專利名稱：來自乳酸菌的脂磷壁酸及其調(diào)節(jié)革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌介導(dǎo)的免疫應(yīng) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物，所述免疫應(yīng)答由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)，所述組合物包含來自乳酸菌的脂磷壁酸作為活性成分。本發(fā)明也涉及作為活性成分的來自乳酸菌的脂磷壁酸和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或其培養(yǎng)物上清，在制備用于美容、皮膚或眼部應(yīng)用的藥物、口部或局部產(chǎn)品，用于在胃腸道、骨、皮膚、眼、耳、肺和口腔中調(diào)節(jié)細菌定殖、免疫應(yīng)答、降低與細菌介導(dǎo)的疾病和感染有關(guān)的炎癥過程的食品或?qū)櫸锸称分械挠猛?。本發(fā)明也涉及特定的脂磷壁酸。
背景技術(shù)：
在分娩時，先前無菌的胎腸被大量的微生物接種體定殖(colonisation)。在胃腸道的特定區(qū)域中建立起穩(wěn)定的種群之前，腸微生物區(qū)(microflora)的建立在生命的第一天是非?；钴S的過程。存在相繼的定殖，首先是大腸桿菌和鏈球菌(Mata，L.J.和J.J.Urrutia，1971，Ann N Y Acad Sci 17693-108)，隨后是bifidogenic微生物區(qū)，這在喂奶的嬰兒中是非常明顯的，提供了對潛在病原體的某些保護(Gibson，G.R.和X.Wang，1994，J Appl Bacteriol，77412-420)。
乳酸菌(LAB)如乳桿菌和雙歧桿菌是成人胃腸道的正常習(xí)居菌。這些菌屬的特定菌株(稱為益生菌(probiotics))在口服給宿主后對健康有益(Brassart，D.和E.J.Schiffrin，1997，Trends Food Sci Technol9321-326)。如共生的LAB那樣，益生菌拮抗病原生物體，并刺激免疫防御機制。雖然產(chǎn)生這些生物作用的準確機制很少為人所知，但廣泛接受的是最有利于健康的菌株是那些可能通過細胞壁中的脂磷壁酸(LTA)而與腸上皮短暫粘附的菌株。
LTA是一種與疏水的脂部分連接的復(fù)合甘油-磷脂聚合物(Fischer，W.1990，細菌磷糖脂和脂磷壁酸，糖脂，磷糖脂和硫糖脂，M.Kates，編輯Hanahan，D.J.，紐約和倫敦，123-234)。它是大多數(shù)革蘭氏陽性菌的細胞壁成分。雖然不同細菌的LTA差別很大，但它的結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性生物體的細胞壁中發(fā)現(xiàn)的LPS類似。
雖然革蘭氏陰性菌的LPS以其對免疫細胞的前炎性效應(yīng)為人們所知，但用革蘭氏陽性生物體的LTA進行的工作很少。似乎只有特定細菌的LTA才具有這樣的效應(yīng)(Suda，Y.等，1995，F(xiàn)EMS ImmunolMed Microbiol 1297-112；Arakaki，R.等，1998，F(xiàn)EMS Immunol MedMicrobiol 22283-291)。
雖然革蘭氏陽性菌的LTA隨細菌菌株的不同而呈現(xiàn)極大的差異，它與革蘭氏陰性生物體的細胞壁中存在的LPS有結(jié)構(gòu)上的相似性。模式識別受體(Pattern Recognition Receptor，PRR)識別細菌結(jié)構(gòu)的保守區(qū)和細菌接種體存在的宿主信號。CD14(一種骨髓細胞中存在的糖基磷脂酰肌醇(GPI)固著性糖蛋白)是一種這樣的受體?，F(xiàn)已知道它能結(jié)合LTA和LPS。實際上，由革蘭氏陰性生物體引起的敗血癥是通過與單核細胞-巨噬細胞膜上的CD14結(jié)合的LPS產(chǎn)生的。越來越多的證據(jù)表明CD14受體的可溶形式介導(dǎo)LPS與CD14陰性細胞的結(jié)合。然而，該分子也識別其他細菌成分，例如肽聚糖、脂阿拉伯甘露聚糖和manuronic酸聚合物(Dziarski，R.等，2000，Chem Immunol.7483-107)。我們已報道了在用非致病性的大腸桿菌或其LPS攻擊之后，人乳中存在的CD14的可溶形式(sCD14)刺激人腸上皮細胞(IECs)釋放細胞因子(Labeta，M.O.等，2000，J Exp Med 1911807-1812)，但在用革蘭氏陽性細菌或其細胞壁成分攻擊之后不行。
本發(fā)明的目的是提供一種組合物，它能在人或動物的胃腸道、骨、皮膚、眼、肺、耳和口腔中調(diào)節(jié)與細菌定殖或感染有關(guān)的免疫應(yīng)答、防止或減少由此產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。
發(fā)明概述相應(yīng)地，本發(fā)明的第一方面提供一種組合物，其含有來自乳酸菌的脂磷壁酸作為活性成分，用于調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
含有來自乳酸菌的脂磷壁酸的組合物能夠維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，防止或降低由革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)的炎癥過程和/或LPS介導(dǎo)的失調(diào)。它也可用于抗致病或可能致病的革蘭氏陽性菌和/或LTA介導(dǎo)的失調(diào)。
實際上，已發(fā)現(xiàn)來自乳酸菌菌株(例如約氏乳桿菌La1菌株和嗜酸乳桿菌La10菌株)的LTA對用LPS或完整的大腸桿菌攻擊的IECs的響應(yīng)有拮抗作用，其中所述LPS純化自大腸桿菌和腸炎沙門氏菌。此外，當來自兩種乳桿菌菌株中任一種的LTA與LPS同時存在于人乳中時，LPS-sCD14介導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生被抑制。
所述組合物可以是藥物、口部或局部美容用品、皮膚或眼部產(chǎn)品、食品或?qū)櫸锸称方M合物。它對胃腸道、骨、皮膚、眼、肺、耳和口腔中與細菌介導(dǎo)的疾病或LPS介導(dǎo)的失調(diào)有關(guān)的炎癥過程有作用，可用于調(diào)節(jié)細菌在上述組織中定殖和免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一方面提供來自乳酸菌的脂磷壁酸。通過它們結(jié)合CD14的能力以及它們不能誘導(dǎo)從IECs中前炎性細胞因子(例如IL-8或TNF-α)的釋放來篩選它們。
