂甙提取物。不管是粗制的皂甙還是純化的皂甙提取物的加工過程都包括了用色譜法從組合物種純化皂甙。依照本發(fā)明有用的皂甙佐劑包括粗制的和純化的皂甙提取物(Garuda國際公司.LemonCove，加洲93244)。有用的皂甙佐劑也包括含有皂甙的植物的一部分(如葉，根，水果或其它的部份)或經(jīng)過加工的植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，皂甙佐劑是與轉(zhuǎn)基因植物材料一起經(jīng)口飼喂的。免疫檢測(cè)本發(fā)明提供了給動(dòng)物飼喂一種抗孕蛋白后誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)該抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例種，給動(dòng)物飼喂含有本發(fā)明中的抗孕蛋白的轉(zhuǎn)基因植物后，檢測(cè)動(dòng)物以確定是否誘發(fā)了針對(duì)該抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)。動(dòng)物針對(duì)該抗孕蛋白的免疫反應(yīng)的檢測(cè)是在飼喂動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物材料后的某一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行的。以下描述的是透明帶蛋白的評(píng)估，但是，這些方法也可用來評(píng)估針對(duì)下述抗孕蛋白的動(dòng)物免疫狀態(tài)。在一個(gè)實(shí)施例中，本專業(yè)的熟練人員可通過測(cè)定動(dòng)物針對(duì)透明帶蛋白的免疫狀態(tài)來確定該動(dòng)物是否被免疫。這種評(píng)估可通過測(cè)定如全血、血清、尿、唾液、淚液等標(biāo)本中的透明帶結(jié)合抗體的效價(jià)來進(jìn)行。優(yōu)選是應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(″ELISA″)來達(dá)到該目的，它能檢測(cè)透明帶免疫原或其等效物的抗體(Drell，等，Biol.Reprod.30445(1984)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和其它的固相免疫檢測(cè)法(Kemeny，D.M.等，Eds.)，JohnWiley&Sons，N.Y.(1988)，此處綜合參考文獻(xiàn))。從眾所周知的免疫測(cè)定法(也叫做″兩點(diǎn)″或″夾心″檢測(cè))的原理來理解，免疫測(cè)定法包括“前向”、“同時(shí)”以及“反向”測(cè)定(Fackrell，J.Clin.Immunoassay8213-219(1985)；Yolken，R.H.，Rev.Infect.Dis.435(1982)；Collins，W.P.，InAlternativeImmunoassay.JohnWiley&Sons，N.Y.(1985)；Ngo，T.T.等，InEnzymeMediatedImmunoassay，PlenumPress，N.Y.(1985))。例如，在“前向”檢測(cè)法中，透明帶抗原被結(jié)合到固相支持物上(比如微量滴定盤，試管，微量滴定法，等)，然后在一定的條件下與需要檢測(cè)抗透明帶蛋白抗體的標(biāo)本首先相接觸，以形成一種二元固相透明帶蛋白-抗體組合物。孵育和漂洗后，該支持物被放置在與一定量的標(biāo)記透明帶抗原(它起著″報(bào)道分子的作用″)接觸。第二次孵育后，標(biāo)記的透明帶蛋白抗原通過與未標(biāo)記的抗體而與被固定的透明帶蛋白形成組合物，第二次漂洗該固相支持物以除去未反應(yīng)的標(biāo)記透明帶蛋白抗原。這種類型的前向夾心檢測(cè)是一種檢測(cè)抗透明帶蛋白抗體是否存在簡(jiǎn)單的“是”/“否”檢測(cè)法，通過將滯留的標(biāo)記透明帶蛋白抗原的數(shù)量與含有已知數(shù)量的抗透明帶抗體的標(biāo)準(zhǔn)品相比較而得到定量的結(jié)果?！皟牲c(diǎn)”或“夾心”檢測(cè)法在下列文獻(xiàn)中有描述Wide，RadioimmuneAssayMethod，(Kirkhametal.，Ed.)，E.&S.Livingstone，Edinburgh，pp.199-206(1970)。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，前向酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可被用來檢測(cè)黏膜免疫反應(yīng)。該檢測(cè)按上述的方法實(shí)施，有一些修改，即與需要檢測(cè)黏膜免疫球蛋白的標(biāo)本孵育后，固相支持物與標(biāo)記的抗-IgA抗體相接觸，標(biāo)記的抗-IgA抗體起著檢測(cè)IgA是否出現(xiàn)在從動(dòng)物身上獲得的標(biāo)本的指示劑作用。在一種“同步”檢測(cè)法中，在單次的孵育步驟中，結(jié)合的透明膜蛋白以及標(biāo)記的透明膜蛋白二者同時(shí)加入到需要檢測(cè)的標(biāo)本中。孵育完成后，漂洗固相支持物以除去殘留的液體標(biāo)本以及沒有形成組合物的標(biāo)記抗體。然后，與固相支持物相連的標(biāo)記抗體的檢測(cè)與傳統(tǒng)的“前向”夾心檢測(cè)法中的檢測(cè)方法是一樣的。在“反向”檢測(cè)法中，標(biāo)記透明帶蛋白的溶液與標(biāo)本一起孵育，然后，該反應(yīng)體系與預(yù)先已結(jié)合了未標(biāo)記的透明帶蛋白的固相支持物接觸。第二次孵育后，該固相支持物以傳統(tǒng)的方式漂洗，以清除殘留的受檢標(biāo)本以及未反應(yīng)的標(biāo)記透明帶蛋白溶液?？贵w效價(jià)的確定方法與“同步”和“前向”檢測(cè)法是一樣的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明中的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)使用的是單克隆抗體。優(yōu)選是，那樣的抗體按照上述的方法，通過免疫異種動(dòng)物(例如，小鼠、兔、大鼠等)而生成后，收集動(dòng)物的脾臟白細(xì)胞，并以上述的方式將它們與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞相融合。雖然免疫測(cè)定法是根據(jù)選定的固相支持物來描述的，可應(yīng)用的固相支持物是多種多樣的。適當(dāng)?shù)墓滔嘀С治锸怯芍T如玻璃、紙、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龍、淀粉酶以及自然的和改良的纖維素，聚丙烯酰胺、瓊脂糖、右旋糖酐或磁鐵礦等不同的材料組成的。固相支持物的性質(zhì)可在一定程度上是可溶性的、或者如本發(fā)明中是不可溶的。固相支持物材料需要有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)構(gòu)型，以便透明帶蛋白分子可結(jié)合到抗體上。因此，支持物的構(gòu)型可以是球形的，比如在圓珠形，或圓柱的，正如在試管的內(nèi)表面，或柱狀物的外表面。或者，其表面也可以象床單或測(cè)試條一樣的平。本專業(yè)的熟練人員會(huì)注意許多其它的適合結(jié)合單克隆抗體的載體，或者能通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用探索新的用法。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，也可通過免疫組化的方法來檢測(cè)被飼喂了本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因植物材料動(dòng)物的免疫狀態(tài)。簡(jiǎn)單的說，在用上述的飼喂方法給動(dòng)物飼喂了轉(zhuǎn)基因植物后，雌性動(dòng)物被處死，切取其卵巢。在卵子從卵巢釋放后，如果在輸卵管里發(fā)生了受精作用，優(yōu)選能在卵巢的卵子上發(fā)現(xiàn)有針對(duì)抗孕蛋白的抗體的表達(dá)。從動(dòng)物中取出后，卵巢被做成冰凍切片。切片用本專業(yè)熟悉的固定劑固定，這些固定劑包括(但不限于此)福爾馬林、丙酮、聚甲醛以及戊二醛。然后漂洗切片并與抗體孵育，這些抗體可與動(dòng)物對(duì)抗孕蛋白的免疫反應(yīng)中升高的抗體相結(jié)合。切片再與一種第二抗體一起孵育，該抗體含有一種報(bào)道分子(如熒光染料)，然后在顯微鏡下檢查。如能鑒定出動(dòng)物中針對(duì)被飼喂的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的抗孕蛋白的抗體的存在，則表明動(dòng)物發(fā)生了針對(duì)該抗孕蛋白的免疫反應(yīng)。例如，如果將本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因植物材料飼喂給小鼠，可通過下列步驟來檢測(cè)針對(duì)該植物表達(dá)的抗孕蛋白的黏膜免疫反應(yīng)，獲得小鼠卵巢的組織切片，用針對(duì)小鼠免疫球蛋白的k鏈的抗體處理該組織切片，抗-鼠k鏈抗體的定位可通過用與報(bào)道分子如熒光染料相結(jié)合的第二抗體處理組織切片而觀察到。然后在顯觀察下觀察組織切片，以對(duì)標(biāo)記抗體進(jìn)行視覺定位，抗體標(biāo)記的圖象可用一個(gè)本專業(yè)熟練人員所熟知的形態(tài)測(cè)量學(xué)計(jì)算機(jī)軟件來進(jìn)行定量，這樣的軟件例子“NIHImage”美國國立衛(wèi)生研究所，Bethesda，MD。