專利名稱：使用抗血管生成劑和TNFα的聯(lián)合療法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于腫瘤和腫瘤轉移治療的聯(lián)合療法，此療法包括施用抗血管生成劑和腫瘤壞死因子α(TNFα)或具有TNFα生物活性的分子，以及任選地與其它細胞毒性劑如干擾素γ(IFNγ)或化療劑如順氯氨鉑、或ErbB受體抑制劑如抗EGFR抗體一起聯(lián)合使用。本方法和含有所述藥劑的藥物組合物可協(xié)同地增加各單個治療劑對腫瘤細胞增殖的抑制效果，得到比單組份單獨使用時更有效的治療效果。
背景技術：
血管生成也稱作新血管發(fā)生，它是涉及到新生血管向組織內生長的組織血管化過程。這個過程由內皮細胞和平滑肌細胞的浸潤介導。這個過程據(jù)信可以按照下面3個路徑中的任何一個進行(1)從已經(jīng)存在的血管中分生出血管；(2)由前體細胞開始血管的從頭發(fā)育(血管發(fā)生)；或(3)已經(jīng)存在的小血管擴增直徑(Blood等，1990，Bioch.Biophys.Acta 1032，89)。已知血管內皮細胞至少含有5種RGD依賴性整合蛋白，其中包括玻連蛋白受體(αvβ3或αvβ5)、膠原蛋白I型和IV型受體、層粘連蛋白受體、纖連蛋白/層粘連蛋白/膠原蛋白受體和纖連蛋白受體(Davis等，1993，J.cell.Biochem.51，206)。已知平滑肌細胞含有至少6種RGD依賴性整合蛋白，其中包括有αvβ3和αvβ5。
雖然血管生成是新生期生長中的一個重要過程，但它在傷口愈合和大量臨床重要疾病—包括組織炎癥，關節(jié)炎，牛皮癬，癌癥，糖尿病，視網(wǎng)膜病，黃斑變性和其它新血管眼病的病理中同樣重要。這些伴有血管生成的臨床病癥稱為生血管疾病(Folkman等，1987，Science 235，442)。
利用免疫特異性針對各種整合蛋白α或β亞基的單克隆抗體在體外抑制細胞粘連，提示玻連蛋白受體αvβ3參與了多種細胞類型(包括微血管上皮細胞)的細胞粘附(Davis等，1993，J.Cell.Biol.51，206)。
整合蛋白是一類細胞受體，已知這種細胞受體和細胞外基質蛋白結合，并介導細胞-細胞和細胞-細胞外基質間的相互作用，一般這種相互作用被稱為細胞粘附事件。整合蛋白受體構成一個蛋白質家族，其共同結構特征是由α亞基和β亞基構成的非共價異二聚體糖蛋白復合物。玻連蛋白受體因其最初被發(fā)現(xiàn)的特征是它優(yōu)先和玻連蛋白結合而得名?，F(xiàn)已知玻連蛋白受體代表3種不同的整合蛋白，分別命名為αvβ1，αvβ3和αvβ5。αvβ1與纖連蛋白以及玻連蛋白結合。αvβ3與種類眾多的配體結合，其中包括纖維蛋白，纖維蛋白原，層粘連蛋白，血小板反應蛋白，玻連蛋白和馮·維勒布蘭德因子。αvβ5和玻連蛋白結合。很明顯，有些不同的整合蛋白有不同的生物學功能，但是有些不同的整合蛋白和亞基卻有共同的生物學特異性。對于很多整合蛋白，配體中的一個重要的識別位點是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD在上述所有鑒定到的玻連蛋白受體整合蛋白的配體中都存在。
此RGD識別位點可以用含有RGD序列的線性和環(huán)形(多)肽模擬。已知這些RGD肽分別是整合蛋白功能的抑制劑或拮抗劑。然而，很重要的是應當注意到隨RGD肽的序列和結構的不同，抑制的特異性可發(fā)生改變而靶向特異的整合蛋白。已描述過許多有不同整合蛋白特異性的RGD多肽，見比如，Cheresh，等，1989，Cell 58，945，Aumailley等，1991，F(xiàn)EBS Letts.291，50，以及數(shù)目眾多的專利申請和專利(如美國專利4,517,686、4,578,079、4,589,881、4,614,517、4,661,111、4,792,525；EP 0770 622)。
新血管發(fā)生或血管生成在惡性疾病的發(fā)展中起關鍵作用，并已在血管生成抑制劑研發(fā)上引起了極大的興趣。(實例可參見Holmgren等，1995，Nature Medicine 1，149；Folkman，1995，Nature Medicine 1，27；O′Reilly等，1994，Cell 79，315)。已知用αvβ3整合蛋白拮抗劑抑制血管生成可以用于通過減少對實體腫瘤的血液供給而抑制實體腫瘤生長的方法中(實例可參見US 5,753,230以及US 5,766,591，其中描述了可與αvβ3受體結合并抑制血管生成的αvβ3拮抗劑-如αvβ3的合成多肽，單克隆抗體和模擬物-的使用)。在WO 97/45447中公開了用玻連蛋白受體αvβ5的拮抗劑抑制αvβ5介導的組織血管生成的方法和組合物。
血管生成的特征是內皮細胞的浸潤、遷移和增殖，這些過程依賴于細胞與細胞外基質成分之間的相互作用。從這一點上講，整合蛋白細胞-基質受體介導了細胞擴散和遷移。整合蛋白αvβ3的內皮粘附受體因為給抗血管生成治療策略提供了脈管系統(tǒng)特異性的靶子而成為重要角色(Brooks等，1994，Science 264，569；Friedlander et.al.，1995，Science 270)。已經(jīng)通過幾個體內模型證明了在血管生成中需要血管整合蛋白αvβ3，所述模型中移植的人腫瘤的新血管發(fā)生完全被全身施用上面所述的整合蛋白αvβ3和αvβ5的肽拮抗劑或作為備選方案的抗αvβ3抗體LM609(Brooks等，1994，Cell 79，1157；ATCC HB 9537)所抑制。此抗體可阻斷αvβ3整合蛋白受體被其天然配體激活(此激活作用可以抑制增生的生血管血管細胞的細胞凋亡)并由此破壞新生成血管的成熟(這是腫瘤增殖中的必要事件)。然而，據(jù)最近的報道，黑素瘤細胞即使在沒有內皮細胞的情況下也能形成網(wǎng)狀結構的血管(Barinaga，1999，Science 285，1475)，這暗示腫瘤可能能繞過一些只有在有內皮組織存在的情況下才有效的抗血管生成藥物。
很多分子，包括VEGF，Ang1和bFGF，都能刺激內皮細胞的增殖、遷移和組裝，它們是極其重要的存活因子。VEGF(血管內皮生長因子)經(jīng)鑒定是一種選擇性的生血管生長因子，它可以刺激內皮細胞的有絲分裂。特別是，VEGF被認為是原發(fā)性腫瘤和眼睛局部缺血疾病中血管生成的一個主要的介質。VEGF是同二聚體(分子量46,000)，它是一種內皮細胞特異性生血管因子(Ferrara等，1992，Endocrin.Rev.，13，18)和血管滲透因子(Senger等，1986，Cancer Res.，465629)，它與有酪氨酸激酶活性的高親和性膜結合受體結合(Jakeman等，1992，J.Clin.Invest.，89，244)。人腫瘤的活體組織檢查顯示，惡性細胞中的VEGF mRNA和鄰近的內皮細胞中的VEGF受體mRNA表達增強。VEGF的表達似乎在鄰近血管壞死區(qū)域的腫瘤部位最高。(綜述參見Thomas等，1996，J.Biol.Chem271(2)，603；Folkman，1995，Nature Medicine 1，27)。WO 97/45447中提示，αvβ5整合蛋參與了尤其是由VEGF、EGF和TGF-α誘導的新血管生成，并公開了αvβ5拮抗劑可抑制VEGF促進的血管生成。有效的抗腫瘤療法也可通過單克隆抗體靶向VEGF受體來抑制血管生成(Witte等，1998，Cancer Metastasis Rev.17(2)，155)。已知單抗DC-101可用于抑制腫瘤細胞的血管生成。
酪氨酸激酶是一類酶，它催化腺苷三磷酸的末端磷酸向蛋白質底物中的酪氨酸殘基轉移。據(jù)信通過酪氨酸激酶的底物磷酸化，酪氨酸激酶在許多細胞功能的信號傳導中起關鍵作用。雖然信號傳導的確切機理仍不清楚，但是酪氨酸激酶在細胞增殖，癌發(fā)生和細胞分化中顯示出是重要的起作用因子。
酪氨酸激酶可分為受體型和非受體型。受體型和非受體型兩種酪氨酸激酶都參與細胞信號途徑，這些途徑可導致許多病理狀況，包括癌癥，牛皮癬和超免疫反應。許多酪氨酸激酶既參與細胞生長也參與血管生成。
受體型酪氨酸激酶包括細胞外，跨膜和細胞內部分，而非受體型酪氨酸激酶完全是細胞內的。受體連接的酪氨酸激酶是跨膜蛋白，它包含細胞外配體結合域，跨膜序列，以及胞質酪氨酸激酶功能域。受體型酪氨酸激酶由大量具有不同生物活性的跨膜受體組成。事實上，已經(jīng)鑒定出了不同亞家族的受體型酪氨酸激酶。涉及的酪氨酸激酶包括成纖維細胞生長因子(FGF)受體，ErbB主要類型家族中的表皮生長因子(EGF)受體和血小板衍生生長因子(PDGF)受體。還涉及神經(jīng)生長因子(NGF)受體，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)受體，以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)受體和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4(NT-4)受體。
一個受體型酪氨酸激酶亞家族，被命名為HER或ErbB亞家族，由EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)組成。此亞家族受體的配體包括表皮生長因子(EGF)，TGF-a，雙調蛋白(amphiregulin)，HB-EGF，β-細胞調節(jié)素(betacellulin)和heregulin。PDGF亞家族包括由激酶插入域受體(KDR)組成的FLK家族。
EGFR，由erbB1基因編碼，它與人類惡性腫瘤因果相關。特別是，在乳腺，膀胱，肺，頭，頸和胃部癌癥以及成膠質細胞瘤中已經(jīng)觀察到EGFR的表達增強。EGFR受體表達的增強通常伴隨有同一腫瘤細胞中EGFR配體-即轉化生長因子α(TGF-α)的產生增加，從而經(jīng)自分泌刺激途徑引起受體激活(Baselga和Mendelsohn，Pharmac.Ther.64127-154(1994))。EGF是一種分子量為170,000的跨膜糖蛋白，并發(fā)現(xiàn)它存在于許多上皮細胞類型上。它可以被至少三種配體-EGF，TGF-α(轉化生長因子α)和雙調蛋白激活。經(jīng)證明表皮生長因子(EGF)和轉化生長因子α(TGF-α)都能與EGF受體結合進而引起細胞增殖和腫瘤生長。這些生長因子不能與HER2結合(Ulrich and Schlesinger，1990，Cell 61，203)。與借助自身二聚化性質誘導受體二聚化的幾個生長因子家族(如PDGF)不同，單體生長因子如EGF具有2個受體結合位點，因此，它可以交聯(lián)兩個鄰近的EGF受體(Lemmon等，1997，EMBO J.16，281)。受體二聚化對激活生長因子受體的內在催化活性以及對生長因子受體的自磷酸化是必需的。應當指出的是受體蛋白酪氨酸激酶(PTK)既能進行同二聚化，也能進行異二聚化。
已經(jīng)證明抗EGF受體的抗體在阻斷EGF和TGF-α與受體結合的時候，顯示出對腫瘤細胞增殖的抑制?？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)研制出很多小鼠和大鼠單克隆抗EGF受體抗體，并在體內和體外檢測了它們對腫瘤細胞生長進行抑制的能力(Modjtahedi和Dean，1994，J.Oncology 4，277)。人源化單克隆抗體425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合型單克隆抗體225(cMAb 225，US 4,943,533和EP 0359282)都是針對EGF受體的，而且在臨床試驗中均顯示有效。已經(jīng)證明C225抗體可在體外抑制由EGF介導的腫瘤細胞生長，以及在裸鼠體內抑制人腫瘤的形成。而且，最重要的是，該抗體在異種移植小鼠模型中還顯示出可與某些化療劑(即阿霉素(doxorubicin，adriamycin)，紫杉醇和順氯氨鉑)協(xié)同作用根除人腫瘤。Ye等(1999，Oncogene 18，731)報道通過聯(lián)合應用cMAb225和針對HER2受體的人源化MAb 4D5對人卵巢癌細胞進行了成功地治療。
ErbB家族的第二個成員-HER2(ErbB2或p185neu)，它最初被鑒定為來自經(jīng)化學處理的大鼠的成神經(jīng)細胞瘤的轉化基因產物。neu原癌基因的激活形式是由編碼蛋白的跨膜區(qū)中的點突變(纈氨酸變成谷氨酸)產生的?？稍谌橄俸吐殉舶┌Y中觀察到neu人同系物的擴增，其與預后不良有關(Slamon等，Science，235177-182(1987)；Slamon等，Science，244707-712(1989)；US 4,968,603)。ErbB2(HER2)的分子量為大約185,000，雖然至今對HER2的特異性配體尚未明確確定，但ErbB2(HER2)與EGF受體(HER1)有相當高的同源性。
進一步發(fā)現(xiàn)針對HER2受體的抗體4D5使過表達ErbB2的乳腺腫瘤細胞系對TNFα的細胞毒性效應敏感(US 5,677,171)。鼠抗-ErbB2抗體4D5的人源化重組體(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；US 5,821,337)在已進行過大量抗癌前期治療的患有ErbB2-過表達轉移性乳腺癌的患者中具有臨床活性(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。HERCEPTIN在1988年被正式批準上市用于治療患有轉移性乳腺癌—即腫瘤過表達ErbB2蛋白—的患者。
TNFα屬于一個分子大家族，此家族包括重要的細胞因子如Fas配體，CD40配體，TRAIL，淋巴毒素等(Locksley等，2001，Cell 104487-501)。TNFα除了可以從多種細胞中釋放，還可以以細胞膜結合的高分子量形式存在于細胞上，并且此形式還似乎可介導多種生物效應。TNFα據(jù)認為在正常發(fā)育和生理學中幾乎不起作用；然而，在多種疾病狀態(tài)下它對許多組織有害并具有破壞作用(Tracey等，Ann.Rev.Med 1994；45491)。TNFα顯示能在其中發(fā)揮主要作用的疾病包括膿毒性休克綜合征，癌性惡病質，類風濕性關節(jié)炎等。