當口服時，本發(fā)明的脂磷壁酸不僅可在胃腸道中，而且也可在骨、皮膚、眼、耳、肺和口腔中維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)節(jié)細菌定殖，或定靶(target)細菌介導(dǎo)的疾病和感染或LTA/LPS介導(dǎo)的疾病。
相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面提供至少一種來自乳酸菌的脂磷壁酸在制備用于調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的組合物中的用途。脂磷壁酸可用于制備用于在人或動物中降低與細菌介導(dǎo)的疾病或LTA/LPS介導(dǎo)的失調(diào)有關(guān)的炎癥過程的藥物、局部產(chǎn)品(例如乳膏或洗劑)、食品或?qū)櫸锸称方M合物。
本發(fā)明的另一方面提供在人或動物中調(diào)節(jié)上述應(yīng)答的方法，其包括施用有效量的來自乳酸菌的脂磷壁酸或含有它的組合物。
另一方面，本發(fā)明提供在寵物動物中調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性細菌、可能致病的革蘭氏陽性細菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括給寵物動物施用一種組合物，所述組合物含有能夠調(diào)節(jié)所述應(yīng)答的益生菌菌株的一部分。
所述方法可包括給寵物動物施用一種組合物，所述組合物含有益生菌、其培養(yǎng)物上清或其代謝物，所述益生菌能夠至少暫時粘附至寵物動物的腸上皮。
在一個實施方案中，所述方法包括施用作為營養(yǎng)平衡食品的組分的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，該組分包含在濕或干的寵物食品制備物中。
本發(fā)明的最后一個方面涉及寵物食品制備物，它包含營養(yǎng)平衡食品和一種活性成分，所述活性成分具有調(diào)節(jié)在寵物動物中由革蘭氏陰性菌菌株、可能致病的革蘭氏陽性菌菌株和/或其衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。
在一個實施方案中，活性成分包含具有LTA的微生物。LTA優(yōu)選地存在于所述微生物的細胞壁中。
所述微生物優(yōu)選地是能夠暫時粘附到攝食了該微生物的寵物的腸上皮的益生菌。在優(yōu)選的實施方案中，微生物是乳酸菌。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是提供了調(diào)節(jié)針對革蘭氏陰性生物體、致病或可能致病的革蘭氏陽性生物體或它們的衍生物L(fēng)PS或LTA的免疫應(yīng)答的手段，特別是降低炎癥過程的手段，所述炎癥過程例如IEC產(chǎn)生前炎性細胞因子，例如IL-8、TNF-α和來源于上皮細胞的嗜中性粒細胞激活蛋白(ENA)。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是提供一種通過例如降低前炎性細胞因子(例如IL-8和TNF-α)的釋放而下調(diào)(down-regulate)巨噬細胞炎癥應(yīng)答的手段。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是通過單純食用本發(fā)明的食品組合物，可以提高哺乳動物中的保護性免疫過程，降低有害的炎癥和感染的風(fēng)險。應(yīng)意識到靜脈或皮下施用藥物需要專業(yè)技能，而且與口服相比不安全、不方便、更難被患者接受。因此，本發(fā)明的可以口服的營養(yǎng)和/或治療產(chǎn)品具有明顯的優(yōu)點。
此外，本發(fā)明使用來自食品級細菌的LTA，具有GRAS(GenerallyRegarded As Safe，一般認為是安全的)狀況，提供了一些歸因于益生菌的優(yōu)點。因此，本發(fā)明可用于無菌藥品(sterile medicaments)、用于臨床失調(diào)的腸內(nèi)和局部組合物和不能使用活的益生菌的感染。
發(fā)明詳述在下面的描述中使用了以下縮寫ENA-78來源于上皮細胞的嗜中性粒細胞激活蛋白-78；HM人乳；IECs腸上皮細胞；IL白介素；LPS脂多糖；LTA脂磷壁酸；mAb單克隆抗體；PBMC外周血單核細胞；PRR模式識別受體；TNF腫瘤壞死因子。
最后，“NCC”表示雀巢培養(yǎng)物保藏機構(gòu)(雀巢研究中心，Vers-chez-les-Blanc，洛桑，瑞士)。
本發(fā)明的第一方面涉及一種組合物，其含有來自乳酸菌的脂磷壁酸，用于調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，特別是炎癥過程。
所述炎癥過程可被革蘭氏陰性菌(例如埃希氏菌、螺桿菌、沙門氏菌)和/或其LPS誘導(dǎo)；它們也可被致病或可能致病(即在某些條件下致病)的革蘭氏陽性菌誘導(dǎo)。
優(yōu)選地，來自乳酸菌的脂磷壁酸具有結(jié)合CD14的能力，不具有誘導(dǎo)IECs釋放前炎性因子(例如IL-8或TNF-α)的能力。脂磷壁酸應(yīng)含有其脂質(zhì)部分。
優(yōu)選地，脂磷壁酸分離自乳桿菌、雙歧桿菌或鏈球菌屬細菌，例如嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、酪乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌；最優(yōu)選約氏乳桿菌La1菌株(NCC 533)、嗜酸乳桿菌La10菌株(NCC 90)和加氏乳桿菌(NCC 2493)。
約氏乳桿菌NCC 533菌株、嗜酸乳桿菌NCC 90菌株已分別于92年6月30日和99年10月12日保藏于巴斯德研究所(23 rue du DocteurRoux，F(xiàn)-75024 Paris cédex 15，F(xiàn)RANCE)，保藏號分別為CNCM I-1225和CNCM I-2332。
在最優(yōu)選的實施方案中，來自乳酸菌的LTA可與例如sCD14的分子結(jié)合使用。
