專(zhuān)利名稱(chēng)：疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和治療視網(wǎng)膜變性疾病的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及對(duì)視錐變性進(jìn)行防護(hù)的蛋白質(zhì)、編碼這種蛋白質(zhì)的核酸分子、識(shí)別這種蛋白質(zhì)的抗體以及診斷視網(wǎng)膜變性疾病的方法。
背景技術(shù)：
光感受器是視網(wǎng)膜神經(jīng)元的特化亞類(lèi)，其與視覺(jué)相關(guān)。光感受器由視桿和視錐組成，它們是視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞。每一視桿和視錐精巧地形成一個(gè)特化的睫，稱(chēng)作外節(jié)，其容納了光傳導(dǎo)機(jī)器。視桿含有特殊的吸收光的視色素——視紫質(zhì)。在人類(lèi)中有三種類(lèi)型的視錐，其由不同的視色素的表達(dá)來(lái)表征藍(lán)視錐、綠視錐和紅視錐色素。每一類(lèi)型的視色素蛋白質(zhì)調(diào)整以最大程度吸收不同波長(zhǎng)的光。視桿視紫質(zhì)介導(dǎo)暗視覺(jué)(在微光下)，而視錐色素負(fù)責(zé)明視覺(jué)(在亮光下)。在人類(lèi)中紅、藍(lán)和綠色素也形成顏色視覺(jué)的基礎(chǔ)。視桿和視錐中的視色素對(duì)光產(chǎn)生反應(yīng)并在輸出細(xì)胞(視桿雙極神經(jīng)元)中產(chǎn)生動(dòng)作電位，其后被視網(wǎng)膜節(jié)神經(jīng)元中繼傳播并在視皮質(zhì)中產(chǎn)生視覺(jué)刺激。
在人類(lèi)中，多種視網(wǎng)膜疾病涉及光感受器的進(jìn)行性變性以及最終的死亡，因而無(wú)情地導(dǎo)致失明。光感受器變性都是以光感受器外節(jié)的進(jìn)行性萎縮和功能喪失為特征的，所上述光感受器變性可以例如由遺傳性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良(例如色素性視網(wǎng)膜炎)、年齡相關(guān)的黃斑變性和其它黃斑病變或者視網(wǎng)膜脫離等等引起。另外，光感受器的死亡或者光感受器的功能喪失還會(huì)導(dǎo)致二級(jí)視網(wǎng)膜神經(jīng)元(視桿雙極細(xì)胞和水平細(xì)胞)出現(xiàn)部分傳入神經(jīng)阻滯，因此使光感受器產(chǎn)生的電信號(hào)傳播的整體效率下降。光感受器變性后繼發(fā)的神經(jīng)膠質(zhì)和色素上皮的改變將引起導(dǎo)致缺血和神經(jīng)膠質(zhì)增生的血管變化。能夠挽救光感受器使其免于細(xì)胞死亡和/或能夠恢復(fù)功能異常(萎縮或營(yíng)養(yǎng)不良)光感受器的功能的營(yíng)養(yǎng)因子可能是治療這些病癥的有用治療方法。
這些病癥的惡化是指兩種類(lèi)型光感受器的相繼喪失最初是視桿作為遺傳或環(huán)境或未知損傷的直接后果而喪失，導(dǎo)致夜盲和視野減小，之后不可避免的發(fā)生視錐喪失從而導(dǎo)致完全的失明。因此，視錐是間接死亡，因?yàn)樗鼈儾⒉槐憩F(xiàn)原發(fā)病變。
并不是所有與視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的基因都已經(jīng)被鑒定。這些基因的鑒定將使該疾病的診斷和有效療法的確立成為可能。
發(fā)明概述本發(fā)明總得來(lái)說(shuō)涉及新的基因家族——視桿來(lái)源的視錐生存因子(Rod-derived Cone Viability Factor，Rdcvf)。第一方面，本發(fā)明提供分離的多肽，其具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中所示氨基酸序列。這種多肽或其片斷在患視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的患者眼中的含量比在沒(méi)有患視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體眼中的含量大大減少。具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的分離的多肽的片斷包括下述多肽，其含有約5到10個(gè)氨基酸，優(yōu)選約10到約20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選約20到約100個(gè)氨基酸，并且最優(yōu)選約20到約50個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了哺乳動(dòng)物來(lái)源、并且特別是小鼠或人來(lái)源的新的多肽，以及該多肽在生物學(xué)、診斷學(xué)或治療學(xué)上有用的片斷、變體和衍生物及片斷的變體和衍生物以及前述的類(lèi)似物。與具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的多肽基本相似的多肽也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，例如SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14中所示的氨基酸序列。
第二方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO1或SEQID NO3所示核苷酸序列。與具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3核苷酸序列的核酸基本相似的核酸也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，例如SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13中所示的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其編碼的多肽選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14中所示的多肽，該分離的核酸分子為例如SEQ ID NO1的45-374位核苷酸、SEQ ID NO3的26-676位核苷酸、SEQ ID NO5的24-353位核苷酸、SEQ ID NO7的48-686位核苷酸、SEQ ID NO9的265-570位核苷酸、SEQ ID NO11的300-770位核苷酸或者SEQ ID NO13的331-738位核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的DNA為包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示DNA的載體分子的形式。
第三方面，本發(fā)明包括人視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的診斷方法，所述方法包括在哺乳動(dòng)物生物體(優(yōu)選人)的眼中檢測(cè)從Rdcvf1或Rdcvf2編碼DNA轉(zhuǎn)錄的信使RNA的轉(zhuǎn)錄水平的下降，其中這種轉(zhuǎn)錄水平的下降可用于診斷生物體患有視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良或病理學(xué)老化(ARMD)。本發(fā)明此檢測(cè)方面的另一實(shí)施方案提供哺乳動(dòng)物生物體(優(yōu)選人)中視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的診斷方法，所述方法需要測(cè)量懷疑患有視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的人眼中Rdcvf1或Rdcvf2多肽或者其片斷的量，其中通過(guò)與未患視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體眼中的此多肽或其片斷的量相比所述測(cè)量到的多肽或其片斷的量的減少可以用于診斷該人患有視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供調(diào)節(jié)Rdcvf1或Rdcvf2基因轉(zhuǎn)錄的反義多核苷酸；在另一實(shí)施方案中，提供可以調(diào)節(jié)Rdcvf1或Rdcvf2基因轉(zhuǎn)錄的雙鏈RNA。
本發(fā)明另一方面提供用于生產(chǎn)前述多肽、多肽片斷、變體和衍生物、變體和衍生物的片斷以及它們的類(lèi)似物的方法。在本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供生產(chǎn)前述Rdcvf1多肽的方法，所述方法包括將其中導(dǎo)入了包含外源Rdcf1或Rdcf2編碼多核苷酸的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞在足以使宿主表達(dá)Rdcvf1或Rdcvf2多肽的條件下培養(yǎng)，并隨后回收表達(dá)的多肽。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供將前述多肽和多核苷酸用于研究、生物學(xué)、臨床和治療目的的產(chǎn)品、組合物、工藝和方法。
在本發(fā)明某些另外的優(yōu)選方面，提供抗體或其片斷，所述抗體或其片斷特異結(jié)合含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ IDNO8(即Rdcvf1)或者SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14(即Rdcvf2)所示氨基酸序列的多肽。在這一點(diǎn)的某些特別優(yōu)選的方面，抗體對(duì)哺乳動(dòng)物(優(yōu)選小鼠，并且特別是人)Rdcvf1或Rdcvf2多肽或這些Rdcvf1或Rdcvf2多肽的部分具有高度選擇性。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供抗體或其片斷，所述抗體或其片斷可以與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ IDNO14所示氨基酸序列的片斷或部分結(jié)合。
在另一方面，本發(fā)明提供通過(guò)向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康腞DCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)或其相關(guān)蛋白質(zhì)或其片斷或部分而治療對(duì)象所患疾病的方法，其中所述疾病由眼中Rdcvf1或Rdcvf2基因表達(dá)的改變(例如RDCVF1或RDCVF2多肽的減少)介導(dǎo)或者與其相關(guān)，且所述RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)為SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14所示蛋白質(zhì)。本發(fā)明也提供在對(duì)象中與Rdcvf1或Rdcvf2基因表達(dá)減少或RDCVF1或RDCVF2多肽存在量減少相關(guān)的疾病或病癥的診斷方法，所述方法包括在免疫測(cè)定中使用與如下多肽或其片斷或部分相結(jié)合的抗體，所述多肽具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供可在體外增殖的細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動(dòng)物細(xì)胞。所述細(xì)胞在培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)可以產(chǎn)生含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14氨基酸序列的多肽或其片斷，其中所述細(xì)胞含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA序列，其中此轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列不是小鼠或人的Rdcvf1或Rdcvf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列且其控制如下DNA的轉(zhuǎn)錄，所述DNA編碼具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ IDNO14中所示氨基酸序列的多肽或其片段。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)Rdcvf1或Rdcvf2多肽的方法，所述方法包括將其中導(dǎo)入了包含外源Rdcvf1或Rdcvf2編碼多核苷酸的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞在足于使該宿主細(xì)胞表達(dá)Rdcvf1或Rdcvf2多肽的條件下培養(yǎng)，由此產(chǎn)生表達(dá)的多肽，并回收此表達(dá)的多肽。
另一方面，本發(fā)明提供測(cè)定方法和試劑盒，其包括檢測(cè)來(lái)自患者的機(jī)體組織樣本中Rdcvf1或Rdcvf2多核苷酸或多肽或其片斷的反常表達(dá)(如低于正常的表達(dá))所必需的成分，這些試劑盒包括例如可以結(jié)合Rdcvf1或Rdcvf2的抗體或者可以與本發(fā)明多核苷酸雜交的寡核苷酸探針。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些試劑盒也包括用于詳述試劑盒成分的使用方法的說(shuō)明書(shū)。
另一方面，本發(fā)明涉及在治療人或動(dòng)物時(shí)Rdcvf1或Rdcvf2多肽的使用。其相關(guān)方面涉及在制備用于治療視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的藥物中Rdcvf1或Rdcvf2多肽或其片斷、編碼Rdcvf1或Rdcvf2或其片斷的核苷酸或者結(jié)合Rdcvf1或Rdcvf2或其片斷的抗體的用途。
另一方面，本發(fā)明提供視網(wǎng)膜保護(hù)劑，其含有選自SEQ ID NO2、SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14的多肽以及任選地可藥用載體。其相關(guān)方面，本發(fā)明提供治療視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的藥物組合物，其含有Rdcvf1或Rdcvf2多肽或其片斷、編碼Rdcvf1或Rdcvf2或其片斷的核苷酸。在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其含有治療有效量的選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14的多肽以及可藥用載體。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供治療視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，所述方法包括對(duì)有需要的對(duì)象施用治療有效量的選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14的多肽以及可藥用載體。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定下述分子的方法，所述分子可以結(jié)合至Rdcvf1或Rdcvf2和/或可以調(diào)節(jié)Rdcvf1或Rdcvf2的活性，或者其可以結(jié)合能調(diào)節(jié)Rdcvf1或Rdcvf2轉(zhuǎn)錄或翻譯的核酸序列。這些方法在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,541,070、5,567,317、5,593,853、5,670,326、5,679,582、5,856,083、5,858,657、5,866,341、5,876,946、5,989,814、6,010,861、6,020,141、6,030,779和6,043,024中公開(kāi)，所有上述專(zhuān)利特此全部引用作為參考。利用這些方法鑒定的分子也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明涉及向需要治療的對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)組織中導(dǎo)入本發(fā)明核酸、并導(dǎo)致該組織中的細(xì)胞表達(dá)和/或分泌所述核酸所編碼的一種或多種蛋白質(zhì)的方法。
另一方面，本發(fā)明涉及提供用于移植的光感受器細(xì)胞的方法，其中光感受器細(xì)胞與RdCVF1或RdCVF2一起培養(yǎng)。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的其它目的、特征、優(yōu)勢(shì)和方面將隨著以下描述而變得明顯。然而應(yīng)當(dāng)理解，下列描述和特定實(shí)例雖說(shuō)明了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，然其僅僅用于舉例闡釋目的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，經(jīng)過(guò)閱讀下列描述和本發(fā)明公開(kāi)的其它部分可以容易地在本發(fā)明精神和范圍之內(nèi)作出多種改變和修改。
附圖簡(jiǎn)述

圖1來(lái)自表達(dá)克隆的小鼠Rdcvf1核苷酸序列和小鼠RdCVF1氨基酸序列。
圖2小鼠Rdcvf1L核苷酸序列和氨基酸序列。
圖3人Rdcvf1和人Rdcvf1氨基酸序列。
圖4人Rdcvf1L核苷酸序列及人Rdcvf1L氨基酸序列。
圖5小鼠Rdcvf2核苷酸序列和小鼠Rdcvf2氨基酸序列。
圖6小鼠Rdcvf2L核苷酸序列和小鼠Rdcvf2L氨基酸序列。
圖7人Rdcvf2核苷酸序列和人Rdcvf2氨基酸序列。
圖8描繪Rdcvf的短形式(SEQ ID No 2、6、10和14)的氨基酸比對(duì)和Rdcvf的長(zhǎng)形式(SEQ ID No 4、8、12和14)的氨基酸比對(duì)。
圖9描繪用于GST-Rdcvf1的引物。
圖10RDCVF1/RDCVF2的多比對(duì)。
圖11小鼠和人RDCVF2的比較。
圖12小鼠Rdcvf2與EST克隆be552141、bi517442、bg707818和bi603812的多比對(duì)。
圖13Rdcvf1與EST克隆bg299078、ai716631、bg294111、be108041和bg395178的多比對(duì)。
圖14修正以匹配Rdcvf1的EST序列bg299078。
圖15修正以匹配Rdcvf1L的EST序列bg294111。
圖16對(duì)5周齡C57BL/6@N(綠)和C3H/HE@N(紅)視網(wǎng)膜中視桿抑制蛋白(A)和RdCSF1(B)表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析。
圖17RT-PCR分析，其顯示Rdcvf2以視桿依賴(lài)性方式表達(dá)以及在CNS的其它部分中表達(dá)。
圖18顯示RdCVF1以視桿依賴(lài)性方式表達(dá)的PCR分析。
發(fā)明詳述于此引用的所有專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和參考文獻(xiàn)特此全部引用作為參考。
在本發(fā)明的實(shí)施中，使用許多分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)為人所公知，并且闡釋在例如最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(Current Protocols in Molecular Biology)，卷I、II、III，1997(F.M.Ausubel主編)；Sambrook等人，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MloecularCloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；DNA克隆實(shí)用方法(DNA CloningApractical Approach)，卷I、II，1985(D.N.Glover主編)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，1984(M.L.Gait主編)；核酸雜交(Nucleic acid Hybridization)，1985(Hames和Higgins)；轉(zhuǎn)錄與翻譯(Transcription and Translation)，1984(Hames和Higgins主編)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)，1986(R.I.Freshney主編)；固定化細(xì)胞與酶(Immobilized Cells and Enzymes)，1986(IRL出版社)；Perbal，1984，分子克隆實(shí)用指南(A Practical Guide toMolecular cloning)；酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)系列(學(xué)院出版公司；哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for MammalianCells)，1987(J.H.Miller和M.P.Calos主編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)；以及酶學(xué)方法154卷和155卷(分別由Wu和Grossman，和Wu主編)。
于此使用的“差異表達(dá)基因”是指(a)含有至少一個(gè)于此公開(kāi)的DNA序列(例如，圖1和SEQ ID NO1所示，或圖2和SEQ ID NO3所示序列)的基因；(b)任何編碼如下氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列由此處公開(kāi)的DNA序列所編碼(例如，圖1和SEQ ID NO2所示，或圖2和SEQ ID NO4所示序列)；或(c)任何與于此公開(kāi)的編碼序列基本相似的DNA序列。
廣義而言，于此使用的與核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“基本相似”是指與參考核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，其中此相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列編碼的多肽具有與參考核苷酸序列所編碼的多肽基本相同的結(jié)構(gòu)和功能，例如其中僅僅發(fā)生不影響多肽功能的氨基酸改變。優(yōu)選基本相似的核苷酸序列編碼由參考核苷酸序列所編碼的多肽?；鞠嗨频暮塑账嵝蛄信c參考核苷酸序列之間的同一性百分比優(yōu)選至少為90％，更優(yōu)選至少為95％，并且更優(yōu)選至少為99％。序列比較利用Smith-Waterman序列比對(duì)算法進(jìn)行(參見(jiàn)例如Waterman，M.S.計(jì)算生物學(xué)導(dǎo)論圖譜、序列和基因組(Introductionto Computational BiologyMaps，sepuences and genomes)。Chapman & Hall倫敦1995.ISBN 0-412-99391-0，或http//www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)?？梢允褂胠ocalS程序(1.16版)及如下參數(shù)匹配1，錯(cuò)配罰分0.33，空位(open)-開(kāi)放罰分2，空位延伸罰分2。與參考核苷酸序列“基本相似”的核苷酸序列可以在如下條件下與參考核苷酸序列發(fā)生雜交在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA及50℃下雜交并在2×SSC、0.1％SDS及50℃下洗滌，更有利地在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA及50℃下雜交并在1×SSC、0.1％SDS及50℃下洗滌，再更有利地在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA及50℃下雜交并在0.5×SSC、0.1％SDS及50℃下洗滌，優(yōu)選在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA及50℃下雜交并在0.1×SSC、0.1％SDS及50℃下洗滌，更優(yōu)選在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA及50℃下雜交并在0.1×SSC、0.1％SDS及65℃下洗滌，而且該核苷酸依舊編碼功能等價(jià)的基因產(chǎn)物。
于此公開(kāi)的差異表達(dá)基因在眼組織中表達(dá)，并且特別在視桿細(xì)胞中產(chǎn)生，但是在患有視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良，例如色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)黃斑變性、巴比綜合征、巴科綜合征、貝斯特病、脈絡(luò)膜瘤(choroidema)、螺旋狀萎縮、先天性黑矇、雷夫敘姆綜合征、青年遺傳性黃斑變性和厄舍綜合征的患者中，與沒(méi)有患視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的人的相應(yīng)組織相比，這些基因在患者組織中產(chǎn)生的量減少，即以較小程度產(chǎn)生。存在于視桿組織中或與這些組織相關(guān)的從差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA和從這種mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的量與沒(méi)有患視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的人的相應(yīng)組織中的mRNA和蛋白質(zhì)的量相比，至少減少約一半，優(yōu)選至少減少約5倍，更優(yōu)選至少減少約10倍，最優(yōu)選至少減少約100倍。這種Rdcvf1或Rdcvf2 mRNA轉(zhuǎn)錄的減少于此被稱(chēng)為“下降的轉(zhuǎn)錄”。