人TNFα在1985年被首次純化出來(參見Aggarwal等，J Biol.Chem.1985，260，2345-2354)。之后不久，完成了TNF cDNA的分子克隆和人TNF的基因座克隆(Pennica等，Nature 1984，312，124-729；Wang等，Nature 1985，313，803-806)。TNFα是一個可三聚化的17KDa多肽，主要由巨噬細胞產生。此肽鏈最初表達為26Kda的跨膜蛋白，經(jīng)蛋白酶剪切從中斷裂和釋放出17Kda亞基。TNFα一般可由各種細胞產生，舉例來說，有激活的巨噬細胞和成纖維細胞。據(jù)報道TNFα可以誘導多種不同的因子。TNFα據(jù)報道還直接或間接地參與到不同的疾病中，如傳染性疾病，自身免疫疾病-如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和關節(jié)炎，AIDS，敗血病，以及一些傳染病。
TNFα和炎癥反應傳染病和組織損傷可以引起一系列生化變化，進而觸發(fā)免疫系統(tǒng)復雜反應的發(fā)作，這統(tǒng)稱為炎癥反應。此反應的進展，至少部分地，基于局部血管擴張或血管通透性的增加和血管內皮的活化，這就使白細胞能高效循環(huán)并遷移到達受損位點，從而增加了白細胞和任意抗原結合并破壞抗原的機會。然后血管內皮據(jù)認為被激活或發(fā)炎。通常，發(fā)炎對多種意外刺激來說是一種良性的免疫反應，并且它發(fā)作快且持續(xù)時間短(急性發(fā)炎)。然而，發(fā)炎的持續(xù)的或不受控制的活性(慢性發(fā)炎)對身體有害，并成為幾種免疫疾病-如膿毒性休克，類風濕性關節(jié)炎，炎性腸病，充血性心力衰竭的發(fā)病機理(參見“細胞因子和細胞因子受體”(Cytokines and cytokine receptors)中的“TNF和TNF受體超家族”，Bona和Revillard(Eds.)，Harvard Academic Publishers，Amsterdam 2000，118-148頁)。
TNFα以及許多其它細胞因子在炎癥反應啟動后不久由巨噬細胞分泌，并引起凝血，增加血管滲透性并激活粘附分子在血管內皮細胞上的表達。
對宿主來說，TNFα既不是完全有益的也不是完全破壞性的。因此，TNFα是內皮細胞功能的有力調節(jié)器。在不同血管背景下，TNFα通過誘導內皮細胞活化和存活促使發(fā)炎，或者通過誘導內皮細胞的凋亡和血管破壞引起組織壞死(Pober，J.S.，Pathol Biol(Paris)46，159-163.(1998)；Aggarwal，& Natarajan，Eur.Cytokine Netw.7，93-124(1996))。雖然已經(jīng)對介導這兩種相異反應的許多細胞內信號途徑進行了表征(Wallach等，Annual Review of Immunology 17，331-367(1999))，但是對決定接觸TNFα的內皮細胞是否存亡的細胞外信號尚不了解。
更確切地說，保持TNFα合成和調節(jié)的平衡可以確保宿主能夠有效地與入侵的微生物進行反應，而且在此反應中不會危及宿主的健康。TNFα作為炎癥的介質，通過加強適當?shù)拿庖叻磻獊韰f(xié)助機體對抗細菌感染和組織損傷。然而，過量產生的TNFα卻導致慢性炎癥，這對機體有害并在幾種疾病的發(fā)病機理中起主要作用。
IFNγ是TNFα的有效增強劑(Dealtry等，Eur J Immunol 17，689-693，(1987))。在TNFα引起細胞凋亡的情況下，NF-κB(一種促使細胞存活的轉錄因子)的激活可以抑制TNFα誘導的細胞凋亡(Van Antwerp等，Science 274，787-789(1996))。
TNFα可引發(fā)各種各樣的細胞信號，不僅導致細胞反應如增殖，激活，分化而且可導致程序化細胞凋亡。針對TNFα的細胞信號可分為早期反應(如激酶，磷酸酯酶，脂肪酶，蛋白酶和轉錄因子的激活)和晚期反應，以及因此更間接的反應(如干擾線粒體中的電子傳遞鏈，自由基產生，氧化物產生以及各種底物的釋放)。許多早期細胞反應-如募集含死亡結構域的銜接蛋白，NFκB的激活或caspase激活，也可以通過TNF配體家族的其它成員與其各自受體的結合而被啟動。因此，諸如淋巴毒素，F(xiàn)as配體或TRAIL等分子能夠與TNF具有重復作用(Grell和Clauss上述引文)。
整合蛋白介導的對細胞外基質(ECM)的粘附對于包括內皮細胞在內的大多數(shù)細胞的生存是必需的。例如，血管整合蛋白aVβ3促進生血管內皮細胞的增殖和存活而aVβ3拮抗劑誘導生血管內皮細胞的凋亡并抑制血管生成(Brooks等，Cell 79，1157-1164(1994)。已經(jīng)鑒定了幾個與整合蛋白-介導的細胞存活相關的生化事件，包括PI 3-K/AKT(Khwaja等，EmboJoumal 16，2783-2793(1997))和NF-κB(Scatena等，J Cell Biol 141，1083-1093(1998))信號途徑的激活。除整合蛋白之外，細胞-細胞粘附分子PECAM-1和VE鈣粘著蛋白也促進內皮細胞存活(Bird等J Cell Sci112，1989-1997(1999)；Carmeliet等Cell 98，147-157(1999))。
雖然TNF對某些腫瘤細胞系是有細胞毒性的，但是大多數(shù)腫瘤細胞在生長中幾乎不受TNF的影響。因此TNF在某些動物模型中表現(xiàn)的抗腫瘤作用(Balkwill等，Cancer Res.463990-3993(1986))不可能是由于該細胞因子對腫瘤細胞的直接作用而引起的。一些研究顯示宿主介導的機制參與了TNF引發(fā)的腫瘤消退(Manda等，Cancer Res.473707-3711(1987))。累積的數(shù)據(jù)指出由TNF引起的腫瘤出血性壞死是在腫瘤內血管的內皮細胞水平上發(fā)起的(Havell等，J.Exp.Med.1671967-1985(1988)).。
癌癥患者的臨床TNF研究結果基本上來說是令人失望的(參見綜述Haranaka，J.Biol.Response Mod.7525-534(1988))。通常，TNF的抗腫瘤作用受到大量副作用的限制。減少TNF的副作用的一個方法是制備表現(xiàn)出TNF1型受體特異性活性或具有不同的藥物動力學性質的TNF突變體(Brouckaert等，Circ.Shock 43185-190(1994)；Eggermont，AnticancerRes.183899-3905(1998)；Lucas等，Int.J.Cancer 15543-549(2001)).最近在四肢黑素瘤或肉瘤患者的治療上已經(jīng)取得了進展。利用分離灌注技術可以獲得顯著的有益療效。將高達4mg的TNF極端劑量與細胞生長抑制劑或IFN結合施用(Lienard等，J.Clin.Oncol.1052-60(1992))。局部反應包括腫瘤的急性軟化和發(fā)紅并伴隨有強烈的炎癥反應，這類似于TNF在鼠系統(tǒng)中介導的抗腫瘤作用。
已證實，這種針對患有肢體轉移性黑素瘤的患者的治療方法可選擇地破壞腫瘤的脈管系統(tǒng)而讓靜止的血管保持完整。此作用與TNF和IFNγ-誘導的體外內皮細胞中整合蛋白αVβ3的功能抑制及在體內誘導的內皮細胞凋亡有關(Ruegg et al，Nature Med 4，408-414(1998))。這些結果證實倘若系統(tǒng)性毒性能夠得到控制，那么TNF與其它治療藥劑聯(lián)合在臨床上能夠非常有效地治療某些腫瘤。
本發(fā)明目前描述了有助于血管生成的分子(如整合蛋白)在調節(jié)TNFα活性的同時可以對TNFα作為抗腫瘤劑的臨床應用有直接影響?？寡苌伤巹瑑?yōu)選整合蛋白拮抗劑與TNFα一起聯(lián)合施用可以選擇性地使帶有血管生成受體的內皮細胞對TNF的細胞凋亡活性敏感，從而導致對腫瘤血管的破壞增強。因此，此聯(lián)合療法可有助于減少TNF劑量，避免TNF引起的全身副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明首次描述這一腫瘤治療新概念，即給個體施用阻斷或抑制血管生成的藥劑以及TNFα，TNF突變體或TNF樣分子。本發(fā)明的組合物還可任選地包含其他有治療活性的化合物，這些化合物優(yōu)選選自細胞毒性劑、化療劑和ErbB受體酪氨酸激酶家族的抑制劑或拮抗劑，如下文更詳細描述的。因此，本發(fā)明涉及藥物組合物，其以治療有效量包含作為優(yōu)選的抗血管生成劑的整合蛋白(受體)拮抗劑和TNFα、TNF突變體或TNF樣分子。更特別地是，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含線性或環(huán)狀RGD肽和TNFα以及任選地IFNγ。本發(fā)明優(yōu)選的組合物包含環(huán)肽—環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)、TNFα和IFNγ。本發(fā)明所述的治療活性劑也可以以包含如下包裝的藥物試劑盒的形式提供，此包裝中包含獨立包裝的或在單獨容器內的一種或多種抗血管生成劑、TNFα及任選地一種或多種細胞毒性劑/化療劑/抗ErbB劑。
更具體地，本發(fā)明涉及這樣的聯(lián)合療法，其包括分別地應用和施用兩種或多種分子，其中至少一種分子具有血管生成抑制活性而另一種是TNFα。但是，本發(fā)明還涉及這樣的聯(lián)合療法，其包括施用僅一種既有抗血管生成活性又有TNFα活性的(融合)分子，及任選地還施用一種或多種細胞毒性劑/化療劑。例如，可以給患者施用主要由直接或通過連接分子與TNFα融合的環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)組成的融合蛋白。另一個例子是通過Fc部分的C末端與TNFα融合的抗整合蛋白抗體，如下文所述的LM609。再例如，與TNFα融合的雙特異性抗體，此抗體中一個特異性針對整合蛋白受體或VEGF受體而另一個針對EGF受體。
大抵上，此藥物施用可與放射治療伴隨進行，其中放射治療可與藥物施用基本上同時，或在之前，或在之后進行。本發(fā)明聯(lián)合療法中的各種藥劑的施用也可以基本上同時進行或相繼進行。細胞表面上有參與腫瘤血管形成的受體的腫瘤可用本發(fā)明聯(lián)合療法成功地治療。
已知腫瘤的發(fā)育和生長有多條可替換的路線。如果一條路線被阻斷，則它們常能通過表達和使用其他受體和信號途徑而轉換到另一條路線上。因此，由于本發(fā)明的藥物聯(lián)合可以阻斷幾種這樣的可能腫瘤發(fā)育策略，因而具有多種優(yōu)點。本發(fā)明的聯(lián)合可用于治療和預防如下文詳述的腫瘤、腫瘤樣和瘤形成性疾病以及腫瘤轉移。本發(fā)明的不同組合藥劑優(yōu)選以低劑量聯(lián)合應用，即，低于常規(guī)的臨床條件下使用的劑量。在給個體施用本發(fā)明的化合物、組合物、藥劑和治療的時候，降低劑量的優(yōu)點包括降低了高劑量所帶來的負反應的發(fā)生率。比如，通過降低化療劑如氨甲蝶呤的劑量，和高劑量條件下觀察到的效果相比，惡心和嘔吐的頻率和嚴重程度都得到降低。預期降低負反應發(fā)生率將能改善癌癥患者的生活質量。降低負反應發(fā)生率的優(yōu)點還包括改善患者的依順性，降低因負反應產生的需要住院治療的次數(shù)，減少在醫(yī)治負反應帶來的疼痛時所需止痛劑的使用。另外，本發(fā)明的方法和聯(lián)合還能使高劑量時的治療效果最大化。
本發(fā)明的聯(lián)合治療顯示出令人驚異的協(xié)同效應。臨床研究顯示使用此藥物聯(lián)合可使腫瘤出現(xiàn)真實的萎縮和解體，同時沒有可檢測的明顯的藥物副作用。
具體的，本發(fā)明涉及·藥物組合物，其包含治療有效量的至少(i)一種抗血管生成劑和(ii)腫瘤壞死因子α(TNFα)或具有TNFα生物活性的分子，及任選地藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑；·相應的藥物組合物，其中所述的抗血管生成劑是整合蛋白(受體)抑制劑/拮抗劑或VEGF(受體)抑制劑/拮抗劑；·相應的藥物組合物，其中所述的整合蛋白受體抑制劑/拮抗劑是含RGD的線性或環(huán)狀肽；·相應的藥物組合物，其中所述的含RGD的肽是環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)；·相應的藥物組合物，其中所述的抗血管生成劑是可以與整合蛋白受體或VEGF受體結合的抗體或此抗體的免疫治療活性片段；·相應的藥物組合物，其中所述的抗血管生成劑和TNFα連接在一起形成一個融合分子；·相應的藥物組合物，其還包含至少一種細胞毒性劑和/或化療劑；·相應的藥物組合物，其中所述的細胞毒性劑是干擾素γ(IFNγ)和/或另一有效的細胞因子；·相應的藥物組合物，其中所述的化療化合物選自順氯氨鉑、阿霉素、吉西他濱、多烯紫杉醇、紫杉醇、博來霉素；·相應的藥物組合物，其還包含ErbB受體酪氨酸激酶家族的抑制劑或拮抗劑；·相應的藥物組合物，其中所述的抑制劑是抗EGFR抗體，抗HER2抗體或它們的免疫活性片斷；·藥物試劑盒，其包含如下包裝，該包裝含有(i)至少一種抗血管生成劑，優(yōu)選整合蛋白受體抑制劑/拮抗劑，(ii)TNFα以及任選地(iii)另外的細胞毒性劑和/或化療劑；·相應的優(yōu)選藥物試劑盒，其包含(i)環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)；(ii)TNFα和(iii)IFNγ以及任選地(iii)另外的細胞毒性劑和/或化療劑和/或ErbB受體酪氨酸激酶家族的抑制劑或拮抗劑；·相應的藥物試劑盒，其中所述藥物活性劑在所述包裝中于分開的單獨容器中提供；·上文及權利要求書中定義的藥物組合物在制備用于治療腫瘤和腫瘤轉移的藥物或藥物組合物中的用途；以及·治療個體的腫瘤和腫瘤轉移的方法，其包括同時或相繼給所述個體施用上文定義的治療有效的藥物組合物；