脂磷壁酸和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或其培養(yǎng)物上清可被摻入干的或液態(tài)的食品組合物或腸飼(enteral feeds)，用于嬰兒營養(yǎng)、寵物營養(yǎng)和動物飼料，用于臨床營養(yǎng)和藥物應(yīng)用。
它也可以以局部(乳膏和藥膏)或口腔制備物形式用于美容或皮膚應(yīng)用、眼部應(yīng)用(洗眼液)或口腔應(yīng)用(漱口液、牙膏)。LTA可用于預(yù)防耳部感染。此外，產(chǎn)品中的LTA可用于預(yù)防LPS介導(dǎo)的骨失調(diào)。
相應(yīng)地，所述組合物可以是藥物、口部或局部化妝品、皮膚或眼部制備物、食品或?qū)櫸锸称方M合物。
脂磷壁酸的使用量可以變化，但相應(yīng)于食品組合物中的細菌水平，可從105cfu/g至大約1011cfu/g，最優(yōu)選從大約107cfu/g至109cfu/g。對于藥物制備物而言，LTA的量可以變化并相應(yīng)于細菌的量，可從105cfu/g至1016cfu/g，優(yōu)選從大約107cfu/g至1010cfu/g。
它對胃腸道、骨、皮膚、眼、耳、肺或口腔中與細菌介導(dǎo)的疾病或LTA/LPS介導(dǎo)的失調(diào)有關(guān)的炎癥過程有作用。
最特別地，這些產(chǎn)品能改變細菌定殖和新生兒感染，以及嬰兒的免疫能力(competence)，用于臨床營養(yǎng)，用于治療敗血癥、細菌移位(translocation)、炎癥、感染和疾病以及細菌過度生長。
在優(yōu)選的實施方案中，所述組合物可以是完全的、營養(yǎng)平衡的食品或?qū)櫸锸称贰Ｋ部梢允抢缡称诽砑游铩?br> 如果制得的食品組合物是用于人的，它可以是營養(yǎng)完全的嬰兒食品(formula)、奶制品、冷藏的或貨架穩(wěn)定的飲料、湯、食品添加物、膳食替代品、營養(yǎng)條棒(bar)或糖果。
除了脂磷壁酸和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或其培養(yǎng)物上清之外，根據(jù)本發(fā)明，營養(yǎng)嬰兒食品可包含蛋白源。優(yōu)選地用食品蛋白(dietaryproteins)作為蛋白源。食品蛋白可以是任何適合的食品蛋白，例如動物蛋白(如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)、植物蛋白(例如大豆蛋白、小麥蛋白、稻米蛋白和豌豆蛋白)、游離氨基酸的混合物、或它們的組合。乳蛋白例如酪蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白是特別優(yōu)選的。所述組合物也可含有碳水化合物源和脂肪源。
如果營養(yǎng)嬰兒食品包括脂肪源，該脂肪源優(yōu)選提供營養(yǎng)嬰兒食品的大約5％至大約55％的能量，例如大約20％至大約50％的能量。組成脂肪源的液體可以是任何適當?shù)闹净蛑窘M合物。植物脂肪是特別優(yōu)選的，例如豆油、棕櫚油、椰子油、紅花油、葵花油、玉米油、canola油、卵磷脂等。如果需要的話可以添加動物脂肪例如奶類脂肪。
可向營養(yǎng)嬰兒食品中添加碳水化合物源。它優(yōu)選地提供營養(yǎng)組合物的大約40％至大約80％的能量?？梢允褂萌魏芜m當?shù)奶妓衔?，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固體、麥芽糖糊精和它們的混合物。如果需要的話可以加入食用纖維。如果使用了食用纖維，它優(yōu)選地構(gòu)成營養(yǎng)嬰兒食品的至多大約5％的能量。食用纖維可以是任何適當來源的，包括例如大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、果糖寡糖(fructooligosaccharides)。
可以在營養(yǎng)嬰兒食品中加入適當?shù)木S生素和礦物質(zhì)，加入的量合乎適當?shù)闹敢?br> 如果需要，可以在營養(yǎng)嬰兒食品中加入一種或幾種食品級乳化劑，例如二乙酰酒石酸一或二甘油酯、卵磷脂以及一和二甘油酯。類似地，可以加入適當?shù)柠}和穩(wěn)定劑。
營養(yǎng)嬰兒食品優(yōu)選地腸內(nèi)施用，例如以粉末、片劑、膠囊、液體濃縮物、固體產(chǎn)品和即飲型飲料。如果需要生產(chǎn)粉末狀的營養(yǎng)嬰兒食品，將均勻化的混合物轉(zhuǎn)移到適當?shù)母稍镅b置(例如噴霧干燥器、冷凍干燥器)中，轉(zhuǎn)變成粉末。
在另一實施方案中，可在普通食品中富集至少一種本發(fā)明的來自乳酸菌的脂磷壁酸。例如發(fā)酵的奶、酸乳酪、新鮮干酪、凝乳(rennetedmilk)、甜食(例如甜的或增甜的飲料)、糖果條棒、早餐谷類薄片或條棒、飲料、奶粉、豆制品、非奶類發(fā)酵產(chǎn)品或臨床營養(yǎng)品的營養(yǎng)添加物。
在另一實施方案中，可以制備營養(yǎng)完全的寵物食品。營養(yǎng)完全的寵物食品可以是任何適當?shù)男问剑绺傻?、半濕的或濕的形式。它可以是冷藏的或貨架穩(wěn)定的寵物食品。這些寵物食品可以用常規(guī)的方法制備。除本發(fā)明的脂磷壁酸之外，這些寵物食品可以包含任何一種或幾種碳水化合物源、蛋白源和脂質(zhì)源。
可以使用任何適當?shù)奶妓衔镌础?yōu)選地，碳水化合物源以谷物、面粉和淀粉的形式提供。例如，碳水化合物源可以是稻米、大麥、高梁、粟、燕麥、玉米粗粉(meal)和小麥粉。也可以使用簡單的糖例如蔗糖、葡萄糖和玉米糖漿。碳水化合物源提供的碳水化合物的量可以根據(jù)需要選擇。例如，寵物食品可含有高達大約60重量％的碳水化合物。
合適的蛋白源可選自任何合適的動物或植物蛋白源，例如，肌肉或骨骼肉類、肉和骨膳食、禽肉、魚肉、奶蛋白、玉米面筋(gluten)、小麥面筋、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、卵蛋白、乳清、酪蛋白、面筋等。蛋白源提供的蛋白的量可以根據(jù)需要選擇。例如，以干重計，寵物食品可含有大約12重量％至大約70重量％的蛋白。
寵物食品可含有脂肪源?？梢允褂萌魏魏线m的動物脂肪和植物脂肪的脂肪源。優(yōu)選地，脂肪源是動物脂肪源，例如動物脂(tallow)。也可使用植物油，例如玉米油、葵花油、紅花油、菜籽油、大豆油、橄欖油和其他富含單不飽和和多不飽和脂肪酸的油。除必需脂肪酸(亞油酸和α亞油酸)外，脂肪源可包含長鏈脂肪酸。脂肪源提供的脂肪的量可以根據(jù)需要選擇。例如，以干重計，寵物食品可含有大約5％至40重量％的脂肪。優(yōu)選地，寵物食品具有相對少量的脂肪。