于此使用的“宿主細(xì)胞”是指含有異源DNA的原核或真核細(xì)胞，上述異源DNA可以是通過(guò)任何方法導(dǎo)入所述細(xì)胞的，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、顯微注射、轉(zhuǎn)化、病毒侵染等等。
于此使用的“異源”是指“不同的天然來(lái)源”或是指非天然狀態(tài)。例如，如果利用來(lái)自另一生物體(特別是另一種類(lèi))的DNA或基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，則與宿主細(xì)胞以及攜帶此基因的宿主細(xì)胞的后代相對(duì)而言，這一基因就是異源基因。同樣，異源也指來(lái)自并插入相同天然、原初細(xì)胞類(lèi)型的核苷酸序列，但該序列處于非天然狀態(tài)，例如不同的拷貝數(shù)或者在不同的調(diào)控元件的控制之下。
載體分子為其中可以插入異源核酸并且隨后可以被導(dǎo)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的核酸分子。載體優(yōu)選具有一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，并且具有一個(gè)或多個(gè)重組DNA插入位點(diǎn)。載體常具有可以將攜帶載體的細(xì)胞從那些不攜帶該載體的細(xì)胞中篩選出來(lái)的便利手段，例如它們可以編碼藥物抗性基因。常用載體包括質(zhì)粒、病毒基因組以及(主要在酵母和細(xì)菌中的)“人工染色體”。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)命名習(xí)慣，本文中“質(zhì)?！钡拿ǔＪ且孕?xiě)p開(kāi)頭，并且/或者緊跟著大寫(xiě)字母和/或數(shù)字。于此公開(kāi)的起始質(zhì)?；蚩缮虡I(yè)得到或可不受限制地被公眾得到，或可以通過(guò)常規(guī)應(yīng)用公知的發(fā)表方法從可得的質(zhì)粒構(gòu)建產(chǎn)生?？梢杂糜诒景l(fā)明的多種質(zhì)粒和其它克隆及表達(dá)載體為人所公知，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可容易得到。而且，技術(shù)人員可以容易地構(gòu)建適合本發(fā)明使用的任意數(shù)目的其它質(zhì)粒。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，從本公開(kāi)可以容易地明了在本發(fā)明中這些質(zhì)粒及其它載體的特性、構(gòu)建和使用。
術(shù)語(yǔ)“分離”是指將材料從其原初環(huán)境(例如天然環(huán)境，如果它是天然的話(huà))中移出。例如，存在于活的動(dòng)物體內(nèi)的天然多核苷酸或多肽不是分離的，但是從天然系統(tǒng)中共存的一些或所有材料中分離出來(lái)的相同的多核苷酸或多肽就是分離的，即使將其隨后重新導(dǎo)入此天然系統(tǒng)。這些多核苷酸可以是載體的一部分和/或這些多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且仍舊是分離的，因?yàn)檫@種載體或組合物并不是天然環(huán)境的一部分。
于此使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”是指DNA序列，其可以誘導(dǎo)、阻抑或者調(diào)控與它們可操縱相連的蛋白質(zhì)編碼核酸序列的轉(zhuǎn)錄，例如起始序列、增強(qiáng)子序列和啟動(dòng)子序列。
與此使用的“Rdcvf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”或“Rdcvf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”為任何一種通常所發(fā)現(xiàn)的與哺乳動(dòng)物Rdcvf1或Rdcvf2基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，優(yōu)選在小鼠或人基因組中發(fā)現(xiàn)的與Rdcvf2基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
于此使用的“非人轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”是指任何不存在于人基因組中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
術(shù)語(yǔ)“多肽”于此可與術(shù)語(yǔ)“多肽(多個(gè))”和“蛋白質(zhì)(一個(gè)或多個(gè))”互換使用。
于此使用的本發(fā)明多肽的“化學(xué)衍生物”是指含有非分子正常部分的額外化學(xué)部分的本發(fā)明多肽。這些部分可以改進(jìn)分子的溶解性、吸收率、生物學(xué)半衰期等等?；蛘哌@些部分可以降低分子的毒性、消除或削弱分子的任何不為人所期望的副作用等等?？山閷?dǎo)這些效應(yīng)的部分公開(kāi)在例如Remington’s藥物科學(xué)(Remington’s Pharmaceution Sciences)，第16版，Mack出版公司，Easton，賓夕法尼亞(1980)。
于此使用的“神經(jīng)保護(hù)劑”是指阻止或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞使其不發(fā)生變性的化合物?！耙暰W(wǎng)膜保護(hù)劑”是指阻止或保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞使其不發(fā)生變性的化合物。
本發(fā)明包括核酸分子，優(yōu)選DNA分子，例如(1)含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示核苷酸序列的分離的核酸分子；(2)含有在高嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示分離的DNA雜交的核酸序列的分離的核酸分子；和(3)與上述(1)或(2)雜交的核酸序列。這些雜交條件可以如上所述為高嚴(yán)緊性的或較低嚴(yán)緊性的。當(dāng)核酸分子為脫氧寡核苷酸(“寡聚體”)時(shí)，高嚴(yán)緊條件可以指例如洗滌在6×SSC/0.05％焦磷酸鈉中于37℃(對(duì)于14個(gè)堿基的寡聚體)、48℃(對(duì)于17個(gè)堿基的寡聚體)、55℃(對(duì)于20個(gè)堿基的寡聚體)和60℃(對(duì)于23個(gè)堿基的寡聚體)下進(jìn)行。對(duì)具有不同組成的核酸而言這些嚴(yán)緊條件的適當(dāng)范圍描述在Maniatis等人的文獻(xiàn)(如前所引)中，另外在Krause和Aaronson(1991)酶學(xué)方法，200546-556中也有描述。
這些核酸分子可以在例如靶基因調(diào)節(jié)中作為靶基因反義分子和/或在靶基因核酸序列擴(kuò)增反應(yīng)中作為反義引物。此外，這些序列可以作為核酶和/或三股螺旋序列的一部分使用，也用于靶基因調(diào)節(jié)。再者，這些分子可以作為診斷方法的組分使用，籍此可以檢測(cè)出RdCVF1或RdCVF2致病等位基因的存在。
本發(fā)明也包括(a)含有任何前述編碼序列(即有義)和/或它們的互補(bǔ)鏈(即反義)的載體；(b)含有與調(diào)控元件可操作相連的任何前述編碼序列的表達(dá)載體，其中所述調(diào)控元件可以指導(dǎo)該編碼序列表達(dá)；以及(c)含有任何前述編碼序列的遺傳工程構(gòu)建的宿主細(xì)胞，其中該編碼序列與可以指導(dǎo)其在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件可操作相連。于此使用的調(diào)控元件包括但并不限于誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的能夠驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)表達(dá)的元件。
本發(fā)明包括任何于此公開(kāi)的核酸序列的片斷。全長(zhǎng)Rdcvf1或Rdcvf2基因的片斷可以用作cDNA文庫(kù)的雜交探針以分離全長(zhǎng)基因和分離與Rdcvf1或Rdcvf2基因有高度序列相似性和相似生物學(xué)活性的其它基因。這一類(lèi)型的探針優(yōu)選具有至少約30個(gè)堿基，并且可以含有例如約30到約50個(gè)堿基，約50到約100個(gè)堿基，約100到約200個(gè)堿基，或者大于200(例如300)個(gè)的堿基。該探針也可以用于鑒定與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本相對(duì)應(yīng)的cDNA克隆及鑒定含有(包括調(diào)節(jié)區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子在內(nèi)的)完整Rdcvf1或Rdcvf2基因的基因組克隆(一個(gè)或多個(gè))。一個(gè)篩選的例子包括分離Rdcvf1或Rdcvf2基因的編碼區(qū)，這可以通過(guò)使用已知的DNA序列來(lái)合成寡核苷酸探針或者對(duì)公開(kāi)在圖1至8中的分離的序列進(jìn)行引物隨機(jī)引發(fā)來(lái)完成?？梢允褂镁哂斜景l(fā)明基因的互補(bǔ)序列的標(biāo)記寡核苷酸篩選人cDNA文庫(kù)、基因組DNA文庫(kù)以確定文庫(kù)中與探針雜交的單克隆。
除以上所描述的基因序列外，這些序列的直向同源序列(可能例如存在于其它物種中)可以在不需要過(guò)多試驗(yàn)的情況下，利用本領(lǐng)域公知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定并且容易地分離。此外，在基因組其它基因座位上可能存在編碼與這種基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域具有廣泛同源性的蛋白質(zhì)(同系物)的基因。這些基因也可以通過(guò)相似的技術(shù)進(jìn)行鑒定。圖8、10、11、12和13中提供了直向同源基因或同源基因的例子。
例如，分離的表達(dá)基因序列可以被標(biāo)記并用于篩選由獲得自目的生物體的mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。當(dāng)cDNA文庫(kù)所來(lái)源的生物體與標(biāo)記序列所來(lái)源的生物體不同時(shí)，雜交條件為低嚴(yán)緊條件。另外，利用適當(dāng)?shù)牡蛧?yán)緊條件，標(biāo)記片斷也可以用于篩選來(lái)自目的生物體的基因組文庫(kù)。這些低嚴(yán)緊條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且依賴(lài)于文庫(kù)和標(biāo)記序列所來(lái)源的特定生物體的系統(tǒng)發(fā)生的不同，這些低嚴(yán)緊條件可以進(jìn)行可預(yù)見(jiàn)的改變。有關(guān)這些條件的指導(dǎo)參見(jiàn)例如Sambrook等人(以上所引)。
此外，可以利用2個(gè)簡(jiǎn)并寡核苷酸引物池進(jìn)行PCR來(lái)分離先前未知的表達(dá)基因類(lèi)序列，所述引物池的設(shè)計(jì)基于目的基因內(nèi)的氨基酸序列進(jìn)行。反應(yīng)的模板可以是通過(guò)mRNA的反轉(zhuǎn)錄而獲得的cDNA，所述mRNA可以制備自已知或懷疑表達(dá)同源物或剪切變體的人或非人細(xì)胞系或組織。
將PCR產(chǎn)物亞克隆并測(cè)序以保證所擴(kuò)增序列為具有表達(dá)基因樣核酸序列的序列。隨后可以通過(guò)多種方法利用PCR片斷分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可以將擴(kuò)增片斷標(biāo)記并用于篩選噬菌體cDNA文庫(kù)。另外，標(biāo)記的片斷也可以用于篩選基因組文庫(kù)。
PCR技術(shù)也可以被利用來(lái)分離全長(zhǎng)的cDNA序列。例如，可以按照常規(guī)技術(shù)將RNA從適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織源中分離。利用對(duì)擴(kuò)增片斷最5’端特異的寡核苷酸引物來(lái)引發(fā)第一鏈合成，進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。隨后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)利用鳥(niǎo)嘌呤給產(chǎn)生的RNA/DNA雜合體“加尾”，利用RNAaseH消化雜合體，并且隨后利用多聚-C引物引發(fā)第二鏈合成。這樣，就可以很容易地分離到擴(kuò)增片斷上游的cDNA序列。所使用的克隆策略的綜述參見(jiàn)例如Sambrook等人，1989，前述引文。
當(dāng)鑒定到的差異表達(dá)基因?yàn)檎；蛞吧突驎r(shí)，這一基因可以用于分離該基因的突變等位基因。這種分離優(yōu)選在已知或懷疑具有遺傳基礎(chǔ)的生理過(guò)程和病癥中進(jìn)行。突變等位基因可以從已知或懷疑具有對(duì)疾病癥狀有作用的基因型的個(gè)體中分離。隨后突變等位基因和突變等位基因產(chǎn)物可以在下述診斷測(cè)定系統(tǒng)中使用。
突變基因的cDNA可以使用例如RT-PCR分離，所述RT-PCR是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的技術(shù)。在這種情況下，第一cDNA鏈可以通過(guò)將oligo-dT寡核苷酸(或隨機(jī)六聚體)與分離自特定組織的mRNA雜交，并通過(guò)利用反轉(zhuǎn)錄酶延伸新鏈而合成，所述特定組織已知或被懷疑在推定攜帶該突變等位基因的個(gè)體中表達(dá)此突變基因。隨后cDNA第二鏈的合成利用與正?；?’末端特異雜交的寡核苷酸(或任何其它方法)進(jìn)行。隨后利用這兩個(gè)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物，并將其克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行DNA序列分析。通過(guò)將突變基因的DNA序列與正常基因的DNA序列相比較，可以確定出對(duì)突變基因產(chǎn)物的功能丟失或改變起作用的突變。
另外，可以利用來(lái)自特定組織的DNA或RNA構(gòu)建和篩選基因組或cDNA文庫(kù)，所述特定組織是指在懷疑攜帶突變等位基因的個(gè)體中已知或被懷疑表達(dá)目的基因的組織。隨后將該正?；蚧蚱淙魏芜m當(dāng)?shù)钠瑪鄻?biāo)記并且用作探針鑒定文庫(kù)中相應(yīng)的等位基因突變體。隨后將含有這一基因的克隆通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)步驟純化，并進(jìn)行如上所述的序列分析。
另外，利用分離自特定組織的DNA或合成自特定組織的cDNA可以構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)，所述特定組織是指在懷疑攜帶突變等位基因的個(gè)體中已知或被懷疑表達(dá)目的基因的組織。這樣，就可以表達(dá)由推定的突變組織產(chǎn)生的基因產(chǎn)物并利用標(biāo)準(zhǔn)抗體篩選技術(shù)聯(lián)合抗正常基因產(chǎn)物的抗體對(duì)其進(jìn)行篩選，見(jiàn)如下所述。(篩選技術(shù)參見(jiàn)例如Harlow，E.和Lane等人主編，1998，“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港。)在突變導(dǎo)致表達(dá)的基因產(chǎn)物具有改變的功能(例如由錯(cuò)義突變導(dǎo)致)的情況下，多克隆抗體群有可能與突變基因產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng)。通過(guò)與這些標(biāo)記的抗體的反應(yīng)檢測(cè)出的文庫(kù)克隆可以按如上所述被純化并進(jìn)行序列分析。
差異表達(dá)基因產(chǎn)物包括由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11或SEQ ID NO13中所示核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，且特別是這樣的多肽，該多肽就是或包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14中所示的氨基酸序列或其片斷。
另外，表達(dá)基因的產(chǎn)物可以包括本身為功能等價(jià)基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。該等價(jià)基因產(chǎn)物可以在上述差異表達(dá)基因序列所編碼的氨基酸序列內(nèi)含有導(dǎo)致沉默突變的氨基酸殘基缺失、添加或替代，由此產(chǎn)生功能等價(jià)差異表達(dá)基因產(chǎn)物(多態(tài)性)。氨基酸替代可以基于所涉及殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性特征中的相似性并且通過(guò)與其它物種來(lái)源的氨基酸序列進(jìn)行比較而實(shí)施。
例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸；以及帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此處使用的“功能等價(jià)”可以指能夠與以上所述的差異表達(dá)基因序列所編碼的內(nèi)源差異表達(dá)基因產(chǎn)物展示出基本相似的體內(nèi)或體外活性的蛋白質(zhì)或多肽?！肮δ艿葍r(jià)”也可以指能夠與內(nèi)源差異表達(dá)基因產(chǎn)物的相應(yīng)部分以相似方式和其它細(xì)胞或細(xì)胞外分子相互作用的蛋白質(zhì)或多肽。例如，“功能等價(jià)”肽在免疫測(cè)定中能夠減少抗體與內(nèi)源蛋白質(zhì)中的相應(yīng)肽(即這樣的肽，其氨基酸序列被修飾后獲得此“功能等價(jià)”肽)的結(jié)合或與內(nèi)源蛋白質(zhì)本身的結(jié)合，其中所述抗體為針對(duì)此內(nèi)源蛋白質(zhì)的相應(yīng)肽產(chǎn)生的抗體。等摩爾濃度的功能等價(jià)肽可以使相應(yīng)肽的上述結(jié)合至少減少約5％，優(yōu)選約5％到10％，更優(yōu)選約10％到25％，甚至更優(yōu)選約25％到50％，并且最優(yōu)選約40％到50％。
差異表達(dá)基因產(chǎn)物可以利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。因此，本文描述制備本發(fā)明差異表達(dá)基因的多肽和肽的方法，該方法通過(guò)表達(dá)編碼差異表達(dá)基因序列的核酸進(jìn)行。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來(lái)構(gòu)建含有表達(dá)基因蛋白質(zhì)編碼序列和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)重組/遺傳重組。參見(jiàn)，例如Sambrook等人(1989，前述引文)和Ausubel等人(1989，前述引文)中所描述的技術(shù)。另外，能夠編碼表達(dá)基因蛋白質(zhì)序列的RNA或cDNA可以利用例如合成儀化學(xué)合成。參見(jiàn)，例如“寡核苷酸合成”(Oligonucleotide Synthesis)(1984，Gait，M.J主編，IRL出版社，牛津)中所描述的技術(shù)，所述“寡核苷酸合成”特此全部引用作為參考。
本發(fā)明的差異表達(dá)基因編碼序列可以利用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。這些宿主表達(dá)系統(tǒng)不僅是運(yùn)載體也是細(xì)胞，通過(guò)此運(yùn)載體目的編碼序列可以得以產(chǎn)生并隨后被純化，而當(dāng)利用適當(dāng)?shù)暮塑账峋幋a序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞后，該細(xì)胞可以在原位表達(dá)本發(fā)明的差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)。這些宿主載體系統(tǒng)包括但并不限于，用含有差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或柯斯質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物諸如細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(B.subtilis))；用含有差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如釀酒酵母屬(Saccharomyces)，畢赤酵母屬(Pichia))；用含有差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用含有差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染的或用含有差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)編碼序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；含有重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)，該重組表達(dá)構(gòu)建體含有來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如腺病毒晚期啟動(dòng)子、痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒早期基因啟動(dòng)子)。
也可以利用其本身具有Rdcvf1或Rdcvf2基因的細(xì)胞表達(dá)RDCVF1或RDCVF2。這種表達(dá)的方法在例如美國(guó)專(zhuān)利5,641,670、5,733,761、5,968,502和5,994,127中詳述，所有這些專(zhuān)利特此全部引用作為參考。通過(guò)美國(guó)專(zhuān)利5,641,670、5,733,761、5,968,502和5,994,127中任意一項(xiàng)的方法而被誘導(dǎo)表達(dá)RDCVF1或RDCVF2的細(xì)胞可以植入活動(dòng)物的期望組織以增加該組織中RDCVF1或RDCVF2的局部濃度。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以依據(jù)所表達(dá)的差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)的預(yù)期用途，有利地選擇多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)為了生成抗體或篩選肽文庫(kù)而需要產(chǎn)生大量的這種蛋白質(zhì)時(shí)，就希望得到這樣的載體，該載體可以例如指導(dǎo)高水平地表達(dá)可方便地純化的融合蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這些載體包括但并不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等人，1983，EMBO J.21791)和pIN載體(Inouye & Inouye，1985，核酸研究(Nucleic Acids Res.)133101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2645503-5509)等等。在上述pUR278載體中，差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)編碼序列可以與lac Z編碼區(qū)以符合閱讀框的方式獨(dú)立地連接至載體中，由此產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。PGEX載體也可以用于表達(dá)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)形成融合蛋白質(zhì)形式的外源多肽。通常，這些融合蛋白質(zhì)可溶并且可以從裂解細(xì)胞中容易地純化，所述純化可以通過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖小珠的吸附，然后通過(guò)在游離谷胱甘肽存在下的洗脫而實(shí)現(xiàn)。PGEX載體設(shè)計(jì)含有凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點(diǎn)，這樣通過(guò)利用這些內(nèi)肽酶可以將克隆的靶基因蛋白質(zhì)從GST部分中釋放出來(lái)。
利用特定載體可以從任何期望的基因中選擇啟動(dòng)子區(qū)域，所述載體在用于導(dǎo)入候選啟動(dòng)子片斷(即可能含有啟動(dòng)子的片斷)的限制性位點(diǎn)的下游含有缺少啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告轉(zhuǎn)錄單位，例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(“cat”)或螢光素酶轉(zhuǎn)錄單位。眾所周知，向載體的cat或螢光素酶基因上游的限制性位點(diǎn)導(dǎo)入含有啟動(dòng)子的片斷會(huì)導(dǎo)致CAT或螢光素酶活性的產(chǎn)生，這可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的CAT試驗(yàn)或螢光計(jì)檢測(cè)。適于這一目的的載體為人所公知并可以容易地得到。三種這樣的載體是pKK232-8、pCM7和pGL3(Promega，E1751，Genebank Ass n°u47295)。因此，用于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的啟動(dòng)子不僅僅包括已知和可容易得到的啟動(dòng)子，還包括可通過(guò)上述技術(shù)利用報(bào)告基因測(cè)定法容易地獲得的啟動(dòng)子。