該定量資料需要與來自沒有用本發(fā)明中的抗孕蛋白處理小鼠的類似的抗體標(biāo)記資料作統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。如兩組動(dòng)物間存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，則表明小鼠可發(fā)生針對(duì)該抗孕蛋白的免疫反應(yīng)，其中統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)中的P值至少是＜0.1，＜0.05，＜0.01，＜0.005，0.001，0.0005，優(yōu)選是＜0.0001?？乖行?yīng)的測(cè)定在最合適的實(shí)施例中，本發(fā)明中飼喂動(dòng)物的抗孕蛋白的抗孕效應(yīng)是通過記數(shù)按照本發(fā)明中的方法飼喂了轉(zhuǎn)基因植物材料的雌性動(dòng)物在每個(gè)生育周期中所產(chǎn)幼仔的數(shù)量來評(píng)估。例如，給小數(shù)飼喂5至6周的轉(zhuǎn)基因植物材料后，單個(gè)的雌性小鼠與一只雄性小鼠放在一個(gè)籠子里。然后雄性小鼠在10到20天內(nèi)被移走，每天觀察雌性小鼠產(chǎn)幼仔的情況。通過觀察飼喂后所產(chǎn)幼仔數(shù)量的減少來評(píng)估該抗孕蛋白的抗孕效應(yīng)。例如，對(duì)于平均每窩的產(chǎn)仔數(shù)量為3或更多的動(dòng)物種系(比如小鼠)來說，如每窩的幼仔數(shù)的減少是10％到100％，30％到90％，或60％到80％，才可認(rèn)為該抗孕蛋白是有效的。對(duì)于平均每窩的產(chǎn)仔數(shù)量為1或2的動(dòng)物種系(比如白尾鹿)來說，每窩的幼仔數(shù)的至少減少是50％優(yōu)選是100％，才可認(rèn)為該抗孕蛋白是有效的?；蛘?，如上所述，本發(fā)明中的抗孕蛋白的有效性也可通過檢測(cè)全血、血清、黏膜分泌物、大便等標(biāo)本中的針對(duì)該抗孕蛋白的抗體水平來進(jìn)行評(píng)估。也可按上述的方法用免疫組化技術(shù)觀察針對(duì)抗孕蛋白的抗體結(jié)合到卵子上的情況來評(píng)估該抗孕蛋白的有效性。但是，依照本發(fā)明，針對(duì)該抗孕蛋白的抗體的測(cè)定或觀察必須與觀察每窩的幼仔數(shù)量是否減少相結(jié)合，以精確的評(píng)估本發(fā)明中抗孕蛋白的有效性。例如，如果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生育率沒有減少，即使在動(dòng)物的血清中檢測(cè)到了針對(duì)該抗孕蛋白的抗體的存在，也可認(rèn)為該抗孕蛋白是無效的。實(shí)施例1植物優(yōu)化的鼠ZP3表位與植物優(yōu)化的合成LT-B基因的融合一個(gè)來自TH210(Mason等，(1998)Vaccines161336)的EcoRV和KpnI酶切位點(diǎn)之間的片段含有一個(gè)合成的LT-B序列，被插入到載體pBluescript(Stratagene，LaJola，CA，USA)的相應(yīng)的位點(diǎn)上，由此生成重構(gòu)體pBlueLTB。用一個(gè)特異性BbsI位點(diǎn)將一個(gè)編碼6個(gè)氨基酸的連接子(翻譯性)與pBlueLTB重構(gòu)體中的LT-B編碼區(qū)域的3′端融合，由此生成質(zhì)粒PLTB-L。用兩條商業(yè)合成核苷酸寡聚體5′AACTCTGATCCACATGTTCCT(SEQIDNO1)以及5′AGTTAGGAACATGTGGATCAG(SEQIDNO2)來構(gòu)建連接子，這些核苷酸寡聚體已經(jīng)在變性的聚丙酰胺凝膠電泳純化分離。在每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，這些核苷酸寡聚體用T4連接酶，然后以可分子數(shù)相等的數(shù)量混合在一起；退火的處理時(shí)加熱到90℃5分鐘，然后逐漸冷卻到23℃1個(gè)小時(shí)。制備質(zhì)粒PLTB-L，用核酸內(nèi)切酶Bbs核KpnI依次酶切，再用小牛腸磷酸酶(CIP)去磷酸化，以便插入小鼠ZP3表位。分析小鼠的ZP3表位的編碼序列(336-342)以確定與植物基因相比較時(shí)的密碼子選擇(Wada等，1990NucleicAcidResearch182367)。設(shè)計(jì)一個(gè)植物優(yōu)化的表位，保持天然表位本身的氨基酸序列，同時(shí)在其5′和3′端也有另外的核苷酸序列，寡核苷酸組裝后，生成一個(gè)BbsI和KpnI相容性片段。合成寡核苷酸A5′AACTTCCAAATTCATGGACCAAGAAACTAAGTCTTCGGTAC(SEQIDNO3)andB5′CGAAGACTTAGTTTCTTGGTCCATGAATTTGGA(SEQIDNO4)，并用變性的聚丙酰胺凝膠電泳的方法純化。按照前述的PLTB-L構(gòu)建的方法組裝該表位核酸序列，再將其置于冰上，然后將其連接到具有NcoI和KpnI的酶切位點(diǎn)的PLTB-L，生成pLTBL7。用雙脫氧鏈終止法對(duì)質(zhì)粒PLTB-L和pLTB7進(jìn)行測(cè)序。曾有作者獲得了用NcoI和KpnI酶切后的pLTB7片段，并將其插入到用NcoI和KpnI內(nèi)切酶酶切后的pIBT210中而生成pAW7(Haq等，1995Science268714)。用HindIII和EcoRI內(nèi)切酶酶切pAW7后純化而得到該表達(dá)序列，再與用HinDIII和EcoRI酶切pGPTV后生成的PAWBIN7連接(Becker等，PlantMolecularBiology201195)。實(shí)施例2轉(zhuǎn)化西紅柿將通過大腸桿菌DH5∝提取的質(zhì)粒pAWBin7以電穿孔的方式轉(zhuǎn)染膨脹土壤桿菌屬EHA105。再由土壤桿菌屬介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化西紅柿子葉(西紅柿是Tanksley變種，編號(hào)TA234TM2R)。轉(zhuǎn)化步驟除種子消毒過程外，其余參照Frary和Earle文獻(xiàn)提供方法(Frary和Earle，1996PlantCellReports16235)。將種子浸泡與70％乙醇2分鐘，再用無菌水漂洗，然后用10％的消家凈加1％的吐溫-20浸泡2小時(shí)。再將種子用無菌蒸餾水漂洗3次，接種到半強(qiáng)度的MurashigeandSkoog介質(zhì)上(即半強(qiáng)度MS鹽，參考文獻(xiàn)Murashige和Skoog，1962PhysiologiaPlantarum15473)(介質(zhì)成分50毫克/份內(nèi)消旋肌醇、2毫克/份鹽酸維生素B1、0.5毫克/份的鹽酸維生素B6、0.5毫克/份的煙酸、10毫克/份的蔗糖和8毫克/份的pH5.8的difcobacto瓊脂)在上述介質(zhì)中加入300毫克/份的卡那霉素以培植小總苞。通過神經(jīng)節(jié)苷脂依賴性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)篩選其葉子和果實(shí)均表達(dá)熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的單個(gè)植株。用自花授粉的方式培植熱穩(wěn)定腸毒素表達(dá)量最多的植株，得到的種子用含有卡那霉素300毫克/份的介質(zhì)中培養(yǎng)。再將存活的幼苗轉(zhuǎn)到土壤中在溫室下培植并自花授粉。將每棵轉(zhuǎn)基因植物所結(jié)果實(shí)冰凍干燥、混勻后，在干燥環(huán)境下儲(chǔ)存。實(shí)施例3蛋白抽提與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)從溫室種植的植物取得新鮮莖葉和果實(shí)(或干燥果實(shí))樣本，加入2摩爾/升冰凍抽提緩沖液置Bio101快速準(zhǔn)備器內(nèi)作勻漿處理(干燥果實(shí)樣本的抽提緩沖液濃度為50摩爾/升)。抽提緩沖液成分為50毫摩爾磷酸鈉(pH6.6)、100毫摩爾氯化鈉、1毫摩爾依地酸鈉、0.1％TritionX-100溶液、10皮克/毫升的白胃素、1毫摩爾苯甲磺酰氟。不溶性物質(zhì)以壓片機(jī)處理后裝入EP管內(nèi)，用5415C型微量離心機(jī)4℃離心5分鐘，轉(zhuǎn)速14000轉(zhuǎn)/分。提取上清液置冰上作成分分析后置-80℃低溫保存。以考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法(BioRad提供)對(duì)提取的總蛋白濃縮液進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用小牛血清(BSA提供)作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。將每個(gè)蛋白提取液以1/100的濃度稀釋，取其中兩份作神經(jīng)節(jié)苷脂依賴性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定取值(參考文獻(xiàn)Haq等，supra)(圖1a，b，c)。實(shí)施例4融合蛋白純化與檢測(cè)采集熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位含量超過8μg/克的轉(zhuǎn)基因植物1號(hào)干燥標(biāo)本，以20毫升/克的濃度加入冰凍抽提緩沖液，按上述方法進(jìn)行抽提。取上清液，與磷酸鹽緩沖液葡聚糖凝膠混合，置搖床孵育4℃過夜。上述處理后標(biāo)本可分裝為1毫升/管，置4℃保存。孵育處理后將溶液置燒結(jié)玻璃漏斗中，加入60毫升磷酸鹽緩沖液過濾提純。加入5毫升磷酸鹽緩沖液調(diào)制成葡聚糖懸浮液，真空干燥后用BioRadX層析儀作柱層析。層析過程中每1毫升樣本加入50毫升磷酸鹽緩沖液洗柱。按0.2摩爾的濃度加入D-半乳糖，用磷酸鹽緩沖液洗脫融合蛋白，置4℃保存。