寵物食品可含有其他活性因子，例如長鏈脂肪酸。合適的長鏈脂肪酸包括α亞油酸、γ亞油酸、亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。魚油是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的適當來源。琉璃苣油、黑加侖籽油和月見草油是γ亞油酸的合適來源。紅花油、葵花油、玉米油和大豆油是亞油酸的合適來源。
碳水化合物、蛋白和脂類來源的選擇不是關(guān)鍵性的，可根據(jù)動物的營養(yǎng)需要、適口性要求和產(chǎn)品的類型來選擇。此外，不同的其他成分，例如糖、鹽、香料、調(diào)味品、維生素、礦物質(zhì)、香味劑、樹膠、前生菌(prebiotics)和益生菌也可根據(jù)需要摻入寵物食品中。
相應(yīng)地，益生菌可選自適用于動物的一種或幾種微生物，其能提高腸內(nèi)的微生物平衡。益生菌可以是粉末狀、干燥的形式，特別是形成孢子的微生物的孢子的形式。此外，如果需要，益生菌可裝入膠囊以進一步提高其生存能力，例如，在糖基質(zhì)、脂肪基質(zhì)或多糖基質(zhì)中。
對干的寵物食品來說，適當?shù)募庸し椒ㄊ菙D壓烹制，雖然也可以使用烘焙或其他適當?shù)募庸し椒?。當擠壓烹制后，干的寵物食品通常是粗粉(kibble)形式。如果使用了前生菌，它可以在加工之前與干的寵物食品的其他成分混合。歐洲專利申請No 0850569描述了一種適當?shù)募庸し椒?。如果使用了益生菌，該微生物最好包被在干的寵物食品上或填入干的寵物食品中。歐洲專利申請No 0862863描述了一種適當?shù)募庸し椒ā?br> 對濕的寵物食品來說，可以使用美國專利4,781,939和5,132,137描述的方法以產(chǎn)生仿制的肉類產(chǎn)品。也可使用生產(chǎn)大塊(chunk)產(chǎn)品的其他方法，例如在蒸氣爐中烹制?；蛘撸ㄟ^以下方法來生產(chǎn)條塊(loaf)產(chǎn)品乳化適當?shù)娜庖援a(chǎn)生肉漿，加入適當?shù)哪z凝劑，在裝入罐頭或其他容器之前加熱肉漿。
以下實施例僅是示例性的，不構(gòu)成對本發(fā)明主題的限制。除非另外指出，百分比和份數(shù)以重量計。實施例之前是附圖簡述。


圖1.來自約氏乳桿菌La1菌株和嗜酸乳桿菌La10菌株的LTA對HT29細胞釋放IL-8的作用，所述HT29細胞受到純化自大腸桿菌的LPS的攻擊。在10ng/ml(●)或100ng/ml(■)的大腸桿菌LPS以及不同量的來自La1(A)或La10(B)的LTA的存在下，通過ELISA測量在補充了2％人乳(HM)的培養(yǎng)基中溫育24小時的HT29細胞的上清液中產(chǎn)生的IL-8。單獨用LPS-HM對HT29細胞的激活用虛線表示。誤差(Error bars)表示SD。結(jié)果由三個獨立的實驗表示。
圖2.來自乳桿菌La1的LTA對HT29細胞釋放IL-8的作用，所述HT29細胞受到來自腸炎沙門氏菌的LPS或完整大腸桿菌的攻擊。在不同量的來自La1的LTA的存在下，通過ELISA測量在補充了2％人乳(HM)和10ng/ml(●)或100ng/ml(■)的腸炎沙門氏菌LPS(A)或2.5×105/ml完整大腸桿菌(B)的培養(yǎng)基中溫育24小時的HT29細胞的上清液中產(chǎn)生的IL-8。在沒有LTA的條件下的HT29細胞的激活用虛線表示。誤差表示SD。
圖3.來自乳桿菌La1和La10的LTA對HT29細胞釋放TNF-α的作用，所述HT29細胞受到大腸桿菌LPS的攻擊。在100ng/ml的大腸桿菌LPS和不同量的來自La1(■)或La10(●)的LTA的存在下，通過ELISA測量在補充了2％人乳(HM)的培養(yǎng)基中溫育24小時的HT29細胞的上清液中產(chǎn)生的TNF-α。在沒有LTA的條件下的HT29細胞的激活用虛線表示。誤差表示SD。
圖4.來自乳桿菌La1的LTA對HT29細胞中LPS誘導(dǎo)的ENA-78mRNA表達的作用。通過RT-PCR測定在HT29細胞的完整RNA上的ENA-78表達，所述HT29細胞受到100ng/ml大腸桿菌LPS的攻擊，條件分別為不存在(泳道1)或存在2％人乳(泳道2至6)，添加MY4抗CD14 mAb(泳道3)，同型匹配(isotype-matched)抗體對照(泳道4)，或1μg/ml(泳道5)或50μg/ml(泳道6)來自La1的LTA。ENA-78轉(zhuǎn)錄物的預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為220bp。作為內(nèi)標，β肌動蛋白(460bp)的擴增帶被用作管家基因。
圖5.來自乳桿菌La1和La10的LTA對分化的HT29細胞釋放IL-8的作用，所述HT29細胞受到大腸桿菌LPS的攻擊。在100ng/ml的大腸桿菌LPS和標明量的來自乳桿菌La1(■)或La10(●)的LTA的存在下，通過ELISA測量在補充了2％人乳(HM)的培養(yǎng)基中溫育24小時的分化的HT29細胞的上清液中產(chǎn)生的IL-8。
圖6.來自乳桿菌La1的LTA對人PBMC活化的作用。(A)在不同量的大腸桿菌LPS(·)或來自La1的LTA(●)存在下，在補充了1％人血清的RPMI中溫育剛分離的人PBMC(2×105細胞/孔)。(B)和(C)在加入大腸桿菌LPS(1ng/ml)之前，在不存在(虛線)或存在(實線)不同量的來自La1的LTA的條件下，在37℃下將PBMC溫育30分鐘。在24小時溫育之后，收集培養(yǎng)物上清，通過特異性ELISA分析IL-8(A)和(B)，或TNF-α(C)的存在。誤差表示SD。
圖7.LTA的脫?；饔脤λ鼈兊霓卓够钚缘淖饔?。在不存在(虛線)或存在(實線)純化自La1(A)或La10(B)的不同量的天然LTA(■)或脫酰基LTA(●)的條件下，在補充了2％人乳(HM)的培養(yǎng)基中，用大腸桿菌LPS(100ng/ml)攻擊HT29細胞。24小時之后，用ELISA測量培養(yǎng)物上清中的IL-8的釋放。
圖8.將細胞用LTA和sCD14或LTA和LPS預(yù)溫育對拮抗作用的影響。(A)在存在2％的人乳(HM)的條件下，用La1 LTA(50和100μg/ml)預(yù)溫育HT29細胞4小時，用無血清培養(yǎng)基清洗兩次，然后在不存在和存在HM的條件下用大腸桿菌LPS(100ng/ml)攻擊20小時。(B)在加入大腸桿菌LPS(100ng/ml)之前，在存在人乳(HM)的條件下，用La1 LTA(1、10和50μg/ml)溫育HT29細胞4小時。(C)在加入2％人乳(HM)之前，在存在大腸桿菌LPS(100ng/ml)的條件下，用La1 LTA(1、10和50μg/ml)溫育HT29細胞4小時。(D)在加入La1 LTA(1、10和50μg/ml)之前，在存在2％人乳(HM)的條件下，用大腸桿菌LPS(100ng/ml)攻擊HT29細胞4小時。在總共24小時之后，用ELISA測量培養(yǎng)物上清中IL-8的釋放。誤差表示SD。