發(fā)明詳述本發(fā)明中使用的術語和短語，如果沒有另行指明，則具有下面給定的含義和定義。而且，這些定義和含義更詳細地描述了本發(fā)明，包括優(yōu)選實施方案。
“生物分子”包括天然或合成分子，通常其分子量大于約300，并且優(yōu)選是多聚-和寡聚糖類，寡肽和多肽，蛋白質，肽，多聚-和寡聚核苷酸以及它們的糖基化脂類衍生物。最典型地是，生物分子包括免疫治療藥劑，最重要的是抗體或抗體片斷，或這些抗體或片斷的功能性衍生物，包括融合蛋白。
“受體”或“受體分子”是指可溶的或膜結合/連結的蛋白或糖蛋白，其含有一個或多個可與配體結合以形成受體-配體復合物的結構域。通過與可能是激動劑或拮抗劑的配體結合，受體可以被激活或者失活，由此可以啟動或阻斷信號通路。
“配體”或“受體配體”是指這樣的天然的或者合成的化合物，它可以和受體分子結合形成受體-配體復合物。術語配體包括激動劑、拮抗劑以及具有部分激動劑/拮抗劑活性的化合物。根據(jù)本發(fā)明的特定領域，本術語尤其包括TNF樣配體。
此處的術語“TNFα”，如果沒有特殊限制，包括所有種類的TNF分子和具有TNFα生物活性的分子，其中包括天然和合成的、肽或非-肽的TNF突變體，變體或TNF樣配體。本術語優(yōu)選表示天然TNFα肽。
“激動劑”或“受體激動劑”是指這樣的天然的或者合成的化合物，它和受體結合形成受體-激動劑復合物，通過分別激活所述受體和受體-激動劑復合物而啟動信號通路及進一步的生物學過程。
“拮抗劑”或“受體拮抗劑”是指和激動劑有相反的生物學效應的天然的或者合成的化合物。拮抗劑和受體結合，通過和激動劑競爭受體而阻斷受體激動劑的作用。拮抗劑是根據(jù)它阻斷激動劑的作用的能力來定義的。受體拮抗劑也可以是抗體或是其具有免疫治療活性的片段。下面將舉出并論述本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑。
術語“治療有效的”或“治療有效量”指的是有效治療哺乳動物的疾病或病癥的藥物量。對癌癥而言，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數(shù)量；降低腫瘤的大??；抑制(即，一定程度地減緩且最好終止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即，一定程度地減緩且最好終止)腫瘤的轉移；在一定程度上抑制腫瘤的生長；和/或將癌癥相關的一種或多種癥狀減輕到一定程度。如果藥物可以阻止已存在癌細胞的生長而且/或殺死已存在的癌細胞，則該藥物可能具有細胞抑制性和/或細胞毒性。對于癌癥的治療，療效可以比如通過估計疾病進展時間(TTP)和/或測定反應率(RR)來確定。
術語“免疫治療活性”指的是引起哺乳動物免疫反應的生物分子。更具體地，此術語指的是可以識別和結合抗原的分子。典型地，抗體、含有其抗原結合位點(互補決定區(qū)，CDRs)的抗體片斷和抗體融合蛋白具有免疫治療活性。
本申請中所用的術語“前體藥物”指的是藥物活性物質的前體或衍生物，同親本藥劑相比，它對腫瘤細胞的細胞毒性較小并且能夠被酶促激活或轉變成更具活性的親本形式(實例參見“癌癥化療中的前體藥物”，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986))。
“抗血管生成劑”指的是天然的或合成的化合物，它可在一定程度上阻斷或干擾血管的發(fā)育。抗血管生成分子可以是，例如，和生血管生長因子或生長因子受體結合并將其阻斷的生物分子。本處優(yōu)選的抗血管生成分子可以與受體結合，優(yōu)選與整合蛋白受體或與VEGF受體結合。本發(fā)明中此術語還包括所述抗血管生成劑的前體藥物。
有很多結構和來源不同的分子都可以引起抗血管生成性質。本發(fā)明中適宜的血管生成抑制劑或阻斷劑的大多數(shù)相關類型是，例如(i)抗有絲分裂劑，例如氟尿嘧啶，絲裂霉素C，紫杉醇；(ii)雌激素代謝物如2-甲氧基雌二醇；(iii)抑制鋅金屬蛋白酶的基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(例如，betimastat，BB16，TIMPs，二甲胺四環(huán)素，GM6001，或在“基質金屬蛋白酶的抑制治療應用”中論及的那些(物質)(Golub，Annals of the New YorkAcademy of Science，Vol.878a；Greenwald，Zucker(Eds.)，1999)；(iv)抗血管生成的多功能藥劑和因子，如IFNα(US 4,530,901；US4,503,035；5,231,176)；制管張素和纖溶酶原片段(例如kringle 1-4，kringle5，kringle 1-3(O′Reilly，M.S.等，Cell(Cambridge，Mass.)79(2)315-328，1994；Cao等，J.Biol.Chem.27129461-29467，1996；Cao等，J.BiolChem 27222924-22928，1997)；內皮生長抑素(endostatin)(O′Reilly，M.S.等，Cell 88(2)，277，1997和WO 97/15666)，血小板反應蛋白(TSP-1；Frazier，1991，Curr Opin Cell Biol 3(5)792)；血小板因子4(PF4)；(v)纖溶酶原激活物/尿激酶抑制劑；(vi)尿激酶受體拮抗劑；(vii)肝素酶；(viii)煙曲霉素類似物如TNP-470；(ix)酪氨酸激酶抑制劑如SUI 01(上面和下面提到的很多ErbB受體拮抗劑(EGFR/Her 2拮抗劑)也是酪氨酸激酶抑制劑，因此它們分別可以顯示出抗EGF受體阻斷活性從而導致腫瘤生長受抑制，及顯示出抗血管生成的活性從而導致血管發(fā)育和內皮細胞發(fā)育受抑制)；(x)蘇拉明和蘇拉明類似物；(xi)制管張性(angiostatic)類固醇；(xii)VEGF和bFGF拮抗劑；(xiii)VEGF受體拮抗劑如抗VEGF受體抗體(DC-101)；(xiv)flk-1和flt-1拮抗劑；(xv)環(huán)加氧酶-II抑制劑如COX-II；(xvi)整合蛋白拮抗劑和整合蛋白受體拮抗劑如αv拮抗劑和αv受體拮抗劑，例如，抗αv受體抗體和RGD肽。本發(fā)明優(yōu)選整合蛋白(受體)拮抗劑。
術語“整合蛋白拮抗劑/抑制劑”或“整合蛋白受體拮抗劑/抑制劑”指的是天然的或者合成的分子，它阻斷并抑制整合蛋白受體。有時，此術語包括針對所述整合蛋白受體的配體(例如對于αvβ3玻連蛋白，纖維蛋白，纖維蛋白原，馮·維勒布蘭德因子，血小板反應蛋白，層粘連蛋白；對于αvβ5玻連蛋白；對于αvβ1纖連蛋白和玻連蛋白；對于αvβ6纖連蛋白)的拮抗劑。本發(fā)明優(yōu)選針對整合蛋白受體的拮抗劑。整合蛋白(受體)拮抗劑可以是天然的或合成的肽，非肽，肽模擬物(pepetidomimetica)，免疫球蛋白例如抗體或抗體的功能性片段，或免疫綴合物(融合蛋白)。
本發(fā)明優(yōu)選的整合蛋白抑制劑為針對αv整合蛋白受體(例如，αvβ3，αvβ5，αvβ6和亞類)的抑制劑。優(yōu)選的整合蛋白抑制劑為αv拮抗劑，尤其是αvβ3拮抗劑。本發(fā)明優(yōu)選的αv拮抗劑是RGD肽，肽模擬物(非肽)拮抗劑和抗整合蛋白受體抗體如阻斷αv受體的抗體。
典型的非免疫學的αvβ3拮抗劑在US 5,753,230和US 5,766,591中有教導。優(yōu)選的拮抗劑為含RGD的線性和環(huán)型肽。環(huán)肽通常更穩(wěn)定且在血清中的半衰期更長。然而，本發(fā)明最優(yōu)選的整合蛋白拮抗劑是環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(EMD 121974，Cilengitide，Merck KgaA，德國；EP 0770622)，它可有效地阻斷整合蛋白受體αvβ3、αvβ1、αvβ6、αvβ8、αllbβ3。
科技文獻和專利文獻中均描述過αvβ3/αvβ5/αvβ6整合蛋白受體的適宜肽類拮抗劑及肽模擬(非肽)拮抗劑。例如，可參見Hoekstra和Poulter，1998，Curr.Med.Chem.5，195；WO 95/32710；WO 95/37655；WO97/01540；WO 97/37655；WO 97/45137；WO 97/41844；WO 98/08840；WO98/18460；WO 98/18461；WO 98/25892；WO 98/31359；WO 98/30542；WO99/15506；WO 99/15507；WO 99/31061；WO 00/06169；EP 0853 084；EP0854 140；EP 0854 145；US 5,780,426；和US 6,048,861。公開了也適用于本發(fā)明的苯并氮雜唑及相關的苯并二氮雜唑和苯并環(huán)庚烯αvβ3整合蛋白受體拮抗劑的專利包括WO 96/00574，WO 96/00730，WO 96/06087，WO 96/26190，WO 97/24119，WO 97/24122，WO 97/24124，WO98/15278，WO 99/05107，WO 99/06049，WO 99/15170，WO 99/15178，WO 97/34865，WO 97/01540，WO 98/30542，WO 99/11626和WO99/15508。在WO 98/08840；WO 99/30709；WO 99/30713；WO 99/31099；WO 00/09503；US 5,919,792；US 5,925,655；US 5,981,546；和US 6,017,926中描述了具有主鏈構象環(huán)約束特征的其他整合蛋白受體拮抗劑。在US 6,048,861和WO 00/72801中公開了一系列的壬酸衍生物，它們是有效的αvβ3整合蛋白受體拮抗劑。WO 00/38665中公開了其他化學小分子整合蛋白拮抗劑(多數(shù)為玻連蛋白拮抗劑)。其它αvβ3受體拮抗劑已被證實可有效地抑制血管生成。例如，合成的受體拮抗劑如(S)-10，11-二氫-3-[3-(吡啶-2-基氨基)-1-丙氧基]-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-10-乙酸(命名為SB-265123)已經(jīng)在很多哺乳動物模型系統(tǒng)中實驗過。(Keenan等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.8(22)，3171；Ward等，1999，DrugMetab.Dispos.27(11)，1232)。適用作拮抗劑的整合蛋白拮抗劑的甄選實驗在如Smith等，1990，J.Biol.Chem.265，12267中以及參考專利文獻中有描述。
抗整合蛋白受體的抗體也廣為人知。可對適宜的抗整合蛋白(如αvβ3，αvβ5，αvβ6)的單克隆抗體進行修飾，使它包括自身的抗原結合片段(包括F(ab)2，F(xiàn)ab和工程化的Fv或單鏈抗體)。針對整合蛋白受體αvβ3的一個合適的且優(yōu)選使用的單克隆抗體被定為LM609(Brooks等，1994，Cell 79，1157；ATCC HB 9537)。在WO 97/45447中公開了一個強特異性抗αvβ5抗體-P1 F6，它也優(yōu)選用于本發(fā)明。另一合適的αvβ6選擇性抗體是選擇性針對整合蛋白受體的αv鏈的MAb 14D9.F8(WO 99/37683，DSMACC2331，Merck KGaA，德國)以及MAb 17.E6(EP 0719859，DSMACC2160，Merck KGaA)。另一個適宜的抗整合蛋白抗體為上市的Vitraxin。
“生血管生長因子或生長因子受體”是能夠通過自身的激活促進血管生長和發(fā)育的因子或受體。典型地，血管內皮生長因子(VEGF)及其受體屬于此類。
此處的術語“抗體”或“免疫球蛋白”有最廣義的含義，特別包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少2個完整抗體構成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段，只要它們顯示有所需的生物學活性即可。此術語一般包括由2個或多個具有不同結合特異性的抗體或抗體片段連接在一起構成的雜合抗體。
根據(jù)抗體恒定區(qū)的氨基酸序列，完整的抗體可被劃分成不同的“抗體(免疫球蛋白)類型”。完整抗體有5個主要類型IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可以被進一步劃分成“亞類”(同種型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。相應于不同抗體類型的重鏈恒定區(qū)分別稱為α，δ，ε，γ和μ。本發(fā)明優(yōu)選的抗體主要類型是IgG，更具體的說是IgG1和IgG2。
抗體常常是分子量約150,000的糖蛋白，由2條同樣的輕(L)鏈和2條同樣的重(H)鏈組成。每條輕鏈都通過一個共價二硫鍵和重鏈相連，而在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還有規(guī)則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈都在一端有一個可變區(qū)(VH)并隨后有多個恒定區(qū)。每條輕鏈都在一個末端上有一個可變區(qū)(VL)，在另一末端上有一個恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)并列，輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)并列。據(jù)信特定氨基酸殘基構成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的介面?？蓪⒓棺祫游镂锓N的抗體“輕鏈”劃分成2個明確不同的類型，稱為卡帕(κ)和拉姆達(λ)，這取決于它們恒定區(qū)的氨基酸序列。