在已知細(xì)菌啟動(dòng)子中，適合本發(fā)明多核苷酸和多肽表達(dá)的啟動(dòng)子為大腸桿菌lacI和lacZ啟動(dòng)子、T3和T7啟動(dòng)子、T5 tac啟動(dòng)子、λPR、PL啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子。在已知真核啟動(dòng)子中，適合本方面的啟動(dòng)子為CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒(諸如Rous肉瘤病毒“RSV”)的LTR啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子(例如小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子)。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)是可以用作表達(dá)外源基因的載體的幾種昆蟲(chóng)系統(tǒng)之一。該病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中生長(zhǎng)。差異表達(dá)基因的編碼序列可以單獨(dú)克隆至病毒的非必需區(qū)域并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的調(diào)控之下。差異表達(dá)基因的編碼序列的成功插入將導(dǎo)致多角體蛋白基因失活并產(chǎn)生無(wú)包含體重組病毒(即缺少由多角體蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)外殼的病毒)。隨后將這些重組病毒用于感染草地貪夜蛾細(xì)胞，在所述細(xì)胞中該插入基因?qū)⒌靡员磉_(dá)(例如參見(jiàn)Smith等人，1983，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)46584；Smith，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,251,051)。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在使用腺病毒作為表達(dá)載體的情況中，目的差異表達(dá)基因編碼序列可以被連接至腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復(fù)合體，例如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列上。隨后可以將此嵌合基因通過(guò)體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組。在病毒基因組非必需區(qū)域(例如E1或E3區(qū))中的插入導(dǎo)致重組病毒仍可存活并且能夠在感染的宿主中表達(dá)差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)(例如參見(jiàn)Logan & Shenk，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)813655-3659)。為有效翻譯插入的差異表達(dá)基因編碼序列，也可能需要特異的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在將包括自身的起始密碼子和相鄰序列的完整的差異表達(dá)基因插入合適的表達(dá)載體中時(shí)，可以不需要額外的翻譯調(diào)控信號(hào)。然而，在僅插入差異表達(dá)基因編碼序列的一部分時(shí)，就必須提供外源翻譯調(diào)控序列，包括可能地ATG起始密碼子。此外，起始密碼子必須與所期望的編碼序列的閱讀框同相，這樣才能保證完整插入片斷的翻譯。這些外源翻譯調(diào)控信號(hào)(Kozack序列)和起始密碼子可以有多種來(lái)源，包括天然的和人工合成的。表達(dá)的效率可以通過(guò)包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等等增強(qiáng)(參見(jiàn)Bittner等人，1987，酶學(xué)方法(Methodsin Enzymol.)153516-544)。
選擇用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的合適的載體和啟動(dòng)子的方法為人所共知，并且用于表達(dá)載體構(gòu)建、向宿主中導(dǎo)入載體和在宿主中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的必需技術(shù)本身為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。
一般地，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)、指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的來(lái)自高表達(dá)基因的啟動(dòng)子和選擇標(biāo)志，該選擇標(biāo)志允許在細(xì)胞暴露于載體后分離含有載體的細(xì)胞。
另外，可以選擇宿主細(xì)胞株，以便按特定預(yù)期方式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或者修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這些修飾(如糖基化)和加工(如切割)對(duì)蛋白質(zhì)的功能而言至關(guān)重要。不同的宿主細(xì)胞具有特征性的特異機(jī)制用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工和修飾?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)來(lái)保證表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。為此，可以使用真核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞具有正確加工初級(jí)轉(zhuǎn)錄物及糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)器。這些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但并不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等等。
為達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間、高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的目的，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，可以構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。除利用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體外，可以利用由適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等等)調(diào)控并具有可選擇標(biāo)志的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外源DNA后，可以讓構(gòu)建的細(xì)胞在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1到2天，隨后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的可選擇標(biāo)志賦予了選擇抗性，并使得細(xì)胞可以將質(zhì)粒穩(wěn)定整合至其染色體上并生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)化灶，該轉(zhuǎn)化灶反過(guò)來(lái)可以被克隆并擴(kuò)大成細(xì)胞系。這一方法可以有利地用于構(gòu)建表達(dá)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。這些工程化的細(xì)胞系特別可以用于篩選和評(píng)價(jià)影響差異表達(dá)蛋白質(zhì)內(nèi)源活性的化合物。這些穩(wěn)定的細(xì)胞系可以直接或經(jīng)包囊化后作為細(xì)胞治療的方法。
可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括但不限于在tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中分別應(yīng)用的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等人，1977，細(xì)胞(Cell)11223)、次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Szybalska & Szybalski，1962，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)482026)以及腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy等人，1980，細(xì)胞(Cell)22817)。另外，也可以將抗代謝物抗性作為選擇的基礎(chǔ)，對(duì)dhfr基因而言，其賦予氨甲蝶呤抗性(Wigler等人，1980，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)773567；O′Hare等人，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，781527)；對(duì)gpt基因而言，其賦予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)782072)；對(duì)neo基因而言，其賦予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)1501)；以及對(duì)hygro基因而言，其賦予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，基因(Gene)30147)。
可供選擇的融合蛋白質(zhì)系統(tǒng)可以使在人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白質(zhì)容易地得以純化(Janknecht等人，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)888972-8976)。在該系統(tǒng)中，可以將目的基因亞克隆至痘苗重組質(zhì)粒中以使該基因的開(kāi)放閱讀框在翻譯時(shí)融合至由6個(gè)組氨酸殘基組成的氨基端標(biāo)簽上。將感染重組痘苗病毒的細(xì)胞的提取物上Ni2+氮川乙酸瓊脂糖柱并且利用含咪唑的緩沖液將帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)選擇性洗脫下來(lái)。
當(dāng)差異表達(dá)蛋白質(zhì)在諸如下述的測(cè)定系統(tǒng)中作為組分使用時(shí)，可以將差異表達(dá)蛋白質(zhì)直接或間接標(biāo)記以便于差異表達(dá)蛋白質(zhì)與測(cè)試底物間形成的復(fù)合體的檢測(cè)?？梢允褂枚喾N合適的標(biāo)記系統(tǒng)的任意一種，其包括但并不限于放射性同位素如125I；當(dāng)暴露于底物時(shí)生成可檢測(cè)熱量信號(hào)或光的酶標(biāo)記系統(tǒng)；以及熒光標(biāo)記。
當(dāng)使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生供這種測(cè)定系統(tǒng)使用的差異表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選構(gòu)建便于標(biāo)記、固定和/或檢測(cè)的融合蛋白質(zhì)。
間接標(biāo)記涉及使用可特異地與任一種差異表達(dá)基因產(chǎn)物結(jié)合的蛋白質(zhì)，諸如標(biāo)記的抗體。這些抗體包括但并不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈抗體及Fab片斷以及由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片斷。
在另一實(shí)施方案中，利用基因治療手段，通過(guò)施用含有編碼RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)或其功能衍生物的序列的核酸促進(jìn)視錐功能?；蛑委熓侵竿ㄟ^(guò)向?qū)ο笫┯煤怂醽?lái)進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中，核酸產(chǎn)生其編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過(guò)促進(jìn)視錐功能介導(dǎo)治療作用。
本領(lǐng)域可用的任意一項(xiàng)基因治療方法都可以用于本發(fā)明。以下詳細(xì)描述示例性方法。
在一個(gè)優(yōu)選方面，治療劑含有Rdcvf1或Rdcvf2核酸，該核酸為可以在適當(dāng)宿主中表達(dá)RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)或其片段或嵌合蛋白的表達(dá)載體的一部分。具體地，此核酸具有可操作地與Rdcvf1或Rdcvf2編碼區(qū)域相連的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可為誘導(dǎo)型或組成型的并且任選地具組織特異性。在另一特定實(shí)施方案中，使用下述核酸分子，在該分子中Rdcvf1或Rdcvf2編碼序列以及任何其它期望序列被可以促進(jìn)在基因組期望位點(diǎn)上發(fā)生同源重組的區(qū)域側(cè)翼包圍，由此使Rdcvf1或Rdcvf2核酸可以在染色體內(nèi)表達(dá)(Koller和Smithies，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)868932-8935；Zijlstra等人，1989，自然(Nature)342435-438)。
將核酸遞送給患者可以通過(guò)直接或間接方法，在直接方法中，患者直接暴露于該核酸或帶有該核酸的載體，在間接方法中，首先在體外用該核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后再將細(xì)胞移植入患者體內(nèi)。這兩種方法分別稱(chēng)作體內(nèi)或離體基因治療。
在特定實(shí)施方案中，核酸直接體內(nèi)施用，其在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這可以通過(guò)任意一項(xiàng)本領(lǐng)域公知的方法完成，例如可以將核酸構(gòu)建成適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)載體的一部分然后施用以使其成為細(xì)胞內(nèi)的，例如利用缺陷型或減毒型逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體(腺病毒、腺伴隨病毒和慢病毒)感染(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,980,286以及其它下文所提到專(zhuān)利)，直接注射裸DNA或利用微粒轟擊(例如基因槍、生物轟擊、Dupont)，或通過(guò)脂類(lèi)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被、包囊化于脂質(zhì)體、微?；蛭⒛抑?、或者將核酸與已知可進(jìn)入細(xì)胞核的肽相連而施用、或者將核酸與可發(fā)生受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體相連而施用(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,166,320、5,728,399、5,874,297和6,030,954，所有專(zhuān)利特此全部引用作為參考)(這可用于靶向特異性表達(dá)該受體的靶細(xì)胞類(lèi)型)，等等。在另一實(shí)施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合體，其中配體包括基因融合病毒肽以破壞內(nèi)體，使核酸避免被溶酶體降解。在另外的實(shí)施方案中，核酸通過(guò)靶向特異性受體而體內(nèi)定位從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的特異攝取和表達(dá)(參見(jiàn)例如PCT出版物WO92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316、WO 93/14188和WO 93/20221)。另外，可以將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并通過(guò)同源重組整合至宿主細(xì)胞DNA中表達(dá)(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,413,923、5,416,260和5,574,205，以及Zijlstra等人，1989，自然(Nature)342435-438)。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中使用含有Rdcvf1或Rdcvf2核酸的病毒載體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,219,740、5,604,090和5,834,182)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被修飾以缺失如下逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒序列為病毒基因組包裝和整合至宿主細(xì)胞DNA所不必需的。將基因治療中使用的Rdcvf1或Rdcvf2核酸克隆至載體，這樣便于基因向患者的遞送。
腺病毒是另一種可用于基因治療的病毒載體。腺病毒是用于向呼吸上皮遞送基因的特別有吸引力的載體。天然地，腺病毒侵染呼吸上皮，并在那里引起輕微的病癥?；谙俨《镜倪f送系統(tǒng)的其它靶位點(diǎn)有肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有能夠侵染非分裂細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)行基于腺病毒的基因治療的方法描述在例如美國(guó)專(zhuān)利5,824,544、5,868,040、5,871,722、5,880,102、5,882,877、5,885,808、5,932,210、5,981,225、5,994,106、5,994,132、5,994,134、6,001,557和6,033,8843，所有專(zhuān)利特此全部引用作為參考。
腺伴隨病毒(AAV)也被提出用于基因治療。腺伴隨病毒是用于向視網(wǎng)膜遞送基因的特別有吸引力的載體。生產(chǎn)和利用AAV的方法描述在例如美國(guó)專(zhuān)利5,173,414、5,252,479、5,552,311、5,658,785、5,763,416、5,773,289、5,843,742、5,869,040、5,942,496和5,948,675，所有專(zhuān)利特此全部引用作為參考。
另一基因治療的方法涉及利用電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染等方法來(lái)向組織培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因。通常，轉(zhuǎn)移的方法包括將可選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。隨后將細(xì)胞置于選擇壓力下以分離那些已經(jīng)吸收并且表達(dá)該轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞。隨后將這些細(xì)胞直接或經(jīng)包囊化后遞送至患者體內(nèi)。
在這種實(shí)施方案中，在將產(chǎn)生的重組細(xì)胞體內(nèi)施用之前將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中。這種導(dǎo)入可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任意一項(xiàng)方法進(jìn)行，其包括但并不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、含有該核酸序列的病毒或噬菌體載體的感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等等。將外源基因?qū)爰?xì)胞的多種技術(shù)為本領(lǐng)域公知，并且只要受體細(xì)胞必需的發(fā)育和生理學(xué)功能不會(huì)被破壞，這些技術(shù)均可以用于本發(fā)明。該技術(shù)應(yīng)該允許核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，以使該核酸可以被所述細(xì)胞表達(dá)并優(yōu)選被細(xì)胞后代遺傳和表達(dá)。
所產(chǎn)生的重組細(xì)胞可以通過(guò)多種本領(lǐng)域公知的方法遞送給患者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將上皮細(xì)胞進(jìn)行例如皮下注射。在另一實(shí)施方案中，重組皮膚細(xì)胞可以作為皮膚移植物應(yīng)用于患者。重組血細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞或祖先細(xì)胞)優(yōu)選通過(guò)靜脈施用。預(yù)計(jì)使用的細(xì)胞量依賴(lài)于預(yù)期效果、患者狀況等等，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
為實(shí)現(xiàn)基因治療而可以導(dǎo)入核酸的細(xì)胞包括任何期望的、可得到的細(xì)胞類(lèi)型，并且包括但并不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、血細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜伊紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞)、各種干細(xì)胞或祖先細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或祖先細(xì)胞，例如獲得自骨髓、臍帶血、外周血、胎肝等等的造血干細(xì)胞或祖先細(xì)胞。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于基因治療的細(xì)胞為患者的自體細(xì)胞。
在重組細(xì)胞用于基因治療的實(shí)施方案中，將Rdcvf1或Rdcvf2核酸導(dǎo)入細(xì)胞，使其在細(xì)胞或它們的后代中表達(dá)，并且隨后將重組細(xì)胞施用至體內(nèi)以獲得治療效果。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，使用干細(xì)胞或祖先細(xì)胞。任何可被分離并在體外保持的干細(xì)胞和/或祖先細(xì)胞都可潛在地用于本發(fā)明的該實(shí)施方案。這些干細(xì)胞包括但并不限于造血干細(xì)胞(HSC)、上皮組織例如皮膚和腸內(nèi)襯的干細(xì)胞、胚胎心肌細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞(參見(jiàn)例如WO94/08598)和神經(jīng)干細(xì)胞(Stemple和Anderson，1992，細(xì)胞(Cell)71973-985)。
上皮干細(xì)胞(ESC)或角質(zhì)形成細(xì)胞可以利用已知的方法獲得自例如皮膚和腸內(nèi)襯等組織(Rheinwald，1980，細(xì)胞生物學(xué)方法(Meth.Cell Bio.)21A229)。在例如皮膚等復(fù)層上皮組織中，在生發(fā)層(最靠近基底層的一層)內(nèi)通過(guò)干細(xì)胞的有絲分裂而進(jìn)行更新。腸內(nèi)襯中的干細(xì)胞使該組織保持快的更新速度。獲得自患者或捐獻(xiàn)者皮膚或腸內(nèi)襯的ESC或角質(zhì)形成細(xì)胞可以在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)(Pittelkow和Scott，1986，Mayo ClinicProc61771)。如果ESC由捐獻(xiàn)者提供，可能還要使用抑制宿主抗移植物反應(yīng)性的方法(例如放射治療、施用藥物或抗體以促進(jìn)適當(dāng)?shù)拿庖咭种?。視網(wǎng)膜干細(xì)胞(Tropepe等人，2000，科學(xué)(Science)2872032)。
至于造血干細(xì)胞(HSC)，任何可使HSC體外分離、增殖和保持的技術(shù)都可以用于本發(fā)明該實(shí)施方案?？晒├玫募夹g(shù)包括(a)從分離自未來(lái)宿主或捐獻(xiàn)者的骨髓細(xì)胞中分離和建立HSC培養(yǎng)物，或(b)使用以前建立的長(zhǎng)期HSC培養(yǎng)物(其可能是同種異體的或異種的)。非自體HSC優(yōu)選與抑制未來(lái)宿主/患者的移植免疫反應(yīng)的方法聯(lián)合使用。在本發(fā)明特定實(shí)施方案中，人骨髓細(xì)胞可以通過(guò)針刺抽吸獲自后髂嵴(參見(jiàn)例如Kodo等人，1984，J.Clin.Invest.731377-1384)。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，HSC高度富集或以基本上純的形式存在。這種富集可以在長(zhǎng)期培養(yǎng)前、培養(yǎng)過(guò)程中或長(zhǎng)期培養(yǎng)后完成，并且可以利用本領(lǐng)域任意一項(xiàng)已知技術(shù)完成。骨髓細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)物的建立和保持可以通過(guò)利用例如改良的Dexter細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(Dexter等人，1977，細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell Physiol.)91335)或者Witlock-Witte培養(yǎng)技術(shù)(Witlock和Witte，1982，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)793608-3612)實(shí)現(xiàn)。