經(jīng)上述處理后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析并以考馬斯亮藍(lán)染色。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上可見此融合蛋白條帶，并以實(shí)施例3所述酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)確定結(jié)果。實(shí)施例5基因核酸分離取植物嫩葉部分200-250毫克，裝入1.5毫升微量離心管中，液氮下研磨成粉末。加入500微升抽提液(成分420g/l尿素、312.5毫摩爾氯化鈉、5.0毫摩爾pH8.0三羥基甲烷鹽酸、20毫摩爾依地酸鈉、1％sarcocine)和500微升苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，孵育30分鐘。14000轉(zhuǎn)/分4℃離心15分鐘。吸取上清液，加入等體積4摩爾異丙醇溶液沉淀RNA，-20℃孵育至少8小時(shí)。15000轉(zhuǎn)/分4℃離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上層水相至分離管。以經(jīng)核糖核酸酶滅活處理的無菌水溶解RNA片狀沉淀物。在上清液中加入10％容積7.5摩爾醋酸銨和1體積的異丙醇沉淀基因DNA，-20℃孵育至少8小時(shí)。70％乙醇洗滌RNA，真空干燥5分鐘后，用含核糖核酸酶50皮克/毫升的無菌水50微升溶解。實(shí)施例6Southern雜交分析本實(shí)施例用于確定融合脫氧核糖核酸(DNA)的染色體整合。每反應(yīng)加入15μg的DNA，每微克DNA加3.4單位HindIII，以37℃消化過夜后，以1％TAE瓊脂糖凝膠電泳過夜。將瓊脂糖凝膠以0.25M鹽酸作去嘌呤處理后，按試劑盒說明書以堿性轉(zhuǎn)移法行轉(zhuǎn)膜處理(BioRad公司提供探針)。DNA被紫外交聯(lián)固定在ZETA膜上。探針制備用PAW7作模板，按試劑盒說明書進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)制成標(biāo)記探針。引物序列如下上游5′-GCATTCTACTTCTATTGCAGC)(SEQIDNO5)；下游5′-GTGCATATCAGCATAC)(SEQIDNO6)。擴(kuò)增產(chǎn)物含洋地黃標(biāo)記脫氧嘧啶核苷三磷酸，長(zhǎng)度588堿基；反應(yīng)參數(shù)94℃預(yù)熱4分鐘；94℃變性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共32個(gè)循環(huán)；4℃停留5分鐘；最后72℃延伸5分鐘。(使用儀器HybaidPCRExpressThermo-Cycler。(聚合酶鏈反應(yīng)、洋地黃標(biāo)記脫氧嘧啶核苷三磷酸反應(yīng)試劑盒由BoehringerMannheim提供)。雜交備原位雜交瓶和雜交膜(每片配備10毫升洋地黃標(biāo)記脫氧嘧啶核苷三磷酸Easy雜交探針)(由BoehringerMannheim提供)，置雜交箱中預(yù)熱45℃。雜交膜作預(yù)雜交至少90分鐘后，進(jìn)行雜交過夜。雜交探針濃度為5毫升/膜。雜交后按試劑盒說明書進(jìn)行膜洗滌。經(jīng)上述處理后，將雜交膜行放射自顯影，陽性結(jié)果顯示植物染色體的融合脫氧核糖核酸的整合情況。(DIG洗滌和阻斷緩沖試劑盒、DIG發(fā)光檢測(cè)試劑盒由BoehringerMannheim提供)。實(shí)施例7Northern雜交Northern雜交用于證實(shí)融合蛋白在轉(zhuǎn)錄核糖核酸水平的表達(dá)。Northern雜交按《分子可隆》(Sambrook等著)方法進(jìn)行。用甲醛/甲酰胺對(duì)基因RNA進(jìn)行變性處理，1％的3-N-嗎啉代丙磺酸-乙酸-依地酸鈉瓊脂糖凝膠電泳2小時(shí)，再利用毛細(xì)管作用將RNA轉(zhuǎn)移到ZETA探針膜上(BioRad提供)，UV交聯(lián)固定。雜交溫度42℃，其余步驟與方法同Southern雜交。以上實(shí)施例證實(shí)了融合蛋白在轉(zhuǎn)錄核糖核酸水平的表達(dá)。實(shí)施例8小鼠飼喂與標(biāo)本采集用實(shí)施例小鼠對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的抗孕效果進(jìn)行體外測(cè)試。將小鼠按一只雄性配三只雌性的比例配種喂養(yǎng)，記錄每只雌鼠的產(chǎn)子數(shù)。采集熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位含量超過8微克/克的西紅柿果實(shí)，冰凍干燥，混勻并研磨成粉末，按重量容積比1∶2比例加入蘋果汽水進(jìn)行飼喂，隔周一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。把小鼠分成三組，其中4-5只飼喂4克野生型西紅柿加蘋果汽水；4-5只飼喂4克轉(zhuǎn)基因西紅柿加蘋果汽水；4-6只飼喂4克轉(zhuǎn)基因西紅柿加蘋果汽水和Quillaja浸膏10毫克(Garuda提供)。飼喂當(dāng)天，將雌性小鼠由中午開始隔離、停止飼喂任何食物，只飼喂水，并單獨(dú)隔離，下午4點(diǎn)飼喂上述實(shí)施例用藥，留置飼喂品在籠里過夜。次晨8時(shí)將隔離雌性小鼠放回與配種雄性小鼠同籠喂養(yǎng)。第0天和70天，從雌性小鼠尾部取血，分離血清，于-80℃保存，留作日后抗體分析。第96天從心臟穿刺取血，同法處理。第70天和87天取糞便標(biāo)本，-80℃凍存過夜，取沉淀物凍干處理，加入磷酸鹽緩沖液0.8毫升(pH7.2)制成懸浮液，14000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清-20℃保存，留日后檢測(cè)用。實(shí)施例9ELISAs試驗(yàn)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠LTB亞單位和ZP3抗原決定族的抗體與生殖力按參考文獻(xiàn)方法((Dickenson與Clements，InfectImmun.1995，631617))檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血清中抗熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位和透明帶糖蛋白3抗原抗原決定族免疫球蛋白IgG和糞便沉淀物中抗熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位和透明帶糖蛋白3抗原抗原決定族免疫球蛋白IgA濃度。結(jié)果見圖2a，2b。樣本用含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液連續(xù)稀釋。檢測(cè)熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位抗體將微量滴定板涂上神經(jīng)節(jié)甙酯III型(美國密蘇里洲圣路易斯Sigma公司提供)。0.25％BSA封閉處理后，加入純化熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位重組子孵育1小時(shí)；檢測(cè)透明帶糖蛋白3抗原抗原決定族抗體用共軛BSA抗原決定族重組子涂抹微量滴定板，以0.25％BSA封閉處理。應(yīng)用兔抗小鼠血清或抗田鼠免疫球蛋白IgG和堿性磷酸酶共軛鹿抗兔血清(Sigma提供).作血清熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位和透明帶糖蛋白3抗原抗原決定族抗體檢測(cè)；而糞便熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位和透明帶糖蛋白3抗原決定族抗體檢測(cè)應(yīng)用山羊抗小鼠血清或抗田鼠免疫球蛋白，以及堿性磷酸酶共軛兔抗山羊血清。通過比較實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的雌性小鼠產(chǎn)次和產(chǎn)子數(shù)評(píng)價(jià)經(jīng)口飼喂藥物的效果。每組6只小鼠。實(shí)驗(yàn)組飼喂轉(zhuǎn)基因西紅柿糊劑。同時(shí)評(píng)價(jià)田鼠經(jīng)口飼喂的效果作為非目標(biāo)性對(duì)照(圖4)。實(shí)施例10具抗孕效應(yīng)轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)將編碼小鼠透明帶糖蛋白3抗原決定族、袋鼯透明帶糖蛋白3的抗原抗原決定族和通用型GnRH的基因融合到熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位上(構(gòu)建方法描述如下，圖5a，b，c)。分別將小鼠和袋鼯的抗原決定族與熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位融合，以使其翻譯至熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的羥基末端。使用三個(gè)融合體將GnRH與熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位融合，以使GnRH的抗原決定族可翻譯至熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的氨基末端、羥基末端或熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位五聚體其中任一單體的外部。