本處所用的術語“單克隆抗體”指從基本上均質的抗體群中獲得的抗體，即，除了可能的天然發(fā)生的微量突變以外，抗體群內的每一株抗體都是相同的。單克隆抗體具有高度的特異性，它針對單一的抗原位點。而且，和多克隆抗體制品不同，多克隆抗體含有針對不同決定簇(表位)的不同抗體，而每個單克隆抗體都僅針對抗原上的一個決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越之處還在于可以合成無其他抗體污染的單克隆抗體。單克隆抗體的制備方法包括Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495)和＂單克隆抗體技術，嚙齒類和人類雜交瘤的制備和表征＂(1985，Burdon等，Eds，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Volume 13，Elsevier Science Publishers，Amsterdam)中描述的雜交瘤法，或者可以用廣為人知的重組DNA方法進行制備(實例可參見US 4,816,567)。也可用比如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離單克隆抗體。
術語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分和來自特定物種的抗體或屬于特定抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，然而鏈的其余部分則與來自另一物種的抗體或屬于另一抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，該術語還指此種抗體的片段，只要其具有所需的生物學活性即可(例如US 4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。生產嵌合型和人源化抗體的方法是本領域技術人員所熟知的。例如，制備嵌合抗體的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)(US 4,816,397；US 4,816,567)的專利中描述的方法。
“人源化抗體”是非人(如嚙齒類)嵌合抗體形式的抗體，其含有最低量的源于非人免疫球蛋白的序列。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區(qū)(CDR)的殘基被替換成非人物種(如小鼠，大鼠，兔或非人靈長類)(供體抗體)的具有所需的特異性、親和性和作用的高變區(qū)殘基。有時，人免疫球蛋白構架區(qū)(FR)殘基被對應的非人殘基替換。而且，人源化抗體還可以含有受體抗體和供體抗體上均沒有的殘基。這些修飾可以進一步限定抗體的性能。通常，人源化抗體含有至少一個，一般兩個可變區(qū)的基本上全部內容，其中所有或基本上所有的高變環(huán)都對應于非人免疫球蛋白的相應部分，而所有或基本上所有的FR都是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗體也可任選地含有至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，特別是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。人源化抗體的制備方法描述在例如Winter，US 5,225,539和Boss，Celltech，US 4,816,397中。
術語“可變”或“FR”指的是如下事實，即抗體與抗體之間在可變區(qū)的某些部分具有十分不同的序列，這些部分用于各特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，此可變性并不均勻分布在抗體的整個可變區(qū)。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個稱為高變區(qū)的區(qū)段中?？勺儏^(qū)的較高保守部分稱為構架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)每一個都包含四個FR(FR1-FR4)，它們主要采用β-片層構型，由三個高變區(qū)連接，而高變區(qū)形成環(huán)與β-片層連接且有時形成β-片層結構的一部分。每條鏈的高變區(qū)通過FR緊密鄰近，并與另一條鏈的高度可變區(qū)一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。雖然恒定區(qū)沒有直接參與抗體和抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能，如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
此處所用的術語“高變區(qū)”或“CDR”指負責與抗原結合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包含“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變區(qū)的24-34位(L1)，50-56位(L2)和89-97位(L3)殘基，重鏈可變區(qū)的31-35位(H1)，50-65位(H2)和95-102位(H3)殘基)；和/或“高變環(huán)”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變區(qū)的26-32位(L1)，50-52位(L2)和91-96位(L3)殘基，重鏈可變區(qū)的26-32位(H1)，53-55位(H2)和96-101位(H3)殘基；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。
“構架區(qū)”或“FR”殘基是指除本處定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變區(qū)殘基。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含抗體的抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v和Fc片段，diabodies，線性抗體，單鏈抗體分子；及由抗體片段構成的多特異性抗體?！巴暾贵w”是指包含結合抗原的可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)的抗體。完整抗體優(yōu)選具有一個或多個效應子功能。
木瓜蛋白酶消化抗體產生2個相同抗原結合片段(稱之為＂Fab＂片段，每個片段含有一個抗原結合位點和一個CL區(qū)和一個CH1區(qū))以及一個殘余的＂Fc＂片段(其名稱反映了其易于結晶的能力)。
抗體＂Fc＂區(qū)一般含有CH2，CH3和IgG1或IgG2抗體主要類型的鉸鏈區(qū)。鉸鏈區(qū)是具有約15個氨基酸殘基的基團，它把CH1區(qū)和CH2-CH3區(qū)結合起來。
胃蛋白酶處理產生一個＂F(ab′)2＂片段，它有2個抗原結合位點且仍有交聯(lián)抗原的能力。＂Fv＂是最小的抗體片段，它含有一個完整的抗原識別和抗原結合位點。此區(qū)域由一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)通過牢固的非共價連接形成的二聚體組成。在此構型中每個可變區(qū)的3個高變區(qū)(CDR)相互作用在VH-VL二聚體表面上確定出一個抗原結合位點?？偟恼f來，6個高變區(qū)賦予了抗體的抗原結合特異性。但是，甚至僅一個可變區(qū)(或僅含有3個抗原特異性高變區(qū)的一半Fv)也有識別并結合抗原的能力，雖然它比完整的結合位點的親合力低。Fab片段還包括輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。＂Fab片段和Fab片段的不同之處在于在重鏈CH1區(qū)的羧基端多了幾個殘基，包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。F(ab′)2抗體片段最初以Fab′片段對形式產生，這兩個Fab′片段之間有半胱氨酸鉸鏈。抗體片段的其它化學偶聯(lián)也是已知的(參見如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996；.US 4,342,566)。
“單鏈Fv＂或＂scFv＂抗體片段包含抗體的VH和VL區(qū)，其中，這些結構域存在于一條多肽鏈上。Fv多肽優(yōu)選在VH和VL結構域之間還含有多肽接頭，它可使scFv形成抗原結合所需的結構。單鏈FV抗體也可從例如Plückthun(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，Vol.113，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994))，WO 93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)獲知。
術語“diabodies”是指有兩個抗原結合位點的小抗體片斷，此片斷包含一個重鏈可變區(qū)(VH)，它與輕鏈可變區(qū)(VL)連接在同一多肽鏈(VH-VL)上。通過利用不能使位于同一鏈上的這兩個域配對的小接頭，使一條鏈上的這些結構域被迫與另一條鏈的互補域配對從而產生兩個抗原結合位點。例如在EP 404,097；WO 93/11161中對diabodies有更充分的描述。
“雙特異性抗體”是一個雙價的抗體(或其有免疫治療活性的片段)，其有2個不同特異性的抗原結合位點。例如第一個抗原結合位點可針對血管生成受體(例如整合蛋白或VEGF受體)，而第二個抗原結合位點可針對ErbB受體(例如EGFR或Her2)。雙特異性抗體能用化學方法(實例參見Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5807)或＂polydoma＂技術(參見US 4,474,893)或重組DNA技術制備，所有這些技術均為本身已知的技術。其他方法在WO 91/00360，WO 92/05793和WO 96/04305中有描述。雙特異性抗體還能用單鏈抗體來制備(實例參見Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。這些是以單條多肽鏈形式產生的抗體可變區(qū)類似物。為了構成雙特異性結合劑，單鏈抗體可以通過本領域內技術人員熟知的化學方法或遺傳工程方法偶聯(lián)在一起。本發(fā)明的雙特異性抗體也可以用亮氨酸拉鏈序列來制備。此序列可來自于轉錄因子Fos和Jun的亮氨酸拉鏈區(qū)(Landschulz等，1988，Science 240，1759；綜述見，Maniatis和Abel，1989，Nature 341，24)。亮氨酸拉鏈是約20-40個殘基長的特殊氨基酸序列，典型地每7個殘基就有一個亮氨酸。此拉鏈序列形成兩親性α螺旋，亮氨酸殘基在疏水側面上排成一線以便形成二聚體。相應于Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈的肽優(yōu)選形成異二聚體(O′Shea等，1989，Science 245，646)。含有拉鏈的雙特異性抗體及其制備方法在WO 92/10209和WO 93/11162中有公開。本發(fā)明的雙特異性抗體可以是針對VEGF受體和αvβ3受體的抗體，其中這兩個受體是在上面論及單特異性抗體時討論過的受體。
術語“免疫綴合物”指和非免疫學效應分子通過共價鍵融合在一起的抗體或免疫球蛋白或其有免疫學活性的片段。此融合伙伴(partner)優(yōu)選為可以糖基化的肽或蛋白質。所述的非抗體分子能連接到抗體重鏈恒定區(qū)的C末端或連接到輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的N末端。此融合伙伴可以通過接頭分子連接，一般這種接頭分子是含3-15個氨基酸殘基的肽。本發(fā)明的免疫綴合物優(yōu)選包含由針對血管生成受體(優(yōu)選整合蛋白或VEGF受體)的免疫球蛋白或其有免疫治療效果的片段和TNFα組成的融合蛋白或基本由TNFα和IFNγ或其他適合的細胞因子通過N末端和所述的免疫球蛋白(優(yōu)選Fc部分)的C末端相連組成的融合蛋白。
術語“融合蛋白”指的是由一個或多個非免疫治療活性(非抗體)蛋白或肽組成的天然或合成分子，其中這些蛋白或肽具有不同的特異性并任選地通過接頭分子融合在一起。例如，本發(fā)明的融合蛋白可以是由環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)和TNFα和/或IFNγ融合組成的分子。