在特定實(shí)施方案中，為進(jìn)行基因治療而導(dǎo)入的核酸包括可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地連接至編碼區(qū)域，這樣該核酸的表達(dá)可以通過(guò)控制適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在與否而實(shí)現(xiàn)操縱。
此處描述了生產(chǎn)可特異識(shí)別一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)基因表位的抗體的方法。這些抗體包括但并不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片斷、F(ab’)2片斷、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片斷、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體以及上述任何一項(xiàng)的表位結(jié)合片斷。這些抗體可以用于例如檢測(cè)指紋圖譜、靶及生物學(xué)樣品中的基因，或者，備選地，其可以作為抑制異常靶基因活性的方法。因此，這些抗體可以作為疾病治療方法的一部分使用，并且/或者可以用作診斷技術(shù)的一部分，由此可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法(參見(jiàn)Forster，RK，Abbott，RL，Gelender，H.(1980)Management of infectious endophthalmitisOphthalmology 87，3 13-319)，對(duì)房水和/或玻璃體取樣以測(cè)試患者的Rdcvf1或Rdcvf2的不正常水平或者檢測(cè)Rdcvf1或Rdcvf2不正常形式的存在。
為生產(chǎn)差異表達(dá)基因的抗體，可以通過(guò)注射差異表達(dá)蛋白質(zhì)或其部分或者通過(guò)DNA免疫方法來(lái)免疫各種宿主動(dòng)物。這些宿主動(dòng)物包括但并不限于兔、小鼠和大鼠等等。依賴(lài)于宿主種類(lèi)，多種佐劑可用于增加免疫學(xué)應(yīng)答，其包括但并不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦質(zhì)凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油性乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚以及潛在有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和小型棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗體為來(lái)自利用抗原免疫的動(dòng)物血清的異質(zhì)抗體分子群，上述抗原例如靶基因產(chǎn)物或其抗原性功能衍生物。為生產(chǎn)多克隆抗體，可以通過(guò)利用添加了上述佐劑的差異表達(dá)基因產(chǎn)物注射來(lái)免疫例如以上所述的宿主動(dòng)物。
單克隆抗體是針對(duì)特定抗原的同質(zhì)抗體群，其可以通過(guò)利用任何可允許培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但并不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，自然(Nature)256495-497；以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,376,110)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，1983，今日免疫學(xué)(Immunology Today)472；Cole等人，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)802026-2030)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985，單克隆抗體與癌癥治療(Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy)，Alan R.Liss公司，77-96)。這些抗體可以為任何免疫球蛋白種類(lèi)，包括Ig G、Ig M、Ig E、Ig A、Ig D以及它們的任何亞類(lèi)。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)產(chǎn)生高效價(jià)mAb的方法為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
另外，也可以使用生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等人，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)816851-6855；Neuberger等人，1984，自然(Nature)312604-608；Takeda等人，1985，自然(Nature)314452-454)，其通過(guò)將具適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因拼接在一起而進(jìn)行。嵌合抗體是其中不同的部分來(lái)自不同的動(dòng)物種類(lèi)的分子，例如那些具有來(lái)自小鼠mAb的可變或高變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。
備選地，可以采用產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778；Bird，1988，科學(xué)(Science)242423-426；Huston等人，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)855879-5883；以及Ward等人，1989，自然(Nature)334544-546)來(lái)生產(chǎn)差異表達(dá)基因的單鏈抗體。單鏈抗體可通過(guò)使Fv區(qū)域的重鏈和輕鏈片斷借助氨基酸橋相連產(chǎn)生單鏈多肽而形成。
最優(yōu)選地，采用用于生產(chǎn)“人源化抗體”的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)于此公開(kāi)的多肽、片斷、衍生物和功能等價(jià)物的抗體。這些技術(shù)公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,932,488、5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101、5,910,771、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,545,580、5,661,016和5,770,429中，所有這些公開(kāi)特此全部引用于此作為參考。
識(shí)別特異表位的抗體片斷可以通過(guò)公知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，這些片斷包括但并不限于通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片斷和通過(guò)還原F(ab’)2片斷的二硫鍵而生成的Fab片斷。另外，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等人，1989，科學(xué)(Science)，2461275-1281)以進(jìn)行具有期望特異性的單克隆Fab片斷的快速而容易的鑒定。
為便于檢測(cè)，特別優(yōu)選使用三明治測(cè)定法，該測(cè)定法存在多種變異方式。所有方式均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
例如，在一般的正向測(cè)定中，將未標(biāo)記抗體固定于固體基質(zhì)上，并將測(cè)試樣品與結(jié)合的分子接觸。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間，該時(shí)間將足夠抗體抗原二元復(fù)合體形成。這時(shí)，再加入用能夠誘導(dǎo)可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告分子標(biāo)記的第二抗體并孵育，孵育時(shí)間應(yīng)足夠抗體-抗原-標(biāo)記抗體三元復(fù)合體的形成。將任何未反應(yīng)物質(zhì)洗去，并通過(guò)觀察信號(hào)確定抗原的存在或者通過(guò)與含有已知量抗原的對(duì)照樣品比較來(lái)定量。正向測(cè)定的變異方式包括同時(shí)測(cè)定和反向測(cè)定，其中在同時(shí)測(cè)定中樣品和抗體同時(shí)加至結(jié)合的抗體中；而在反向測(cè)定中標(biāo)記的抗體與待測(cè)試樣品首先混合、孵育然后加至未標(biāo)記的表面結(jié)合抗體中。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且顯而易見(jiàn)可以進(jìn)行小的改動(dòng)。于此使用的“三明治測(cè)定法”意味著包括基于此基本的兩位點(diǎn)技術(shù)的所有變異方案。對(duì)本發(fā)明的免疫測(cè)定而言，僅有的限制因素是未標(biāo)記和標(biāo)記的抗體應(yīng)為RdCVF1或RdCVF2特異性抗體。
在這種測(cè)定中最常使用的報(bào)告分子為酶或者含熒光團(tuán)或放射性核素的分子。在酶免疫測(cè)定的案例中，將酶偶聯(lián)至第二抗體，這通常通過(guò)戊二醛或過(guò)碘酸實(shí)現(xiàn)。然而，正如易于意識(shí)到的，存在相當(dāng)大量不同的連接技術(shù)，它們?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知。通常使用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等等。對(duì)于與特定酶一起使用的底物，一般選擇在相應(yīng)酶的水解作用后可以產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色改變的底物。例如對(duì)硝基苯磷酸適合與堿性磷酸酶綴合物一起使用；對(duì)過(guò)氧化物酶綴合物而言，通常使用1，2-苯二胺或甲苯胺。也可以使用熒光底物，其生成熒光產(chǎn)物而不是上文提及的生色底物。然后將含有適當(dāng)?shù)孜锏娜芤杭又量贵w-RdCVF1-或RdCVF2-標(biāo)記抗體三元復(fù)合體中。底物與連接至第二抗體的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可見(jiàn)信號(hào)，該信號(hào)可以進(jìn)一步通過(guò)通常地分光光度計(jì)定量以評(píng)價(jià)血清樣品中Rdcvf1或Rdcvf2的存在量。
備選地，可以將熒光化合物(例如熒光素和羅丹明)在不改變抗體的結(jié)合能力的條件下化學(xué)偶聯(lián)至抗體。當(dāng)利用特定波長(zhǎng)的光照射激活后，熒光色素標(biāo)記的抗體吸收光能，誘導(dǎo)分子進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，并隨后發(fā)射出特征長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。該發(fā)射光在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)為可觀測(cè)的特征顏色。免疫熒光和EIA技術(shù)在本領(lǐng)域均是極為成熟的技術(shù)并且為本方法所特別優(yōu)選。然而，本發(fā)明也可以使用其它報(bào)告分子，例如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，如何改變方法以適應(yīng)所需用途是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明多核苷酸作為診斷試劑的用途。當(dāng)基因編碼的多肽選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14所示多肽時(shí)，對(duì)與功能不良相關(guān)的基因的突變形式的檢測(cè)將提供診斷工具以增加或者限定疾病或者疾病易感性的診斷結(jié)果，其中所述疾病為由于該基因的低表達(dá)、過(guò)表達(dá)或改變的時(shí)空表達(dá)而導(dǎo)致，該基因中帶有突變的個(gè)體可以通過(guò)多種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)。
用于診斷的核酸可以從對(duì)象細(xì)胞中獲取，例如從血液、尿液、唾液、活檢組織或尸體解剖材料獲取?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)或者可以在分析前通過(guò)利用PCR或者其它擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶學(xué)擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以以相似方式使用。缺失和插入可以通過(guò)與正常基因型比較擴(kuò)增產(chǎn)物大小的改變來(lái)檢測(cè)。點(diǎn)突變可以通過(guò)將擴(kuò)增DNA與標(biāo)記核苷酸序列雜交來(lái)鑒定。利用RNase消化或者熔解溫度不同可以區(qū)分完全配對(duì)序列和錯(cuò)配的雙鏈體。DNA序列的差異也可以通過(guò)DNA片斷在變性或非變性(SSCP)膠上的電泳遷移率的變化或者通過(guò)DNA直接測(cè)序來(lái)檢測(cè)(例如，Myers等人，科學(xué)(Science)(1985)2301242)。在特定位置的序列改變也可以利用核酸酶保護(hù)試驗(yàn)，例如RNase和S1保護(hù)或者化學(xué)裂解方法(參見(jiàn)Cotton等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad Sci USA)(1985)854397-4401)揭示。在另一實(shí)施方案中，可以構(gòu)建含有Rdcvf1或Rdcvf2核苷酸序列或其片斷的寡核苷酸探針陣列用于例如遺傳突變的有效篩選。陣列技術(shù)方法為人所共知并且具有一般適用性，可以用于解決分子遺傳學(xué)的多種問(wèn)題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳變異性(參見(jiàn)例如M.Chee等人，科學(xué)(Science)274卷，610-613(1996))。
這些診斷試驗(yàn)提供了診斷或者確定疾病易感性的方法，所述方法通過(guò)利用本文描述的方法檢測(cè)Rdcvf1或Rdcvf2基因上的突變進(jìn)行。另外，這些疾病可以通過(guò)下述方法診斷，所述方法包括確定來(lái)自對(duì)象的樣品中Rdcvf1或Rdcvf2的不正常表達(dá)所述表達(dá)可以在RNA水平上利用任何本領(lǐng)域公知用于定量多核苷酸的方法測(cè)量，這些方法例如核酸擴(kuò)增(例如PCR、RT-PCR)、RNase保護(hù)、Northern印跡和其它雜交方法?？梢杂糜诖_定來(lái)自宿主的樣品中的蛋白質(zhì)(例如本發(fā)明多肽)水平的測(cè)定技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。這些測(cè)定方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析和ELISA測(cè)定。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其包括(a)本發(fā)明多核苷酸，優(yōu)選編碼如下多肽的核苷酸序列或其片斷，所述多肽選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14；(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明多肽，優(yōu)選多肽或其片斷；或(d)本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選針對(duì)選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14的多肽的抗體。
應(yīng)該理解，在任何這種試劑盒中，(a)、(b)、(c)或者(d)可以組成基本組分。這種試劑盒將用于疾病的診斷或者疾病易感性的診斷，所述疾病特別是色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)黃斑變性、巴比綜合征、巴科綜合征、貝斯特病、脈絡(luò)膜瘤、螺旋狀萎縮、先天性黑矇、雷夫敘姆綜合征、青年遺傳性黃斑變性和厄舍綜合征。本發(fā)明核苷酸序列在染色體定位上也頗有價(jià)值。染色體定位可以通過(guò)對(duì)制備自一組雜合體細(xì)胞系(小鼠-倉(cāng)鼠)的DNA進(jìn)行PCR獲得。人基因的染色體定位可以利用同線性(syntheny)從小鼠基因的定位推測(cè)出(McCarthy等人(1997)，基因組研究，7，1153)。該序列將特異性靶向單個(gè)染色體的特定位置并且可以與其雜交，所述染色體包括小鼠和人染色體。本發(fā)明相關(guān)序列的染色體作圖是將這些序列與基因相關(guān)疾病相互關(guān)連的重要第一步。一旦序列定位至精確的染色體位置，染色體上序列的物理位置即可以與遺傳圖數(shù)據(jù)相聯(lián)系。這些數(shù)據(jù)可以在例如V.McKusick，人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳(Mendelian Inheritance in Man)(可通過(guò)Johns Hopkins University Welch Medical Library，RetNet在線獲得)上發(fā)現(xiàn)。隨后在相同染色體區(qū)域定位的疾病與基因之間的關(guān)系可通過(guò)連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)鑒定。
也可以確定患病和未患病個(gè)體間cDNA或基因組序列的差異。如果突變?cè)谝恍┗蛘咚谢疾€(gè)體中被發(fā)現(xiàn)而沒(méi)有在任何正常個(gè)體中發(fā)現(xiàn)，那么該突變就有可能是該疾病的致病因素。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案涉及為實(shí)現(xiàn)上述任意一項(xiàng)治療效果而施用藥物組合物以及可藥用載體。這種藥物組合物可以由Rdcvf1或Rdcvf2、模擬物或拮抗劑組成。組合物可以單獨(dú)施用或者與至少一種其它藥劑(例如穩(wěn)定化合物)聯(lián)合施用，并且其可以在任何無(wú)菌、生物相容的藥用載體中施用，所述載體包括但并不限于鹽水、緩沖鹽溶液、葡萄糖和水。組合物可以單獨(dú)施用給患者，或者聯(lián)合其它藥劑、藥物或者激素一起施用。
本發(fā)明所包括的藥物組合物可以通過(guò)多種途徑施用例如生物活性蛋白質(zhì)透過(guò)鞏膜遞送至脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜(Ambati等人(2000)眼科研究與視覺(jué)科學(xué)(Investigative Ophthalmology and Visual Science)41，1186)。局部眼用制劑(包括眼用溶液、懸液和軟膏)的配制為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知(參見(jiàn)Remington’s藥物科學(xué)，第18版，86章，1581-1592頁(yè)，Mack出版公司，1990)。也可以利用其它的施用方式，包括房?jī)?nèi)(intracameral)注射(其可以直接注射至眼前房或者直接至玻璃體房)、結(jié)膜下注射和球后注射，并且生產(chǎn)適應(yīng)這些施用方式的眼科制劑的方法也為人所公知。
本申請(qǐng)書(shū)中所使用的“眼外”是指眼表面和眼球和眼瞼之間的(外部)空間。眼外區(qū)域的例子包括眼瞼穹窿(fornix或cul-de-sac)、結(jié)膜表面和角膜表面。這一位置在所有眼組織的外部，并且接近這一區(qū)域并不需要侵入性的方法。眼外系統(tǒng)的例子包括插入物(insert)和“局部”用滴劑、凝膠或軟膏，它們可被用于向這些區(qū)域遞送治療物質(zhì)。眼外裝置通常可被容易地移去，甚至患者自己亦可將其除去。
以下所述專(zhuān)利公開(kāi)了用于向眼外區(qū)域施用藥物的眼外系統(tǒng)。Higuchi等人在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,981,303、3,986,510和3,995,635中公開(kāi)了含有藥物的可生物降解的插入物。插入物可以制成不同形狀以使其停留在眼球的穹窿，眼球和眼瞼之間的眼外空間。幾種常見(jiàn)的生物相容性多聚體作為適合制備這種裝置的材料被公開(kāi)。這些多聚體包括藻酸鋅、多聚(乳酸)、多聚(乙烯醇)、多聚(酐)和多聚(乙醇酸)。這些專(zhuān)利也描述了具有減小的藥物滲透并具容納藥物制劑的中空室的膜包被裝置。
Theeuwes的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,217,898公開(kāi)了可用于控制藥物遞送的微孔貯器。這些裝置眼外放置在眼穹窿內(nèi)。有意義的多聚體系統(tǒng)包括多聚(乙烯氯)-共-多聚(乙酸乙烯酯)共聚體。Kaufman在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,865,846和4,882,150中公開(kāi)了一種眼科藥物遞送系統(tǒng)，其含有至少一種可生物消解物質(zhì)或用于結(jié)膜囊的軟膏載體。該專(zhuān)利公開(kāi)了適用作遞送系統(tǒng)的多聚體系統(tǒng)，例如聚交酯、聚乙醇酸交酯、聚(乙烯醇)和交聯(lián)膠原。
在現(xiàn)在描述的RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)產(chǎn)物在治療視網(wǎng)膜疾病或損傷的用途中，局部應(yīng)用的眼科制劑還可有利地包括促進(jìn)治療劑向眼內(nèi)滲透或轉(zhuǎn)移的藥劑。這種藥劑為本領(lǐng)域所公知。例如，Ke等人在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,221,696中公開(kāi)了增強(qiáng)眼科制劑滲透穿過(guò)角膜的物質(zhì)的使用。
眼內(nèi)系統(tǒng)為那些適合在眼組織層內(nèi)部、之間或周?chē)娜魏谓M織區(qū)室中使用的系統(tǒng)。這些位置包括結(jié)膜下(臨近眼球的眼粘膜之下)、眼窩(眼球后)和眼房?jī)?nèi)(眼球本身的房室內(nèi))。與眼外系統(tǒng)相反，接近這些區(qū)域需要由注射或移植構(gòu)成的侵入式方法。
下述專(zhuān)利中公開(kāi)了眼內(nèi)裝置。Wong在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,853,224中公開(kāi)了可以導(dǎo)入眼房室的微囊化藥物。可在這一系統(tǒng)中使用的多聚體包括聚酯和聚醚。Lee在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,863,457中公開(kāi)了一種可生物降解的裝置，其經(jīng)過(guò)手術(shù)植入眼內(nèi)用于治療劑的緩慢釋放。該裝置設(shè)計(jì)用于手術(shù)植入結(jié)膜(眼球粘膜下)。Krezancaki在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,188,373中公開(kāi)了在人體溫條件下成凝膠的藥用載體。這種載體為藥物和來(lái)自合成衍生物的膠或纖維素的水懸液。Haslam等人在美國(guó)專(zhuān)利4,474,751和4,474,752中公開(kāi)了在室溫下呈液態(tài)而在體溫下呈凝膠態(tài)的多聚體-藥物系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中合適的多聚體包括聚氧乙烯和聚氧丙烯。Davis等人在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,384,333中公開(kāi)了可提供長(zhǎng)時(shí)間藥物釋放的注射用可生物降解藥物遞送多聚體。該藥物組合物是利用在可生物降解多聚體基質(zhì)中的藥學(xué)活性劑制成，其中多聚體基質(zhì)在溫度為20℃到37℃之間時(shí)為固體，而在溫度為38℃到52℃之間時(shí)為可流動(dòng)的。此藥物遞送多聚體并不限于可溶性或液體藥物制劑的遞送。例如，多聚體可以用作基質(zhì)以使含有藥物的微球、脂質(zhì)體或其它微粒結(jié)合的藥物穩(wěn)定并保持在注射部位。
用于眼內(nèi)注射的特別適合的載體為無(wú)菌蒸餾水，其中RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)產(chǎn)物配制成可適當(dāng)保存的無(wú)菌等滲溶液的形式。而另一眼科制劑可能涉及RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)產(chǎn)物與如下藥劑的制劑形式，所述藥劑為例如可注射微球或脂質(zhì)體，其提供蛋白質(zhì)的緩慢或持續(xù)釋放，該制劑可以隨后以貯存注射劑形式遞送。用于眼內(nèi)導(dǎo)入RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的其它合適方式包括含有RDCVF1或RDCVF2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的可植入的藥物遞送裝置。