將融合上述蛋白的基因編碼區(qū)導(dǎo)入植物基因的表達(dá)盒內(nèi)(編號(hào)PIBT210.1，然后插入二元載體pGPTV，再通過土壤桿菌屬介導(dǎo)，將含有小鼠透明帶糖蛋白3-熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位、袋鼯透明帶糖蛋白3-熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位、GnRH的羥基末端以及GnRH內(nèi)部四個(gè)融合體的基因轉(zhuǎn)化至煙草細(xì)胞系NT1中。用熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位和GnRH特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法分析小鼠和GnRH融合體的基因轉(zhuǎn)化情況(圖6)。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)羥基末端融合體的存在；而融合體內(nèi)部熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的表達(dá)水平較低。我們認(rèn)為是由于熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的五聚體結(jié)構(gòu)防礙了熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的表達(dá)，并再作檢測(cè)。在基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞系中能檢測(cè)到GnRH抗原決定族的低水平表達(dá)。實(shí)施例11轉(zhuǎn)基因胡蘿卜作物培植本實(shí)驗(yàn)使用胡蘿卜品種Nanco(DaucuscarotaL.cv.Nanco提供)Gilbert等于1996年對(duì)三個(gè)胡蘿卜品種進(jìn)行研究(文獻(xiàn)參考詳后)證實(shí)Nanco最適合基因轉(zhuǎn)化，而且容易培植。本實(shí)驗(yàn)所用種子由英國進(jìn)口，亨普斯特德種子供應(yīng)商Hemel生產(chǎn)，BoyceThompson植物研究供。所有種子用漂白水進(jìn)行消毒20分鐘，發(fā)芽后再用70％乙醇消毒20分鐘。若有發(fā)現(xiàn)某種子樣本在培植過程中被細(xì)菌或真菌污染，終止培植并銷毀該樣本。將胡蘿卜無菌培植后7-15天割下胚軸，移植到液體培養(yǎng)基中，在溫室、避光、慢速震搖條件下，與土壤桿菌屬EHA105共同培植36-48小時(shí)(培養(yǎng)基中有含量適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，詳述后)。然后，將移植作物轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中加入植物生長(zhǎng)素2，4-D以刺激胚芽胼胝體再生；以及羧噻吩青霉素-棒酸復(fù)合劑以殺滅殘存的土壤桿菌。室溫避光培植。五周后，移植物已長(zhǎng)出胼胝體，將其轉(zhuǎn)移至新鮮配制的含卡那霉素的固體培養(yǎng)基，以篩選優(yōu)勢(shì)植株細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。所有植株均以室溫、避光培植。再過五周，將健康胼胝體轉(zhuǎn)移到不含2，4-D的新鮮固體培養(yǎng)基上，給予充足光線以促進(jìn)幼苗再生。另外，將其中部分胼胝體轉(zhuǎn)移到含2，4-D的新鮮固體培養(yǎng)基上，仍以避光培植，以刺激胼胝體進(jìn)一步生長(zhǎng)，以培植出下一批幼苗。所有在卡那霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良或被細(xì)菌、真菌污染的植株均要終止培植并銷毀。經(jīng)過大約10-14周的培植與優(yōu)勢(shì)篩選后，給予充足光線，將長(zhǎng)出根芽的胡蘿卜轉(zhuǎn)移到控制條件的溫室中培植。8周后可收獲轉(zhuǎn)基因胡蘿卜根部。實(shí)施例12轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)取2-5克上述卡那霉素培養(yǎng)篩選的健康胡蘿卜胼胝體轉(zhuǎn)移到50毫升的液體培養(yǎng)基上。此標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基成分400毫升水、400微升Murashige&Skoog維生素、1.7克Murashige&Skoog鹽、1.2克蔗糖，經(jīng)高壓滅菌處理后，按濃度2.2毫克/升加入2，4-D，并按濃度300毫克/升加入羧噻吩青霉素-棒酸復(fù)合劑以防止微生物污染。將上述培養(yǎng)基置旋轉(zhuǎn)型搖床上，常溫下，100-120轉(zhuǎn)/分搖轉(zhuǎn)。經(jīng)上述處理，胼胝體逐漸分解為單一細(xì)胞或細(xì)胞系。每隔7-10天，每5毫升細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液加入45毫升新鮮液體培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的健康生長(zhǎng)。實(shí)施例13將胡蘿卜細(xì)胞制成干粉胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)7-10天后，將細(xì)胞懸浮液用濾紙過濾，-80℃凍結(jié)24小時(shí)。收集樣本凍存數(shù)周后，將樣本置冷凍管中，最低參數(shù)真空干燥48小時(shí)后。稱重、用手?jǐn)D壓樣本，用密封塑料袋分裝-20℃儲(chǔ)存，每袋約350克。所制成的細(xì)胞干粉應(yīng)該高度脫水，不沾手；而且細(xì)胞干粉的重量至少比新鮮采集的成品減少10％。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)干粉的結(jié)構(gòu)作特異性檢測(cè)?？蓽y(cè)量抗原含量為50-100微克/克凈重干粉；可測(cè)量抗原濃度約為10-15倍。實(shí)施例14特異性構(gòu)建體PTH110構(gòu)建體PTH110編碼E.coli熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位。研究證實(shí)本構(gòu)建體在馬鈴薯表達(dá)并能在給小鼠飼喂給藥后產(chǎn)生效應(yīng)(Mason等，supra)；而且用于人類臨床試驗(yàn)(Tacket等，1998NatureMed.4607)。本構(gòu)建體在馬鈴薯表達(dá)，是巨噬細(xì)胞激活因子的靶基因(進(jìn)口準(zhǔn)字1999007035)。紐西蘭林肯Landcare研究所已用于飼喂袋鼯研究。以下實(shí)驗(yàn)研究本抗孕植物對(duì)免疫和生殖方面的影響，用熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位(熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位)表達(dá)陽性的胡蘿卜作為陰性對(duì)照。作為陰性對(duì)照的植物細(xì)胞中的熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位分子結(jié)構(gòu)為五聚體，和生殖道、呼吸道和消化道黏膜的上皮細(xì)胞有親和力，因此可以與分子量更小的蛋白例如抗孕藥的抗原決定族特異性結(jié)合。以下的構(gòu)建體編碼含有熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位和具有免疫抗孕效應(yīng)的多肽的融合蛋白。對(duì)植物的根部和葉子進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法分析也顯示熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位為五聚體，分子結(jié)構(gòu)中含有具有免疫抗孕效應(yīng)的多肽。pGPTV-MuZP3與構(gòu)建體PTH110比較，構(gòu)建體PTH110在原熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的基因下游近端有插入序列，表達(dá)于蛋白多肽的羥基末端。其氨基酸序列中有多肽結(jié)合位點(diǎn)(氨基酸序列Asn-Ser-Asp-Pro-His-Val-Pro)(SEQIDNO7)，B細(xì)胞的微小抗原決定族，以及小鼠透明帶糖蛋白3的氨基酸殘基335-342(序列Asn-Phe-Gln-Ile-His-Gly-Pro-Arg)(SEQIDNO8)。pGPTV-GnRH1與二元載體pGPTV-小鼠透明帶糖蛋白3構(gòu)建體比較，本構(gòu)建體具有豬的GnRH的十肽結(jié)構(gòu)的基因編碼序列，表達(dá)在小鼠透明帶糖蛋白3的抗原決定族上。本十肽結(jié)構(gòu)的氨基酸序列如下Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQIDNO9)，在哺乳動(dòng)物中普遍表達(dá)。pGPTV-GnRH3與構(gòu)建體PTH110比較，本構(gòu)建體具有GnRH的十肽結(jié)構(gòu)，通過連接位點(diǎn)與熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位基因的氨基末端融合。在熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位基因中含有信號(hào)多肽，在翻譯后切割以使其分子五聚體結(jié)構(gòu)的成熟。此切割位點(diǎn)在酪氨酸和甘氨酸殘基之間(殘基編號(hào)21&22)。切割完成后，GnRH抗原決定族已經(jīng)插入到甘氨酸殘基后。