實施例1來自約氏乳桿菌NCC 533菌株和嗜酸乳桿菌NCC 90菌株的脂磷壁酸拮抗人腸上皮細胞對LPS或革蘭氏陰性菌的反應(yīng)材料和方法細胞、培養(yǎng)基和試劑人結(jié)腸腺癌細胞系HT29得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA.ATCCHTB-38)。在5％CO2/空氣的恒溫箱中，在37℃下，將未分化的細胞維持在補充了10％胎牛血清(FCS；AmimedBioConcept，Allschwill，瑞士)的含葡萄糖的DMEM中，而分化的細胞在無葡萄糖的培養(yǎng)基中生長。每兩天更換培養(yǎng)基，直至細胞單層達到90％匯合。人外周血單核細胞(PBMC)用Ficoll-Isopaque(Pharmacia)密度梯度離心分離自肝素化的成人供血者的血。分離的PBMC清洗3次，重懸于補充了1％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies，address)中。來自大腸桿菌和腸炎沙門氏菌菌株的LPS購自Sigma化學(xué)品公司(St Louis，MO)。鼠抗CD14單克隆抗體MY4(IgG2b)購自Coulter(Instrumentation Laboratory AG，瑞士)。同型匹配的對照mAb是小鼠IgG2b(kappa)，來源于MOPC 141(Sigma)。人乳得自健康的母親。樣品用乳泵擠壓法在最多產(chǎn)后70天收集到無菌的離心管中，在收集后2小時之內(nèi)進行處理。在200×g離心30分鐘后，無非細胞液體的級分在-80℃下冷凍備用。
LTAs的分離和純化約氏乳桿菌La1 NCC 533和嗜酸乳桿菌La10 NCC 90的LTAs用Fischer等的方法(Fischer，W.等，1983，Eur.J.Biochem 133523-530)分離。簡單地說，細菌在MRS肉湯中培養(yǎng)過夜，收集，以800毫克濕重/毫升緩沖液重懸于0.1M乙酸鈉(pH4.5)中。然后將它們與2體積的甲醇和1體積的氯仿在室溫下混合過夜而脫脂。過濾回收脫脂的細菌，用2體積的甲醇清洗，重懸于0.1M乙酸鈉(pH4.7)中，濃度為每毫升緩沖液500毫克細菌。懸浮液與等體積的熱的80％(w/v)含水苯酚混合，在65℃水浴中勻速攪拌45分鐘。冷卻后，將形成的乳液在4℃以5000×g離心30分鐘。將上面的水層用0.1M乙酸鈉(pH5)充分透析(截止分子量6-8kDa)。用溶于5mM MgSO4、40mM EDTA二鈉和0.2mM NaN3的30U/ml DNAse I(Sigma)、9U/ml核糖核酸酶消化核酸(室溫下24小時)，加入1毫升甲苯防止微生物污染。將消化物用0.1M乙酸鈉(pH4.7)再次透析，用1-丙醇調(diào)到15％。將它加樣到用0.1M乙酸鈉加15％1-丙醇平衡的Octyl-瓊脂糖柱上，流速為0.1毫升/分鐘。收集5毫升的級分。在相同的緩沖液中用15-80％梯度的1-丙醇洗脫LTA，流速為0.5毫升/分鐘。收集3毫升的級分。通過測量折射率來監(jiān)測1-丙醇濃度。分析每個級分的總中性糖含量(Dubois，M.A.等，確定糖和相關(guān)物質(zhì)的比色方法，AnalChem 28350-356)，磷含量(Chen，P.S.等，1956，磷的微量測定，Anal Chem 281756-1758)，核酸含量和折射率。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotavap)濃縮樣品峰，以除去丙醇，然后用水徹底透析。濃縮之后，加入0.1M乙酸鈉(pH4.7)、1mM CaCl2和MgCl2，將等分試樣在-20℃下冷凍。用最近描述的ELISA法確認Lal LTA的抗原活性(Granato，D.等，1999，Appl Environ Microbiol 651071-1077)。用Teti等描述的方法脫(Teti，G.等，1987，Infect Immun 553057-3064)。
鱟變形細胞裂解物測試對所有將與細胞接觸的試劑用比濁動力學(xué)鱟變形細胞裂解物凝塊測試(E-Toxate測試)來檢測內(nèi)毒素污染。檢測的靈敏度為每毫升0.05-0.1內(nèi)毒素單位(大腸桿菌0.55B5 LPS)。發(fā)現(xiàn)在本研究中所用的不同培養(yǎng)基是無活性的或含有＜50pg/ml的內(nèi)毒素。
細胞處理將HT29細胞以104細胞/孔加入96孔平底平板。在溫育5天之后，在加入溶于200μl的DMEM中的人乳、LPS和/或LTA之前，用無血清培養(yǎng)基清洗HT29細胞兩次。在某些孔中，加入終濃度為20μg/ml的抗CD14單克隆抗體。在其他實驗中，將PBMC懸浮于含1％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后以2×105細胞/孔的濃度加入96孔平底平板中。然后將細胞與LTA在37℃下溫育30分鐘，再用LPS刺激。在37℃下溫育24小時之后，收集上清，在-20℃下貯存，用于進一步測量細胞因子含量。用細胞毒性檢測試劑盒(RocheDiagnostics)檢測細胞的生存能力，該方法檢測從受損細胞的細胞溶質(zhì)釋放到上清中的乳酸脫氫酶(LDH)的活性。
IL-8和TNF-α在培養(yǎng)物上清中的濃度通過ELISA測量細胞培養(yǎng)物上清中生成的IL-8的量。簡單地說，通過4℃下溫育過夜將抗IL-8單克隆抗體(2μg/ml，ImmunoKontakt，Bioggio，瑞士)包被在96孔平板(Nunc)上。用溶于PBS的0.05％Tween-20清洗平板2次。通過用溶于PBS的10％FCS在室溫下溫育平板2個小時來封閉非特異性結(jié)合。加入樣品或標準濃度的溶于FCS-PBS的重組細胞因子(15.625至2000pg/ml，ImmunoKontakt)，室溫下3個小時。在加入生物素標記的抗人IL-8單克隆抗體(1μg/ml，ImmunoKontakt)之前，用PBS-Tween清洗平板4次，室溫下1小時。4次清洗之后，加入鏈霉抗生物素-過氧化物酶(0.5μg/ml，KPL，Bioreba，Reinach，瑞士)，室溫下1小時。再次清洗平板，加入底物(TMB-peroxydase，KPL)10-30分鐘。通過加入1N HCl中斷酶促反應(yīng)。在ELISA讀數(shù)器(Dynex Technologies)中讀取450nm的吸收值。檢測范圍是大約30pg/ml。通過市售的ELISA試劑盒(R&D systems)測量釋放到細胞培養(yǎng)物上清的TNF-α的量。