“雜合抗體”是連接在一起的兩個或多個抗體或抗體結合片段，它們中每個都有一個不同的結合特異性。雜合抗體可以通過兩個或多個抗體或抗體片段的綴合而制備。優(yōu)選的雜合抗體由交聯(lián)的Fab/Fab′片段組成。很多偶聯(lián)或交聯(lián)試劑可用于抗體的綴合。比如蛋白A，碳二亞胺，N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；?硫代乙酸酯(SATA)和N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酸酯(SPDP)(實例參見Karpovsky等(1984)J.EXP.Med.160，1686；Liu等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，8648)。其他的方法還有Paulus，Behring Inst.Mitt.，No.78，118(1985)；Brennan等(1985)Science30m81或Glennie等(1987)J.Immunol.139，2367描述的方法。另一個方法使用鄰苯二馬來酰亞胺(oPDM)將三個Fab′片段偶聯(lián)在一起(WO91/03493)。本發(fā)明中多特異性抗體也是適用的，并可按照如WO 94/13804和WO 98/50431的教導進行制備。
抗體“效應子功能”是指抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))引起的那些生物活性。抗體效應子功能的實例包括補體依賴的細胞毒性，F(xiàn)c受體結合，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)，吞噬作用；細胞表面受體(如B細胞受體)的下調等。
術語“ADCC”(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用)指的是這樣一個細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(如天然殺傷(NK)細胞，嗜中性粒細胞，和巨噬細胞)識別靶細胞上的結合抗體并隨后引起靶細胞的裂解。介導ADCC的重要細胞-NK細胞只表達FcγR III，而單核細胞可表達FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III。為估計目的分子的ADCC活性，可利用例如現(xiàn)有技術(US 5,500,362；US 5,821,337)中描述的體外ADCC實驗來進行。此實驗中有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。
“人效應細胞”是能表達一個或多個FcR并執(zhí)行效應子功能的白細胞。此細胞優(yōu)選表達至少FcγR III并執(zhí)行ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)，天然殺傷(NK)細胞，單核細胞，細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞。
術語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結合IgG抗體的受體(γ受體)并包括FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III亞類的受體-包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。例如，對FcR的綜述可參見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991)。
術語“細胞因子”是對由一個細胞群釋放的作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白質的通稱。這類細胞因子的實例有淋巴因子、單核因子以及傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子包括生長激素如人生長激素，N-甲硫氨?；松L激素以及牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)，促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；整合蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGFβ；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGFα和TGFβ；紅細胞生成素(EPO)；干擾素如IFNα，IFNβ和IFNγ；集落刺激因子如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白細胞介素如IL-1，IL-1a，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；和TNFα或TNFβ。本發(fā)明優(yōu)選的細胞因子為干擾素和TNFα。
本處使用的術語“細胞毒性劑”指的是可以抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。此術語旨在包括放射性同位素，化療劑，毒素如細菌，真菌，植物或動物來源的酶活性毒素，或它們的片段。此術語還可以包括細胞因子家族的成員，優(yōu)選IFNγ。
術語“化療劑”或“抗腫瘤劑”包括具有抗腫瘤效果的化學藥劑，即直接地(作用在腫瘤細胞上，比如通過抑制細胞生長或細胞毒性作用)和間接地(通過如修飾生物學反應等機制)防止腫瘤細胞的發(fā)育，成熟或擴散的化學藥劑。本發(fā)明適宜的化療劑優(yōu)選為天然的或合成的化學化合物，但是生物分子如蛋白質，多肽等并不被明確地排除在外。大量的現(xiàn)有處于商業(yè)使用、臨床評價和臨床前研發(fā)階段的抗腫瘤劑都可包括在本發(fā)明內，用于通過和TNFα及上面提到的抗血管生成劑及任選地其它藥劑比如EGF受體拮抗劑相聯(lián)合來治療腫瘤/贅生物。應當指出化療劑可以任選地與上述藥劑聯(lián)合一起施用。
化療劑的實例包括烷化劑，如氮芥，吖丙啶化合物，烷基磺酸酯以及其他有烷基化作用的化合物如亞硝基脲，順氯氨鉑和達卡巴嗪；抗代謝物如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑如長春花生物堿和鬼臼毒素衍生物；細胞毒性抗生素和喜樹堿衍生物。優(yōu)選的化療劑或化療法包括氨磷汀(ethyol)，順氯氨鉑，達卡巴嗪(DTIC)，放線菌素D，氮芥，鏈脲霉素，環(huán)磷酰胺，carrnustine(BCNU)，環(huán)己亞硝脲(CCNU)，阿霉素(adriamycin)，阿霉素微脂體(doxil)，吉西他濱(gemzar)，柔紅霉素，柔紅霉素微脂體(daunoxome)，甲基芐肼，絲裂霉素，阿糖胞苷，足葉乙甙，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)，長春花堿，長春新堿，博來霉素，紫杉醇(taxol)，泰索帝(多烯紫杉醇，docetaxel)，阿地白介素(aldesleukin)，天冬酰胺酶，白消安，卡鉑，克拉立平，喜樹堿，CPT-11，10-羥基-7-乙基-喜樹堿(SN38)，達卡巴嗪，氟尿苷，氟達拉濱，羥基脲，異環(huán)磷酰胺，伊達比星，巰乙磺酸鈉，干擾素α，干擾素β，伊立替康(irinotecan)，米托蒽醌，托泊替堪，亮丙瑞林，甲地孕酮，抗瘤氨酸，巰嘌呤，普卡霉素(plicamycin)，氯苯二氯乙烷，天冬酰胺酶(pegaspargase)，噴司他丁(pentostatin)，哌酰溴烷，普卡霉素，鏈脲霉素，他莫西芬，替尼泊甙，睪內酯，硫鳥嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，維諾利賓，苯丁酸氮芥及其組合。本發(fā)明最優(yōu)選的化療劑是順氯氨鉑，吉西他濱，阿霉素，紫杉醇和博來霉素。
術語“癌”和“腫瘤”指的是或描述的是典型特征為無調控細胞生長的哺乳動物生理疾病。通過施用本發(fā)明的藥物組合物，可對腫瘤進行治療，如乳腺，心臟，肺，小腸，結腸，脾，腎，膀胱，頭部和頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，子宮頸和肝的腫瘤。更具體地，腫瘤選自腺瘤，血管肉瘤(angio-sarcoma)，星形細胞瘤，上皮癌，生殖細胞瘤，成膠質細胞瘤，神經(jīng)膠質瘤，錯構瘤，血管內皮瘤，血管肉瘤(hemangio sarcoma)，血腫，肝胚細胞瘤，白血病，淋巴瘤，成神經(jīng)管細胞瘤，黑素瘤，成神經(jīng)細胞瘤，骨肉瘤，成視網(wǎng)膜細胞瘤，橫紋肌肉瘤，肉瘤和畸胎瘤。
詳細地說，腫瘤選自肢端色斑樣黑素瘤，光化性角化病，腺癌，囊腺癌，腺瘤，腺肉瘤，腺鱗癌，星形細胞瘤，前庭大腺癌，基底細胞癌，支氣管腺癌，毛細血管瘤、癌、癌肉瘤，海綿狀膽管癌，軟骨肉瘤，脈絡絲乳頭狀瘤/癌，透明細胞癌，囊腺瘤，內胚竇瘤，子宮內膜增生，子宮內膜間質肉瘤，子宮內膜腺癌，室管膜肉瘤，上皮樣肉瘤，尤因肉瘤，纖維板層樣癌，局灶性結節(jié)性增生，胃泌素瘤，生殖細胞瘤，成神經(jīng)膠質細胞瘤，胰升糖素瘤，成血管細胞瘤，血管內皮瘤，血管瘤，肝腺瘤，肝腺瘤病，肝細胞癌，胰島素瘤，上皮內瘤形成，上皮間鱗狀細胞癌，侵襲性鱗狀細胞癌，大細胞癌，平滑肌肉瘤，惡性著色斑型黑素瘤，惡性黑素瘤，惡性間皮瘤，成神經(jīng)管細胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，腦膜腫瘤，間皮腫瘤，轉移性腫瘤，粘液上皮癌，成神經(jīng)細胞瘤，神經(jīng)上皮腺癌，結節(jié)性黑色素瘤，燕麥細胞癌，少突神經(jīng)膠質瘤，骨肉瘤，胰腺多肽，乳頭狀漿液性腺癌，松果體細胞瘤，垂體瘤，漿細胞瘤，假肉瘤，肺母細胞瘤，腎細胞瘤，成視網(wǎng)膜細胞癌，橫紋肌肉瘤，肉瘤，漿液性癌，小細胞肺癌，軟組織癌，抑生長素分泌細胞腫瘤，鱗癌，鱗狀細胞癌，間皮下，表淺蔓延型黑素瘤，未分化的癌，眼色素層黑色素瘤，疣狀癌，血管活性腸多肽瘤，完全分化的癌，和腎母細胞瘤。
“ErbB受體”是指屬于ErbB受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(ErbB1)，ErbB2，ErbB3和ErbB4受體以及此家族中有待于在將來進行鑒別的其他成員。ErbB受體一般含有一個可與ErbB配體結合的細胞外結構域；一個親脂性的跨膜結構域；一個保守的細胞內酪氨酸激酶結構域；以及一個含有若干可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號結構域。ErbB受體可以是“天然序列的”ErbB受體，或它的“氨基酸序列變異體”。優(yōu)選的ErbB受體是天然序列的人ErbB受體。ErbB1指的是編碼EGFR蛋白產物的基因。最優(yōu)選的是EGF受體(Her1)?！癊rbB1”和“HER1”在本處可互換使用且均指人HER1蛋白?！癊rbB2”和“HER2”在本處可互換使用且均指人HER2蛋白。本發(fā)明優(yōu)選ErbB1受體(EGFR)。
“ErbB配體”是結合并且/或者激活ErbB受體的多肽。與EGFR結合的ErbB配體包括有EGF，TGF-a，雙調蛋白，β-細胞調節(jié)素(betacellulin)，HB-EGF和表皮調節(jié)素(epiregulin)。
術語“ErbB受體拮抗劑/抑制劑”指的是天然或合成的能結合并阻斷或抑制ErbB受體的分子。因此通過阻斷受體，拮抗劑阻止了ErbB配體(激動劑)的結合以及激動劑/配體受體復合物的活化。ErbB拮抗劑可能針對HER1(EGFR)或HER2。本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑針對EGF受體(EGFR，Her1)。ErbB受體拮抗劑可以是抗體或抗體的免疫治療活性片段或非免疫生物學分子—如肽、多肽蛋白。化學分子也包括在內，但是本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑為抗EGFR抗體和抗HER2抗體。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體為抗Her1和抗Her2抗體，更優(yōu)選抗Her1抗體。優(yōu)選的抗Her1抗體為MAb 425，優(yōu)選人源化的MAb 425(hMAb 425，US5,558,864；EP 0531472)和嵌合MAb 225(cMAb 225，US 4,943,533和EP0359 282)。最優(yōu)選的是單克隆抗體h425，在單藥物治療中它已顯示出高療效和降低的負反應和副作用。最優(yōu)選的抗Her2抗體是Genentech/Roche上市的HERCEPTIN。本發(fā)明的有效EGF受體拮抗劑還可以是天然的或合成的化學化合物。此類優(yōu)選分子的一些實例包括有機化合物、有機金屬化合物、有機化合物和有機金屬化合物的鹽。
HER2受體拮抗劑的實例有苯乙烯基取代的雜芳基化合物(US5,656,655)；雙單環(huán)和/或雙環(huán)芳基、雜芳基、碳環(huán)和雜碳環(huán)化合物(US5,646,153)；三環(huán)的嘧啶化合物(US 5,679,683)；有受體酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物(US 5,616,582)；雜芳基乙烯基或雜芳基乙烯基芳基化合物(US 5,196,446)；可以抑制EGFR、PDGFR和FGFR受體家族的名稱為6-(2，6-二氯代苯基)-2-(4-(2-二乙基-氨基乙氧基)苯基氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3)-5-嘧啶-7-酮的化合物(Panek，等，1997，J.Pharmacol.Exp.Therap.283，1433)。