在GnRH的抗原決定族與熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的氨基末端有短序列(氨基酸序列Tyr-Ala-His-Gly)(SEQIDNO10)，以維持丙氨酸-丙氨酸序列結(jié)構(gòu)，由此促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)的成熟過程。pGPTV-pAW6與pGPLIV-GnRH1構(gòu)建體比較，本構(gòu)建體具有澳洲袋鼠的透明帶糖蛋白3來源的B細(xì)胞抗原抗原決定族，位于GnRH的十肽結(jié)構(gòu)內(nèi)。此抗原抗原決定族由27個(gè)氨基酸組成，(野生型序列第334-361)，其序列保守。pGPTV-pAW4與構(gòu)建體PTH110比較，其熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的基因被澳洲袋鼠的透明帶糖蛋白3的編碼基因全段所替代。pGPTV-pAW4-A2與二元載體pGPTV-pAW4構(gòu)建體比較，其結(jié)構(gòu)中僅具有澳洲袋鼠透明帶糖蛋白3的部分序列短片段，推測(cè)是部分多肽被切割造成的。在澳洲袋鼠透明帶糖蛋白3基因的羥基末端有插入片段，其中有短肽序列(Gly-Pro-Gly-Pro)(SEQIDNO11)和E.coli熱穩(wěn)定腸毒素A亞單位的基因編碼區(qū)。E.coli根據(jù)分泌產(chǎn)生的腸毒素不同而分A和B兩個(gè)亞單位。在野生型和植物細(xì)胞里的，兩者結(jié)合在一起組成穩(wěn)定的海參毒素。其中B亞單位作用于上皮細(xì)胞，而A亞單位通過腺苷二磷酸核糖化作用引起腹瀉。A亞單位有A1和A2兩個(gè)區(qū)。A1區(qū)在下游處延伸形成A2區(qū)，通過α-螺旋與B亞單位形成的五聚體連接，組成分子結(jié)構(gòu)骨架，最后A1區(qū)錨定在五聚體上。將二元載體pGPTV-pAW4-A2構(gòu)建體與構(gòu)建體PTH110或上述一系列衍生構(gòu)建體共同轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，A2區(qū)提供錨定位點(diǎn)，使澳洲袋鼠透明帶糖蛋白與3熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位連接起來。實(shí)施例15小鼠飼喂轉(zhuǎn)基因胡蘿卜抗孕試驗(yàn)以前述實(shí)施例14方法構(gòu)建基因并轉(zhuǎn)化胡蘿卜，實(shí)施例11方法培植，實(shí)施例12、13方法加工處理。將小鼠按雌雄比例3∶1進(jìn)行配種，同籠飼養(yǎng)，記錄雌鼠產(chǎn)子數(shù)目。胡蘿卜干粉的熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的表達(dá)量應(yīng)高于50μg/克。將干粉混勻，按重量容積比1∶2的比例加入蘋果汽水調(diào)成糊狀。隔周飼喂一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。把小鼠分成三組，其中4-5只飼喂4克野生型胡蘿卜加蘋果汽水；4-5只飼喂4克轉(zhuǎn)基因胡蘿卜加蘋果汽水；4-6只飼喂4克轉(zhuǎn)基因胡蘿卜加蘋果汽水和Quillaja提取粉末10毫克(Garuda提供)。飼喂當(dāng)天，將雌性小鼠由中午開始隔離、停止飼喂任何食物，只飼喂水，并單獨(dú)隔離，下午4點(diǎn)飼喂上述實(shí)驗(yàn)用藥，留置飼喂品在籠里過夜。次晨8時(shí)將隔離雌性小鼠放回與配種雄性小鼠同籠喂養(yǎng)。第0天和70天，從雌性小鼠尾部取血，分離血清，于-80℃保存，留作日后抗體分析。第96天從心臟穿刺取血，同法處理。第70天和87天取糞便標(biāo)本，-80℃凍存過夜，取沉淀物凍干處理，加入磷酸鹽緩沖液0.8毫升(pH7.2)制成懸浮液，14000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清-20℃保存，留日后檢測(cè)用。實(shí)施例16新鮮植物飼喂小鼠同時(shí)給受試小鼠飼喂新鮮植物，實(shí)驗(yàn)中使用新鮮西紅柿和胡蘿卜的果實(shí)和葉子。挑選熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的表達(dá)量大于50皮克/克的西紅柿和胡蘿卜干粉，采用其相對(duì)應(yīng)的來源新鮮植物，葉子和果實(shí)均可。將植物切碎混勻，加蘋果汽水調(diào)成糊狀。隔周飼喂一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。把小鼠分成三組，其中4-5只飼喂4克野生型胡蘿卜或西紅柿加蘋果汽水；4-5只飼喂4克轉(zhuǎn)基因胡蘿卜或西紅柿加蘋果汽水；4-6只飼喂4克轉(zhuǎn)基因胡蘿卜或西紅柿加蘋果汽水和Quillaja浸膏10毫克(Garuda提供)。飼喂當(dāng)天，將雌性小鼠由中午開始隔離、停止飼喂任何食物，只飼喂水，并單獨(dú)隔離，下午4點(diǎn)飼喂上述實(shí)驗(yàn)用藥，留置飼喂品在籠里過夜。次晨8時(shí)將隔離雌性小鼠放回與配種雄性小鼠同籠喂養(yǎng)。第0天和70天，從雌性小鼠尾部取血，分離血清，于-80℃保存，留作日后抗體分析。第96天從心臟穿刺取血，同法處理。第70天和87天取糞便標(biāo)本，-80℃凍存過夜，取沉淀物凍干處理，加入磷酸鹽緩沖液0.8毫升(pH7.2)制成懸浮液，14000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清-20℃保存，留日后檢測(cè)用。實(shí)施例17植物干粉勻漿的抗原衰減程度變化植物來源疫苗的應(yīng)用要使用適當(dāng)劑量，這要通過臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出用藥最小劑量和最大劑量之間的范圍。用于制造疫苗的原材料要有適當(dāng)?shù)目乖瓭舛扔行Х秶?，藥廠的批量生產(chǎn)和質(zhì)量控制才有意義。最近三項(xiàng)人體試驗(yàn)(Tacket等，1998；Tacket等2000；Thanavala等，personalcommunication)中，受試者食用未經(jīng)加工的、表達(dá)有效的抗原蛋白的小塊轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。上述試驗(yàn)中，由隨機(jī)抽樣檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的抗原表達(dá)量得出試驗(yàn)用藥劑量，結(jié)果相差懸殊，高達(dá)3倍。挑選類似的馬鈴薯，用前述方法脫水制成干粉，隨機(jī)抽樣作體外免疫反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同樣本之間的抗原衰減程度相差高達(dá)10倍。在表達(dá)相同抗原(乙型肝炎表面抗原)的轉(zhuǎn)基因西紅柿以及其他幾種轉(zhuǎn)基因植物的試驗(yàn)中也得出相同結(jié)果(見表1，說明書附圖部分)。在本試驗(yàn)中，用以下兩種方法之一取得均化作用效果。第一種方法在冰凍干燥前，搗碎和混勻新鮮植物材料的過程中，以及在將混勻材料冰凍和冰凍干燥以后使用。首先把植物切片、混合或研磨，將果實(shí)、塊莖、葉子、種子等作初步加工，做成果漿。果漿內(nèi)含有完整植物細(xì)胞和細(xì)胞歲片。此方法的優(yōu)點(diǎn)是將較大的植物樣本如果實(shí)和塊莖類的體積縮小，混在一起形成較均質(zhì)的混合物，以使不同樣本的同種蛋白的含量之間的差異縮小，達(dá)到大致的相同。另外，由于本方法沒有完全破壞植物細(xì)胞的完整性，提供穩(wěn)定環(huán)境有利于在以后的處理過程中細(xì)胞內(nèi)同種蛋白的保存。第二種均化方法對(duì)植物初步加工處理的步驟簡(jiǎn)單。按上述步驟將植物切成四份或碎片，或不予切開，冰凍干燥。然后手工擠壓成粉末，儲(chǔ)存在一大容器內(nèi)，用震蕩器或干燥混勻器使之混勻。在植物的加工全過程中要求簡(jiǎn)化步驟，以盡量減少對(duì)植物的抗原濃度的影響。在標(biāo)準(zhǔn)，以干燥前處理工序(勻漿、去皮、切成四份或小片)對(duì)干燥所需要時(shí)間的影響作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)這些工序?qū)χ参锏目乖瓭舛鹊挠绊?。如圖7顯示，除馬鈴薯沒作去皮或任何切碎處理(切成四份、果丁、片狀或勻漿)以外，全部冰凍干燥步驟均是必須的。實(shí)施例18使用非勻漿技術(shù)，對(duì)馬鈴薯進(jìn)行脫水處理，使其凈重減少至毛重的1/11，而將轉(zhuǎn)基因蛋白的丟失減低到最低程度前面所述口服試驗(yàn)中使用了相對(duì)比較大的劑量以保證受試食品中含有足夠的抗原濃度。例如，上述的三個(gè)人體臨床試驗(yàn)中，受試者每次服食100至150克未經(jīng)加工的馬鈴薯，以至有些受試者要30分鐘才能消化掉。對(duì)于大部分接受疫苗接種的人來說，服食100克左右或更多的未加工食品似乎難以接受。因此，這里表述的實(shí)驗(yàn)方法的主要優(yōu)點(diǎn)就是能夠濃縮蛋白質(zhì)。如表2所示(說明書附圖部分)，材料被最大限度的壓縮94％(馬鈴薯經(jīng)處理后凈重減少至毛重的11％，而西紅柿是6％)。與前述的臨床試驗(yàn)比較，使用本方法處理后，受試者只需要口服6克的植物干粉，而植物的抗原量不會(huì)在加工過程中丟失。而且，植物干粉可以用常用方法賦型，如制成糊劑或飲料，以便口服。這里的資料描述了多種抗原和植物品種的加工方法。這些加工方法去除了植物90％的水分，使樣本的凈重比毛重減輕了11倍，但是，對(duì)植物品種的評(píng)估顯示，濃縮后的樣本的抗原濃度僅增加了4-8倍，說明了在加工過程抗原的丟失明顯(至少是在檢測(cè)過程中發(fā)生抗原丟失)。加工過程通常包括原材料的勻漿，冰凍、冰凍干燥、濃縮后制成精細(xì)干粉，然后使用賦形劑(抗氧化劑、穩(wěn)定劑、佐劑等)。