上皮嗜中性粒細胞激活因子(ENA)-78的逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)用Trizol法(GIBCO-BRL)從組織培養(yǎng)皿中的HT29細胞中提取總細胞RNA。用Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Perkin-Elmer，address)逆轉(zhuǎn)錄分離自腸上皮細胞的RNA。簡單地說，將RNA樣品(0.5μg的總RNA)、0.5單位的RNase抑制劑、1mM的各dNTP、0.5nmol/ml的特異性3’引物、5mM MgCl2和1.25單位的逆轉(zhuǎn)錄酶以總體積10μl的反應(yīng)混合物進行溫育，所述反應(yīng)混合物含有制造商提供的酶緩沖液。反應(yīng)混合物在42℃下溫育30分鐘，然后在95℃下加熱。用GoldDNA聚合酶(Perkin Elmer)在熱循環(huán)儀(Biolabo，Scientific Instruments，Chatel St Denis，瑞士)上擴增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR以50μl總體積進行，使用10μl溶于PCR緩沖液的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2mM MgCl2，5μM各dNTP，0.2nmol/ml ENA-78-特異性3’反義和5’有義引物(分別為CGTTCTCAGGGAGGCTC和TCCTTCGAGCTCCTTGTG，Keates等，1997Am.J.Physiol 273 G75-G82)和1.25單位的DNA聚合酶。在95℃下起始變性10分鐘后，對樣品進行35個循環(huán)的擴增94℃變性45秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒，然后進行在72℃下進行7分鐘的延伸。對所有樣品進行RT-PCR，以β肌動蛋白作為陽性對照。將RT-PCR產(chǎn)物的樣品加樣到溶于TAE緩沖液的1.2％瓊脂糖凝膠(含溴乙錠)中，在150V下電泳1小時進行分離。在紫外光下RT-PCR產(chǎn)物為可見的。通過與DNA分子量標記物(BoehringerMannheim)進行比較確定條帶的正確大小。
結(jié)果來自乳桿菌的LTA抑制HT29細胞由大腸桿菌或LPS誘導(dǎo)的IL-8、TNF-α和ENA-78釋放我們檢查了革蘭氏陽性菌或它們的衍生物是否也能刺激人腸上皮細胞HT29細胞。不同的革蘭氏陽性生物體在存在或不存在作為sCD14來源的人乳的條件下與HT29細胞溫育。與大腸桿菌相反，革蘭氏陽性菌L.sakei、酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌La10菌株和約氏乳桿菌La1菌株，以及金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌即使在sCD14存在下也不能刺激HT29細胞釋放IL-8。此外，當以至多100μg/ml的濃度加入來自La1、La10或金黃色葡萄球菌的LTA時，沒有觀察到IL-8的分泌。
由于已知sCD14識別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌二者的組分，我們檢測了革蘭氏陽性生物體的組分(例如LTA)是否拮抗革蘭氏陰性菌對HT29細胞的作用。為此，在存在或不存在作為sCD14源的人乳，以及不同量的來自La1(圖1A)或La10(圖1B)的LTA的條件下，用LPS(10和100ng/ml)攻擊HT29細胞。如預(yù)期的那樣，在存在sCD14的條件下暴露于10或100ng/ml大腸桿菌LPS的HT29細胞釋放大量的IL-8(圖1，虛線)。加入來自La1(圖1A，實線)或La10(圖1B，實線)的LTA引起LPS誘導(dǎo)的IL-8分泌顯著減少(marked decrease)。這種抑制活性是劑量依賴性的，使用100至1000倍過量的LTA觀察到完全抑制。為了確定LTA的抑制活性是一種普遍現(xiàn)象，檢測了LTA對HT29細胞應(yīng)答另一LPS源的拮抗活性。如圖2A所示，來自La1的LTA抑制HT29細胞分泌IL-8，所述HT29細胞受到10或100ng/ml的來自腸炎沙門氏菌的LPS的攻擊。此外，來自La1的LTA拮抗全大腸桿菌sCD14對HT29細胞的作用(圖2B)。
如圖3所示，來自La1和La10的LTA都抑制大腸桿菌LPS誘導(dǎo)的由HT29細胞釋放TNF-α。此外，來自La1的LTA也顯著地抑制LPS誘導(dǎo)的ENA-78mRNA的表達(圖4)。值得注意的是，觀察到的乳桿菌LTA抑制活性并不歸因于LTA制備物對HT29細胞的細胞毒作用，因為在培養(yǎng)物上清中不能檢測到LDH的明顯釋放(數(shù)據(jù)未顯示)。
來自La1和La10的LTA抑制LPS誘導(dǎo)分化的HT29細胞釋放IL-8如圖5所示，在存在人乳的條件下，用10ng/ml的大腸桿菌LPS攻擊的分化的HT29細胞釋放大量的IL-8(虛線)。如上所述，來自La1或La10(實線)的LTA以劑量依賴方式引起分泌減少。用5000倍過量的LTA觀察到完全抑制。
來自La1的LTA抑制LPS刺激人單核細胞一些LTA與血單核細胞和巨噬細胞上的與膜結(jié)合的CD14相互作用，刺激不同細胞因子的分泌。我們因此分析了暴露于乳桿菌LTA的PBMC分泌的IL-8和TNF-α。在存在增加量的乳桿菌LTA(100至10000ng/ml)的條件下將PBMC溫育30分鐘，然后加入濃度為1ng/ml的大腸桿菌LPS。如圖6所示，當單獨給出時，La1 LTA在濃度為5μg/ml或更高時刺激IL-8分泌(圖6A)，然而，在任何受試濃度下都沒有觀察到刺激TNF-α釋放。此外，雖然來自La1的LTA對由LPS誘導(dǎo)的PBMC分泌IL-8僅有弱的拮抗作用(圖6B)，但它以劑量依賴形式對LPS誘導(dǎo)的TNF-α的分泌有更明顯的抑制(圖6C)。來自La10的LTA，單獨或與LPS結(jié)合，對IL-8或TNF-α的產(chǎn)生沒有明顯的作用。