“放射性療法”可以利用本發(fā)明的藥物組合物進行治療的腫瘤還可以利用放射線或放射藥物進行治療。放射源既可以給患者外用也可以給患者內用。如果給患者外用放射源，該治療方法稱作體外照射放療(EBRT)。如果給患者內用放射源，此治療稱為近距放射療法(BT)。已經(jīng)使用的一些典型的放射活性原子包括鐳，銫-137，和銥-192，镅-241和金-198，鈷-57；銅-67；锝-99；碘-123；碘-131；以及銦-111。也可以用放射活性同位素標記本發(fā)明藥劑。當前放射性療法是控制不能切除的和不宜手術的腫瘤和/或腫瘤轉移的標準治療方法。已經(jīng)看到放射性療法和化療組合可提高療效。放射性療法依據(jù)的原理是投射到靶區(qū)的高劑量輻射將導致腫瘤和正常組織中的增殖細胞的死亡。輻射劑量方案一般根據(jù)輻射吸收劑量(rad)，時間和分段進行確定，并且必須由腫瘤專家進行仔細確定?；颊呓邮艿妮椛淞繉⑷Q于各種因素，但兩個最重要的因素是腫瘤相對身體其它重要結構或器官的位置，以及腫瘤擴散的程度。對患者實施放射性療法的一個優(yōu)選治療方案是療程持續(xù)5-6個星期，將50-60Gy總劑量按照每星期5天每天1次1.8-2.0Gy的劑量給患者分段施用。Gy是戈瑞的縮寫，指100 rad劑量。在優(yōu)選的實施方案中，血管生成拮抗劑和TNFα/IFNγ以及放射物對人類患者腫瘤的治療具有協(xié)同作用。換句話說，所述化合物如果與放射物和/或化療劑組合，則對腫瘤生長的抑制作用將增強。本發(fā)明可任選地使用放射性療法。在不能給患者施用足量的本發(fā)明藥劑的情況下建議和優(yōu)選使用放射性療法。
“藥物治療”就步驟而言，本發(fā)明的方法包括多種實施形式。比如，本發(fā)明的藥劑可以同時地，相繼地或獨立地使用。另外，藥劑可分開施用且兩次施用間隔在約3周以內，即第二種藥劑在第一種活性劑施用后基本上立即開始施用到第一種藥劑施用后不超過約3周的時間開始施用。本方法可在手術之后進行?；蛘撸中g可在施用第一種活性藥劑和施用第二種活性藥劑之間的間隔期內進行。此方法的實例是將本發(fā)明方法和外科腫瘤摘除手術聯(lián)合應用。根據(jù)本發(fā)明方法的治療典型地包括在一個或多個施用周期內施用本治療組合物。例如，當進行同時施用的時侯，含有2種藥劑的治療組合物在一個周期內持繼施用大約2天到約3周。此后，治療周期可根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)生的判斷按需要進行重復。類似地，如果進行相繼施用，則每種治療劑施用的時間可調整到典型地覆蓋同樣的時間。兩周期之間的間隔可從約0到2個月不等。
本發(fā)明的藥劑可通過注射或隨時間逐漸輸注經(jīng)腸胃外施用。體內待治療的組織用全身給藥的方法一般就可進行治療，因此最經(jīng)常使用的方法是靜脈內給予治療組合物，但是當目標組織可能含有靶分子的時候，其他組織和給藥方法也是可考慮的。因此，本發(fā)明的藥劑可眼內，靜脈內，腹膜內，肌內，皮下，腔內，經(jīng)皮，通過常位注射和輸注給藥，而且還可以通過蠕動方式給藥。例如，包括本發(fā)明的整合蛋白拮抗劑的治療組合物通常通過靜脈方式，比如以單位劑量注射給藥。本發(fā)明的治療組合物包含生理學可耐受的載體和溶解或分散于其中作為活性成分的本處描述的相關藥劑。
如在本處使用的那樣，術語“藥學上可接受的”指這樣的組合物，載體，稀釋劑和試劑，這些物質可用在哺乳動物身上而不會產生不想要的生理效應如惡心，眩暈，反胃等。其中溶解或分散有活性成分的藥物組合物的制備是本領域技術人員所熟知的，不必在制劑的基礎上進行限定。典型地，這種組合物可制成注射劑如液體溶液或懸液，但是，也可制成適于在使用前在液體中形成溶液或混懸液的固體形式。制劑也可進行乳化?？蓪⒒钚猿煞趾推淞窟m于本處描述的治療方法的藥學上可接受的并與活性成分兼容的賦形劑混合。適當?shù)馁x形劑是，例如，水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等以及這些的組合。另外，如果需要的話，組合物還可以包括小量可增加活性成分效用的輔助物質如潤濕劑或乳化劑，pH緩沖劑等。本發(fā)明治療組合物可在其中包括這些成分在藥學上可接受的鹽。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(和多肽的游離氨基基團成鹽)，所述酸是無機酸，例如，鹽酸或磷酸，或像乙酸，酒石酸，苦杏仁酸等有機酸。也可從無機堿，例如，鈉，鉀，銨，鈣或鐵的氫氧化物，以及有機堿如異丙胺，三甲基胺，2-乙氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等，得到與游離羧基基團形成的鹽。在環(huán)肽αv拮抗劑制劑中特別優(yōu)選使用HCl鹽。生理學上可耐受的載體是本領域的技術人員所熟知的。液相載體的例子為無菌水溶液，它可以僅含有活性組分和水或可以還含有緩沖劑例如在生理pH值的磷酸鈉，生理鹽水或兩者，如磷酸緩沖鹽水。再者，含水載體可以含有一種以上的緩沖鹽以及諸如氯化鈉和氯化鉀等鹽，葡萄糖，聚乙二醇和其他溶質。液體組合物也可含有有水或無水的液相。這類其他液相的例子有甘油，植物油如棉籽油和水油乳液。
典型地，對于形式為例如，整合蛋白受體阻斷抗體或抗體片段或抗體綴合物或者抗VEGF受體阻斷抗體、片斷或綴合物的免疫治療劑，治療有效量是在生理可耐受的組合物中給藥時，足以使血漿濃度達到約0.01微克(μg)每毫升(ml)至約100μg/ml，優(yōu)選約1μg/ml至5μg/ml，通常約5μg/ml的量。換言之，劑量可從約0.1mg/kg變化到約300mg/kg，優(yōu)選約0.2mg/kg至約200mg/kg，最優(yōu)選約0.5mg/kg至約20mg/kg，一日或多日持繼進行一日一次或一日多次給藥。當免疫治療劑是單克隆抗體的片段或綴合物的時侯，其用量可很容易地根據(jù)片段/綴合物的質量相對于整個抗體的質量的比例進行調整。以摩爾濃度表示，優(yōu)選的血漿濃度為約2微摩爾(μM)至約5毫摩爾(mM)，優(yōu)選約100μM到1mM抗體拮抗劑。
對于屬于非免疫治療性肽或蛋白質多肽(例如TNFα、IFNγ)或其他類似大小的生物分子的本發(fā)明藥劑，其治療有效的量典型地為這樣的多肽量，即在生理可耐受的組合物中給藥時足以使血漿濃度達到約0.1微克(μg)每毫升(ml)至約200μg/ml，優(yōu)選約1μg/ml至約150μg/ml的量。根據(jù)每摩爾有約500克質量的多肽來計算，優(yōu)選的血漿摩爾濃度為約2微摩爾(μM)到約5毫摩爾(mM)，優(yōu)選約100μM至1mM多肽拮抗劑。
對于本發(fā)明中優(yōu)選為化學拮抗劑或(化學)化療劑(既不是免疫治療劑，也不是非免疫治療性肽/蛋白)的活性藥劑，其典型劑量為每公斤體重每天10mg至1000mg，優(yōu)選約20至200mg，更優(yōu)選的是50至100mg。
本發(fā)明的“藥物組合物”可以包含能降低或避免伴隨本發(fā)明聯(lián)合療法出現(xiàn)的副作用的藥劑(“輔助療法”)，這包括但不限于，如降低抗癌藥物毒性作用的藥劑，例如骨重吸收抑制劑，心臟保護藥物。所述的輔助藥劑可以防止或降低化療，放射治療或手術帶來的惡心和嘔吐的發(fā)生率，或降低施用骨髓抑制性抗癌藥物帶來的感染機率。輔助藥劑是本領域內的技術人員所熟知的。此外，本發(fā)明的免疫治療劑還可以和佐劑如BCG和免疫系統(tǒng)刺激劑一起使用。而且，組合物可包括含有具細胞毒性作用的放射性標記同位素或其他細胞毒性劑如細胞毒性肽(例如細胞因子)或細胞毒性藥物等的免疫治療劑或化療劑。
術語用于治療腫瘤或腫瘤轉移的“藥物試劑盒”指的是一種包裝以及通常地藥劑在腫瘤和腫瘤轉移治療方法中的使用說明書。本發(fā)明試劑盒中的藥劑一般被配制成本處所描述的治療組合物，因此可以采用任何適于試劑盒內放置的形式。這些形式可以包括液體，粉末，片劑，混懸液等以便提供本發(fā)明的拮抗劑和/或融合蛋白。這些藥劑可以在適合于根據(jù)本發(fā)明方法單獨給藥的各單獨容器中提供，或可以在此包裝中的單一容器內結合在組合物中提供。包裝中可含有足以按照此處描述的治療方法施用一次或多次的藥劑量。本發(fā)明試劑盒還包括包裝中所含材料的“使用說明”。


圖1HUVEC球的形成和存活不需要整合蛋白連接。(a)阻斷性抗VE-鈣粘著蛋白(75)mAb或Ca2+-耗竭(EDTA，EDTA/Ca2+)抑制HUVEC球的形成，而阻斷性抗整合蛋白α1(Lia1/2)，α5(SAM-1)，αVβ3(LM609)和PECAM-1(10D9)的mAb和RGD肽均不抑制HUVEC球的形成。(b)生存力。從球體(○)和纖連蛋白(●)培養(yǎng)物回收的HUVEC具有相似的生存曲線。
圖2整合蛋白依賴性粘著保護HUVEC抵抗TNF誘導的細胞凋亡。(a)YoPro-1攝取暴露于TNF(T)和TNF/IFNγ(TI)沒有引起纖連蛋白粘著HUVEC中的YoPro-1著色，而引起了HUVEC球體中的YoPro-1強著色，這種著色受到caspase抑制劑—BOC和ZVAD的抑制。TNF±IFNγ(TI)。C，未處理的培養(yǎng)物。(b)利用蛋白質印跡法證明caspase-3激活和PARP斷裂(箭頭)存在于TNF/IFNγ-處理(TI)的球體HUVEC中而不存在于纖連蛋白粘著HUVEC中。C，未處理的培養(yǎng)物。(c，d)HUVEC的生存力曲線，此HUVEC暴露于TNF(■)，TNF/IFNγ(▲)或對照培養(yǎng)基(○)。(e)在抗α1(△/▲)，αVβ3(□/■)和α4(○/●)整合蛋白的固定化抗體(imAb)上在TNF/IFNγ存在(實心符號)或不存在(空心符號)時進行培養(yǎng)的HUVEC的生存力。
圖3TNF誘導的NF-κB激活不需要整合蛋白連接。(a)蛋白質印跡法和(b)電泳遷移率變動分析(EMSA)證實了在暴露于TNF/IFNγ的纖連蛋白-粘著HUVEC和球體中的1-κB磷酸化(Pi-κB)、1-κB降解(I-κB)和NF-κB核轉位(EMSA)的平行動力學。(c)流式細胞計分析顯示在暴露于TNF(----)或TNF/IFNγ(-)的纖連蛋白和球體HUVEC培養(yǎng)物上具有相同的ICAM-1的細胞表面表達誘導。(……)未處理細胞。PECAM-1表達作為對照。
圖4Akt的活化是HUVEC存活所必需的并且Akt的活化需要整合蛋白連接。(a)檢測經(jīng)指定時間的TNF/IFNγ刺激后纖連蛋白粘著HUVEC和球體HUVEC培養(yǎng)物中的磷酸化Akt(Pi-Akt)和總Akt(Akt)。(b)左圖PI-3激酶抑制劑——渥曼青霉素(W)和LY294002(LY)使纖連蛋白粘著HUVEC對TNF(T)和TNF/IFNγ(TI)誘導的細胞凋亡敏感。死細胞以YoPro-1染色顯示。右圖暴露于LY294002(●)，TNF/IFNγ(△)或LY294002/TNF/IFNγ(▲)的纖連蛋白粘著HUVEC的存活曲線。(○)未處理的培養(yǎng)物。(c)組成活性的PI-3激酶(p110*)和Akt(Aktmp)，但不是野生型Akt(Aktwt)或對照質粒(pBS)，促進暴露于TNF(●)或TNF/IFNγ(▲)的球體細胞存活。(○)未處理的培養(yǎng)物。插入表示的是流式細胞計分析的轉染細胞的EGFP熒光(％陽性細胞)。(d)在沒有(C)或有TNF(T)或TNF/IFNγ(TI)存在下以纖連蛋白粘著的單層形式或球體形式培養(yǎng)經(jīng)對照質粒(pBS)或組成活性Akt(Akt*)電穿孔及Ad△NI-κB或AdLacZ感染的HUVEC。凋亡細胞通過YoPro-1染色檢測?；畹睦w連蛋白粘著細胞用結晶紫染色。(e)在有梯度濃度TNF的存在下，在纖連蛋白上培養(yǎng)經(jīng)對照質粒(空心符號)或pAktmp(實心符號)電穿孔及AdΔNI-κB(○/●)或AdLacZ(△/▲)感染的HUVEC，活的粘著細胞通過測定結晶紫染色的孔的OD值進行確定。(f)流式細胞計數(shù)分析未處理的HUVEC(……)、或經(jīng)TNF(----)和TNF/LY294002(-)處理的HUVEC(左圖)以及經(jīng)Ad△NI-κB(中圖)或AdLacZ感染并暴露于TNF(----)和TNF/IFNγ(-)的HUVEC中的ICAM-1表達。
圖5(a-c)利用蛋白質印跡法分析暴露于TNF/IFNγ所示時間的纖連蛋白和球體HUVEC培養(yǎng)物中的Pi-Akt，MDM2，p53，Pi-FKHR/FRKHL1(a)，及Pi-MEK，Pi-p38和Pi-JNK和Pi-ERK。研究證明，就總的Akt，F(xiàn)KHR，MEK，p38，ERK和JNK蛋白而言，總蛋白量表現(xiàn)出相等。響應TNF/IFNγ，細胞球體培養(yǎng)物同纖連蛋白粘著細胞相比，它缺少Akt和FKHR/FKRL1的磷酸化但p53水平增加且MEK，p38、ERK和JNK的磷酸化增強。
附圖6在體外降低的整合蛋白連接增強TNF的細胞毒性。(a)將HUVEC在不存在(C)或存在TNF(T)或TNF/IFNγ(TI)的條件下在纖連蛋白或PLL上培養(yǎng)16小時。凋亡的和活的粘著細胞分別用YoPro-1和結晶紫染色顯示。(b)EMD121974破壞αVβ3介導的HUVEC在明膠上的粘附(■)但是不破壞α5β1/αVβ3的α5β1組分介導的對纖連蛋白的粘附(●)。對照肽EMD135981無此作用(空心符號)。(c)如圖所示在沒有(C)或存在TNF/IFNγ(TI)、EMD121974和EMD135981時，HUVEC在纖連蛋白上進行培養(yǎng)。凋亡細胞和粘著細胞分別用YoPro-1染色和相差顯微鏡顯示。(d)c部分所示實驗中的HUVEC的生存力曲線，無肽(○/●)；EMD121974(△/▲)；EMD135981(□/■)。未處理的培養(yǎng)物，空心符號。TNF/IFNγ處理的培養(yǎng)物，實心符號。(e)HUVEC生存力曲線，此HUVEC細胞用Aktmp(空心符號)或pBS(實心符號)電穿孔并在纖連蛋白上進行培養(yǎng)并暴露于單獨的TNF/IFNγ(○/●)或還暴露于EMD121974(△/▲)或EMD135981(□/■)肽。Aktmp阻止由EMD121974和TNF/IFNγ聯(lián)合處理誘導的細胞死亡。