如表2所總結(jié)，在多個(gè)植物品種的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上述非勻漿方法可以濃縮原材料而最大限度的減少植物抗原的丟失。使用本方法可以明顯減少口服植物量而達(dá)到有效的劑量濃度，并增加口服植物的抗原濃度。另外，對(duì)于更多的植物成分，如葉子或莖部，使用勻漿方法會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)基因蛋白，使用本方法，簡(jiǎn)便易行，可穩(wěn)定疫苗或其他治療用藥物。實(shí)施例19組織勻漿劑型環(huán)境穩(wěn)定性與賦形劑對(duì)抗原修復(fù)和穩(wěn)定的影響先前關(guān)于植物來源提取物的藥物學(xué)方面的研究評(píng)價(jià)了目的蛋白在天然植物中的穩(wěn)定性。苜蓿來源的標(biāo)準(zhǔn)抗體提取物在液體抽提液中可以保持穩(wěn)定性兩個(gè)小時(shí)，在干燥苜蓿中可保持穩(wěn)定性12周(Khoudi等，1999)。對(duì)于植物來源的治療用藥來說，尤其是口服疫苗，要保持大部分的藥效，以穩(wěn)定食物形式保存可使抗原穩(wěn)定性保存期延長(zhǎng)到至少6個(gè)月到2-3年。對(duì)幾種表達(dá)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)抗原的劑型的環(huán)境穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，目的蛋白的穩(wěn)定性可保持達(dá)12個(gè)月。如圖9顯示，大多數(shù)的材料在穩(wěn)定周邊環(huán)境和較低溫度條件下，沒有明顯降解。說明高效非熱性脫水是保護(hù)抗原的手段，此方法可使抗原與植物同時(shí)脫水或存留在完整植物細(xì)胞和部分細(xì)胞碎片內(nèi)，從而不被降解。需作進(jìn)一步的檢測(cè)以確定是否植物本身的酶或結(jié)構(gòu)蛋白可破壞劑型的保護(hù)結(jié)構(gòu)，使抗原失效，成為無目的基因的勻漿。在這些標(biāo)準(zhǔn)劑型中，使用的賦形劑有好幾種，對(duì)其免疫原性、對(duì)植物材料的保護(hù)效果、抗原修復(fù)和抗原穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。有研究顯示(Leopold，1998)，單一結(jié)構(gòu)玻璃化糖可以通過保護(hù)防止蛋白自然變性而對(duì)植物酶起穩(wěn)定作用。在將轉(zhuǎn)基因西紅柿制成果醬的過程中，加入食用蔗糖，評(píng)價(jià)其對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)抗原的穩(wěn)定性的影響。除蔗糖以外，將西紅柿和馬鈴薯勻漿后，加入試驗(yàn)用佐劑液，作為臨床評(píng)價(jià)；并且在部分樣本中加入維生素C(Aldrich提供)，以評(píng)價(jià)抗氧化劑對(duì)減少馬鈴薯勻漿抗原丟失的效果。而這些賦形劑對(duì)抗原修復(fù)和穩(wěn)定性的效應(yīng)嚴(yán)格來說是不一致的。加入蔗糖并不明顯增加植物材料脫水處理的時(shí)間。維生素C的用量必須不少于1∶150的濃度(質(zhì)量比)，才能對(duì)馬鈴薯勻漿產(chǎn)生可見性的抗氧化效應(yīng)(勻漿變?yōu)樽睾稚?。但是此用量并沒有大到修復(fù)抗原的效果。通常所有冰凍干燥的材料在周邊溫度下可保持抗原穩(wěn)定性6個(gè)月，某些甚至可保持到12個(gè)月。因此，在上述實(shí)驗(yàn)中，冰凍干燥是脫水過程中的基本步驟，而經(jīng)過初步勻漿加工的材料可以在儲(chǔ)存之前應(yīng)用空氣干燥或噴霧干燥。優(yōu)選是無論什么干燥方法，最后可以使材料脫水90％以上(重量比)，儲(chǔ)存在密封袋和密封容器里。密封后，勻漿干粉可儲(chǔ)存于室溫下。使用此方法未發(fā)現(xiàn)明顯的可測(cè)量性目的蛋白的減少。實(shí)施例20飼喂轉(zhuǎn)基因免疫性抗孕用西紅柿動(dòng)物產(chǎn)子胎數(shù)小于對(duì)照組本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給小鼠經(jīng)口飼喂植物來源的由熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位-小鼠透明帶糖蛋白3抗原決定族的融合蛋白加皂甙佐劑制成的藥物以后，其生殖力降低45.3％。將Millar等所述實(shí)驗(yàn)方法合成的熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位與小鼠透明帶糖蛋白3抗原決定族的融合基因轉(zhuǎn)化西紅柿，然后用于本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)使用三個(gè)飼喂方案野生型西紅(對(duì)照組)，轉(zhuǎn)基因西紅柿(轉(zhuǎn)基因組)，轉(zhuǎn)基因西紅柿加Quillaja浸膏(轉(zhuǎn)基因+佐劑組)。將西紅柿冰凍干燥、研磨成粉末后以1∶2的比例(重量比)加入經(jīng)巴氏消毒的蘋果汽水(由CORNELL提供)。將西紅柿所含的熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的濃度值作為融合蛋白的近似值。實(shí)驗(yàn)組所用的轉(zhuǎn)基因西紅柿每?jī)糁?克所含有的熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的表達(dá)量應(yīng)大于8克。西紅柿配成飼喂品后，熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位或融合蛋白的含量是37.8克；轉(zhuǎn)基因加佐劑加入的Quillaja浸膏粉末(由Garuda提供)的量為10毫克/4克。每次用培養(yǎng)皿裝4克飼喂品飼喂雌鼠；每次飼喂的轉(zhuǎn)基因西紅柿中含有熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位或融合蛋白100.8克。同時(shí)給予小鼠和田鼠飼喂，隔周一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。在小鼠組，在頭5個(gè)飼喂天，將雌性小鼠從原來的籠中隔離出來，給予單獨(dú)飼喂，停留4到6小時(shí)后放回原來的籠里。飼喂當(dāng)天，將雌性小鼠由中午開始隔離、停止飼喂任何食物，只飼喂水，并單獨(dú)隔離，下午4點(diǎn)飼喂上述實(shí)驗(yàn)用藥，留置飼喂品在籠里過夜。次晨8時(shí)將隔離雌性小鼠放回與配種雄性小鼠同籠喂養(yǎng)。記錄剩余飼喂品的重量，以觀察小鼠進(jìn)食和進(jìn)飲情況。在田鼠組，在給予雌性田鼠飼喂前將雄性田鼠和小田鼠從籠里取出，暫時(shí)停留啊另外一個(gè)籠里，以免它們進(jìn)食飼喂品。停留時(shí)間不大于一小時(shí)，以免其由于分離而產(chǎn)生緊張。如果雌性田鼠沒吃完飼喂品，取走剩余飼喂品，四小時(shí)后采用相同方式飼喂剩余飼喂品。記錄剩余飼喂品的重量。對(duì)受試小鼠和田鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的產(chǎn)次和產(chǎn)子數(shù)進(jìn)行記錄。在小鼠組，各組之間的產(chǎn)次無明顯差異(∝＝0.05)。然而轉(zhuǎn)基因加佐劑組的產(chǎn)子數(shù)比對(duì)照組下降45.3％前者是平均每次產(chǎn)2.9只，而后者是每次產(chǎn)5.3只。本結(jié)果的統(tǒng)計(jì)可信區(qū)間是90％。在田鼠組，各組之間的產(chǎn)次無明顯差異(∝＝0.05)；而各組之間的產(chǎn)子數(shù)也沒有差異。本結(jié)果的統(tǒng)計(jì)可信區(qū)間是95％(∝＝0.05，∝＝0.1)實(shí)施例21植物加工處理對(duì)抗原含量的影響在進(jìn)行冰凍干燥處理前后對(duì)轉(zhuǎn)基因植物2號(hào)的重量和熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的含量進(jìn)行測(cè)量，以檢測(cè)冰凍干燥處理對(duì)植物的重量和抗原含量的影響。對(duì)樣本的重量方面的測(cè)量顯示，處理后植物的重量較處理前(無相關(guān)數(shù)據(jù))下降6％。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)顯示，熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的含量在冰凍干燥處理前后的無明顯差別，抗原濃度約為16倍，提示冰凍干燥過程沒有發(fā)生明顯的抗原丟失。實(shí)施例22使用植物來源疫苗經(jīng)口飼喂小鼠以被動(dòng)免疫子代小鼠動(dòng)物將小鼠置籠里喂養(yǎng)，除飼喂測(cè)試食品外，給予飼喂水和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用食物。每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用5-6只成年雌性小鼠。將小鼠按雌雄比3∶1和2∶1的比例同籠飼養(yǎng)。幼鼠斷奶后將其與母鼠隔離并與其他幼鼠同籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法將表達(dá)熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的轉(zhuǎn)基因西紅柿細(xì)胞系放溫室，以適宜的條件培育，用于本實(shí)驗(yàn)。