脫酰基LTA的生物活性LTA的脫?；瘜?dǎo)致細胞生物活性的損失。這意味著LTA的脂部分對免疫調(diào)節(jié)活性是關(guān)鍵性的。我們因此在我們的細胞模型中檢測了LTA的脫?；瘜λ鼈兊腖PS拮抗性的影響。如圖7所示，來自La1(圖7A)和La10(圖7B)的LTA對LPS-sCD14誘導(dǎo)HT29細胞產(chǎn)生IL-8的拮抗活性，在脫?；竺黠@減弱。因此，在我們的細胞系統(tǒng)中，乳桿菌LTA的拮抗活性也由脂部分所介導(dǎo)。
sCD14-LTA相互作用在抑制LPS-sCD14作用中的角色為了理解LTA如何對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生拮抗作用，進行不同的處理方法，其中HT29細胞與來自La1的LTA以及人乳sCD14或大腸桿菌LPS預(yù)溫育。將HT29細胞與La1 LTA(50和100μg/ml)(含有或不含人乳)預(yù)溫育4小時，用無血清培養(yǎng)基清洗2次，然后在存在乳液的條件下用LPS(100ng/ml)攻擊20小時，IL-8的分泌沒有消除(圖8A)。然而，將細胞在存在sCD14的條件下與La1 LTA(1至50μg/ml)預(yù)溫育4小時，不經(jīng)過清洗，用LPS(100ng/ml)攻擊24小時，產(chǎn)生的IL-8的水平與HT29細胞和LTA、LPS和sCD14共同溫育24小時后得到的水平是相似的(圖8B)。圖8C顯示在向細胞加入sCD14源24小時之后產(chǎn)生的IL-8的水平，所述細胞與La1LTA(1-50μg/ml)和LPS(100ng/ml)預(yù)溫育4小時。這一水平與HT29細胞和LTA、LPS和sCD14的混合物溫育24小時所獲得的量相似。當細胞在加入LTA之前與LPS(100ng/ml)和CD14源預(yù)溫育4小時時，得到相似的結(jié)果(圖8D)。
IEC不表達膜CD14，并要求以可溶形式來體外應(yīng)答LPS(Pugin，J.等，1993 PNAS 902744-2748)。我們先前顯示了革蘭氏陰性菌和LPS在IEC中通過人乳sCD14的作用介導(dǎo)前炎性細胞因子產(chǎn)生(Labeta，M.O.等，2000，J Exp Med 1911807-1812)。然而，IEC不應(yīng)答不同的LTA源，即使存在sCD14。由于其他研究表明LTA與真核細胞膜的結(jié)合需要脂肪酸部分，并且結(jié)合脂肪酸的蛋白只在腸絨毛上部的分化的IEC上表達，我們也檢測了LTA-乳對分化的HT29的作用。有趣的是，LTA仍沒有引起任何應(yīng)答，而來自約氏乳桿菌La1菌株和嗜酸乳桿菌La10菌株的LTA能夠刺激血單核細胞釋放IL-8。這些結(jié)果進一步支持了約氏乳桿菌La1菌株和嗜酸乳桿菌La10菌株的前生命期(probiotic)狀態(tài)，并暗示了它們的LTA在對抗由革蘭氏陰性菌或它們的衍生物引起的疾病中的治療用途。
實施例2嬰兒食品為了獲得嬰兒食品(infant formula)，我們制備了在100ml中含有下列成分的混合物0.5-5％，優(yōu)選2％的肽；0.2-10％，優(yōu)選4％的脂肪；1-25％，優(yōu)選8％的非果聚糖碳水化合物(包括65％乳糖、20％麥芽糖糊精、15％淀粉)；至少106cfu/ml的下列菌株嗜酸乳桿菌NCC90(CNCM I-2332)或約氏乳桿菌NCC 533(CNCM I-1225)；痕量的維生素和日常所需的少量元素；0.01-2％，優(yōu)選0.3％的礦物質(zhì)；以及50-90％，優(yōu)選75％的水。
實施例3奶制品中的用途根據(jù)本發(fā)明，嗜酸乳桿菌NCC 90(CNCM I-2332)或約氏乳桿菌NCC 533(CNCM I-1225)中的一種或幾種菌株可用于制備發(fā)酵的酸奶樣奶制品。
為此，制備了含有2.8％脂肪并補充了2％的脫脂奶粉和6％蔗糖的1升奶制品。將它在96℃下巴氏消毒30分鐘，然后降溫至42℃。嗜熱鏈球菌的非增稠(non-thickening)菌株和保加利亞乳桿菌的非粘性菌株的預(yù)培養(yǎng)物，在含有10％的重建奶粉和0.1％市售酵母提取物的無菌的MSK培養(yǎng)基中重新活化。
一種或幾種菌株的預(yù)培養(yǎng)物也在含有10％的重建奶粉和0.1％市售酵母提取物以及1％蔗糖的培養(yǎng)基中重新活化。用1％的各種重新活化的預(yù)培養(yǎng)物接種巴氏消毒的奶制品，然后將奶制品在32℃下發(fā)酵直至pH達到4.5。用這種方法產(chǎn)生發(fā)酵的酸奶樣產(chǎn)物，在4℃下保存。
實施例4干的寵物食品飼料組合物由以下成分組成大約58重量％玉米、大約6重量％的玉米面筋、大約23重量％的雞肉，其余為鹽、維生素和礦物質(zhì)。
將飼料混合物送入預(yù)處理器(preconditioner)并弄濕。濕潤的飼料被送入擠出機-烹制機(cooker)中并凝膠化。離開擠出機的凝膠化物質(zhì)通過一個模具(die)并被擠出。將擠出物切成適于飼喂給貓的小塊，在大約110℃下干燥大約20分鐘，冷卻形成小團塊(pellet)。在此時，將約氏乳桿菌NCC533(CNCM I-1225)或嗜酸乳桿菌NCC 90(CNCMI-2332)中的一種或幾種菌株的凍干粉末施加到小團塊上。如此提供足夠的粉末使得寵物攝入的量為大約1.0E+07-1.0E+9cfu/天。將一些粉末與第一份小團塊混合并裝袋。稱出第二份量的粉末，混入液態(tài)載體中，然后噴灑在第二份小團塊上。在50-60℃下若干分鐘，待涂層充分干燥后將小團塊裝袋。
這種干的狗食品特別適用于降低與細菌定殖有關(guān)的炎癥過程。
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物，所述免疫應(yīng)答由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)，所述組合物包含來自乳酸菌的脂磷壁酸作為活性成分。
2.權(quán)利要求1的組合物，它特別適于在人和動物的胃腸道、骨、眼、肺、耳和口腔中調(diào)節(jié)與細菌定殖或感染有關(guān)的免疫應(yīng)答和/或預(yù)防或降低由此誘導(dǎo)的炎癥過程。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中來自乳酸菌的脂磷壁酸具有結(jié)合CD14的能力，不具有誘導(dǎo)由腸上皮細胞釋放前炎性細胞因子例如IL-8或TNF-α的能力。
4.權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項的組合物，其中脂磷壁酸來自乳桿菌、雙歧桿菌或鏈球菌屬的乳酸菌，優(yōu)選嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、酪乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌。