圖7減少的整合蛋白連接增強TNF在體內的細胞毒性。帶有BN-175同基因軟組織肉瘤的BN大鼠通過ILP技術以EMD121974(□)，TNF(△)或EMD1 21974/TNF(■)進行處理。(○)假處理的大鼠。ILP處理之后連續(xù)六天測量腫瘤生長。結果表示為平均腫瘤體積±s.e.m.(n＝6)。將此同基因軟組織肉瘤BN-175的小塊植入雄性BN大鼠的右后肢，肉瘤直徑達到12-14mm時開始處理(Manusama等，Oncol.Rep.6，173-177.(1999))。股動脈和靜脈插上硅橡膠套管并用止血帶封閉側支循環(huán)(collaterals)。用5ml Heamacce灌注30分鐘(2.4ml/min)，Heamacce中添加大丸劑形式(boluse)的藥物(EMD121974，500μg，在灌注液中終濃度是170μM；TNF，50μg)。灌注液經(jīng)氧化處理，腿部用溫暖褥墊保溫38-39℃。用EMD12194灌注的大鼠在ILP處理前2小時和處理后3小時還全身施用該肽(100mk/kg，腹膜內)。用卡尺測量腫瘤的二維直徑并計算腫瘤體積(V)(V＝0.4×A2×B，其中B指的是最大直徑，A是垂直于B的直徑)。每組處理6只大鼠。按照(Manusama等，Oncol.Rep.6，173-177.(1999))所述方法評估局部和全身的副作用。
圖8在體外減少整合蛋白連接增強了TNF-，TRAIL-和FasL誘導的細胞毒性。按照所示在沒有(對照)或有EMD121974(300μM)，TNF(200ng/ml)，F(xiàn)asL(200ng/ml)，TRAIL(200ng/ml)，LIGHT(200ng/ml)和IFNγ(330ng/ml)存在下，將HUVEC在纖連蛋白包被的微量滴定平板上過夜培養(yǎng)。通過MST實驗測定生存力。
本發(fā)明可通過下列實施例更詳細說明。
實施例1整合蛋白依賴的粘著內皮細胞抗TNFα誘導的細胞凋亡。
HUVEC球的形成和存活不需要整合蛋白為檢驗整合蛋白連接對TNF誘導的細胞凋亡的作用，我們鑒定了無整合蛋白依賴性粘著時培養(yǎng)內皮細胞的條件。內皮細胞的單細胞懸浮液由于失巢凋亡(anoikis)很快死亡(Meredith等，Mol.Biol Cell.4，953-961(1993))因此無法進一步分析。但是將高密度(1.0×106個細胞/ml)的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)接種在BSA包被的孔中，在2-4小時內形成了多細胞球，并且能夠存活24小時以上，這依賴于VE-鈣粘著蛋白而整合蛋白沒有任何可檢測到的貢獻。通過阻斷性單克隆抗體(mAb)或以EDTA耗竭Ca2+-Mg2+來抑制VE-鈣粘著蛋白活性可阻斷細胞球形成，而對于抗α2，α3，α5，α6，β1，αVβ3或aVβ5整合蛋白的抑制性mAbs、基于RGD的封閉性肽和封閉性抗PECAM-1mAb，這些組分的單獨或組合存在都不影響HUVEC球體(圖1a，未顯示數(shù)據(jù))。
為確定球體培養(yǎng)對細胞生存力的影響，將球體和纖連蛋白-粘著的HUVEC在鋪平板后的6-72小時之間進行回收，之后系列稀釋并再繼續(xù)培養(yǎng)48小時，測定相對細胞數(shù)。稀釋曲線的向左移動或變平表明細胞生存力降低。在鋪平板后6，12，16和24小時，從球體培養(yǎng)物回收的HUVEC的生存力與來自纖連蛋白粘著培養(yǎng)物的HUVEC的生存力相當，但是從36小時開始來自球體培養(yǎng)物的HUVEC的生存力進行性降低(圖1b在16小時，未顯示數(shù)據(jù))。
綜合這些結果證明在沒有整合蛋白依賴性粘著存在時，HUVEC能夠形成球體并存活24小時以上。
實施例2粘附于纖連蛋白可保護HUVEC抵抗TNF誘導的細胞凋亡。
為檢驗整合蛋白是否能夠調節(jié)TNF誘導的細胞凋亡，我們在纖連蛋白(整合蛋白依賴的粘著)上或以球體(整合蛋白不依賴的粘著)形式培養(yǎng)HUVEC，其中在培養(yǎng)物中加入或不加入TNF(200ng/ml)及IFNγ(330ng/ml)-TNF細胞毒性的增強劑(Dealtry等，Eur.J.Immunol.17，689-693(1987))。將纖連蛋白上的單層HUVEC暴露于TNF±IFNγ，細胞沒有出現(xiàn)YoPro-1攝取(Idziorek等，J.Immunol.Methods185，249-258(1995))、膜聯(lián)蛋白V的細胞表面結合、caspase-3的激活和caspase-3底物PARP的切割(圖2a，2b，未顯示數(shù)據(jù))，這些現(xiàn)象證實此暴露未增加細胞凋亡。相反，以TNF±IFNγ處理的HUVEC球體中增加了YoPro-1的攝取(此增加可以被caspase抑制劑BOC，Z-VAD，IETD和DVED抑制)、DNA片段化、caspase-3的激活和PARP的切割(圖2a，2b，未顯示數(shù)據(jù))。為檢測TNF±IFNγ對細胞存活的影響，我們測定了未處理的培養(yǎng)物和處理的培養(yǎng)物的生存力。將纖連蛋白粘著的HUVEC暴露于TNF±IFNγ不影響細胞的生存力(圖2c)。細胞球體以TNF處理，結果80％以上細胞死亡，而以TNF/IFNγ聯(lián)合處理，細胞全部死亡(圖2d)。單獨以IFNγ處理沒有細胞毒性(未顯示數(shù)據(jù))。HUVEC通過αVβ3和α5β1整合蛋白粘附于固定化的纖連蛋白上(Ruegg等，Nature Med.4，408-414(1998))。為檢測這些整合蛋白每個對纖連蛋白上的細胞的生存的貢獻，我們在塑料-固定化的抗αVβ3、α1、α5和α4整合蛋白mAb(imAb)上培養(yǎng)HUVEC。固定化的抗αVβ3、抗α5和抗α1 mAb能夠保護HUVEC抵抗TNF誘導的死亡而抗α4 mAb則不能(圖2e，未顯示數(shù)據(jù))。
從這些結果我們可以推斷αVβ3和αVβ1整合蛋白介導的粘著可以抑制TNF誘導的細胞凋亡，而缺少αVβ1和αVβ3整合蛋白-介導的粘著則使HUVEC對TNF和caspase介導的細胞凋亡敏感。
實施例3整合蛋白依賴性信號保護內皮細胞抵抗TNFα誘導的細胞凋亡。
TNF誘導的NF-κB激活不需要整合蛋白連接核因子-κB(NF-κB)的激活促進暴露于TNF的細胞的生存(Beg& Baltimore，Science 274，782-784；Van Antwerp等，Science 274，787-789(1996))。因為通過整合蛋白的細胞粘著能夠激活NF-κB(Scatena等，J.Cell Biol.141，1083-1093(1998))，所以我們研究了細胞球體對TNF誘導的細胞凋亡的敏感性是否是由于缺少NF-κB激活而致。通過測定1-κB的磷酸化和降解、NF-κB的核轉位及ICAM-1(NF-κB誘導的基因)的細胞表面表達來檢測暴露于TNF±IFNγ的球體HUVEC和纖連蛋白粘著HUVEC培養(yǎng)物中的NF-κB激活。我們未觀察到在1-κB磷酸化和降解、NF--κB核轉位和ICAM-1表達上有顯著差異(圖3a-c)，表明TNF誘導的培養(yǎng)于球體中的HUVEC的細胞凋亡不是由于削弱的NF-κB激活所致。
實施例4活化作用依賴于整合蛋白連接并是細胞存活所必需的下面，分析Akt/PKB的激活，Akt/PKB是一個TNF激活的蛋白激酶，它促進內皮細胞的存活(Madge & Pober，J.Biol.Chem.275，15458-15465.(2000))。與組成性的和TNF-誘導的Akt激活一樣，纖連蛋白粘著HUVEC中的基礎Akt磷酸化因暴露于TNF/IFNγ而增加。相反，在未處理的球體中沒有觀測到Akt磷酸化，而暴露于TNF/IFNγ只引起弱磷酸化(圖4a)。為了分析Akt激活和HUVEC存活的相關性，我們用渥曼青霉素和LY294002—兩種磷酸肌醇-3(PI-3)激酶(Akt的上游激活劑)的藥理學抑制劑(Kandel，& Hay，Exp.Cell Res.253，210-229.(1999))—處理纖連蛋白粘著細胞，還在球體中表達了Akt(Aktmp)和PI-3激酶催化亞基(p110*)的組成型活性形式。渥曼青霉素和LY294002的處理使暴露于TNF±IFNγ的纖連蛋白粘著細胞的細胞凋亡增加而存活降低(圖4b)，而Aktmp和p110*而非野生型的Akt(Aktwt)或對照質粒(pBS)可以保護球體抵抗TNF±IFNγ誘導的細胞凋亡(圖4c)。
從這些結果我們推斷Akt的激活是暴露于TNF±IFNγ中的HUVEC的存活所必需的，并且Akt的基礎和TNF誘導的激活都依賴整合蛋白的連接。
實施例4TNF處理的HUVEC的存活需要Akt和NF-κB的激活在活性NF-κB存在下，Aktmp抑制TNF-誘導的細胞球體的細胞凋亡。我們還檢測了NF-κB活化和活性Akt信號是否均為細胞存活所需要的，還是只有活性Akt就可以。我們利用能夠表達非降解I-κB的腺病毒(Ad△NI-κB—可防止IκB-NFκB解離(Brown等，Science267，1485-1488.(1995))感染HUVEC，阻斷表達組成型活性Akt(Aktmp)的細胞中NF-B的激活。Ad△NI-κB使纖連蛋白粘著HUVEC對TNF±IFNγ誘導的細胞凋亡敏感，而且此作用不受Aktmp影響。對照電穿孔(pBS)和腺病毒感染(AdLacZ)沒有作用。Ad△NI-κB還使過表達Aktmp的細胞球體對TNF±IFNγ誘導的細胞凋亡敏感(圖4d)。為檢測Akt是否能使缺少NF-κB激活的HUVEC免受低劑量TNF的影響，將表達wt和Aktmp的HUVEC的貼壁單層細胞以Ad△NI-κB感染并暴露于TNF(0.33-100ng/ml)。Ad△NI-κB使HUVEC對細胞凋亡敏感(TNF＞0.1ng/ml)，但是Aktmp甚至在這些低劑量TNF下也不能保護HUVEC(圖4e)。而且，LY294002和渥曼青霉素不能抑制TNF誘導的ICAM-1表達，這表明HUVEC中的NF-κB激活不需要Akt信號(圖4f，未顯示數(shù)據(jù))，這與球體中ICAM-1的誘導相一致(參見圖3c)。相反，以Ad△NI-κB感染的HUVEC抑制響應TNF±IFNγ的ICAM-1表達(圖4f)。
綜上所述這些結果證明暴露于TNF±IFNγ中的HUVEC的存活需要同時激活Akt和NF-κB兩者。
實施例5整合蛋白連接促進FKHR和MDM2的激活并且抑制MEK、p38和JNK的磷酸化Akt的抗細胞凋亡活性最初被歸因于它磷酸化和抑制caspase-9和Bad的作用(Datta等，Genes Dev.13，2905-2927.(1999))。然而現(xiàn)在，研究表明Akt依賴性存活涉及Forkhead轉錄因子(FKHR/FKHRL1)的磷酸化和抑制(Datta等，Genes Dev.13，2905-2927.(1999)；Brunet等，Cell 96，857-868，(1999))和MDM2的磷酸化和抑制、p53的降解(Mayo & Donner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，11598-11603.(2001))以及對蛋白激酶ERK、p38和JNK的活化的抑制(Rommel等，Science 286，1738-1741.(1999)；Gratton等，J.Biol.Chem.276，30359-30365.(2001)；Park等，J.Biol.Chem.277，2573-2578.(2002)；Madge & Pober，J.Biol.Chem.275，15458-15465.(2000))。我們研究了缺乏整合蛋白連接和Akt信號是否伴隨有這些信號途徑的變化。我們測定了在暴露于TNF/IFNγ的粘著HUVEC和細胞球中MDM2、p53和磷酸化的FKHR/FRKHL1、MEK、p38和-JNK的水平。細胞球同纖連蛋白粘著細胞相比缺少FKHR/FKRL1的磷酸化且MDM2的水平和p53的累積減少(圖5a)。此外，細胞球中基礎的和TNF/IFNγ-誘導的MEK、p38和JNK的磷酸化增加(圖5b)。這些結果與Akt通過抑制FKHR/FKHR1、減少p53水平以及抑制MEK、p38和JNK的磷酸化從而促進存活的作用一致。
實施例6利用小分子化合物抑制整合蛋白依賴的粘著可以在體內和體外使內皮細胞對TNFα誘導的細胞凋亡敏感。
減少整合蛋白連接使粘著HUVEC對TNFα誘導的細胞凋亡敏感在減少整合蛋白連接的條件下針對TNF的敏感性出現(xiàn)增加并非是細胞球體所特有的對于在聚-L-賴氨酸(PLL)上培養(yǎng)和存活的HUVEC，其中PLL是一種促進不依賴整合蛋白的粘著的底物(Bershadsky等，Curr.Biol.6，1279-1289.(1996))，TNF±IFNγ的加入引起細胞大量死亡(圖6a)，這種死亡可通過表達Aktmp來防止(未顯示)。此外，我們利用EMD121974((環(huán)(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)，αVβ3/αVβ5拮抗環(huán)肽)(Dechantsreiter等，J.Med.Chem.42，3033-3040.(1999))選擇性抑制纖連蛋白上的HUVEC中的整合蛋白αVβ3，而不影響纖連蛋白上依賴于α5β1/αVβ3的α5β1組分的粘著(圖6b)。雖然TNF/IFNγ和EMD121974兩者單獨都不影響細胞存活，但是細胞同時暴露于TNF/IFNγ和EMD121974(而不是非抑制性對照肽EMD135981)卻增加了細胞凋亡和細胞的脫附(圖6c)并降低了存活(圖6d)。而Aktmp的表達保護纖連蛋白粘著HUVEC抵抗由TNF、IFNγ和EMD121974誘導的細胞凋亡(圖6e)。