本發(fā)明眼科制劑(特別是局部用制劑)可以包括其它組分，例如可眼用防腐劑、張力劑、共溶劑、濕潤(rùn)劑、絡(luò)合劑、緩沖劑、抗微生物劑、抗氧化劑和表面活性劑，這些均為本領(lǐng)域公知。例如，合適的張力增強(qiáng)劑包括堿金屬鹵化物(優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇、山梨醇等等。優(yōu)選加入足量的張力增強(qiáng)劑以使滴入眼中的制劑為低滲或基本等滲的。合適的防腐劑包括但并不限于苯扎氯胺、乙基汞硫代水楊酸鈉、苯乙醇、羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等等。過(guò)氧化氫也可用作防腐劑。合適的共溶劑包括但并不限于甘油、丙二醇和聚乙二醇。合適的絡(luò)合劑包括咖啡堿、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精。合適的表面活性劑或濕潤(rùn)劑包括但并不限于脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯80)、氨基丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊等等。緩沖液可以為常規(guī)緩沖液，例如硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、重碳酸鹽或Tris-HCl。
制劑組分以眼外或眼內(nèi)施用位點(diǎn)可接受的濃度存在。例如，緩沖液用于維持組合物在生理pH或稍低的pH，一般pH范圍為約5到約8。其它制劑組分可以包括用于延長(zhǎng)眼外施用的治療劑的眼內(nèi)存留的物質(zhì)，這樣有助于達(dá)到最大局部接觸和促進(jìn)吸收。適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)包括用于增加眼科制劑的粘性的多聚體或凝膠形成物質(zhì)。脫乙酰殼多糖是在緩釋液體眼科藥物制劑中作為眼部釋放速率控制劑的特別合適的物質(zhì)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,422,116，Yen等人)。對(duì)于眼科治療劑的眼內(nèi)控釋(例如持續(xù)和延長(zhǎng)遞送)而言，本發(fā)明制劑的適宜度可以通過(guò)多種本領(lǐng)域公知的方法確定，例如在控釋雜志(Journal of Controlled Release)，6367-373，1987中所描述的方法以及其變異方法。
除活性成分外，這些藥物組合物也可以含有適當(dāng)?shù)目伤幱幂d體，包括賦形劑和輔助劑，這些可藥用載體可以有利于活性組分加工成藥物制劑。有關(guān)配制和施用的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可參見(jiàn)最新版的Remington’s藥物科學(xué)(Maack出版公司，Easton，Pa)。
用于口服的藥物組合物可以利用本領(lǐng)域公知的可藥用載體配制成適于口服的劑量形式。這些載體使藥物組合物可以配制成可被患者吸收的片劑、藥丸、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸液等等。
用于口服的藥物制劑可以通過(guò)如下方式獲得混合活性組分和固體賦形劑，任選地研磨得到的混合物并在加入適當(dāng)?shù)妮o助劑后(如果需要)加工顆?；旌衔锏玫狡瑒┗蝈V劑的核芯。適當(dāng)?shù)馁x形劑為碳水化合物或蛋白質(zhì)填充劑，例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇)、淀粉(來(lái)自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其它植物)、纖維素(例如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羰甲基纖維素鈉)、樹(shù)膠(包括阿拉伯樹(shù)膠和黃芪膠)和蛋白質(zhì)(例如明膠和膠原)。如果需要，可以加入崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、褐藻酸或其鹽(例如藻酸鈉)。
錠劑核芯部分可以與適當(dāng)?shù)陌虏牧下?lián)合使用，所述材料例如濃縮的糖溶液，其也可以含有阿拉伯樹(shù)膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、紫膠漆溶液以及適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶劑混合物。為進(jìn)行產(chǎn)品標(biāo)識(shí)或表征活性化合物的量(即劑量)，可以向片劑或錠劑包衣中加入著色劑或色素。
可用于口服的藥物制劑包括明膠制成的輕壓填充型(push-fit)膠囊以及由明膠和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的軟密封膠囊。輕壓填充型膠囊可以含有活性成分，這些成分與填充劑或粘合劑(例如乳糖或淀粉)、滑潤(rùn)劑(例如滑石或硬脂酸鎂)以及任選地穩(wěn)定劑相混和。在軟膠囊中，活性化合物可以在穩(wěn)定劑存在或不存在的條件下溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)囊后w，例如脂肪油、液體或者液體聚乙二醇中。
適于腸胃外施用的藥物制劑可以在水溶液中配制，優(yōu)選在生理相容性緩沖液例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理緩沖鹽溶液中配制。水性注射懸液可以含有增加懸液粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的懸液可以制備成適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺乙旱男问?。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或者脂質(zhì)體。非脂類(lèi)聚陽(yáng)離子氨基多聚體也可以用于遞送。任選地，懸液也可以含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解性以允許制備高濃度溶液的試劑。
對(duì)局部或經(jīng)鼻施用而言，適于待滲透的特定屏障的滲透劑可以在制劑中使用。這些滲透劑為本領(lǐng)域公知。
本發(fā)明藥物組合物可以利用本領(lǐng)域公知的方法制備，例如通過(guò)常規(guī)的混和、溶解、制粒、成錠、研碎、乳化、膠囊化、截留(entrapping)或者凍干等過(guò)程。
藥物組合物可以以鹽的形式提供，并且可以與許多種酸成鹽，所述酸包括但并不限于鹽酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等等。鹽形式傾向于在水或者其它質(zhì)子溶劑中比其相應(yīng)的游離堿形式更容易溶解。在其它情況中，優(yōu)選的制劑可以是含有下述物質(zhì)之任意一種或者所有的凍干粉末1-50mM組氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH4.5-5.5。該凍干粉在使用前與緩沖液混和。
藥物組合物一經(jīng)制備，其可以在合適的容器中存放并標(biāo)上其可以治療的適應(yīng)癥。對(duì)Rdcvf1或Rdcvf2的給藥而言，這種標(biāo)記應(yīng)包括施用的量、頻率和方法。
適于本發(fā)明使用的藥物組合物包括這樣的組合物，其中活性成分以可達(dá)到預(yù)計(jì)目的的有效量存在。有效劑量的確定為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
對(duì)任何化合物而言，治療有效劑量最先可以在細(xì)胞(例如瘤細(xì)胞)培養(yǎng)試驗(yàn)中或者在動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)。所述動(dòng)物模型通常為小鼠、兔、狗或者豬。這些動(dòng)物模型也可用于確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶褪┯猛緩?。隨后這些信息可被用于確定在人類(lèi)中施用時(shí)的有用劑量和途徑。
治療有效劑量是指能夠改善癥狀或病癥的活性成分的量，所述活性成分例如Rdcvf1或Rdcvf2或其片斷、Rdcvf1的抗體、激動(dòng)劑。治療效果和毒性可以通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中利用標(biāo)準(zhǔn)的藥理學(xué)方法確定，例如ED50(50％群體中的治療有效劑量)和LD50(50％群體的致死劑量)。毒性和治療效果的劑量比稱(chēng)為治療指數(shù)，并且它可以由比值LD50/ED50來(lái)表示。優(yōu)選那些展現(xiàn)出大的治療指數(shù)的藥物組合物。獲自細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用于確定人用劑量的范圍。這些組合物中含有的劑量?jī)?yōu)選在如下循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該范圍包括ED50且?guī)缀鯖](méi)有或完全沒(méi)有毒性。該劑量在此范圍內(nèi)的變動(dòng)取決于所使用的劑型、患者的敏感性以及施用途徑。
確切的劑量由醫(yī)師根據(jù)需要治療的對(duì)象的相關(guān)因素確定。可以調(diào)整劑量和施用方法以提供足夠水平的活性部分或者維持所期望的效果?？梢钥紤]的因素包括疾病的嚴(yán)重性、對(duì)象的一般健康狀況、對(duì)象的年齡、體重和性別、飲食、施用的時(shí)間和頻度、聯(lián)用的藥物、反應(yīng)敏感性以及對(duì)該療法的耐受/應(yīng)答。根據(jù)特定制劑的半衰期和清除速度，長(zhǎng)效藥物組合物可以每3到4天、每周或每?jī)芍苁┯靡淮巍?br> 依賴(lài)于所選的施用途徑，正常劑量的量可以從0.1到100,000微克，直至總劑量為約1克。有關(guān)具體劑量和遞送方法的指導(dǎo)在文獻(xiàn)中提供，并且通常可為本領(lǐng)域從業(yè)人員所得到。對(duì)于核苷酸和蛋白質(zhì)或它們的抑制劑本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)使用不同制劑形式。同樣，對(duì)特定細(xì)胞、病癥、位置等等而言，多核苷酸或多肽的遞送也將是特異的。適于口服施用蛋白質(zhì)的藥物制劑在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,008,114、5,505,962、5,641,515、5,681,811、5,700,486、5,766,633、5,792,451、5,853,748、5,972,387、5,976,569和6,051,561中描述。
下述實(shí)施例用于舉例闡明本發(fā)明，但并不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.表達(dá)克隆
1)從5周齡正常小鼠視網(wǎng)膜中純化總RNA大體上根據(jù)Glissin等人(1974)，生物化學(xué)(Biochemistry)，13，2633-2637中所述方法利用5周齡C57BL/6@N小鼠的視網(wǎng)膜構(gòu)建cDNA文庫(kù)。簡(jiǎn)言之，處死動(dòng)物后，摘出動(dòng)物的眼睛并將眼首先置于補(bǔ)充有0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。迅速解剖神經(jīng)視網(wǎng)膜(在該組織制備中忽略視網(wǎng)膜色素上皮)。在每一解剖完成后，迅速將組織在新鮮配制的6M氯化胍(GC)中勻漿。將10個(gè)視網(wǎng)膜合并加至存在于4ml無(wú)菌試管中的2.4ml GC中，并且該組織通過(guò)在室溫下劇烈勻漿1分鐘而完全破碎。
從5周齡正常小鼠視網(wǎng)膜中純化信使RNA(mRNA)mRNA的分離利用oligo-dT包被的多孔小珠(Oligotex，Qiagen)在嚴(yán)緊條件下根據(jù)Kuribayashi等人，(1988)核酸研究專(zhuān)題系列(Nucleic Acids Res.Symposium series)19，61-64的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將100-150μg小鼠視網(wǎng)膜總RNA與15μl oligo-dT小珠在結(jié)合緩沖液[10mM Tris pH7.5，0.3M NaCl，0.1M EDTA，0.5％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)]中混和，并于65℃、0.5l水(becher)中孵育6分鐘，隨后在約3-4小時(shí)逐漸冷卻至室溫，然后在室溫下離心以回收瓊脂糖小珠。隨后通過(guò)在0.4ml(0.1M Tris pH7.5，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.5％w/v SDS)中孵育10分鐘洗滌小珠兩次。結(jié)合的RNA(mRNA)通過(guò)兩步用50μl 70℃預(yù)熱的無(wú)Rnase的水洗脫下來(lái)，利用10μl醋酸鈉pH5.2和0.25ml乙醇將其沉淀并在-70℃下孵育12小時(shí)。mRNA通過(guò)離心(15000rpm 1小時(shí)，之后利用70％乙醇洗滌兩次)收集并在20μl無(wú)Rnase的水中重懸。mRNA濃度在260nm測(cè)定并且rRNA污染與否按如上所述在變性條件下通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)。
cDNA合成cDNA合成根據(jù)Okayama和Berg，(1982)，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)2，161-170上所述方法進(jìn)行。第一鏈合成利用2.5μg Not I接頭寡核苷酸(5’TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGA CAA(T)183’)引發(fā)，并與50單位的改良莫洛尼鼠類(lèi)白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscipt II，Life Technology)在供應(yīng)商推薦的條件下孵育2小時(shí)。為進(jìn)行第二鏈合成，反應(yīng)物與4單位RNAseH和100單位DNA聚合酶I在SS緩沖液(40mM Tris pH7.2，85mM氯化鉀，4.4mM氯化鎂，3mMDTT，5μg/ml牛血清白蛋白(BSA))中(總體積0.25ml)14℃孵育4小時(shí)。EcoR I接頭(5’-OH AATTCGGCACGAGG 3’-OH/3’-OHGCCGTGCTCC 5’-PO4)連接至雙鏈cDNA的兩個(gè)末端是通過(guò)利用40單位T4 DNA連接酶(Promega，Madison，USA)在20μl總體積中在供應(yīng)商推薦的條件下16℃孵育14小時(shí)完成。此反應(yīng)的產(chǎn)物為dscDNA，其在5’端具有EcoR I半位點(diǎn)而3’端具有Not I半位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可以使此dscDNA在克隆載體中定向。
在pcDNA3中連接dscDNA在pcDNA3中連接dscDNA根據(jù)Maniatis T.(1992)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版所述方法進(jìn)行，其中利用了在供應(yīng)商提供的條件下通過(guò)EcoR I和Not I(Promega，Madison，USA)切割制備的10μg pcDNA3質(zhì)粒(Invitrogen)。
重組克隆的擴(kuò)增重組克隆的擴(kuò)增大體上根據(jù)Birnboim等人(1979)，核酸研究(NucleicAcids Res.)7，1513-1523中的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，為制備具有100個(gè)初級(jí)克隆的庫(kù)(匯合物)，我們稍微修改了XL1 Gold(Strategene)轉(zhuǎn)化方案(由Strategene提供)，見(jiàn)如下。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)物調(diào)節(jié)至具有20％(體積/體積)甘油和8％(體積/體積)馬血清白蛋白(HAS，Life Technologies)。HAS和甘油能夠抑制凍融后的死亡。通過(guò)用遞增體積的每一轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布瓊脂平板(含100μg/ml氨芐青霉素)來(lái)進(jìn)行滴度測(cè)定以計(jì)算出產(chǎn)生100個(gè)菌落的體積，而大批的轉(zhuǎn)化反應(yīng)物在-80℃貯存。同時(shí)進(jìn)行96份文庫(kù)重組質(zhì)粒純化。為制備各含100個(gè)克隆的96個(gè)庫(kù)，將計(jì)算出的對(duì)應(yīng)于100個(gè)克隆的體積涂布于瓊脂上并使其在37℃生長(zhǎng)20小時(shí)。DNA的純化直接利用從瓊脂平板上剝離的菌落進(jìn)行。在23％甘油中將每一培養(yǎng)物的儲(chǔ)存物貯存在-80℃。DNA利用Qiawell ultra(Qiagen)及供應(yīng)商推薦的方案純化。一般地，得到10μg純化的質(zhì)粒，每一制備物的濃度利用260nm光密度測(cè)量。為將所選的具100個(gè)克隆的庫(kù)細(xì)分成具10個(gè)克隆的庫(kù)，將50μl來(lái)自原初庫(kù)的甘油儲(chǔ)存物的1/250,000稀釋物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的瓊脂平板上。經(jīng)37℃生長(zhǎng)16小時(shí)后，在16個(gè)瓊脂平板上復(fù)制了160個(gè)單菌落(每平板10個(gè))并在37℃生長(zhǎng)16小時(shí)。將每一平板的10個(gè)菌落收獲并在液體培養(yǎng)基[Luria肉湯(LB)，100μg/ml氨芐青霉素]中37℃生長(zhǎng)3小時(shí)。含30％甘油的這些培養(yǎng)物的儲(chǔ)存物貯存在-80℃。如上所述制備質(zhì)粒DNA。為將具10個(gè)克隆的亞庫(kù)分解成單個(gè)的克隆，將50μl來(lái)自10克隆亞庫(kù)的甘油儲(chǔ)存物的1/250,000稀釋物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的瓊脂平板上。經(jīng)37℃生長(zhǎng)16小時(shí)后，挑取了16個(gè)單菌落并在2ml LB 100μg/ml氨芐青霉素中生長(zhǎng)16小時(shí)。含30％甘油的這些培養(yǎng)物的儲(chǔ)存物貯存在-80℃。利用如上所述的方法制備質(zhì)粒DNA。
Cos-1細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cos-1細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染利用Chen和Okayama，(1987)“質(zhì)粒DNA對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)化”(Mol ceu Biol.，7，2745-2752)一文中所述方法進(jìn)行。
雞胚胎視網(wǎng)膜培養(yǎng)該方案改自Adler和Hatlee[(1989)科學(xué)(Science)，243，391]。將雞胚胎視網(wǎng)膜(在卵中(in ovo)6天)分散并單層培養(yǎng)。在無(wú)分化信號(hào)的培養(yǎng)條件下，視錐占60-80％的細(xì)胞。我們制備了兔抗visinin(一種雞視錐標(biāo)志分子，Genbank登錄號(hào)M84729)的多克隆抗體并證實(shí)我們的培養(yǎng)物中視錐的比例為60-80％。除該方法簡(jiǎn)單快捷外，我們模型的簡(jiǎn)單環(huán)境(人工合成培養(yǎng)基，缺少細(xì)胞與細(xì)胞接觸)使其成為研究視錐存活有關(guān)營(yíng)養(yǎng)因子的非常合適的系統(tǒng)。簡(jiǎn)言之，在卵中發(fā)育6天后解剖視網(wǎng)膜，將細(xì)胞分散并以低密度接種(105個(gè)細(xì)胞/cm2)，其中的視網(wǎng)膜取自種雞(progenitor)控制隔離群產(chǎn)生的胚胎。在10天中利用活細(xì)胞/死細(xì)胞測(cè)定(MolecularProbes，Eugene，USA)對(duì)細(xì)胞(60-80％的視錐)的生存能力進(jìn)行跟蹤，所述測(cè)定試驗(yàn)定量活的和死亡的細(xì)胞。在人工合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，活細(xì)胞數(shù)目下降至初始細(xì)胞數(shù)目的8％。當(dāng)條件培養(yǎng)基存在時(shí)，計(jì)數(shù)在體外7天后活細(xì)胞的數(shù)目，所述條件培養(yǎng)基來(lái)自轉(zhuǎn)染了文庫(kù)克隆匯合物的COS1細(xì)胞。
為進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，種雞(657 red label株系)在距本實(shí)驗(yàn)室25km遠(yuǎn)的孵化設(shè)施中于單獨(dú)的分隔間中養(yǎng)殖。自然獲得的受精卵按周收集，并在孵化后在實(shí)驗(yàn)室中17℃(其生物學(xué)零度)保持。每天，將5個(gè)雞蛋20℃下孵育24小時(shí)并隨后在37℃下孵育136小時(shí)，其間間歇地翻轉(zhuǎn)雞蛋在濕室中的傾斜度。培養(yǎng)的那天，用Mucocit-A洗滌雞蛋表面，隨后打破并將雞胚胎轉(zhuǎn)移至PBS中。每一胚胎的發(fā)育階段根據(jù)Hamburger和Hamilton(1951)在發(fā)育生物學(xué)精粹(Essential Development Biology)(Stern和Holland主編)中的所述目視比較證實(shí)是第29天。選擇了其中的2個(gè)胚胎并摘出眼，將眼轉(zhuǎn)移至CO2非依賴(lài)性培養(yǎng)基(Life technologies)中。解剖視網(wǎng)膜并轉(zhuǎn)移至Ringer緩沖液中并洗滌2次。將視網(wǎng)膜切成小塊并在胰蛋白酶溶液(0.25％w/v)中37℃處理20分鐘。反應(yīng)通過(guò)加入補(bǔ)充有10％滅活FCS的培養(yǎng)基(M199，Life Technologies)終止。利用25μl DNAseI(1mg/ml，Sigma)處理細(xì)胞懸液幾分鐘。隨后將細(xì)胞懸液在人工合成培養(yǎng)基[CDCM，等體積的DMEM和M199培養(yǎng)基(Life Technologies)及具有補(bǔ)充物的AB(5μg/ml胰島素；5μg/ml Transferring；64nM孕酮；0.1mM腐胺；5ng/ml硒；3mM?；撬?；2.7μM胞苷5’-二磷酸乙醇胺；5.2μM胞苷5’-二磷酸膽堿，0.2μg/ml氫化可的松；30nM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸；1mM丙酮酸鈉)，0.3μM前列腺素D2；0.1mg/ml亞油酸]中洗滌2次以除去FCS。采用臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞的濃度利用Mallassez’cell測(cè)量，并對(duì)應(yīng)于兩個(gè)接種密度(2和4×105個(gè)細(xì)胞/cm2)得到兩個(gè)濃度(5.6和1.12×105個(gè)細(xì)胞/ml)。
來(lái)自Cos-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在冰上融化并按如下設(shè)計(jì)將50μl轉(zhuǎn)移至2個(gè)處理過(guò)的96孔黑色組織培養(yǎng)板(Corning Costar)上，該板已用100μg/ml多聚-L-賴(lài)氨酸溶液(Sigma)進(jìn)行包被
其中數(shù)字是指具100個(gè)克隆的庫(kù)的編號(hào)，C為來(lái)自轉(zhuǎn)染了空載體(pcDNA3)的Cos-1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，而P為陽(yáng)性對(duì)照(轉(zhuǎn)染了pcDNA-小鼠GDNF的條件培養(yǎng)基)。
第二和第三輪篩選
其中x(第二輪)和y(第三輪)分別代表在第一和第二輪中所選的庫(kù)的編號(hào)。01到16代表所用的亞庫(kù)。x(y)代表這16個(gè)庫(kù)所來(lái)源的親本庫(kù)。C如第一輪中所述意義。P在第二輪中修改成為pCMVScript-CNTF，而在第三輪中逐漸改為pcDNA-939.09.08。0代表雞視錐細(xì)胞僅存在于CDCM培養(yǎng)基中。C57和C3H為按照(從小鼠視網(wǎng)膜外植塊制備條件培養(yǎng)基)中所述方法分別從C57B/6@N和C3H/He@N 5周齡小鼠視網(wǎng)膜制備的視網(wǎng)膜外植塊的條件培養(yǎng)基。
為使實(shí)驗(yàn)誤差最小化，利用8道電動(dòng)加樣器(Biohit)將對(duì)應(yīng)于2個(gè)密度(2和4×105細(xì)胞/cm2)的50μl細(xì)胞懸液加至2個(gè)96孔板的孔中，所述96孔板中已加有條件培養(yǎng)基。細(xì)胞在5％CO2條件下37℃孵育7天。
從小鼠視網(wǎng)膜外植塊制備條件培養(yǎng)基第二和第三輪篩選所包括的陽(yáng)性對(duì)照據(jù)Mohand-Said等人(1998)進(jìn)行適應(yīng)性修改。將5周齡小鼠C57BL/6@N(野生型)和C3H/He@N(rd1)處死并摘出眼。解剖出2個(gè)視網(wǎng)膜并在12孔板上用1.5ml CDCM于5％CO2條件下37℃孵育24小時(shí)。將條件培養(yǎng)基回收并利用Vivaspin(Sartorius，截留點(diǎn)10kDa)通過(guò)超濾濃縮40倍。將條件培養(yǎng)基在液氮中速凍并在使用前分成小份在-20℃貯存。使用時(shí)，將條件培養(yǎng)基在冰上融化，在CDCM中稀釋10倍并利用0.22μm濾器(Acrodisk 13，GelmanSciences)過(guò)濾除菌。