5.權(quán)利要求1-4中任一權(quán)項的組合物，其中乳酸菌是約氏乳桿菌CNCM I-1225、嗜酸乳桿菌CNCM I-2332。
6.權(quán)利要求1-5中任一權(quán)項的組合物，其含有產(chǎn)生所述脂磷壁酸的乳酸菌或其培養(yǎng)物上清。
7.權(quán)利要求1-6中任一權(quán)項的組合物，其中脂磷壁酸存在的量相應(yīng)于細菌的量，在食品組合物中為105cfu/g至大約1011cfu/g，在藥物制劑中為大約105cfu/g至1016cfu/g。
8.權(quán)利要求1-7中任一權(quán)項的組合物，它是藥物、口部或局部美容產(chǎn)品、皮膚或眼部應(yīng)用、食品或?qū)櫸锸称方M合物的形式。
9.來自乳酸菌的脂磷壁酸，它能結(jié)合CD14，不能誘導(dǎo)由腸上皮細胞釋放前炎性細胞因子例如IL-8或TNF-α。
10.權(quán)利要求9的脂磷壁酸，它含有它的脂類部分。
11.權(quán)利要求9或10的脂磷壁酸，它來自乳桿菌、雙歧桿菌或鏈球菌屬的乳酸菌。
12.權(quán)利要求9-11中任一權(quán)項的脂磷壁酸，其中乳酸菌選自嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、酪乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌。
13.權(quán)利要求9-12中任一權(quán)項的脂磷壁酸，其中乳酸菌是約氏乳桿菌CNCM I-1225、嗜酸乳桿菌CNCM I-2332。
14.至少一種來自乳酸菌的脂磷壁酸和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或它的培養(yǎng)物上清，在制備用于在人或動物中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物中的用途，所述免疫應(yīng)答由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)。
15.權(quán)利要求9-13中任一權(quán)項的脂磷壁酸的用途。
16.權(quán)利要求14或15的用途，用于在人或動物的胃腸道、骨、皮膚、眼、耳、肺和口腔中降低或預(yù)防與細菌介導(dǎo)的疾病或LTA/LPS介導(dǎo)的失調(diào)有關(guān)的炎癥過程。
17.權(quán)利要求14-16中任一權(quán)項的用途，用于食品組合物或腸飼，用于嬰兒營養(yǎng)、寵物營養(yǎng)和動物飼料，用于臨床營養(yǎng)或藥物應(yīng)用。
18.權(quán)利要求14-17中任一權(quán)項的用途，以局部或口部制劑形式用于美容或皮膚應(yīng)用、眼部應(yīng)用或口部應(yīng)用。
19.在人或動物中調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括給人或動物施用有效量的來自乳酸菌的脂磷壁酸和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或它的培養(yǎng)物上清，或含有來自乳酸菌的脂磷壁酸作為活性成分和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或它的培養(yǎng)物上清的組合物。
20.在人或動物的胃腸道、骨、皮膚、眼、耳、肺和口腔中降低或預(yù)防與細菌介導(dǎo)的疾病或LTA/LPS介導(dǎo)的失調(diào)有關(guān)的炎癥過程的方法，其包括給人或動物施用有效量的來自乳酸菌的脂磷壁酸和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或它的培養(yǎng)物上清，或含有來自乳酸菌的脂磷壁酸作為活性成分和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或它的培養(yǎng)物上清的組合物。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中組合物是權(quán)利要求1-8中任一權(quán)項的組合物。
22.在寵物動物中調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給寵物動物施用一種組合物，所述組合物含有能夠調(diào)節(jié)所述應(yīng)答的益生菌菌株的一部分。
23.權(quán)利要求22的方法，其包括給寵物動物施用含有益生菌、其培養(yǎng)物上清或其代謝物的組合物，所述益生菌等能夠至少暫時粘附于寵物動物的腸上皮。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其包括施用作為營養(yǎng)平衡膳食的組分的所述組合物，在優(yōu)選實施方案中，所述組分包含于濕的或干的寵物食品制備物中。
25.一種寵物食品制備物，其包含營養(yǎng)平衡膳食和一種活性成分，所述活性成分能夠在寵物動物中調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性菌菌株、可能致病的革蘭氏陽性菌菌株和/或它們的衍生物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物，所述免疫應(yīng)答由革蘭氏陰性菌、可能致病的革蘭氏陽性菌和/或它們的衍生物誘導(dǎo)，所述組合物包含來自乳酸菌的脂磷壁酸作為活性成分。本發(fā)明也涉及作為活性成分的來自乳酸菌的脂磷壁酸和/或產(chǎn)生它的乳酸菌和/或其培養(yǎng)物上清，在制備用于美容、皮膚或眼部應(yīng)用的藥物、口部或局部產(chǎn)品，用于在胃腸道、骨、皮膚、眼、耳、肺和口腔中調(diào)節(jié)細菌定殖、免疫應(yīng)答、降低與細菌介導(dǎo)的疾病和感染有關(guān)的炎癥過程的食品或?qū)櫸锸称分械挠猛尽１景l(fā)明也涉及特定的脂磷壁酸。
文檔編號A61P17/00GK1525863SQ02810479
公開日2004年9月1日 申請日期2002年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月23日
發(fā)明者K·維達爾, A·東內(nèi)一胡赫斯, D·-A·格拉納托, I·科爾特斯-托伊拉茲, K 維達爾, じ窶 賞, 廝 托伊拉茲, 諞緩 賬 申請人:雀巢制品公司