將西紅柿果實(shí)制成粉末，批量制成植物疫苗，4℃保存。將西紅柿粉末與蘋果汽水以1∶2的比例(重量比)配制，作為口飼疫苗組；另外，在上述基礎(chǔ)上按每4克加入10毫克的Quillaia浸膏作為佐劑組。疫苗的飼喂方案隔周飼喂一次(0天，3天，14天，17天，28天，31天，42天，45天，56天，59天，70天，73天，84天，87天)共12周。飼喂當(dāng)天，將雌性小鼠由中午開始隔離、停止飼喂任何食物，只飼喂水，并單獨(dú)隔離，下午4點(diǎn)進(jìn)行飼喂，留置飼喂品在籠里過夜。次晨8時(shí)將隔離雌性小鼠放回與配種雄性小鼠同籠喂養(yǎng)。如前述，將小鼠分為三組對(duì)照組(四只小鼠)、疫苗組(五只小鼠)、疫苗加佐劑組(五只小鼠)。血清取樣第0天和70天，從雌性小鼠尾部取血，分離血清，于-80℃保存，留作日后分析。第96天從心臟穿刺取血，同法處理。試驗(yàn)進(jìn)行42天后，每組均有小鼠出生(每組有2只或大于2只雌性小鼠生產(chǎn)，每組至少13只)。將新生小鼠用良好條件喂養(yǎng)，以保持健康，留作日后作熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位的抗體效價(jià)分析，取血時(shí)間是幼鼠出生第21天，心臟穿刺取血。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位抗體對(duì)血清樣本的抗熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位免疫球蛋白G進(jìn)行測(cè)定，方法如[8]。簡(jiǎn)單來說，將樣本用含0.05％的吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)稀釋。將微量滴定板涂上神經(jīng)節(jié)甙酯III型(美國密蘇里洲圣路易斯Sigma公司提供)。然后，用0.25％BSA封閉，再加入純化的熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位重組子孵育1小時(shí)。洗滌后，加入兔抗鼠免疫球蛋白G和堿性磷酸酶共軛山羊抗兔血清(Sigma公司提供).，最后加入稀釋血清進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過比較母鼠和其生產(chǎn)的幼鼠的血清的抗體陽性反應(yīng)的最低稀釋度來探討母鼠和幼鼠之間的關(guān)系。所檢測(cè)的母鼠的血清抗體陽性反應(yīng)的最低稀釋度的取血時(shí)間是第70和96天，正好與其相應(yīng)幼鼠的取血時(shí)間相近。因此，所有幼鼠的取血時(shí)間應(yīng)限定在出生第21天。受試小鼠中有7只母鼠、9胎幼鼠、41只幼鼠。處理和產(chǎn)仔進(jìn)行熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位抗體效價(jià)檢測(cè)的小鼠情況在對(duì)照組中，3只母鼠、生產(chǎn)4胎、共18只幼鼠；在轉(zhuǎn)基因西紅柿組，4只母鼠、生產(chǎn)5胎、共17只幼鼠；在轉(zhuǎn)基因西紅柿加佐劑組，2只母鼠、生產(chǎn)3胎、共13只幼鼠。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位抗體給予轉(zhuǎn)基因西紅柿組和轉(zhuǎn)基因西紅柿加佐劑組母鼠的經(jīng)口飼喂疫苗總次數(shù)為14次，平均每次飼喂的疫苗的熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位含量為75.6μg。而每只母鼠在生產(chǎn)前接受飼喂的次數(shù)是不同的，但至少都有8次。第70天取血做的血清檢測(cè)顯示，飼喂轉(zhuǎn)基因西紅柿組和轉(zhuǎn)基因西紅柿加佐劑組中所有母鼠的抗熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位免疫球蛋白的效價(jià)明顯高于對(duì)照組(圖11，檢驗(yàn)水準(zhǔn)＝0.05)；而轉(zhuǎn)基因西紅柿組和轉(zhuǎn)基因西紅柿加佐劑組之間的比較差異無顯著性。對(duì)照組的18只幼鼠中，沒有樣本的血清抗體陽性反應(yīng)的最低稀釋度大于25(圖12)；而轉(zhuǎn)基因西紅柿組的17只幼鼠的血清抗體陽性反應(yīng)的最低稀釋度為558.3；轉(zhuǎn)基因西紅柿加佐劑組的13只幼鼠的血清抗體陽性反應(yīng)的最低稀釋度為448.1。轉(zhuǎn)基因西紅柿組和轉(zhuǎn)基因西紅柿加佐劑組之間的比較差異無顯著性(檢驗(yàn)水準(zhǔn)＝0.05)；轉(zhuǎn)基因西紅柿組和轉(zhuǎn)基因西紅柿加佐劑組的血清抗體陽性反應(yīng)的最低稀釋度明顯高于對(duì)照組(檢驗(yàn)水準(zhǔn)＝0.05)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，母鼠和相應(yīng)幼鼠的血清抗熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位免疫球蛋白的效價(jià)成正相關(guān)(r2值為0.9289)。實(shí)施例23穩(wěn)定性研究此處表述了一些植物原料的儲(chǔ)存情況。包括NT-1細(xì)胞培養(yǎng)，此細(xì)胞表達(dá)AIV-HA和改造過的大腸桿菌腸毒素(SLT102)；轉(zhuǎn)基因西紅柿表達(dá)AIV-HA、NVCP、乙型肝炎表面抗原和E.大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素B亞單位；以及轉(zhuǎn)基因西紅柿表達(dá)NVCP和乙型肝炎表面抗原。上述材料在不同的溫度下儲(chǔ)存超過6個(gè)月，在此過程中，定期隨機(jī)抽樣通過進(jìn)行標(biāo)志抗原檢測(cè)，評(píng)估其抗原含量。圖14至17描述了在上述儲(chǔ)存植物材料中隨機(jī)抽樣檢測(cè)顯示的存留可測(cè)量抗原含量。其他實(shí)施例其他的實(shí)施例是本領(lǐng)域的公知技術(shù)。必須聲明上述內(nèi)容僅作為增加本發(fā)明的透明度，而且僅作為示范。本發(fā)明的精要和內(nèi)涵不只是以上實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，而且包括權(quán)利要求書。所有的專利、專利申請(qǐng)和出版物的引用都完整引作參考。參考文獻(xiàn)ArakawaT，YuJ，ChongDK，HoughJ，EngenPC，LangridgeWH″Aplant-basedcholeratoxinBsubunit-insulinFUSIONPROTEINPROTECTSAGAINSTTHEDEVELOPMENTOFAUTOIMMUNEDIABETES″；NatBiotechnol16934-8(1998).ARIKAWA，J.，K.Yoshimatsu，andK.H.″Epidemiologyandepizootiologyofhantavirusinfectionin[JAPAN.″；Jpn.J.Infect.Dis.，54，no.395-102(2001).BagdasarianMM，NagaiM，F(xiàn)reyJ，BagdasarianM″ImmunogenicityofActinobacillusApxIAtoxinEPTIOPESFUSEDTOTHEE.COLIHEAT-LABILEENTEROTOXINBSUBUNIT″.Vaccine17441-447.(1999).Bandivdekar，A.H.，V.J.VERNEKAR，S.B.Moodbidrietal.″Characterizationof80kDahumanspermantigenRESPONSIBLEFORIMMUNOINFERTILITY.″AM.JREPROD.IMMUNOL″；45，no.128-34(2001).BeckerD，KemperE，SchellJ，MastersonR″NewplantbinaryvectorswithselectablemarkersLOCATEDPROXIMALTOTHELEFTTDNABORDER.PLANTMOLECULARBIOLOGY″；201195-1197(1992).Berger，J.，andS.L.Cain″Reproductivesynchronyinbrucellosis-exposedbisoninthesouthernGREATERYELLOWSTONEECOSYSTEMANDINNONINFECTEDPOPULATIONS.″；CONSERVATIONBIOLOGY，13，no.2357-366(1999).Bosshardt，S.C.，etal.″BrugiapahangicirculatingantibodiestoadultwormantigensinUNINFECTEDPROGENYOFHOMOLOGOUSLYINFECTEDFEMALEJIRDS″；ExpParasitol，72(4)p.440-449(1991).CardenasL，ClementsJD″Developmentofmucosalprotectionagainsttheheat-stableenterotoxin(ST)OFESCHERICHIACOLIBYORALIMMUNIZATIONWITHageneticfusiondeliveredbyabacterialvector″；InfectImmun614629-36(1993).Chavali，S.R.andJ.B.Campbell″AdjuvanteffectsoforallyadministeredsaponinsonhumoralANDCELLULARIMMUNERESPONSESINMICE″；IMMUNOBIOLOGY，174(3)p.347-359(1987).Cousins，D.V.″Mycobacteriumbovisinfectionandcontrolindomesticlivestock.″Rev.Sci.TECH.