實施例7整合蛋白連接的減少使粘著HUVEC對TNF配體家族的不同死亡配體所誘導的細胞凋亡敏感對于死亡受體信號的促細胞凋亡效應，整合蛋白連接減少會引起細胞對此效應的敏感性增加，這種敏感性增加并不限于TNF，當在纖連蛋白上培養(yǎng)的HUVEC在EMD121974存在下暴露于TRAIL和FasL時也觀察到這種增加。LIGHT，一種能與沒有死亡結構域的受體結合的配體，顯示與αVβ3阻斷沒有協(xié)同作用(圖7)。
實施例8EMD121974增加移植腫瘤(established tumor)對TNF的抗腫瘤活性的敏感性生血管內皮細胞表達αVβ3整合蛋白并且αVβ3連接促進內皮細胞存活(Brooks等，Cell79，1157-1164(1994)；Brooks等，Science 264，569-571(1994))。據(jù)觀察EMD121974在體外可以使內皮細胞對TNF誘導的細胞凋亡敏感，這說明這種化合物能夠增強TNF的抗腫瘤活性。為驗證這個假說，我們處理帶有同基因BN175軟組織肉瘤的大鼠，同基因BN175軟組織肉瘤是一種在體外和體內抗TNF細胞毒性的高度進攻性和血管化的腫瘤(Manusama等，Oncol.Rep.6，173-177.(1999))。我們利用分離肢體灌注(ILP)技術給帶腫瘤的肢體施用TNF、EMD121974或TNF和EMD121974的組合。單獨以TNF或肽處理對腫瘤生長沒有影響。相反，聯(lián)合施用TNF和EMD121974使50％動物中的腫瘤受到完全抑制，并導致腫瘤生長的整體顯著降低(圖8)。在EMD121974/TNF處理的動物中沒有觀測到局部的和全身的毒性，這一現(xiàn)象說明EMD121974選擇性地增加腫瘤對TNF的細胞毒性的敏感性。BN175腫瘤細胞對TNF不敏感，并且不表達活性αVβ3整合蛋白(這可以通過該細胞甚至在高濃度Mn2+存在時仍缺少與纖維蛋白原的粘著和它們對αVβ3選擇性抑制劑如EMD121974的低敏感性(未發(fā)表的觀測結果)推斷)，由此我們推斷此有效的協(xié)同抗腫瘤作用最有可能涉及到腫瘤脈管系統(tǒng)的破壞。
綜合我們研究所得的體外數(shù)據(jù)，強有力的說明在此系統(tǒng)中對于調控內皮細胞的存活，整合蛋白αVβ3要比αVβ1重要。
實施例9HUVEC培養(yǎng)和電穿孔HUVEC按照以前(Ruegg等，Nature Med 4，408-414(1998))所述方法進行制備和培養(yǎng)并在第3-7代間使用。完全培養(yǎng)基是M199(LifeTechnologies，瑞士巴塞爾)、10％FCS(Seromed，德國柏林)、12μg/ml的牛腦提取物(Clonetics-Bio Whittaker，Walkersville，MD，USA)、10ng/ml人重組EGF(Peprotech，英國倫敦)、25U/ml肝素、1μg/ml氫化可的松(Sigma Chemie)、2 mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素(Life Technologies)。對于電穿孔，將HUVEC重懸浮于完全培養(yǎng)基中，然后和DNA(20μg特定質粒和5μg pEGFP-C1)一起在冰上孵育5分鐘后，利用Gene Pulser(Biorad，Glattbrugg，瑞士)進行電穿孔。經(jīng)電穿孔的HUVEC培養(yǎng)48小時之后使用。在電穿孔后40小時，約80％的細胞表達了EGFP。
實施例10球體形成HUVEC經(jīng)胰蛋白酶消化收集，以1.0×106細胞/ml的濃度重新懸浮于完全培養(yǎng)基中，并以1ml/孔接種到提前包被有1％BAS的12孔非組織培養(yǎng)板(Evergreen Scientific，Los Angeles，CA，USA)中。對于聚集作用研究，將200μl細胞懸浮液單獨或在有mAb(10μg/ml)、EDTA(5mM)或Ca2+/EDTA(10/5mM)存在下接種到包被有1％BAS的ELISA板孔(Maxisorp II，NUNC，Roskilde，Denmark)中。在6小時和16小時評價球體的形成。利用Televal 31顯微鏡(Carl Zeiss AG，Zurich，瑞士)顯微成像。
實施例11球體形態(tài)分析為進行形態(tài)學評定，將球體包埋在Epon(Fluka Chemie)中并且所得厚切片以1％Metylene/Azur藍染色。為進行免疫染色，冰凍球體切片在4％甲醛(Fluka Chemis，Buchs，Switzerland)中固定。切片用1％BSA封閉后，接著與一級mAb(20μg/ml)和Cyan3-標記的GaM抗血清(West Grove，PA，USA)一起孵育1小時。就TUNEL反應而言，冰凍球體切片在4％多聚甲醛中固定并按照(Ruegg等，上述引文)所述進行處理。球體經(jīng)碘化丙錠復染以測定總DNA含量。切片在配有CCD攝像機(Photonic Science，Milham，UK)的落射熒光顯微鏡(Axioskop，Carl Zeiss AG)上或者通過激光共聚焦顯微鏡(LSM 410，Carl Zeiss AG)進行觀察。細胞凋亡指數(shù)通過計算綠色(TUNEL染色的片斷化的DNA)和紅色(碘化丙錠染色的總DNA)象素之間的比率來確定。每一條件下分析的球體的數(shù)目是C，31；T，21；TI，12。為檢測培養(yǎng)物中的凋亡細胞，將DNA染料YoPro-1(250nM)添加到總培養(yǎng)物或收集的漂浮細胞中(Delhase，M.，Li，N.& Karin，M.炎癥應答中激酶的調節(jié)作用.Nature 406，367-368.2000))。培養(yǎng)物通過倒置熒光顯微鏡(Leica DM IRB，Heerbrugg，Switzerland)進行觀察。就電子顯微術而言，球體用100mM二甲胂酸緩沖液中的2.5％戊二醛進行固定并在1％OsO4中進行后固定處理。細胞在乙醇中脫水并包埋在Epon中。利用PhilipsCM10透射電鏡檢測超薄切片。
實施例12細胞存活和增殖就細胞存活而言，以TNFα(200ng/ml＝104U/ml)±IFNγ(330ng/ml＝104U/ml)刺激HUVEC球體(以1×106個細胞/ml鋪于1％BSA-包被的24mm非組織培養(yǎng)平板(Evergreen Scientific)孔中)或貼壁細胞(以4×105個細胞/ml鋪于3μg/ml纖連蛋白-包被的35mm非組織培養(yǎng)平板(Evergreen Scientific)孔中)。在進行刺激前1或4小時，分別按照下列濃度加入激酶抑制劑或EMD肽渥曼青霉素，100nM；LY294002，20μM；EMD肽，300μM。培養(yǎng)16小時后，細胞以5mM EDTA或1x胰蛋白酶(用于貼壁培養(yǎng))進行解離(對于球體，20℃進行5分鐘)并收獲，洗滌后以4×105細胞/ml重懸浮于完全培養(yǎng)基中，以100μl/孔等分到微量組織培養(yǎng)平板(Falcon，Becton Dickinson)的孔中并以1∶2階(step)一式三份進行滴定。48小時后相對細胞數(shù)通過測量在培養(yǎng)的最后4個小時期間的MTT轉化來估計。結果以540nm下的O.D.值(Packard Spectra Count，Meriden，CT，USA)給出，表示為三個重復孔的平均值±s.d。
實施例13細胞脫附實驗Maxisorp II ELISA板用1μg/孔的纖連蛋白或0.5％明膠在PBS中4℃下包被過夜。洗滌包被的孔并用1％BSA在37℃處理2小時進行封閉，之后在使用之前再進行洗滌。以2×104細胞/孔加入不含F(xiàn)CS的基礎培養(yǎng)基中并通過離心(40xg)短暫沉淀。細胞在37℃保持2小時進行貼壁，然后加入梯度濃度的肽。2小時后，用溫熱的PBS洗滌板孔，貼壁細胞在2％多聚甲醛中固定，用0.5％結晶紫(Sigma Chemie)染色并通過620nm下的O.D.讀數(shù)進行定量(Packard Spectra Count)。結果以O.D.值給出，表示為特異性粘附(＝在ECM蛋白上的粘附減去在BSA上的粘附)的一式兩份重復孔的平均值±s.d.。
實施例14流式細胞計HUVEC和EGFP表達的間接免疫染色按照如下所述的標準步驟(Ruegg等，上述引文)進行。死細胞通過碘化丙錠染色排除。所有樣品都用FACScan II和Cell Quest軟件(Becton Dickinson，Mountain ViewCA，USA)進行分析。
實施例15電泳遷移率變動分析(EMSA)
按照(Cai等，J Biol Chem 272，96-101.(1997))所述方法制備HUVEV(每種條件各1×106個細胞)的核提取物并與合成的末端利用T4激酶以[γ-32 P]ATP標記的、含有人HIV長末端重復的κB序列的雙鏈31聚體寡核苷酸一起孵育。NF-1κB與32P-標記的寡核苷酸的結合通過PAGE和放射自顯影進行測定。
實施例16蛋白質印跡法50μl細胞裂解物上清液(1×106，于250μl的2×Laemmli緩沖液中)用7.5％-12.5％SDS-PAGE解析并利用濕法轉印(Bio Rad)轉移到Immobilon-P膜(Millipore，Volketswil，Switzerland)上。接著將膜在5％奶粉中孵育1小時，在4℃下與一級抗體一起孵育過夜，然后與HRP-標記的GaM(Dako，Zug，Switzerland)一起孵育1小時。利用ECL系統(tǒng)(Amersham-Pharmacia Biotech)進行檢測。為進行再次探測，膜在50℃下在2％SDS，50mM Tris和100mM BME中處理30分鐘進行探針剝離。
權利要求
1.藥物組合物，其包含治療有效量的至少(i)一種抗血管生成劑和(ii)腫瘤壞死因子α(TNFα)或具有TNFα生物活性的分子，及任選地藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述抗血管生成劑是整合蛋白(受體)抑制劑/拮抗劑或VEGF(受體)抑制劑/拮抗劑。
3.如權利要求2所述的藥物組合物，其中所述抗血管生成劑是整合蛋白受體抑制劑/拮抗劑。
4.如權利要求3所述的藥物組合物，其中所述整合蛋白受體抑制劑/拮抗劑是含RGD的線性或環(huán)狀肽。
5.如權利要求4所述的藥物組合物，其中所述含RGD的肽是環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)。
6.如權利要求1或2所述的藥物組合物，其中所述抗血管生成劑是與整合蛋白受體或VEGF受體結合的抗體或抗體的免疫治療活性片段。
7.如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述抗血管生成劑和TNFα連接在一起形成一個融合分子。
8.如權利要求1-8任一項所述的藥物組合物，其還包含至少一種細胞毒性劑和/或化療劑。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其中所述細胞毒性劑是干擾素γ(IFNγ)。
10.如權利要求9所述的藥物組合物，其中所述化療劑選自順氯氨鉑、阿霉素、吉西他濱、多烯紫杉醇、紫杉醇、博來霉素。
11.如權利要求1-8任一項所述的藥物組合物，其還包含ErbB受體酪氨酸激酶家族的抑制劑。
12.如權利要求11所述的藥物組合物，其中所述的抑制劑是抗EGFR抗體、抗HER2抗體或抗體的免疫治療活性片斷。
13.藥物試劑盒，其包含這樣的包裝，該包裝含有(i)至少一種抗血管生成劑、(ii)TNFα或具有TNFα生物活性的分子以及任選地(iii)別的細胞毒性劑和/或化療劑。
14.如權利要求13所述的藥物試劑盒，其包含(i)整合蛋白受體抑制劑/拮抗劑，(ii)TNFα，(iii)IFNγ。
15.如權利要求14所述的藥物試劑盒，其包含(i)環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)，(ii)TNFα，(iii)IFNγ。
16.如權利要求13-15任一項所述的藥物試劑盒，其中所述藥物活性劑在所述包裝中各于分開的容器內提供。
17.權利要求1-12任一項所述的藥物組合物或權利要求13-16任一項所述的藥物試劑盒在制備用于治療腫瘤和腫瘤轉移的藥物或藥物組合物中的用途。
18.治療個體的腫瘤或腫瘤轉移的方法，其包括同時或相繼地給所述個體施用治療有效量的(i)抗血管生成劑和(ii)TNFα。
19.如權利要求18所述的方法，其包括還給所述個體施用治療有效量的細胞毒性劑和/或化療劑。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述細胞毒性劑是IFNγ。
21.如權利要求19所述的方法，其中所述化療劑選自順氯氨鉑、阿霉素、吉西他濱、多烯紫杉醇、紫杉醇、博來霉素。
22.如權利要求18-21任一項所述的方法，其包括同時或相繼地給所述個體施用治療有效量的(i)環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)、(ii)TNFα和(iii)IFNγ。
23.如權利要求18所述的方法，其包括還給所述個體施用治療有效量的ErbB受體酪氨酸激酶家族的抑制劑。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述抑制劑是抗EGFR抗體、抗HER2抗體或抗體的免疫治療活性片斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于腫瘤轉移治療的聯(lián)合療法，包括施用抗血管生成劑和腫瘤壞死因子α(TNFα)及任選地其它細胞毒性劑如干擾素γ(IFNγ)或化療劑如抗EGFR抗體。本方法和含有所述藥劑的藥物組合物可協(xié)同地加強各單個治療劑對腫瘤細胞增殖的抑制效果，得到比單組份單獨使用時更有效的治療效果。
文檔編號A61K45/06GK1505527SQ02808876
公開日2004年6月16日 申請日期2002年4月18日 優(yōu)先權日2001年4月24日
發(fā)明者M·格雷爾, S·戈德曼, C·魯格, M 格雷爾, 侶 申請人:默克專利有限公司