功能測(cè)定，活細(xì)胞/死細(xì)胞測(cè)定功能測(cè)定基于7天體外孵育后存活雞視網(wǎng)膜細(xì)胞的數(shù)目。我們使用活細(xì)胞/死細(xì)胞測(cè)定試劑盒(Molecular probes，Eugene，USA)，該試劑盒基于使用兩種分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色的熒光染料(Calcein AM和Ethidium dimer)?；罴?xì)胞具有代謝活性(這里是酯酶活性)，其可以將底物(Calcein AM)轉(zhuǎn)化為發(fā)射波長(zhǎng)520nm的熒光產(chǎn)物。死細(xì)胞的膜通透性發(fā)生改變并且允許核DNA被發(fā)射波長(zhǎng)635nm的Ethidium dimmer染色?；罴?xì)胞485nm激發(fā)后520nm發(fā)射，或者死細(xì)胞520nm激發(fā)后635nm發(fā)射。利用落射熒光顯微鏡，可以分別觀察兩種類(lèi)型的熒光細(xì)胞。經(jīng)7天體外培養(yǎng)后，將細(xì)胞在室溫下暗處與2.7μM Calcein AM和0.3mMEthidium dimmer孵育30分鐘。
圖象采集簡(jiǎn)言之，圖象采集的組成為對(duì)每一個(gè)孔自動(dòng)聚焦、在兩種熒光下自動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及其后利用專(zhuān)門(mén)軟件(例如Metamorph，UniversalImaging Corporation，West Chester，USA)對(duì)原始數(shù)據(jù)處理以獲得每一平板孔的數(shù)字化圖片。我們使用倒置顯微鏡(Nikon TE 200)，所述倒置顯微鏡裝備有汞落射熒光燈、兩個(gè)激發(fā)光濾片485和520nm、兩個(gè)發(fā)射光濾片520和635nm、目鏡(×10)、計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的電動(dòng)盤(pán)(platine)(Multicontrol2000，Martzauzer)和CCD相機(jī)(Cohu)。
為記錄平板，將其放置在電動(dòng)盤(pán)上，并且在第一個(gè)孔上手動(dòng)調(diào)焦，這樣這一平面被記錄(z原點(diǎn))。死細(xì)胞和活細(xì)胞圖象的閾值由第一個(gè)孔設(shè)定。利用白光通過(guò)手動(dòng)對(duì)齊第一個(gè)孔的底部與電腦顯示器上圖象的底部，然后通過(guò)將第一個(gè)孔的最右邊與電腦屏幕上圖象的右邊對(duì)齊并記錄下這兩個(gè)位置來(lái)調(diào)整第一個(gè)孔的中心位置。第一個(gè)孔的中心被計(jì)算出來(lái)從而給出培養(yǎng)板上每個(gè)孔的中心位置。我們?cè)谶M(jìn)行過(guò)程中注意到孔邊緣具有稍高的細(xì)胞密度，因此我們從獲取的圖象中排除了邊緣位置。每一孔的圖象恰好位于正中非常重要，這樣可以避免任何誤導(dǎo)結(jié)果。當(dāng)一切準(zhǔn)備就緒，平板的第一次掃描進(jìn)行死細(xì)胞的記錄。死細(xì)胞密度在這些條件下較少變化。該過(guò)程通過(guò)在不同焦平面拍照并挑選最亮的那個(gè)而執(zhí)行自動(dòng)聚焦在準(zhǔn)確的焦點(diǎn)。這個(gè)z位置被存儲(chǔ)起來(lái)而盤(pán)在x和y軸上執(zhí)行程序化運(yùn)動(dòng)拍下共4張圖象，當(dāng)將這些圖象重建為一張圖象時(shí)，它代表孔的2/3表面。從焦平面得到的一堆圖象被存儲(chǔ)用于對(duì)照。盤(pán)對(duì)每一板孔執(zhí)行自動(dòng)聚焦和四次圖象獲取，該過(guò)程從孔A1起始到A12，然后從B12到B1，C1到C12等等。最后，盤(pán)移出平板以過(guò)度曝光最后一個(gè)孔(H1)。死細(xì)胞的掃描花費(fèi)30分鐘。第二次掃描(活細(xì)胞)在轉(zhuǎn)換濾光片后進(jìn)行。該第二次掃描利用死細(xì)胞掃描時(shí)記錄的每一孔的z位置進(jìn)行。與死細(xì)胞相同，每一孔拍四張圖象。在第二次掃描(22分鐘)的最后，重建的死細(xì)胞和活細(xì)胞的圖象被存儲(chǔ)為利用日期自動(dòng)命名的一個(gè)文件。利用預(yù)先設(shè)定的形態(tài)度量參數(shù)(平均值)來(lái)自動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目(死細(xì)胞和活細(xì)胞)，并將其顯示在電腦顯示器上以檢查該實(shí)驗(yàn)正確與否。重要的是，基于每天的基礎(chǔ)來(lái)檢查活細(xì)胞的數(shù)目是否太高。我們已經(jīng)觀察到如果以過(guò)大的密度接種，雞視網(wǎng)膜細(xì)胞極可能通過(guò)產(chǎn)生它們自己的存活因子而存活更長(zhǎng)的時(shí)間。我們?cè)跊](méi)有這種作用的情況下篩選細(xì)胞。在第二塊平板掃描(同一實(shí)驗(yàn)，利用2倍細(xì)胞接種密度)之前，我們?cè)趤?lái)自第一個(gè)平板的log文件名的末尾加個(gè)a。每一實(shí)驗(yàn)的圖象在CD-rom上存儲(chǔ)。我們已經(jīng)生成了超過(guò)250個(gè)CD-rom的文庫(kù)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)和庫(kù)的選擇細(xì)胞數(shù)目(活細(xì)胞和死細(xì)胞)利用存儲(chǔ)在CD-rom上的每個(gè)實(shí)驗(yàn)的圖象進(jìn)行計(jì)數(shù)。來(lái)自實(shí)驗(yàn)的log文件首先被載入電腦(離線計(jì)數(shù))并使用Metamorph軟件打開(kāi)。第一步，打開(kāi)對(duì)應(yīng)于14個(gè)C孔(來(lái)自轉(zhuǎn)染了空載體的Cos-1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基)的圖象。調(diào)整圖象的閾值后，使用Integrated Morphometry Analysis指令對(duì)這些對(duì)照孔測(cè)量10到250個(gè)面積的目標(biāo)分布(每一總面積內(nèi)活細(xì)胞的數(shù)目)。該分布服從高斯分布，其中目標(biāo)的最大數(shù)目與單個(gè)的細(xì)胞相對(duì)應(yīng)。隨后這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值(SV)用于計(jì)算如下面積值，即，超過(guò)此面積時(shí)目標(biāo)將被計(jì)數(shù)為2個(gè)細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)截點(diǎn)，SOC)，這通過(guò)我們的經(jīng)驗(yàn)公式SOC＝29/20.74SV完成。各培養(yǎng)板的SOC值用于計(jì)數(shù)培養(yǎng)板上活細(xì)胞的數(shù)目。隨后將這些數(shù)目轉(zhuǎn)移至excel表格中。
對(duì)第一輪篩選而言，將每一庫(kù)的值按相對(duì)于14個(gè)對(duì)照孔的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的倍數(shù)差異(活細(xì)胞數(shù)目的增加或減少)作圖。為矯正由培養(yǎng)板中位置不同帶來(lái)的差異，我們分別計(jì)算了200個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)板上對(duì)應(yīng)于測(cè)試庫(kù)所在位置的80個(gè)孔和14個(gè)對(duì)照孔之間的平均倍數(shù)差異。平均而言，觀測(cè)到的差異僅僅是由位置差異導(dǎo)致，并且細(xì)胞數(shù)目利用這一系數(shù)校正。為更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乇鎰e所選的庫(kù)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)按相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)差異作圖，其中對(duì)照為不超過(guò)1.3但是大于0.4的所有值。這樣，所有與對(duì)應(yīng)于空載體的14個(gè)孔相比其倍數(shù)差異在0.4到1.3之間的庫(kù)被認(rèn)為沒(méi)有作用并被用作對(duì)照。經(jīng)校正，將2個(gè)培養(yǎng)板的與對(duì)照相比的倍數(shù)差異相乘，并且結(jié)果按照降低的倍數(shù)差異排序。將位于該列表的頂端的庫(kù)進(jìn)一步通過(guò)視察對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)的20個(gè)庫(kù)(2個(gè)培養(yǎng)板)的圖表以及活細(xì)胞和死細(xì)胞的圖象來(lái)檢查以避免篩選到錯(cuò)誤的庫(kù)。
對(duì)第二輪和第三輪而言，用于亞庫(kù)篩選的培養(yǎng)板包括另外的對(duì)照。我們從5周齡小鼠的視網(wǎng)膜外植塊制備了條件培養(yǎng)基。我們選擇對(duì)于來(lái)自C57BL/6@N的視網(wǎng)膜外植塊記錄為陽(yáng)性結(jié)果的實(shí)驗(yàn)并排除了其它的實(shí)驗(yàn)。將結(jié)果以相對(duì)于14個(gè)對(duì)照孔的倍數(shù)差異作圖，對(duì)照未進(jìn)行重新計(jì)算。將2個(gè)培養(yǎng)板與對(duì)照的倍數(shù)差異相乘并對(duì)16個(gè)亞庫(kù)按照降低的倍數(shù)差異排序所獲結(jié)果。
用T7引物(5′GTAATACGACTCACTATAGGGC3′)在毛細(xì)管測(cè)序儀(CEQ2000，Beckman Coulter)上測(cè)序分離的cDNA。使用Basia LocalAlignment Search Tool(BLAST)將DNA序列和數(shù)據(jù)庫(kù)作比較。
Rdcvf2以及人同源基因的鑒定利用Rdcvf1序列(編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO4多肽的核苷酸序列)和BLAST，鑒定到同源小鼠和人多肽(圖8)。鑒定到與小鼠RdCVF2(GenBank登錄號(hào)bco16199)同源的EST克隆GenBank登錄號(hào)be552141、bi517442、bg707818、bi603812、ai433287、be088414、bg297383、bg297304(也參見(jiàn)圖12)。與小鼠Rdcvf1(SEQ ID NO1)同源的EST克隆也得以鑒定GenBank登錄號(hào)bg299078、ai716631、bg294111、be108041、bg395178(也參見(jiàn)圖13)。
Rdcvf1表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析5周齡小鼠C57BL/6@N和C3H/He@N以及同類(lèi)系C3H(+/+和rd/rd)中Rdcvf1的視網(wǎng)膜表達(dá)利用實(shí)時(shí)RT-PCR方法研究，所述實(shí)時(shí)RT-PCR利用sybergreen PCR試劑盒(Roche)在光循環(huán)儀(Roche)上進(jìn)行。cDNA通過(guò)利用隨機(jī)六聚體寡核苷酸(pdN6，Amersham)引發(fā)、利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(superscript II，Life Technologies)和來(lái)自小鼠視網(wǎng)膜(按1所述制備)的總RNA產(chǎn)生。cDNA的標(biāo)準(zhǔn)化利用普遍存在的信使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)進(jìn)行。將0.2μl第一鏈cDNA合成物(相當(dāng)于10ng總RNA)利用2μM寡核苷酸SEQ ID NO24和SEQ ID NO25擴(kuò)增，總體積為25μl，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。上述擴(kuò)增利用下述程序95℃30秒，以及35個(gè)循環(huán)(95℃1秒，55℃18秒，72℃10秒)。分析(圖16)顯示在rd1小鼠(C3H/He@N)中視桿變性后Rdcvf1表達(dá)下降。實(shí)時(shí)RT-PCR也顯示Rdcvf1直接由光感受器表達(dá)，該實(shí)時(shí)RT-PCR使用的RNA制備自通過(guò)振動(dòng)切片機(jī)切片得到的視網(wǎng)膜外層。
產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用另一對(duì)Rdcvf1特異引物也得到了相似結(jié)果。作為陽(yáng)性對(duì)照，在相同條件下利用引物(5’CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC3’和5’CATCCTCATCTTTCTTCCTTC3’)檢測(cè)視桿抑制蛋白(ASS n°M24086)的表達(dá)。對(duì)Rdcvf1是視錐保護(hù)因子的確認(rèn)可以通過(guò)向5周齡rd1小鼠(C3H/He@N)的視網(wǎng)膜外植塊中加入適當(dāng)?shù)牧康腞dcvf1獲得。適當(dāng)?shù)牧靠梢酝ㄟ^(guò)一些最初的滴定實(shí)驗(yàn)確定。與合適的對(duì)照相比，7天后視錐存活將增加。
Rdcvf2的RT-PCR分析Rdcvf2表達(dá)的RT-PCR分析利用引物5’GCCAGCGTTTTCTGCCTTTTAC3’和5’AAGCCCTGCCTGCTCTAACATC3’。分析表明Rdcvf2以視桿依賴(lài)性方式表達(dá)并且Rdcvf2的表達(dá)并不僅僅限制在視網(wǎng)膜，而是其它神經(jīng)細(xì)胞也表達(dá)Rdcvf2(圖17)，而Rdcvf1的表達(dá)似乎限于視網(wǎng)膜細(xì)胞。
Rdcvf1或Rdcvf2的活細(xì)胞/死細(xì)胞測(cè)定利用帶有在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的Rdcvf1或Rdcvf2的適宜表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Cos-1細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞利用空載體轉(zhuǎn)染。在誘導(dǎo)Rdcvf1或Rdcvf2表達(dá)后將細(xì)胞孵育一段合適的時(shí)間。隨后，按照上述方法計(jì)數(shù)與條件培養(yǎng)基一起孵育的存活的視錐細(xì)胞數(shù)和存活的對(duì)照細(xì)胞數(shù)，所述條件培養(yǎng)基來(lái)自轉(zhuǎn)染了Rdcvf1或Rdcvf2的COS-1細(xì)胞。表達(dá)Rdcvf1或Rdcvf2的細(xì)胞表現(xiàn)出存活細(xì)胞數(shù)量顯著地較高。
視桿特異性因子對(duì)來(lái)自5周齡C57BL/6@N和C3H/He@N的視網(wǎng)膜外植塊中視桿抑制蛋白(對(duì)照)和Rdcvf1的表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行，并利用了下述引物SEQ ID NO245’TCTATGTGTCCCAGGACCCTACAG3’SEQ ID NO255’TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG3’。
結(jié)果顯示RdCVF1僅在視桿存在的情況下表達(dá)(視桿來(lái)源的CVF1)。
多克隆抗體的產(chǎn)生多克隆抗體通過(guò)向兔注射谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)純化的融合蛋白質(zhì)(GST-Rdcvf1)以及來(lái)自SEQ ID NO2的小鼠RdCVF1肽序列氨基酸第11至32位(Ab n°2)和SEQ ID NO2肽序列氨基酸第79至96位(Abn°3)而制備。融合構(gòu)建體pGST-Rdcvf1通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用pcDNA-Rdcvf1作為模板并利用寡核苷酸SEQ ID NO26和SEQ ID NO27擴(kuò)增而制備。將Rdc f1的開(kāi)放閱讀框(ORF)在讀框內(nèi)克隆至pGex2TK(Pharmacia)的Bam HI和Eco RI限制位點(diǎn)之間，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌[BL21(DE3)pLysS，Promega]。單菌落在含100μg/ml氨芐青霉素的3升LB液體培養(yǎng)基中30℃下生長(zhǎng)，并且通過(guò)添加1μg/ml異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，并使其繼續(xù)在30℃下生長(zhǎng)5小時(shí)。將細(xì)胞收獲、超聲裂解并按照標(biāo)準(zhǔn)方案利用谷胱甘肽瓊脂糖純化。融合蛋白質(zhì)利用10mM還原型谷胱甘肽在室溫下洗脫。在注射兔之前將洗脫的蛋白質(zhì)對(duì)PBS透析。蛋白質(zhì)純度通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。通過(guò)在80個(gè)位點(diǎn)皮內(nèi)注射100μg純化的GST-Rdcvf1來(lái)免疫2只兔。8周后收獲血清。
序列表<110>路易斯巴斯德大學(xué)/諾瓦提斯公司(UNIVERSITE LOUIS PASTEUR/NOVARTIS AG)<120>疾病相關(guān)蛋白<130>4-31883<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>468<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(45)..(374)<223>
<400>1atcggatccc tctctgggtc cccagctcct tgcatactgc tacc atg gca tct ctc56Met Ala Ser Leu1ttc tct gga cgc atc ttg atc agg aac aac agc gac cag gat gaa gtg 104Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp Gln Asp Glu Val5 10 15 20gag aca gag gca gag ctg agc cgt agg tta gag aat cgt ctg gtg ttg 152Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu Val Leu25 30 35ctg ttc ttc ggc gcc ggc gcc tgt ccc cag tgc cag gcc ttt gcc cca 200Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln Ala Phe Ala Pro40 45 50gtc ctc aaa gac ttc ttc gtg cgg ctc act gac gag ttc tac gtg ctg 248Val Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr Val Leu55 60 65cgg gca gca cag ctg gcc ctg gtc tat gtg tcc cag gac cct aca gag 296Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln Asp Pro Thr Glu70 75 80gag caa cag gac ctc ttc ctc agg gac atg cct gaa aaa tgg ctc ttc 344Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu Lys Trp Leu Phe85 90 95 100ctg ccg ttc cat gat gaa ctg agg agg tga ggccccaggg aagaccaggg 394Leu Pro Phe His Asp Glu Leu Arg Arg105
agggcttcct ggagaaggca tttccctgga ggtttactgt cctggtacta cttgtgcata454aagaggtatt cctc 468<210>2<211>109<212>PRT<213>小家鼠<400>2Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp1 5 10 15Gln Asp Glu Val Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn20 25 30Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln35 40 45Ala Phe Ala Pro Val Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu50 55 60Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln65 70 75 80Asp Pro Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu85 90 95Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His Asp Glu Leu Arg Arg100 105<210>3<211>764<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(26)..(676)<223>
<400>3ccccagctcc ttgcatactg ctacc atg gca tct ctc ttc tct gga cgc atc52Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile1 5ttg atc agg aac aac agc gac cag gat gaa gtg gag aca gag gca gag100Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp Gln Asp Glu Val Glu Thr Glu Ala Glu10 15 20 25ctg agc cgt agg tta gag aat cgt ctg gtg ttg ctg ttc ttc ggc gcc148Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala30 35 40
ggc gcc tgt ccc cag tgc cag gcc ttt gcc cca gtc ctc aaa gac ttc 196Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln Ala Phe Ala Pro Val Leu Lys Asp Phe45 50 55ttc gtg cgg ctc act gac gag ttc tac gtg ctg cgg gca gca cag ctg 244Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu60 65 70gcc ctg gtc tat gtg tcc cag gac cct aca gag gag caa cag gac ctc 292Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln Asp Pro Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu75 80 85ttc ctc agg gac atg cct gaa aaa tgg ctc ttc ctg ccg ttc cat gat 340Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His Asp90 95 100 105gaa ctg agg agg gac ctc ggg cgc cag ttc tct gtc cgt caa ctg cca 388Glu Leu Arg Arg Asp Leu Gly Arg Gln Phe Ser Val Arg Gln Leu Pro110 115 120gcg gtt gtg gta ctt aag cct ggt ggg gac gtg ctg aca agc gac gcc 436Ala Val Val Val Leu Lys Pro Gly Gly Asp Val Leu Thr Ser Asp Ala125 130 135acg gag gag atc cag cgt ctg gga ccc gcc tgc ttt gcc aac tgg cag 484Thr Glu Glu Ile Gln Arg Leu Gly Pro Ala Cys Phe Ala Asn Trp Gln140 145 150gag gcc gca gag ctc ctg gac cgc agc ttc ctg caa ccg gag gat ttg 532Glu Ala Ala Glu Leu Leu Asp Arg Ser Phe Leu Gln Pro Glu Asp Leu155 160 165gat gag cct gcg cgg cgc agc atc acc gag cct ctg cgc cgt cgc aag 580Asp Glu Pro Ala Arg Arg Ser Ile Thr Glu Pro Leu Arg Arg Arg Lys170 175 180 185tac cga gta gac cgg gat gtc ggc ggg agc ggg gcg aaa cgg cgc gac 628Tyr Arg Val Asp Arg Asp Val Gly Gly Ser Gly Ala Lys Arg Arg Asp190 195 200tct ggt gaa ccc cag ggg gac gcg ggt aca agg gcg gag ctc tgg tga 676Ser Gly Glu Pro Gln Gly Asp Ala Gly Thr Arg Ala Glu Leu Trp205 210 215ctcccagggt aggagtgggg accggagctc tggtgacacc aaagtaccgg tgcacgaccg736aggttgatga ccctcccgaa ggaaccgg 764<210>4<211>216<212>PRT<213>小家鼠