″；20，no.171-85(2001).Cox，J.C.，andA.R.Coulter″Adjuvants--aclassificationandreviewoftheirmodesofaction.″Vaccine″；15，no.3248-256(1997).Dalsgaard，K.，etal.″Plant-derivedvaccineprotectstargetanimalsagainstaviraldisease″.NatBiotechnol，15(3)p.248-52(1997).Dickinson，B.L.andJ.D.Clements″DISSOCIATIONOFESCHERICHIACOLIHEAT-LABILEENTEROTOXINADJUVANTICITYFROMADP-RIBOSYLTRANSFERASEACTIVITY″；InfectImmun，63(5)p.1617-23(1995).Dunbar，B.S.，andS.V.Prasad″Contraceptivevaccinecomprisingaglycosylated[55KD]zonapellucidaproteinimmunogenandmethodofuseofthesameincontraception.″UnitedStates，1997.Edelman，R.″Anupdateonvaccineadjuvantsinclinicaltrial″；AIDSRes.Hum.Retroviruses；8，no.81409-1411(1992).FitchenJ，BeachyRN，HeinMB″Plantvirusexpressinghybridcoatproteinwithaddedmurineepitopeelicitsautoantibodyresponse″；Vaccine131051-7(1995).FraryA，EarleED″ANEXAMINATIONOFFACTORSAFFECTINGTHEEFFICIENCYOFAGROBACTERIUM-mediatedtransformationoftomato″；PlantCellReports16235-240(1996).HaqTA，MasonHS，ClementsJD，ARNTZENCJ.″ORALimmunizationwitharecombinantbacterialantigenproducedintransgenicplants″；Science268714-716(1995).HiattAC，CafferkeyR，BowdishK.″Productionofantibodiesintransgenicplants″；Nature34276-78(1989).Hoshi，S.，A.Uchino，N.Saitoetal.″ComparisonofadjuvantswithrespecttoserumIgGantibodyresponseinorallyimmunizedchickens″；Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.，22，no.163-69(1999).Ingardia，C.J.，etal.，″CorrelationOFMATERNALANDFETALHEPATITISBANTIBODYTITERSFOLLOWINGMATERNALVACCINATIONINPREGNANCY″；Am.J.Perinatology，16(3)p.129-132(1999).Kennelly，J.J.，andK.A.Converse″Surgicalsterilizationanunderutilizedresearchprocedureforwildlifedamagecontrol″；InProceedingofsymposiumContraceptioninwildlifemanagement.Washington，D.C.USDA/APHIS.KhoudiH，LabergeS，F(xiàn)erulloJ-M，BazinR，DarveauA，CastonguayY，AllardG，LEMIEUXR，VezinaL-P″Productionofadiagnosticmonoclonalantibodyinperennialalfalfaplants.BiotechnologyandBioengineering″；64(2)135-143(1999).Koo，M.，etal.″Prote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50％。50.如權(quán)利要求38的植物細(xì)胞，其中所述的核酸載體編碼的具抗孕效應(yīng)的多肽選自透明帶糖蛋白3、GnRH、LHRH、LH、LDH和抗精子抗原。51.如權(quán)利要求39的植物細(xì)胞，其中所述的透明帶糖蛋白是從ZP1、ZP2、ZP3和ZP4中選取的。52.如權(quán)利要求38的植物細(xì)胞，其中所述的抗孕蛋白是種屬特異性的。53.如權(quán)利要求40的植物細(xì)胞，其中所述的抗孕蛋白是ZP3。54.如權(quán)利要求38的植物細(xì)胞，其中所述的核酸載體同時(shí)編碼黏膜親和蛋白。55.如權(quán)利要求43的植物細(xì)胞，其中所述的黏膜親和蛋白是大腸桿菌屬腸毒素B亞單位。56.如權(quán)利要求38的植物細(xì)胞，其中所述的植物細(xì)胞來自單子葉植物。57.如權(quán)利要求38的植物細(xì)胞，其中所述的植物細(xì)胞來自雙子葉植物。58.如權(quán)利要求38的植物細(xì)胞，其中所述的及的植物細(xì)胞是從下列植物細(xì)胞中篩選的西紅柿細(xì)胞、水稻細(xì)胞、小麥細(xì)胞、玉米細(xì)胞、胡蘿卜細(xì)胞、馬鈴薯細(xì)胞、蘋果細(xì)胞、大豆細(xì)胞、紫花苜蓿細(xì)胞、苜蓿屬細(xì)胞、蔬菜細(xì)胞和水果細(xì)胞。59.一種用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的質(zhì)粒載體，它包括編碼具有抗孕效應(yīng)的多肽的核酸序列；植物功能性啟動(dòng)子，它可與上述編碼具抗孕效應(yīng)的多肽的核酸連接起來，從而可以直接在所述的植物細(xì)胞里合成所述的具抗孕效應(yīng)的多肽；含有所述質(zhì)粒載體的植物細(xì)胞可通過誘導(dǎo)所述動(dòng)物對(duì)所述的抗孕蛋白產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)，使用該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的受試動(dòng)物每個(gè)繁殖周期的平均產(chǎn)仔數(shù)至少下降50％。60.如權(quán)利要求48的質(zhì)粒載體，其中所述的核酸編碼的多肽其中所述的核酸載體編碼的具抗孕效應(yīng)的多肽選自透明帶糖蛋白3、GnRH、LHRH、LH、LDH和抗精子抗原。61.如權(quán)利要求49的質(zhì)粒載體，其中所述的透明帶糖蛋白是從ZP1、ZP2、ZP3和ZP4中選取的。62.如權(quán)利要求48的質(zhì)粒載體，其中所述的植物細(xì)胞來自食用植物。63.如權(quán)利要求48的質(zhì)粒載體，它進(jìn)一步含有編碼黏膜親和蛋白的核酸序列。64.如權(quán)利要求52的質(zhì)粒載體，其中所述的黏膜親和蛋白是大腸桿菌屬腸毒素B亞單位。65.一種食物組合物，它含有權(quán)利要求25、26、27或28所述的、可被受試動(dòng)物吸收的轉(zhuǎn)基因植物中的至少一部分，所述的吸收誘導(dǎo)所述的動(dòng)物產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)，受試動(dòng)物每個(gè)繁殖周期的平均產(chǎn)仔數(shù)至少下降50％。66.如權(quán)利要求54的食物組合物，其中至少一部分權(quán)利要求25、26、27或28的轉(zhuǎn)基因植物是由植物葉子、根、芽、莖、果實(shí)、塊莖、花和種子中選取的。67.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求25、26、27或28的轉(zhuǎn)基因植物的至少一部分；藥學(xué)上可接受的載體；使用上述藥物組合物的受試動(dòng)物每個(gè)繁殖周期的平均產(chǎn)仔數(shù)至少下降50％。68.如權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述的至少一部分權(quán)利要求25、26、27或28所述的轉(zhuǎn)基因植物是由植物葉子、根、芽、莖、果實(shí)、塊莖、花和種子中選取的。69.一種組合物，它含有經(jīng)處理的轉(zhuǎn)基因植物材料和皂甙佐劑的混合物，它可經(jīng)口飼喂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，受試動(dòng)物每個(gè)繁殖周期的平均產(chǎn)仔數(shù)至少下降50％。全文摘要本發(fā)明提供了保存在植物中表達(dá)的藥用蛋白的方法。這里的植物組織初料加工成沒有顯著損失蛋白或其藥效的穩(wěn)定的勻漿。該勻漿可以直接用于藥用目的，而不必經(jīng)過進(jìn)一步的提取、純化、或沉淀藥用蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種對(duì)動(dòng)物和人進(jìn)行有效的免疫抗孕的方法。披露的方法可以生產(chǎn)表達(dá)抗孕蛋白的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，它們可以整體或者部分的，或者在加工以后，飼喂動(dòng)物使其產(chǎn)生抗孕效果。文檔編號(hào)A61P15/18GK1639331SQ02807917公開日2005年7月13日申請(qǐng)日期2002年4月12日優(yōu)先權(quán)日2001年4月13日發(fā)明者韋恩·科克,哈夫·馬遜,阿曼達(dá)·維爾穆斯林,查理·阿特澤申請(qǐng)人:波依斯湯普森植物研究所