<400>4Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp1 5 10 15Gln Asp Glu Val Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn20 25 30Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln35 40 45Ala Phe Ala Pro Val Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu50 55 60Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln65 70 75 80Asp Pro Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu85 90 95Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His Asp Glu Leu Arg Arg Asp Leu Gly100 105 110Arg Gln Phe Ser Val Arg Gln Leu Pro Ala Val Val Val Leu Lys Pro115 120 125Gly Gly Asp Val Leu Thr Ser Asp Ala Thr Glu Glu Ile Gln Arg Leu130 135 140Gly Pro Ala Cys Phe Ala Asn Trp Gln Glu Ala Ala Glu Leu Leu Asp145 150 155 160Arg Ser Phe Leu Gln Pro Glu Asp Leu Asp Glu Pro Ala Arg Arg Ser165 170 175Ile Thr Glu Pro Leu Arg Arg Arg Lys Tyr Arg Val Asp Arg Asp Val180 185 190Gly Gly Ser Gly Ala Lys Arg Arg Asp Ser Gly Glu Pro Gln Gly Asp195 200 205Ala Gly Thr Arg Ala Glu Leu Trp210 215<210>5<211>353<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(24)..(353)<223>
<400>5
cccagcaccc aacccaggtt acc atg gcc tcc ctg ttc tct ggc cgc atc ctg53Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu1 5 10atc cgc aac aat agc gac cag gac gag ctg gat acg gag gct gag gtc 101Ile Arg Asn Asn Ser Asp Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val15 20 25agt cgc agg ctg gag aac cgg ctg gtg ctg ctg ttc ttt ggt gct ggg 149Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly30 35 40gct tgt cca cag tgc cag gcc ttc gtg ccc atc ctc aag gac ttc ttc 197Ala Cys Pro Gln Cys Gln Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe45 50 55gtg cgg ctc aca gat gag ttc tat gta ctg cgg gcg gct cag ctg gcc 245Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala60 65 70ctg gtg tac gtg tcc cag gac tcc acg gag gag cag cag gac ctg ttc 293Leu Val Tyr Val Ser Gln Asp Ser Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe75 80 85 90ctc aag gac atg cca aag aaa tgg ctt ttc ctg ccc ttt gag gat gat 341Leu Lys Asp Met Pro Lys Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp95 100 105ctg agg agg tga 353Leu Arg Arg<210>6<211>109<212>PRT<213>人<400>6Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp1 5 10 15Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu Glu Asn20 25 30Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln35 40 45Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu50 55 60Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln65 70 75 80Asp Ser Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met Pro Lys
85 90 95Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg100 105<210>7<211>686<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(48)..(686)<223>
<400>7ccggggacca cacgccgcgc tgtccccagc acccaaccca ggttacc atg gcc tcc56Met Ala Ser1ctg ttc tct ggc cgc atc ctg atc cgc aac aat agc gac cag gac gag104Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp Gln Asp Glu5 10 15ctg gat acg gag gct gag gtc agt cgc agg ctg gag aac cgg ctg gtg152Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu Val20 25 30 35ctg ctg ttc ttt ggt gct ggg gct tgt cca cag tgc cag gcc ttc gtg200Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln Ala Phe Val40 45 50ccc atc ctc aag gac ttc ttc gtg cgg ctc aca gat gag ttc tat gta248Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr Val55 60 65ctg cgg gcg gct cag ctg gcc ctg gtg tac gtg tcc cag gac tcc acg296Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln Asp Ser Thr70 75 80gag gag cag cag gac ctg ttc ctc aag gac atg cca aag aaa tgg ctt344Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met Pro Lys Lys Trp Leu85 90 95ttc ctg ccc ttt gag gat gat ctg agg agg gac ctc ggg cgc cag ttc392Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg Asp Leu Gly Arg Gln Phe100 105 110 115tca gtg gag cgc ctg ccg gcg gtc gtg gtg ctc aag ccg gac ggg gac440Ser Val Glu Arg Leu Pro Ala Val Val Val Leu Lys Pro Asp Gly Asp120 125 130gtg ctc act cgc gac ggc gcc gac gag atc cag cgc ctg ggc acc gcc488Val Leu Thr Arg Asp Gly Ala Asp Glu Ile Gln Arg Leu Gly Thr Ala
135 140 145tgc ttc gcc aac tgg cag gag gcg gcc gag gtg ctg gac cgc aac ttc536Cys Phe Ala Asn Trp Gln Glu Ala Ala Glu Val Leu Asp Arg Asn Phe150 155 160cag ctg cca gag gac ctg gag gac cag gag cca cgg agc ctc acc gag584Gln Leu Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gln Glu Pro Arg Ser Leu Thr Glu165 170 175tgc ctg cgc cgc cac aag tac cgc gtg gaa aag gcg gcg cga ggc ggg632Cys Leu Arg Arg His Lys Tyr Arg Val Glu Lys Ala Ala Arg Gly Gly180 185 190 195cgc gac ccc ggg gga ggg ggt ggg gag gag ggc ggg gcc ggg ggg ctg680Arg Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ala Gly Gly Leu200 205 210ttc tga686Phe<210>8<211>212<212>PRT<213>人<400>8Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp1 5 10 15Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu Glu Asn20 25 30Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln35 40 45Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu50 55 60Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln65 70 75 80Asp Ser Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met Pro Lys85 90 95Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg Asp Leu Gly100 105 110Arg Gln Phe Ser Val Glu Arg Leu Pro Ala Val Val Val Leu Lys Pro115 120 125Asp Gly Asp Val Leu Thr Arg Asp Gly Ala Asp Glu Ile Gln Arg Leu130 135 140
Gly Thr Ala Cys Phe Ala Asn Trp Gln Glu Ala Ala Glu Val Leu Asp145 150 155 160Arg Asn Phe Gln Leu Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gln Glu Pro Arg Ser165 170 175Leu Thr Glu Cys Leu Arg Arg Hig Lys Tyr Arg Val Glu Lys Ala Ala180 185 190Arg Gly Gly Arg Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ala195 200 205Gly Gly Leu Phe210<210>9<211>600<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(265)..(570)<223>
<400>9ataaaataga gggtgggaga ggttgatggc gtggctctgc tttttggtgc ggggcaccca60gctgtcatcg ctgctgtcgc agcttctgga gtggccactg tgctctctcc tcccttcggc120tcaaggtgag ctgttccagc agaaggcggg gctgagaggc gcctagtgct gcgggaggct180cagtgtcatc ttccagctaa caggtggccg tgcagcccag ggctcgtctc tccactgtgt240cctcttcacg ccgagctcgt ggcg atg gtg gac gtg ctg ggc ggg cgg cgc 291Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg1 5ctg gtg acc cgg gag ggc acg gtg gtg gag gcc gag gtg gcg ctg cag 339Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gln10 15 20 25aac aag gtg gta gct ttg tac ttt gcg gcg ggc cgg tgc tcg ccc agc 387Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser30 35 40cgc gac ttc acg ccg ctg ctc tgc gac ttc tac acg gag ctg gtg agc 435Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Val Ser45 50 55gag gcg cgg cgg ccc gct ccc ttc gag gtg gtt ttc gtg tcg gca gac 483Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp60 65 70
ggc agt gcg gag gag atg ttg gac ttc atg cgc gag ctg cac ggc tcc 531Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser75 80 85tgg ctg gca ttg ccc ttc cac gac ccc tac cgg cag tga gtggggaccc 580Trp Leu Ala Leu Pro Phe His Asp Pro Tyr Arg Gln90 95 100aggggtcatg gggctggcgc600<210>10<211>101<212>PRT<213>小家鼠<400>10Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr1 5 10 15Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr20 25 30Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu35 40 45Cys Agp Phe Tyr Thr Glu Leu Val Ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro50 55 60Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu65 70 75 80Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His85 90 95Asp Pro Tyr Arg Gln100<210>11<211>1164<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(300)..(770)<223>
<400>11ttgactctgg tgggtagaga gggtttgcaa ggcaggataa aatagagggt gggagaggtt60gatggcgtgg ctctgctttt tggtgcgggg caccagctgt catcgctgct gtcgcagctt120ctggagtggc cactgtgctc tctcctccct tcggctcaag gtgagctgtt ccagcagaag180
gcggggctga gaggcgccta gtgctgcggg aggctcagtg tcatcttcca gctaacaggt240ggccgtgcag cccagggctc gtctctccac tgtgtcctct tcacgccgag ctcgtggcg 299atg gtg gac gtg ctg ggc ggg cgg cgc ctg gtg acc cgg gag ggc acg 347Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr1 5 10 15gtg gtg gag gcc gag gtg gcg ctg cag aac aag gtg gta gct ttg tac 395Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr20 25 30ttt gcg gcg ggc cgg tgc tcg ccc agc cgc gac ttc acg ccg ctg ctc 443Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu35 40 45tgc gac ttc tac acg gag ctg gtg agc gag gcg cgg cgg ccc gct ccc 491Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Val Ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro50 55 60ttc gag gtg gtt ttc gtg tcg gca gac ggc agt gcg gag gag atg ttg 539Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu65 70 75 80gac ttc atg cgc gag ctg cac ggc tcc tgg ctg gca ttg ccc ttc cac 587Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His85 90 95gac ccc tac cgg cat gaa ctg aag aag agg tac gaa atc acc gcc atc 635Asp Pro Tyr Arg His Glu Leu Lys Lys Arg Tyr Glu Ile Thr Ala Ile100 105 110ccc aag ctg gtg gtc atc aag cag aac gga gct gtc atc acc aac aaa 683Pro Lys Leu Val Val Ile Lys Gln Asn Gly Ala Val Ile Thr Asn Lys115 120 125ggg cgg aag cag atc cga gag cgc ggg cta gct tgc ttt cag aac tgg 731Gly Arg Lys Gln Ile Arg Glu Arg Gly Leu Ala Cys Phe Gln Asn Trp130 135 140gtg gaa gca gcc gat gtt ttc caa aac ttc tcg ggg tga ccagggcagt 780Val Glu Ala Ala Asp Val Phe Gln Asn Phe Ser Gly145 150 155tgctggaagt tcagggcaac tatcttcaaa aagggcttag ctggttccct tctctgctga840ggaatgtcat tgtagagtca ccatgctgtg acagagagca taaactgctc aggaaagaac900tscgtctgcc ccctgtgggt cctagagctc cgttgaatgt ttatttctta cacctttctc960caccggtgcc taggatccag gacacatcag ccacgagtta scagsactct atgcaagatg1020ctctttccta caggaaattt ctttgataaa ttgacctatg gaggtgatac attttctgat1080
gacatttttg tgatgctttg gtaaacgtat ttattactcg ggtttgtaga ctgtgtaatt1140taataaacca acactcacac tttg 1164<210>12<211>156<212>PRT<213>小家鼠<400>12Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr1 5 10 15Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr20 25 30Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu35 40 45Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Val Ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro50 55 60Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu65 70 75 80Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His85 90 95Asp Pro Tyr Arg His Glu Leu Lys Lys Arg Tyr Glu Ile Thr Ala Ile100 105 110Pro Lys Leu Val Val Ile Lys Gln Asn Gly Ala Val Ile Thr Asn Lys115 120 125Gly Arg Lys Gln Ile Arg Glu Arg Gly Leu Ala Cys Phe Gln Asn Trp130 135 140Val Glu Ala Ala Asp Val Phe Gln Asn Phe Ser Gly145 150 155<210>13<211>1472<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(331)..(738)<223>
<400>13gtgtgggcgg ggcgcagttg ggggagggtg cagagacctg agggcttgag gttgcctggc60
tggccccgct cccagaggcg ggtgccgcgc tgtcgcccag gtatctgggg tctctggtgt120ctgagtgtct cattgtcggc gcgaacacaa ttgctccagc cacaggcgag gcctggccaa180ggtgtgggcg catctagggc aggtcttgag aggtccagcg cccggtggtg cggacagagg240cggggcaccg cggcgctcgc cgccgcctcc ccgcaggtga tcatcctcct gcaggtgtcc300tcgggtctca ggtggctgcg tgtctgcgcc atg gtt gac att ctg ggc gag cgg 354Met Val Asp Ile Leu Gly Glu Arg1 5cac ctg gtg acc tgt aag ggc gcg acg gtg gag gcc gag gcg gcg ctg 402His Leu Val Thr Cys Lys Gly Ala Thr Val Glu Ala Glu Ala Ala Leu10 15 20cag aac aag gtg gtg gca ctg tac ttc gcg gcg gcc cgg tgc gcg ccg 450Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Ala Arg Cys Ala Pro25 30 35 40agc cgc gac ttc acg ccg ctg ctc tgc gac ttc tat acg gcg ctg gtg 498Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val45 50 55gcc gag gcg cgg cgg ccc gcg ccc ttc gaa gtg gtc ttc gtg tca gcc 546Ala Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala60 65 70gac ggc agc tgc cag gag atg ctg gac ttc atg cgc gag ctg cat ggc 594Asp Gly Ser Cys Gln Glu Met Leu Asp Phe MetArg Glu Leu His Gly75 80 85gcc tgg ctg gcg ctg ccc ttc cac gac ccc tac cgg caa cgg agt ctc 642Ala Trp Leu Ala Leu Pro Phe His Asp Pro Tyr Arg Gln Arg Ser Leu90 95 100gct ctg ttg ccc agg ctg gag tgc agt ggc gtg atc tta gct cac tgc 690Ala Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys Ser Gly Val Ile Leu Ala His Cys105 110 115 120aac ctt tgc ctc ctg ggt tca agt gat tct cta gcc tta gcc tcc tga 738Asn Leu Cys Leu Leu Gly Ser Ser Asp Ser Leu Ala Leu Ala Ser125 130 135gcatctggga ctacagccat tgctgtgaat tacgtgaggg aaagatattg aagaggagtt798ggacactccg agagtgcagc tgttctcccc ccgcaccatc cgtgtcctgc attctgcgag858tctgtgctca ttaacaatgt gctgtgacca tgtgactcag caatcctgct gctgggtata918tacccgaaag aaaggaaaag gaagccagta tattgaagag gtatctgcac ccccatgttt978attgcagcac tgttcacaac agccaagatt tggaagcaac ctaagtgtcc atcaacagat1038
gaatggataa agaaaacgtg gtacatatac acaatggagt actcttcagc cattaaaaaa1098atgagattct gtcatttgca ataatataga tggaaaagga ggcccttatg tgaagtgaaa1158taagccaggc acagaaagac aaacatcaca tgttctcact tatttgtggg atctaatgat1218caaaacaatt gaactcttgg acatagagag tagaaggttg gttaccagaa gctggaaagg1278aaagtggggt tgggaggaag gtgggaatgg ttaataggta caaaaaaata caaagaataa1338ataagaccta atatttgata gcacaacagt gtgactactg tcaataatca tttaattgta1398catttaaaaa taactataat tgcattgttt gtaacacaaa agataaatgc ttgaggagaa1458aaaaaaaaaa aaaa 1472<210>14<211>135<212>PRT<213>人<400>14Met Val Asp Ile Leu Gly Glu Arg His Leu Val Thr Cys Lys Gly Ala1 5 10 15Thr Val Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr20 25 30Phe Ala Ala Ala Arg Cys Ala Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu35 40 45Cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val Ala Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro50 55 60Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Cys Gln Glu Met Leu65 70 75 80Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ala Trp Leu Ala Leu Pro Phe His85 90 95Asp Pro Tyr Arg Gln Arg Ser Leu Ala Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys100 105 110Ser Gly Val Ile Leu Ala His Cys Asn Leu Cys Leu Leu Gly Ser Ser115 120 125Asp Ser Leu Ala Leu Ala Ser130 135<210>15<211>702<212>DNA<213>小家鼠
<400>15atcggatcct ctctgggtcc ccagctcctt gcatactgct accatggcat ctctcttctc60tggscgcatc ttgatcagga acaacagcga ccaggatgaa gtggagacag aggcagagct120gagccgtagg ttagagaatc gtctggtgtt gctgttcttc ggcgccggcg cctgtcccca180gtgccaggcc ttgccccagt cctcaaagac ttcttcgtgc ggctcactga cgagttctac240gtgctgcggg cagcacagct ggccctggtc tatgtgtccc aggaccctac agaggagcaa300caggacctct tcctcaggga catgcctgaa aaatggctct tcctgccgtc ccactgatga360actgaggagg tgaggcccca gggaagacca gggagggctt cctggagaag gcatttccct420ggaggtttac tgtcctggta ctacttgtgc actaaagagg tattcctcca caccaaccac480aggcgacaac aacacacaag aggtgtccca tccgctcttc catcacagcc cactgacgcc540agacagcatc gcgscgctca cggctcagaa aaacacaggt agtctcacag gcctgccatc600ctaatactgg ccaccctgag cacaagagcg atggctacaa gcctcaaggc tagaatctaa660aaccacgagg tggggaccgt aggccccact ccccgggagc gc 702<210>16<211>387<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>16cggccgctta attaagscgg atccccgact scgtagtcgg gaattcggca cgaggggccg60catcttgatc aggaacaaca gcgaccagga tgaagtggag acagaggcag agctgagccg120ccggttagag aatcgtcttg tgctactgtt cttcggtgct ggggcctgtc cccagtgcca180ggccttcgcc ccagtcctca aagacttctt cgtgcggctc actgatgagt tctacgtgct240scgggcagca cagctggccc tggtctatgt gtcccaggac cctacagagg agcaacagga300cctgttcctc cgggacatgc ctgaaaagtg gctcttcctg ccgttccatg atgacctgag360gagagacctc gggcgccagt tctccgt387<210>17<211>759<212>DNA<213>小家鼠<400>17cagctccttg catactgcta ccatggcatc tctcttctct ggacgcatct tgatcaggaa60caacagcgsc caggatgaag tggagacaga ggcagagctg agccgtaggt tagagaatcg120
tctggtgtgc tgttcttcgg cgccggcgcc tgtccccagt gccaggcctt gccccagtcc180tcaaagactt cttcgtgcgg ctcactgacg agttctacgt gctgcgggca gcacagctgg240ccctggtcta tgtgtcccag gaccctacag aggagcaaca ggacctcttc ctcagggaca300tgcctgaaaa atggctcttc ctgccgttcc atgatgaact gaggagggac ctcgggcgcc360agttctctgt ccgtcaactg ccagcggttg tggtacttaa gcctggtggg gacgtgctga420caagcgacgc cacggaggag atccagcgtc tgggacccgc ctgctttgcc aactggcagg480aggccgcaga gctcctggac cgcagcttcc tgcaaccgga ggatttggat gagcctgcgc540ggcgcagcat caccgagcct ctgcgccgtc gcaagtaccg agtagaccgg gatgtcggcg600ggagcggggc gaaacggcgc gactctggtg aaccccaggg ggacgcgggt acaagggcgg660agctctggtg actcccaggg taggagtggg gaccggagct ctggtgacac caaagtaccg720gtgcacgacc gaggttgatg accctcccga aggaaccgg 759<210>18<211>443<212>DNA<213>褐家鼠<220>
<221>misc_feature<222>(46)..(46)<223>任何核苷酸<400>18acgaggtcaa ccttggctac acagggagtc tgaggacagc atgggntaca agaaaccctc60tctcaaaacc aaacaaggcc tggcagtact agtgcacttg ggaggcagag gaacaacagc120gaccaggatg aagtggagac agaggcagag ctgagccgcc ggttagagaa tcgtcttgtg180ctactgttct tcggtgctgg ggcctgtccc cagtgccagg ccttcgcccc agtcctcaaa240gacttcttcg tgcggctcac tgatgagttc tacgtgctac gggcagcaca gctggccctg300gtctatgtgt cccaggaccc tacagaggag caacaggacc tgttcctccg ggacatgcct360gaaaagtggc tcttcctgcc gttccatgat gacctgagga gtaataaaaa ttagaggttg420tggctcaaaa aaaaaaaaaa aaa443<210>19<211>889<212>DNA<213>人
<400>19acgccgcgct gtccccagca cccaacccag gttaccatgg cctccctgtt ctctggccgc60atcctgatcc gcaacaatag cgaccaggac gagctggata cggaggctga ggtcagtcgc120aggctggaga accggctggt gctgctgttc tttggtgctg gggcttgtcc acagtgccag180gccttcgtgc ccatcctcaa ggacttcttc gtgcggctca cagatgagtt ctatgtactg240cgggcggctc agctggccct ggtgtacgtg tcccaggact ccacggagga gcagcaggac300ctgttcctca aggacatgcc aaagaaatgg cttttcctgc cctttgagga tgatctgagg360agggacctcg ggcgccagtt ctcagtggag cgcctgccgg cggtcgtggt gctcaagccg420gacggggacg tgctcactcg cgacggcgcc gacgagatcc agcgcctggg caccgcctgc480ttcgccaact ggcaggaggc ggccgaggtg ctggaccgca acttccagct gccagaggac540ctggaggacc aggagccacg gagcctcacc gagtgcctgc gccgccacaa gtaccgcgtg600gaaaaggcgg cgcgaggcgg cgcgacccgg gggaggggct ggggacggag gccggggccc660ggggggctgt actgaccgct gggtggagca gagggagggg gattggtgga agaacaacaa720ccacacgcag ccagcaccag gtatcccgac taggggagac agggcgaaga cctgacccaa780agcacaacca ccggggacac taaacgactc aactcaatcc tgtgggcacc aggacaccgc840aaaaaaaaac aaaaaaagca aaatgcaaaa aaagacagga catacgacg889<210>20<211>348<212>DNA<213>人<400>20tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc60acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg120tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct180gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct240tcgtgtcagc cgacggcagc tcccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg300cctggctggc gctgcccttc cacgacccct accggcacca ttgctgtg 348<210>21<211>340<212>DNA<213>人
<400>21tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc60acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg120tggcactgta cttcgcggcg gccggtgcgc gccgagccgc gattcacgcc gctgctctgc180gacttctata cggcgctggt ggccgagcgc ggggccgcgc cttcgaagtg gtcttcgtgt240cagccgacgg cagctcccag gagatgctgg acttcatgcg cgagctgatg gcgcctggct300ggcgctgcct tccacgaccc ctaccggcac agccggagcc 340<210>22<211>348<212>DNA<213>人<400>22tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc60acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg120tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct180gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct240tcgtgtcagc cgacggcagc tgccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg300cctggctggc gctgcccttc cacgaaccct accggcaacg gagtctcg 348<210>23<211>350<212>DNA<213>人<400>23tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc60acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg120tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct180gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct240tcgtgtcagc cgacggcagc tgccaggaga tgcttggact tcatgcgcga gctgcattgc300gcctggcttg gcgctgccct tccacgaccc ctaccggcaa cggagtctcg 350<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>24tctatgtgtc ccaggaccct acag 24<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>25tttatgcaca agtagtacca ggacag26<210>26<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26cgggatccat ggcatctctc ttctctggac gc 32<210>27<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>27ggaattctca cctcctcagt tcatcatgga a 31<210>28<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>銜接物(Adaptor)<400>28tgttaccaat ctgaagtggg agcggccgac aatttttttt tttttttttt 50<210>29<211>14<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>銜接物<400>29aattcggcac gagg 14<210>30<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>銜接物<400>30cctcgtgccg 10<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31gtaatacgac tcactatagg gc22<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32ctattacgtc aagcctgtag cc22<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33catcctcatc tttcttccct tc22<210>34<211>22
<212>DNA<213>人工序列<400>34gccagcgttt tctgcctttt sc22<210>35<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>35aagccctgcc tgctctaaca tc2權(quán)利要求
1.分離的多肽，其包含選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示多肽的氨基酸序列。
2.分離的多肽，其由選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示多肽的氨基酸序列組成。
3.分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求2的多肽的核苷酸序列。
4.宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子。
5.載體分子，其含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的DNA的至少一個(gè)片斷。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體分子，其含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
7.分離的核酸分子，其含有在高嚴(yán)緊條件下與權(quán)利要求3的分離的DNA雜交的核苷酸序列。
8.宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體分子。
9.脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞，其可以在體外增殖并且能夠在培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述細(xì)胞含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其中所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列調(diào)控編碼權(quán)利要求1的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA序列為非人轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
11.診斷人視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，其包括檢測(cè)人眼中可翻譯成RDCVF1或RDCVF2多肽的信使RNA的轉(zhuǎn)錄下降，其中通過(guò)所述轉(zhuǎn)錄下降可以用于診斷該人患有視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良。
12.診斷人視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，其包括測(cè)量人視桿細(xì)胞中RDCVF1或RDCVF2多肽或其片斷的量，其中所述多肽或其片斷的量與正常眼組織中所述多肽或其片斷的量相比顯示下降可以用于診斷該人患有視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括使所述組織與特異性結(jié)合RDCVF1或RDCVF2多肽或其片斷的抗體接觸，并檢測(cè)所述抗體與所述組織中多肽的特異結(jié)合，其中與多肽的特異結(jié)合的檢測(cè)結(jié)果指示RDCVF1或RDCVF2多肽或其片斷的存在。
14.可以與含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14所示氨基酸序列的多肽或其片斷特異性結(jié)合的純化的抗體或它的片斷。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體片斷，其為Fab或F(ab’)2片斷。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體，其為多克隆抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體，其為單克隆抗體。
18.用于人視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良診斷的試劑盒，其包括采集樣品的手段和根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體。
19.生產(chǎn)RDCVF1或RDCVF2多肽的方法，其包括將其中含有包含外源RDCVF1或RDCVF2編碼多核苷酸的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞在足以使RDCVF1或RDCVF2多肽在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，由此產(chǎn)生表達(dá)的多肽；并將所述細(xì)胞產(chǎn)生的多肽回收。
20.預(yù)防或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于變性的方法，其包括利用載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，其中所述載體含有可操作地連接至轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列上的編碼RDCVF1或RDCVF2多肽的核酸序列；并在所述細(xì)胞中表達(dá)所述多肽。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞為視網(wǎng)膜細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中載體為來(lái)自腺病毒或腺伴隨病毒的載體。
23.視網(wǎng)膜保護(hù)劑，其含有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQID NO14的多肽以及任選地可藥用載體。
24.視網(wǎng)膜保護(hù)劑，其含有治療有效量的選自SEQ ID NO1、SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13的核酸以及任選地可藥用載體。
25.藥物組合物，其含有治療有效量的多肽和可藥用載體，其中所述多肽選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14。
26.藥物組合物，其含有治療有效量的核酸和可藥用載體，其中所述核酸選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13。
27.治療視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，其包括向有需要的對(duì)象施用治療有效量的多肽和可藥用載體，所述多肽選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ ID NO14。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其用于治療色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)的黃斑變性、巴比綜合征、巴科綜合征、貝斯特病、脈絡(luò)膜瘤、螺旋狀萎縮、先天性黑矇、雷夫敘姆綜合征、青年遺傳性黃斑變性或厄舍綜合征。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于早期診斷、監(jiān)測(cè)和治療視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、年齡相關(guān)的黃斑變性、巴比綜合征、巴科綜合征、貝斯特病、脈絡(luò)膜瘤、螺旋狀萎縮、先天性黑矇、雷夫敘姆綜合征、青年遺傳性黃斑變性和厄舍綜合征的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)“Rdcvfl”，該蛋白質(zhì)在患有視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良等疾病，例如視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良和年齡相關(guān)的黃斑變性的患者中與在非患者中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)不同；本發(fā)明還涉及識(shí)別該蛋白質(zhì)的抗體和診斷這些病癥的方法。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1529753SQ02809470
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2002年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者T·萊韋拉德, T 萊韋拉德, J·A·薩赫勒, 薩赫勒, S·莫昂－賽德, 賽德, D·?？怂? 慫 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司, 路易斯巴斯德大學(xué)